用于治療表達(dá)密蛋白6之癌癥的抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供可用作治療劑的抗體，其用于治療和/或預(yù)防與表達(dá)CLDN6之細(xì)胞相關(guān)的疾病，包括腫瘤相關(guān)的疾病，例如卵巢癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮膚癌、惡性黑色素瘤、頭頸癌、肉瘤、膽管癌、膀胱癌、腎癌、結(jié)腸癌、胎盤絨毛膜癌、子宮頸癌、睪丸癌和子宮癌。
【專利說明】用于治療表達(dá)密蛋白6之癌癥的抗體
[0001]在過去的十年間，抗體已被成功地引入臨床用于癌癥治療，并且已成為腫瘤學(xué)中最有希望的療法。與常規(guī)藥物相比，基于抗體的癌癥治療具有較高特異性和較低副作用譜的潛力。原因是抗體在正常和腫瘤細(xì)胞之間的精確區(qū)分，及其作用方式依賴毒性較小的免疫抗腫瘤機(jī)制(例如，補(bǔ)體激活和募集細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞)的事實(shí)。
[0002]密蛋白(claudin)是位于上皮與內(nèi)皮的緊密連接內(nèi)的整合膜蛋白(integralmembrane protein)。預(yù)測密蛋白具有四個(gè)跨膜區(qū)段,有兩個(gè)細(xì)胞外環(huán),并且N和C末端位于胞質(zhì)中?？缒さ鞍踪|(zhì)的密蛋白(CLDN)家族在上皮與內(nèi)皮緊密連接的維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且還可能在細(xì)胞骨架的維持中以及在細(xì)胞信號傳導(dǎo)中發(fā)揮作用。除了它們的膜定位之外，這些蛋白質(zhì)在腫瘤和正常細(xì)胞之間的差異表達(dá)使它們成為有吸引力的癌癥免疫治療靶標(biāo)，并且在癌癥治療中使用靶向CLDN的基于抗體的治療劑(therapeutics)使高水平的治療特異性成為可能。
[0003]然而，靶向CLDN之治療劑的臨床應(yīng)用面臨多種障礙。身體中普遍存在的CLDN表達(dá)以及CLDN在維持緊密連接中的關(guān)鍵作用要求靶向CLDN之治療劑的靶標(biāo)特異性，以使治療特異性最大化以及全身毒性最小化。[0004]W02009/087978涉及抗CLDN6抗體，并且涉及其作為抗癌劑的應(yīng)用。特別是描述了所設(shè)計(jì)的單克隆抗體AB3-1、AE1-16、AE49-11和AE3-20。然而，通過實(shí)施例5中的FACS分析表明，這些抗體都不是CLDN6特異性的。抗體AE3-20與CLDN9反應(yīng)，而抗體AE1-16和AE49-11表現(xiàn)出與CLDN9相當(dāng)大的反應(yīng)性，并且還與CLDN4反應(yīng)。抗體AB3-1與CLDN6的結(jié)合與其與CLDN9的結(jié)合一樣強(qiáng)。實(shí)施例7中描述了當(dāng)向小鼠腫瘤模型施用時(shí)，抗體AE49-11傾向于抑制腫瘤生長，并且具有延長生命的作用。然而，鑒于所使用抗體的非特異性，還不清楚所描述的作用是否是由抗體與CLDN6結(jié)合所引起的。
[0005]因此，到目前為止，尚未描述與表達(dá)CLDN6之細(xì)胞的表面選擇性結(jié)合的CLDN6特異性的抗體。然而，需要這樣的特異性抗體用于使用CLDN6作為靶標(biāo)的基于抗體的治療方法。
[0006]圖1中所示的CLDN3、CLDN4、CLDN6和CLDN9的序列比對說明CLDN6與其他密蛋白有高度的保守性。CLDN6與其他密蛋白(特別是CLDN9和CLDN4)的這種高同源性以及W02009/087978無法提供CLDN6特異性抗體的事實(shí)表明也許不能產(chǎn)生與CLDN6特異性結(jié)合的抗體。
[0007]發(fā)明概述
[0008]本文中公開的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確證CLDN6在不同的人癌細(xì)胞中表達(dá)，而在正常組織中的表達(dá)限于胎盤。
[0009]此外，本發(fā)明第一次描述成功地產(chǎn)生能夠與表達(dá)CLDN6之完整細(xì)胞的表面相結(jié)合的CLDN6特異性抗體。表達(dá)CLDN6之完整細(xì)胞的FACS分析顯示抗CLDN6抗體的特異性結(jié)合，而對于表達(dá)其他密蛋白(特別是CLDN3、CLDN4和CLDN9)的細(xì)胞或者不表達(dá)任何這些CLDN蛋白的細(xì)胞未觀察到結(jié)合。因此，本發(fā)明出人意料地證明，可產(chǎn)生這樣的抗體，其與表達(dá)CLDN6之細(xì)胞表面上的CLDN6特異性地進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)，但基本不與其他高度同源性的密蛋白進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)。[0010]本發(fā)明一般地提供可用作治療劑的抗體，其用于治療和/或預(yù)防與表達(dá)CLDN6并以CLDN6與細(xì)胞表面相締合(association)為特征之細(xì)胞相關(guān)的疾病，包括腫瘤相關(guān)的疾病，特別是癌癥，例如卵巢癌(特別是卵巢腺癌和卵巢畸胎癌)、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),特別是鱗狀細(xì)胞肺癌和腺癌)、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮膚癌(特別是基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌)、惡性黑色素瘤、頭頸癌(特別是惡性多形性腺瘤)、肉瘤(特別是滑膜肉瘤和癌肉瘤)、膽管癌、膀胱癌(特別是移行細(xì)胞癌和乳頭狀癌)、腎癌(特別是腎細(xì)胞癌，包括明細(xì)胞腎細(xì)胞癌和乳頭狀腎細(xì)胞癌)、結(jié)腸癌、小腸癌(包括回腸癌，特別是小腸腺癌和回腸腺癌)、睪丸胚胎性癌、胎盤絨毛膜癌、子宮頸癌、睪丸癌(特別是睪丸精原細(xì)胞瘤、睪丸畸胎瘤和胚胎性睪丸癌)、子宮癌、生殖細(xì)胞腫瘤(例如畸胎癌或胚胎性癌，特別是睪丸的生殖細(xì)胞腫瘤)、及其轉(zhuǎn)移形式。
[0011]在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及能夠與表達(dá)CLDN6之細(xì)胞表面所締合的CLDN6相結(jié)合的抗體。優(yōu)選地，所述抗體基本不能與表達(dá)CLDN9之細(xì)胞表面相締合的CLDN9相結(jié)合。優(yōu)選地，所述抗體基本不能與表達(dá)CLDN4之細(xì)胞表面所締合的CLDN4相結(jié)合和/或基本不能與表達(dá)CLDN3之細(xì)胞表面所締合的CLDN3相結(jié)合。最優(yōu)選地，所述抗體基本不能與CLDN6以外的其他CLDN蛋白(所述其他CLDN蛋白與表達(dá)所述CLDN蛋白之細(xì)胞表面相締合)相結(jié)合，并且是CLDN6特異性的。優(yōu)選地，表達(dá)所述CLDN蛋白的所述細(xì)胞是完整細(xì)胞，特別是非透化的細(xì)胞，并且與細(xì)胞表面相締合的所述CLDN蛋白具有天然的(即非變性的)構(gòu)象。優(yōu)選地，所述抗體能夠與一個(gè)或更多個(gè)天然構(gòu)象的CLDN6表位相結(jié)合。
[0012]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體能夠與位于CLDN6的胞外部分中的表位相結(jié)合，其中CLDN6的所述胞外部分優(yōu)選地包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:15的任一氨基酸序列，優(yōu)選SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列，更優(yōu)選SEQID NO:6的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述抗體能夠與位于SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:14和SEQ ID NO:15的任一氨基酸序列(優(yōu)選SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列)中的表位相結(jié)合。
[0013]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體能夠通過如下與CLDN6結(jié)合:通過至少與選自Thr33、Phe35、Gly37、Ser39、Ile40 和 Leul51 的一個(gè)、優(yōu)選超過一個(gè)(例如，2、3、4 或 5 個(gè))、優(yōu)選全部氨基酸相互作用，優(yōu)選通過至少與選自Thr33、Phe35、Gly37、Ser39和Ile40的一個(gè)、優(yōu)選超過一個(gè)、優(yōu)選全部氨基酸相互作用，更優(yōu)選通過至少與選自Phe35、Gly37、Ser39和Ile40或者Thr33、Phe35、Gly37和Ser39的一個(gè)、優(yōu)選超過一個(gè)、優(yōu)選全部氨基酸相互作用，并且特別是通過至少與選自Phe35、Gly37和Ser39的一個(gè)、優(yōu)選超過一個(gè)、優(yōu)選全部氨基酸相互作用。優(yōu)選地，所述抗體不與選自Glul54、Alal55、Argl58和Glyl61的一個(gè)或更多個(gè)、優(yōu)選全部氨基酸相互作用，并且優(yōu)選不與選自Argl58和Glyl61的一個(gè)或更多個(gè)、優(yōu)選全部氨基酸相互作用。
[0014]可通過丙氨酸掃描氨基酸的突變來分析抗體與CLDN6 (特別是天然構(gòu)象CLDN6)之間的相互作用?？稍u價(jià)CLDN6突變體被特異性單克隆抗體所結(jié)合的能力。特異性單克隆抗體與CLDN6突變體之結(jié)合受損表明被突變的氨基酸是重要的接觸殘基?？衫缤ㄟ^流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)合。
[0015]在一個(gè)實(shí)施方案中，通過包括以下步驟的方法可獲得所述抗體:用具有SEQ IDNO:6,SEQ ID N0:7、SEQ ID NO:14 和 SEQ ID NO: 15 的任一氨基酸序列(優(yōu)選 SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列)的肽或免疫等效肽或者表達(dá)所述肽的核酸或宿主細(xì)胞免疫接種動(dòng)物。
[0016]在不同的一些實(shí)施方案中，所述抗體能夠結(jié)合的CLDN6具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。特別優(yōu)選地是，所述抗體能夠與具有SEQ ID NO:2之氨基酸序列的CLDN6相結(jié)合，并且能夠與具有SEQ ID NO:8之氨基酸序列的CLDN6相結(jié)合。[0017]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含抗體重鏈，所述抗體重鏈包含選自SEQ IDNO:34、36、38和40之抗體重鏈序列或其變體的⑶R序列的至少一個(gè)、優(yōu)選兩個(gè)、更優(yōu)選所有三個(gè)。在圖25中所給出的上文中所提及的抗體重鏈序列中，以方框標(biāo)記所述CDR序列。
[0018]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含抗體重鏈，所述抗體重鏈包含⑶R3序列XaalGly Xaa2Val Xaa3，其中Xaal是任何氨基酸，優(yōu)選芳族氨基酸，更優(yōu)選Phe或Tyr，最優(yōu)選Tyr, Xaa2是任何氨基酸,優(yōu)選芳族氨基酸，更優(yōu)選Phe或Tyr,最優(yōu)選Tyr,并且Xaa3是任何氨基酸，優(yōu)選Leu或Phe,更優(yōu)選Leu。在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的抗體包含抗體重鏈，所述抗體重鏈包含CDR3序列Asp XaalGly Xaa2Val Xaa3或XaalGly Xaa2Val Xaa3Asp,其中Xaal、Xaa2和Xaa3的定義見上文。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含抗體重鏈，所述抗體重鏈包含CDR3序列Asp XaalGly Xaa2Val Xaa3Asp，其中Xaal、Xaa2和Xaa3的定義見上文。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含抗體重鏈，所述抗體重鏈包含⑶R3序列AlaArg Asp XaalGly Xaa2Val Xaa3AspTyr,其中 Xaal、Xaa2 和 Xaa3 的定義見上文。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)前述實(shí)施方案的抗體包含抗體重鏈，所述抗體重鏈包含根據(jù)SEQ ID N0:47的⑶Rl序列或其變體和/或根據(jù)SEQ ID NO:48的⑶R2序列或其變體。
[0019]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含抗體重鏈，所述抗體重鏈包含選自SEQ IDNO: 34、36、38和40的抗體重鏈序列或其變體。
[0020]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含抗體輕鏈，所述抗體輕鏈包含選自SEQ IDNO:35、37、39和41之抗體輕鏈序列或其變體的CDR序列的至少一個(gè)、優(yōu)選兩個(gè)、更優(yōu)選所有三個(gè)。在圖26中所給出的上文中提及的抗體輕鏈序列中，以方框標(biāo)記CDR序列。
[0021]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含抗體輕鏈，所述抗體輕鏈包含CDR3序列Arg XaalXaa2Xaa3Pro,其中Xaal是任何氨基酸，優(yōu)選Ser或Asn,最優(yōu)選Ser,Xaa2是任何氨基酸，優(yōu)選Tyr、Ser、Ile、Asn或Thr,更優(yōu)選Tyr、Ser或Asn,最優(yōu)選Asn,并且Xaa3是任何氨基酸，優(yōu)選Ser或Tyr,更優(yōu)選Tyr。在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的抗體包含抗體輕鏈，所述抗體輕鏈包含CDR3序列Gln Arg XaalXaa2Xaa3Pro Pro,其中Xaal、Xaa2和Xaa3的定義見上文。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含抗體輕鏈，所述抗體輕鏈包含CDR3序列Gln Gln Arg XaalXaa2Xaa3Pro Pro Trp Thr,其中 Xaal、Xaa2 和 Xaa3 的定義見上文。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)前述實(shí)施方案的抗體包含抗體輕鏈，所述抗體輕鏈包含根據(jù)SEQ IDNO:52的⑶Rl序列或其變體和/或根據(jù)SEQ ID NO:53的⑶R2序列或其變體。
[0022]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含抗體輕鏈，所述抗體輕鏈包含選自SEQ IDNO:35、37、39、41、54和55的抗體輕鏈序列或其變體。
[0023]在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含上文中所討論的抗體重鏈和上文中所討論的抗體輕鏈。[0024]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含:
[0025](i)抗體重鏈，其包含SEQ ID NO:x的抗體重鏈序列或其變體的⑶R序列的至少一個(gè)、優(yōu)選兩個(gè)、更優(yōu)選所有三個(gè)，以及
[0026](ii)抗體輕鏈，其包含SEQ ID NO:x+l的抗體輕鏈序列或其變體的⑶R序列的至少一個(gè)、優(yōu)選兩個(gè)、更優(yōu)選所有三個(gè)；
[0027]其中X 選自 34、36、38 和 40。
[0028]在上文中所提及的抗體重鏈序列和抗體輕鏈序列中分別用方框標(biāo)出CDR序列，分別在圖25和圖26中給出。
[0029]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含:
[0030](i)抗體重鏈，其包含選自 XaalGly Xaa2Val Xaa3、Asp XaalGly Xaa2Val Xaa3、XaalGly Xaa2Val Xaa3Asp、Asp XaalGly Xaa2Val Xaa3Asp 和 Ala Arg Asp XaalGlyXaa2Val Xaa3AspTyr的CDR3序列，其中Xaal是任何氨基酸，優(yōu)選芳族氨基酸，更優(yōu)選Phe或Tyr,最優(yōu)選Tyr, Xaa2是任何氨基酸,優(yōu)選芳族氨基酸，更優(yōu)選Phe或Tyr,最優(yōu)選Tyr,并且Xaa3是任何氨基酸，優(yōu)選Leu或Phe，最優(yōu)選Leu，以及
[0031](ii)抗體輕鏈，其包含選自 Arg XaalXaa2Xaa3Pr。、Gln Arg XaalXaa2Xaa3ProPro、Gln Gln Arg XaalXaa2Xaa3Pro Pro Trp Thr 的 CDR3 序列，其中 Xaal 是任何氨基酸，優(yōu)選Ser或Ash,最優(yōu)選Ser, Xaa2是任何氨基酸,優(yōu)選Tyr、Ser> lie、Asn或Thr,更優(yōu)選Tyr、Ser或Asn,最優(yōu)選Asn,并且Xaa3是任何氨基酸,優(yōu)選Ser或Tyr,更優(yōu)選Tyr。
[0032]在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)前述實(shí)施方案的抗體包含(i)抗體重鏈，其包含根據(jù)SEQID NO:47的⑶Rl序列或其變體和/或根據(jù)SEQ ID NO:48的⑶R2序列或其變體，和/或
(ii)抗體輕鏈，其包含根據(jù)SEQ ID NO:52的⑶Rl序列或其變體和/或根據(jù)SEQ ID NO:53的⑶R2序列或其變體。
[0033]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含:
[0034](i)抗體重鏈，其包含選自SEQ ID NO:34、36、38和40的抗體重鏈序列或其變體，優(yōu)選SEQ ID NO:36的抗體重鏈序列或其變體；以及
[0035](ii)抗體輕鏈，其包含選自SEQ ID NO:35、37、39、41、54和55的抗體輕鏈序列或其變體，優(yōu)選SEQ ID NO:35的抗體輕鏈序列或其變體。
[0036]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含:
[0037](i)抗體重鏈，其包含SEQ ID NO:36的抗體重鏈序列或其變體；以及(ii)抗體輕鏈，其包含選自SEQ ID NO:35、54和55的抗體輕鏈序列或其變體。
[0038]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含:
[0039](i)抗體重鏈，其包含SEQ ID NO:36的抗體重鏈序列或其變體；以及(ii)抗體輕鏈，其包含選自SEQ ID NO:54和55的抗體輕鏈序列或其變體。
[0040]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含:
[0041](i)抗體重鏈，其包含SEQ ID NO:36的抗體重鏈序列或其變體；以及(ii)抗體輕鏈，其包含SEQ ID NO:35的抗體輕鏈序列或其變體。
[0042]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含:
[0043](i)抗體重鏈，其包含SEQ ID NO:x的抗體重鏈序列或其變體，以及(ii)抗體輕鏈，其包含SEQ ID NO:x+l的抗體輕鏈或其變體；[0044]其中X 選自 34、36、38 和 40。
[0045]在優(yōu)選的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含抗體重鏈和/或抗體輕鏈，所述抗體重鏈包含Y-1重鏈恒定區(qū)，優(yōu)選人Y-1重鏈恒定區(qū)，例如如SEQ ID N0:25所示的序列；所述抗體輕鏈包含K輕鏈恒定區(qū)，優(yōu)選人K輕鏈恒定區(qū)，例如如SEQ ID N0:27所示的序列。
[0046]在優(yōu)選的一些實(shí)施方案中，所述抗體具有一種或更多種以下活性:(i)殺傷表達(dá)CLDN6的細(xì)胞，(ii)抑制表達(dá)CLDN6之細(xì)胞的增殖，(iii)抑制表達(dá)CLDN6之細(xì)胞的集落形成，(iv)介導(dǎo)已建立之腫瘤的緩解(即，大小減小)，優(yōu)選完全緩解(即，完全消失)，
(v)預(yù)防腫瘤的形成或再形成，以及(vi)抑制表達(dá)CLDN6之細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。因此，所述抗體可以用于前述一種或更多種(特別是當(dāng)向患者施用時(shí))。如本文中所描述的那樣，可治療性地應(yīng)用所述殺傷細(xì)胞和/或抑制細(xì)胞的一種或更多種活性。特別是可將殺傷細(xì)胞、抑制細(xì)胞的增殖和/或抑制細(xì)胞的集落形成用于治療或預(yù)防癌癥(包括癌癥轉(zhuǎn)移)?？蓱?yīng)用抑制細(xì)胞的增殖、集落形成和/或轉(zhuǎn)移，特別是用于治療或預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移和癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體通過誘導(dǎo)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(complement dependentcytotoxicity, Q)C)介導(dǎo)的裂解、抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒作用(antibody dependentcellular cytotoxicity, ADCC)介導(dǎo)的裂解、凋亡、同型黏著(homotypic adhesion)和 /或吞噬作用(優(yōu)選通過誘導(dǎo)⑶C介導(dǎo)的裂解和/或ADCC介導(dǎo)的裂解)介導(dǎo)對細(xì)胞的殺傷。然而，本發(fā)明還包括這樣的一些實(shí)施方案，其中所述抗體發(fā)揮本文中所描述的活性(例如，殺傷細(xì)胞和/或抑制一種或更多種細(xì)胞活性(例如，細(xì)胞增殖和/或集落形成))而不誘導(dǎo)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(CDC)介導(dǎo)的裂解、抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒作用(ADCC)介導(dǎo)的裂解、凋亡、同型黏著和/或吞噬作用。例如，本發(fā)明的抗體還可簡單地通過與細(xì)胞表面上的CLDN6結(jié)合而發(fā)揮作用，因而例如阻斷細(xì)胞的增殖。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體不誘導(dǎo)CDC介導(dǎo)的細(xì)胞裂解。
[0047]優(yōu)選地，在效應(yīng)細(xì)胞存在下，發(fā)生ADCC介導(dǎo)的細(xì)胞裂解，在一些具體的實(shí)施方案中，所述效應(yīng)細(xì)胞選自單核細(xì)胞(monocyte)、單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cell)、NK細(xì)胞和PMN，并且吞噬作用是通過巨噬細(xì)胞進(jìn)行的。
[0048]可通過在使用溴脫氧尿苷(5-溴-2-脫氧尿苷，BrdU)的測定中測定表達(dá)CLDN6之癌細(xì)胞的增殖來體外測量抑制或降低表達(dá)CLDN6之細(xì)胞(優(yōu)選癌細(xì)胞)的增殖的活性。BrdU是合成的核苷，其是胸苷的類似物，并且可被并入復(fù)制中的細(xì)胞(在細(xì)胞周期的S期的過程中)的新合成的DNA，在DNA復(fù)制的過程中替代胸苷。使用例如BrdU特異性的抗體檢出所并入的化學(xué)品表明細(xì)胞正在活躍地復(fù)制其DNA。
[0049]在產(chǎn)克隆試驗(yàn)(clonogenic assay)中，可體外測量抑制或降低表達(dá)CLDN6之細(xì)胞(優(yōu)選癌細(xì)胞)集落形成的活性。產(chǎn)克隆試驗(yàn)是用于研究特定藥劑(agent)對細(xì)胞存活和增殖之有效性的微生物技術(shù)。其在癌癥研究的實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)常使用，用于測定藥物或輻射對增殖的腫瘤細(xì)胞的作用。該實(shí)驗(yàn)涉及三個(gè)主要的步驟:(i)向細(xì)胞(特別是癌細(xì)胞)的樣品應(yīng)用處理，(ii)將細(xì)胞平板接種進(jìn)入組織培養(yǎng)容器中，以及(iii)使細(xì)胞生長。固定所產(chǎn)生的集落，染色，計(jì)數(shù)。如果單個(gè)腫瘤細(xì)胞定植(colonize)器官，對于轉(zhuǎn)移灶的形成，集落形成是重要的?？贵w的抑制作用表明其在抑制轉(zhuǎn)移灶之形成中的潛力。在產(chǎn)克隆試驗(yàn)中，具有抑制或降低集落形 成之活性的抗體特別可用于治療或預(yù)防癌細(xì)胞(特別是本文中提及的癌癥類型)的轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散。
[0050]在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體表現(xiàn)出針對帶有天然構(gòu)象CLDN6之細(xì)胞的一種或更多種免疫效應(yīng)功能，其中所述一種或更多種免疫效應(yīng)功能優(yōu)選地選自補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(⑶C)、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity, ADCC)、誘導(dǎo)凋亡、以及抑制增殖，優(yōu)選的效應(yīng)功能是ADCC和/或CDC。
[0051]優(yōu)選地，所述抗體表現(xiàn)出的一種或更多種活性或者一種或更多種免疫效應(yīng)功能是通過所述抗體與CLDN6相結(jié)合(優(yōu)選與位于CLDN6的胞外部分中的表位相結(jié)合)而誘導(dǎo)的，其中CLDN6的所述胞外部分優(yōu)選地包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:14和SEQID NO:15的任何一種氨基酸序列，優(yōu)選SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列，更優(yōu)選SEQ ID NO:6的氨基酸序列。 [0052]根據(jù)本發(fā)明，表達(dá)CLDN6的細(xì)胞優(yōu)選地以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征。表達(dá)CLDN6之細(xì)胞或者帶有天然構(gòu)象CLDN6之細(xì)胞優(yōu)選地是腫瘤細(xì)胞(例如，癌細(xì)胞)，優(yōu)選來自選自以下癌的癌細(xì)胞:卵巢癌(特別是卵巢腺癌和卵巢畸胎瘤)、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，特別是鱗狀細(xì)胞肺癌和腺癌)、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮膚癌(特別是基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌)、惡性黑色素瘤、頭頸癌(特別是惡性多形性腺瘤)、肉瘤(特別是滑膜肉瘤和癌肉瘤)、膽管癌、膀胱癌(特別是移行細(xì)胞癌和乳頭狀癌)、腎癌(特別是腎細(xì)胞癌，包括明細(xì)胞腎細(xì)胞癌和乳頭狀腎細(xì)胞癌)、結(jié)腸癌、小腸癌(包括回腸癌，特別是小腸腺癌和回腸腺癌)、睪丸胚胎性癌、胎盤絨毛膜癌、子宮頸癌、睪丸癌(特別是睪丸精原細(xì)胞瘤、睪丸畸胎瘤和胚胎性睪丸癌)、子宮癌、生殖細(xì)胞腫瘤(例如畸胎癌或胚胎性癌，特別是睪丸的生殖細(xì)胞腫瘤)、及其轉(zhuǎn)移形式。
[0053]本發(fā)明的抗體可以連接一個(gè)或更多個(gè)治療效應(yīng)部分(例如，放射性標(biāo)記物、細(xì)胞毒素、治療酶(therapeutic enzyme)、誘導(dǎo)凋亡的藥劑等)以提供祀向的細(xì)胞毒性(即，殺傷腫瘤細(xì)胞)。
[0054]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體(i)與表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征的細(xì)胞相結(jié)合，并且(ii)不與不表達(dá)CLDN6以及不以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征的細(xì)胞相結(jié)合。本發(fā)明的抗體優(yōu)選(i)介導(dǎo)殺傷表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征的細(xì)胞和/或抑制其增殖，并且(ii)不介導(dǎo)殺傷不表達(dá)CLDN6以及不以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征之細(xì)胞和/或不抑制其增殖。
[0055]在一些具體的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與存在于活細(xì)胞表面上的CLDN6天然表位(例如，SEQ ID NOs:6或7的表位)相結(jié)合。在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體對于表達(dá)CLDN6之癌細(xì)胞是特異性的，并且不與不表達(dá)CLDN6的癌細(xì)胞相結(jié)合。
[0056]本發(fā)明的抗體可源自不同的物種，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠和人。本發(fā)明的抗體還包括嵌合分子，其中源自一個(gè)物種(優(yōu)選人)的抗體恒定區(qū)與源自另一個(gè)物種的抗原結(jié)合位點(diǎn)組合。此外，本發(fā)明的抗體包括人源化分子，其中源自非人物種之抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)與人來源的恒定和框架區(qū)相組合。
[0057]本發(fā)明的抗體包括多克隆和單克隆抗體，并且包括IgG2a(例如，IgG2a、K、λ )、IgG2b (例如，IgG2b、K、λ)、IgG3(例如，IgG3、K、λ)和IgM抗體。然而，本發(fā)明還包括其他抗體同種型，包括IgGl、IgAU IgA2、分泌型IgA、IgD和IgE抗體。所述抗體可以是完整的抗體或者其抗原結(jié)合片段，包括例如Fab、F(ab' ) 2、Fv、單鏈Fv片段或雙特異性抗體。此外，所述抗原結(jié)合片段包括結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)，其包含(i)與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽融合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽(例如，重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū))，(ii)與鉸鏈區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)，以及(iii)與CH2恒定區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)。這樣的結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)還在US2003/0118592和US2003/0133939中公開。
[0058]本發(fā)明的抗體優(yōu)選地是單克隆抗體、嵌合抗體、人抗體或人源化抗體，或者抗體的片段。本發(fā)明的抗體包括完全人抗體?？稍诜侨宿D(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如，轉(zhuǎn)基因小鼠)中產(chǎn)生這樣的抗體，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物能夠通過進(jìn)行V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換產(chǎn)生抗CLDN6人單克隆抗體的多個(gè)同種型。這樣的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物還可以是用于產(chǎn)生多克隆抗體的轉(zhuǎn)基因兔(例如，公開于 US2003/0017534 中)。
[0059]本發(fā)明的抗體優(yōu)選地以約I~IOOnM或更低的解離平衡常數(shù)(KD)與CLDN6解離。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體不與相關(guān)的細(xì)胞表面抗原交叉反應(yīng)，并因而不抑制其功能。
[0060]在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以具有一個(gè)或更多個(gè)以下特性:
[0061]a)對CLDN6的特異性；
[0062]b)與CLDN6的結(jié)合親和力，約IOOnM或更低，優(yōu)選約5~IOnM或更低，以及更優(yōu)選約I~3nM或更低,
[0063]c)誘導(dǎo)細(xì)胞⑶C的能力，所述細(xì)胞表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征；
[0064]d)抑制細(xì)胞生長的能力，所述細(xì)胞表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征；
[0065]e)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力，所述細(xì)胞表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征；
[0066]f)誘導(dǎo)細(xì)胞同型黏著的能力，所述細(xì)胞表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征；
[0067]g)誘導(dǎo)細(xì)胞ADCC的能力，所述細(xì)胞表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征；
[0068]h)延遲具有腫瘤細(xì)胞之對象存活的能力，所述腫瘤細(xì)胞表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征；
[0069]i)耗竭細(xì)胞的能力，所述細(xì)胞表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征；
[0070]j)使CLDN6在活細(xì)胞表面聚集的能力。
[0071] 本文中所描述的優(yōu)選的抗體是由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的或可從其獲得的抗體，所述雜交瘤細(xì)胞保藏在DSMZ (Inhoffenstr.7B, 38124不倫瑞克(Braunschweig),德國)，并且具有以下命名和登記號之一:
[0072]1.GT512muMAB59A,登記號 DSM ACC3067，保藏于 2010 年 6 月 21 日；
[0073]2.GT512muMAB60A,登記號 DSM ACC3068，保藏于 2010 年 6 月 21 日；
[0074]3.GT512muMAB61D,登記號 DSM ACC3069，保藏于 2010 年 6 月 21 日；
[0075]4.GT512muMAB64A,登記號 DSM ACC3070，保藏于 2010 年 6 月 21 日；
[0076]5.GT512muMAB65A，登記號 DSM ACC3071，保藏于 2010 年 6 月 21 日；[0077]6.GT512muMAB66B,登記號 DSM ACC3072，保藏于 2010 年 6 月 21 日；
[0078]7.GT512muMAB67A,登記號 DSM ACC3073.保藏于 2010 年 6 月 21 日；
[0079]8.GT512muMAB55A,登記號 DSM ACC3089，保藏于 2010 年 8 月 31 日；或者
[0080]9.GT512muMAB89A,登記號 DSM ACC3090，保藏于 2010 年 8 月 31 日。
[0081]本文中通過參照抗體的命名和/或通過參照產(chǎn)生抗體的克隆來命名本發(fā)明的抗體,例如 muMAB59A。
[0082]另一些優(yōu)選的抗體具有由上述雜交瘤產(chǎn)生或可從其獲得之抗體特異性的抗體，并且特別是包含與由上述雜交瘤產(chǎn)生的或可從其獲得的抗體的抗原結(jié)合部分或抗原結(jié)合位點(diǎn)(特別是可變區(qū))相同或高度同源的抗體。優(yōu)選的抗體包括具有與由上述雜交瘤產(chǎn)生的或可從其獲得的抗體的CDR區(qū)相同或高度同源的抗體。對于“高度同源”，考慮在每個(gè)CDR區(qū)中進(jìn)行I至5 (優(yōu)選I至4，例如1至3或者I或2)個(gè)替換。特別優(yōu)選的抗體是由上述雜交瘤產(chǎn)生的或可從其獲得的抗體的嵌合化和人源化形式。
[0083]因此，本發(fā)明的抗體可選自:(i)由以如下登記號保藏的克隆產(chǎn)生的或可從其獲得的抗體:DSM ACC3067 (GT512muMAB59A), DSMACC3068 (GT512muMAB60A), DSMACC3069(GT512muMAB61D)、DSM ACC3070(GT512muMAB64A)、DSM ACC3071 (GT512muMAB65A)、DSM ACC30 7 2 (GT5 I 2muMAB66B) , DSM ACC3073 (GT5 I 2muMAB67A)、D SMACC3089 (GT512muMAB55A)或 DSM ACC3090 (GT512muMAB89A), (ii)抗體，其為(i)抗體的嵌合化或人源化形式，(iii)抗體，其具有(i)抗體的特異性，以及(iv)抗體，其包含(i)抗體的抗原結(jié)合部分或抗原結(jié)合位點(diǎn)。所述(i)抗體的抗原結(jié)合部分或抗原結(jié)合位點(diǎn)可包含(i)抗體的可變區(qū)。
[0084]本發(fā)明還涉及例如產(chǎn)生本文中所描述抗體的雜交瘤細(xì)胞。
[0085]優(yōu)選的雜交瘤細(xì)胞是保藏于DSMZ (Inhoffenstr.7B, 38124不倫瑞克，德國)的雜交瘤細(xì)胞，并且其具有以下命名和登記號之一:
[0086]1.GT512muMAB59A,登記號 DSM ACC3067，保藏于 2010 年 6 月 21 日；
[0087]2.GT512muMAB60A,登記號 DSM ACC3068，保藏于 2010 年 6 月 21 日；
[0088]3.GT512muMAB61D，登記號 DSMACC3069，保藏于 2010 年 6 月 21 日；
[0089]4.GT512muMAB64A,登記號 DSM ACC3070，保藏于 2010 年 6 月 21 日；
[0090]5.GT512muMAB65A，登記號 DSM ACC3071，保藏于 2010 年 6 月 21 日；
[0091]6.GT512muMAB66B，登記號 DSM ACC3072，保藏于 2010 年 6 月 21 日；
[0092]7.GT512muMAB67A,登記號 DSM ACC3073.保藏于 2010 年 6 月 21 日；
[0093]8.GT512muMAB55A,登記號 DSM ACC3089，保藏于 2010 年 8 月 31 日；或者
[0094]9.GT512muMAB89A,登記號 DSM ACC3090，保藏于 2010 年 8 月 31 日。
[0095]本發(fā)明的抗CLDN6抗體可以被衍生化，與其他結(jié)合特異性相連接或共表達(dá)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供至少包含一個(gè)對CLDN6的第一結(jié)合特異性(例如，抗CLDN6抗體或其擬似物)和對效應(yīng)細(xì)胞的第二結(jié)合特異性(例如，對Fe受體(例如，F(xiàn)e-Y受體(例如，F(xiàn)e-Y RI)或任何其他Fe受體)或者對T細(xì)胞受體(例如CD3)的結(jié)合特異性)的雙特異性或多特異性分子。
[0096]因此，本發(fā)明包括與CLDN6以及與Fe受體或T細(xì)胞受體(例如⑶3)結(jié)合的雙特異性和多特異性分子。Fe受體的實(shí)例是IgG受體、Fe- Y受體(Fe Y R)(例如，F(xiàn)e y RI (⑶64)、FcyRII(CD32)和FcyRIII(CD16))。還可靶向其他Fe受體(例如，IgA受體(例如，F(xiàn)caRI))。Fe受體優(yōu)選位于效應(yīng)細(xì)胞(例如,單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或活化的單個(gè)核細(xì)胞)的表面上。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述雙特異性和多特異性分子在不同于免疫球蛋白Fe (例如，IgG或IgA)之受體結(jié)合位點(diǎn)的位點(diǎn)與Fe受體結(jié)合。因此，所述雙特異性和多特異性分子的結(jié)合不被生理水平的免疫球蛋白所阻斷。
[0097]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明的抗CLDN6抗體被衍生化，與其他功能性分子(例如，其他肽或蛋白質(zhì)(例如，F(xiàn)ab'片段))相連接或共表達(dá)。例如，本發(fā)明的抗體可以與一個(gè)或更多個(gè)其他分子實(shí)體(例如，其他抗體(例如，以產(chǎn)生雙特異性或多特異性的抗體)、細(xì)胞毒素、細(xì)胞配體或抗原(例如，以產(chǎn)生免疫綴合物(例如，免疫毒素)))功能性地連接(例如，通過化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價(jià)締合等)。本發(fā)明的抗體可以與其他治療部分(例如，放射性同位素、小分子抗癌藥物、重組細(xì)胞因子或趨化因子)相連接。因此，本發(fā)明包括很多種抗體綴合物、雙特異性和多特異性分子以及融合蛋白質(zhì)，它們都與表達(dá)CLDN6的細(xì)胞和/或與以CLDN6與其細(xì)胞表面締合為特征的細(xì)胞相結(jié)合，并且它們可用于將其他分子靶向這樣的細(xì)胞。
[0098]一般來說，對于本發(fā)明的目的而言，術(shù)語“抗體”包括本文中所描述的所有抗體衍生物，例如抗體綴合物、雙特異性和多特異性分子、以及融合蛋白質(zhì)。
[0099]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明還考慮源自非免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)合CLDN6的蛋白質(zhì)，特別是單鏈蛋白質(zhì)。例如 Binz 等(2005) Nature Biotechnology23 (10):1257-1268(通過引用并入本文)中描述了這樣的結(jié)合蛋白以及用于對其進(jìn)行生產(chǎn)的方法。要理解的是，本文中給出的關(guān)于免疫球蛋白或源自免疫球蛋白之結(jié)合分子的教導(dǎo)還相應(yīng)地適用于源自非免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)合分子。特別是使用這樣的源自非免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)合分子可以阻斷表達(dá)所述靶標(biāo)并以所述靶標(biāo)與其細(xì)胞表面相締合為特征之細(xì)胞的CLDN6，并因而引起本文中公開的本發(fā)明抗體的治療作用，特別是本文中公開的抑制腫瘤細(xì)胞的一種或更多種活性，例如增殖。盡管不是強(qiáng)制性的，可以通過例如與抗體的Fe區(qū)融合而將抗體的效應(yīng)功能賦予這樣的非免疫球蛋白結(jié)合分子。
[0100]通過靶向細(xì)胞所表達(dá)的以及與細(xì)胞表面締合的CLDN6，本發(fā)明一般地包括疾病(特別是腫瘤疾病)的治療和/或診斷。這些方法提供對這樣的細(xì)胞的選擇性檢測和/或根除，因而使對不表達(dá)CLDN6以及不以CLDN6與其細(xì)胞表面締合為特征之正常細(xì)胞的不良作用最小化。用于治療或診斷的優(yōu)選疾病是其中涉及表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征的細(xì)胞的疾病(例如，腫瘤疾病)，特別是癌癥疾病，例如本文中描述的那些癌癥疾病。
[0101]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明抗體或抗體組合的組合物(例如，藥物和診斷組合物/試劑盒)。本發(fā)明的藥物組合物可包含可藥用載劑(carrier),并且可任選地包含一種或更多種輔料、穩(wěn)定劑等。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述組合物包含抗體的組合，所述抗體與獨(dú)特的表位結(jié)合或者具有獨(dú)特的功能特征(例如，誘導(dǎo)CDC和/或ADCC以及誘導(dǎo)凋亡)。在本發(fā)明的這一實(shí)施方案中，可組合使用抗體，例如作為包含兩種或更多種抗CLDN6單克隆抗體的藥物組合物而使用。例如，具有不同但互補(bǔ)活性的抗CLDN6抗體可以在單個(gè)治療中組合以達(dá)到期望的治療效果。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含與誘導(dǎo)凋亡的另一抗CLDN6抗體組合的介導(dǎo)⑶C的抗CLDN6抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含在效應(yīng)細(xì)胞存在下介導(dǎo)高度有效殺傷靶細(xì)胞的抗CLDN6抗體，其與抑制表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征之細(xì)胞生長的另一抗CLDN6抗體相組合。
[0102]本發(fā)明還包括同時(shí)或順序施用兩種或更多種本發(fā)明的抗CLDN6抗體，其中優(yōu)選至少一種所述抗體是嵌合的抗CLDN6抗體，并且至少一種其他抗體是人抗CLDN6抗體，所述抗體與相同或不同的CLDN6表位相結(jié)合。優(yōu)選地，首先施用本發(fā)明的嵌合CLDN6抗體，隨后施用本發(fā)明的人抗CLDN6抗體，其中優(yōu)選長時(shí)間(即，作為維持治療)施用所述人抗CLDN6抗體。 [0103]本發(fā)明的抗體、綴合物、雙特異性/多特異性分子和組合物可用于通過使細(xì)胞與有效量的抗體、綴合物、雙特異性/多特異性分子或組合物相接觸來抑制表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征之細(xì)胞的生長和/或選擇性殺傷表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征的細(xì)胞的多種方法，以抑制細(xì)胞的生長和/或殺傷細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括殺傷表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面締合為特征的細(xì)胞，任選地在效應(yīng)細(xì)胞存在下，例如通過CDC、凋亡、ADCC、吞噬作用或通過這些機(jī)制中的兩種或更多種的組合來進(jìn)行殺傷?？墒褂帽景l(fā)明的抗體抑制或殺傷的表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征的細(xì)胞包括癌細(xì)胞。
[0104]本發(fā)明的抗體、綴合物、雙特異性/多特異性分子和組合物可用于治療和/或預(yù)防多種與表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征之細(xì)胞相關(guān)的疾病，通過向遭受此類疾病的患者施用所述抗體來實(shí)現(xiàn)?？杀恢委?例如，改善)或預(yù)防的示例疾病包括但不限于腫瘤發(fā)生性疾病(tumorigenic disease)?？杀恢委熀?或預(yù)防的腫瘤發(fā)生性疾病的實(shí)例包括癌疾病，例如卵巢癌(特別是卵巢腺癌和卵巢畸胎癌)、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，特別是鱗狀細(xì)胞肺癌和腺癌)、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮膚癌(特別是基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌)、惡性黑色素瘤、頭頸癌(特別是惡性多形性腺瘤)、肉瘤(特別是滑膜肉瘤和癌肉瘤)、膽管癌、膀胱癌(特別是移行細(xì)胞癌和乳頭狀癌)、腎癌(特別是腎細(xì)胞癌，包括明細(xì)胞腎細(xì)胞癌和乳頭狀腎細(xì)胞癌)、結(jié)腸癌、小腸癌(包括回腸癌，特別是小腸腺癌和回腸腺癌)、睪丸胚胎性癌、胎盤絨毛膜癌、子宮頸癌、睪丸癌(特別是睪丸精原細(xì)胞瘤、睪丸畸胎瘤和胚胎性睪丸癌)、子宮癌、生殖細(xì)胞腫瘤(例如畸胎癌或胚胎性癌，特別是睪丸的生殖細(xì)胞腫瘤)、及其轉(zhuǎn)移形式。
[0105]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防與表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征之細(xì)胞相關(guān)的疾病或病癥的方法，其包括向?qū)ο笫┯帽景l(fā)明的抗體、綴合物、雙特異性/多特異性分子或組合物。優(yōu)選地，所述疾病或病癥是腫瘤相關(guān)的疾病，并且在一些具體的實(shí)施方案中，所述疾病或病癥選自:卵巢癌(特別是卵巢腺癌和卵巢畸胎癌)、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，特別是鱗狀細(xì)胞肺癌和腺癌)、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮膚癌(特別是基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌)、惡性黑色素瘤、頭頸癌(特別是惡性多形性腺瘤)、肉瘤(特別是滑膜肉瘤和癌肉瘤)、膽管癌、膀胱癌(特別是移行細(xì)胞癌和乳頭狀癌)、腎癌(特別是腎細(xì)胞癌，包括明細(xì)胞腎細(xì)胞癌和乳頭狀腎細(xì)胞癌)、結(jié)腸癌、小腸癌(包括回腸癌，特別是小腸腺癌和回腸腺癌)、睪丸胚胎性癌、胎盤絨毛膜癌、子宮頸癌、睪丸癌(特別是睪丸精原細(xì)胞瘤、睪丸畸胎瘤和胚胎性睪丸癌)、子宮癌、生殖細(xì)胞腫瘤(例如畸胎癌或胚胎性癌，特別是睪丸的生殖細(xì)胞腫瘤)、及其轉(zhuǎn)移形式。CLDN6優(yōu)選地表達(dá)于所述細(xì)胞的表面上。[0106]本發(fā)明可涉及使用本文中描述的藥劑和組合物用于腫瘤疾病的預(yù)防性和/或治療性治療，即用于治療患有腫瘤疾病或有腫瘤疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的患者。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于抑制腫瘤生長的方法，其包括施用一種或更多種本文中描述的藥劑和組合物。
[0107]優(yōu)選地，以這樣的方式施用本文中描述的藥劑和組合物，以使當(dāng)組織或器官(例如，胎盤組織或胎盤)沒有腫瘤時(shí)，即使其中的細(xì)胞表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征，治療活性物質(zhì)也不被遞送或基本不被遞送至所述組織或器官。為此，可局部施用本文中描述的藥劑和組合物。
[0108]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供本文中描述的抗體用于本文中描述的治療方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本文中描述的藥物組合物用于本文中描述的治療方法。
[0109]在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，另外用化療劑、輻射或者調(diào)節(jié)(例如，增強(qiáng)或抑制)Fe受體(例如，F(xiàn)c-Y受體)之表達(dá)或活性的藥劑(例如，細(xì)胞因子)治療施用了所述抗體的對象。在治療過程中用于施用的典型細(xì)胞因子包括粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-Y (IFN- Y )和腫瘤壞死因子(TNF)。除此之外，典型的治療劑還包括抗腫瘤劑，例如多柔比星、順鉬、泰素帝(taxotere)、5_氟尿嘧唳、甲氨蝶呤(methotrexat)、吉西他濱和環(huán)磷酰胺。
[0110]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及用人CLDN6或其肽片段免疫接種非人動(dòng)物(例如，小鼠)以獲得抗體的免疫策略。用于免疫接種的優(yōu)選的肽是選自SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:
7、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的肽，以及免疫等效肽。
[0111]可用CLDN6抗原或其肽片段和/或表達(dá)CLDN6或其肽片段的核酸和/或細(xì)胞的純化或富集的制備物免疫接種野生型以及轉(zhuǎn)基因的非人動(dòng)物。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物能夠通過進(jìn)行V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換產(chǎn)生多同種型的抗CLDN6的人單克隆抗體(例如，IgG、IgA和/或IgM)?？赏ㄟ^例如經(jīng)典的或非經(jīng)典的同種型轉(zhuǎn)換而發(fā)生同種型轉(zhuǎn)換。
[0112]因此，在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供來自上文中所描述的非人動(dòng)物中的分離的B細(xì)胞。可隨后通過與永生化細(xì)胞融合而使所述分離的B細(xì)胞永生化以提供本發(fā)明的抗體來源(例如,雜交瘤)。這樣的雜交瘤(即,其產(chǎn)生本發(fā)明的抗體)也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0113]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及用于診斷、檢測或監(jiān)控腫瘤疾病的方法，其包括使用本發(fā)明抗體檢測和/或測定從患者中分離的生物樣品中CLDN6的量或表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征之細(xì)胞的量。所述生物樣品可以從患有腫瘤疾病、懷疑患有或發(fā)生腫瘤疾病或者具有腫瘤疾病之潛力的患者中分離。
[0114]在根據(jù)本發(fā)明的用于診斷、檢測或監(jiān)控腫瘤疾病的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，生物樣品和/或?qū)φ?參比樣品來自與受腫瘤疾病所影響的要診斷、檢測或監(jiān)控的組織或器官相對應(yīng)的組織或器官，例如要診斷、檢測或監(jiān)控的腫瘤疾病是卵巢癌，則生物樣品和/或?qū)φ?參比樣品是卵巢組織。本文中描述了這樣的組織和器官，例如與不同的腫瘤疾病和癌癥一起描述。
[0115]在根據(jù)本發(fā)明的用于診斷、檢測或監(jiān)控腫瘤疾病的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物樣品來自這樣的組織或器官，當(dāng)所述組織或器官?zèng)]有腫瘤時(shí)，其中的細(xì)胞基本不表達(dá)CLDN6以及基本不以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征。優(yōu)選地，所述組織不是胎盤組織。
[0116]一般來說，相對于參比水平來比較生物樣品中靶分子的水平，其中與所述參比水平的偏差指示腫瘤疾病在對象中的存在和/或階段。所述參比水平可以是在對照樣品(例如，來自健康的組織或?qū)ο?中測定的水平或者來自健康對象的中位水平。與所述參比水平的“偏差”表示任何顯著改變，例如升高或降低至少10^^20%或30%，優(yōu)選至少40%或50%或者甚至更高。優(yōu)選地，在所述生物樣品中存在CLDN6或表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征的細(xì)胞或者所述生物樣品中CLDN6或表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征之細(xì)胞的量相對于參比水平升高指示腫瘤疾病的存在。
[0117]一般來說，本發(fā)明的方法中的檢測和/或定量涉及使用與靶分子特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體。
[0118]在一個(gè)具體的方面中，本發(fā)明涉及用于檢測腫瘤疾病(即，測定位置或位點(diǎn)(例如，具體的組織或器官))的方法，其包括向患者施用偶聯(lián)了可檢測標(biāo)記物的本發(fā)明抗體。在所述患者中標(biāo)記組織或器官可指示在所述組織或器官中存在腫瘤疾病或有發(fā)生腫瘤疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
[0119]如本文中示例的那樣，本發(fā)明的抗體可直接從表達(dá)抗體的雜交瘤獲得，或者可在宿主細(xì)胞(例如，CHO細(xì)胞或淋巴細(xì)胞)中克隆和重組表達(dá)。宿主細(xì)胞的其他實(shí)例是微生物(例如，大腸桿菌(E.coli))和真菌(例如，酵母)。或者，可在轉(zhuǎn)基因的非人動(dòng)物或植物中重組地產(chǎn)生它們。然而，本發(fā)明還考慮這樣的一些實(shí)施方案，其中通過使用本文中公開的免疫策略在患者中原位免疫或接種來產(chǎn)生抗體。
[0120]本發(fā)明還涉及核酸，所述核酸包含編碼本文中描述的抗體或其部分(例如，抗體鏈)的基因或核酸序列。所述核酸可包含于載體(vector)(例如，質(zhì)粒、黏粒、病毒、噬菌體或者例如常規(guī)地用于基因工程中的其他載體)中。所述載體可包含其他基因，例如標(biāo)志物基因，其允許在合適的宿主細(xì)胞和在合適的條件下選擇所述載體。此外，所述載體可包含表達(dá)控制元件，其允許在合適的宿主中適當(dāng)?shù)乇磉_(dá)編碼區(qū)。這樣的控制元件是技術(shù)人員已知的，并且可包括啟動(dòng)子、剪接盒(splice cassette)和翻譯起始密碼子。
[0121]優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸與上文中允許在真核或原核細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)控制序列可操作地連接。確保在真核或原核細(xì)胞中表達(dá)的控制元件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
[0122]用于構(gòu)建根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的方法，用于構(gòu)建包含上述核酸分子之載體的方法，用于將載體引入到合適地選擇的宿主細(xì)胞中的方法，用于引起或?qū)崿F(xiàn)表達(dá)的方法是現(xiàn)有技術(shù)中公知的。
[0123]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及包含本文中所公開的核酸或載體的宿主細(xì)胞。
[0124]通過以下的詳細(xì)描述和權(quán)利要求，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢將是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0125]圖1.CLDN3、CLDN4、CLDN6 和 CLDN9 的序列比對。
[0126]圖2.從經(jīng)免疫接種以產(chǎn)生CLDN6特異性抗體的小鼠中獲得的血清的免疫熒光分析。
[0127]⑷用抗CLDN6單克隆小鼠抗體(R&D Systems,MAB3656)探查分別以編碼人CLDN6和GFP的核酸共轉(zhuǎn)染的未固定的CHO-Kl細(xì)胞。CLDN6位于經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的質(zhì)膜，并且可在活細(xì)胞上被特異性抗體所靶向。(B)來自以其為基礎(chǔ)產(chǎn)生雜交瘤F3-6C3-H8的小鼠的血清含有與未固定的CHO-Kl細(xì)胞表面上的CLDN6相結(jié)合的抗體，所述CHO-Kl細(xì)胞是以編碼人CLDN6和GFP的核酸共轉(zhuǎn)染的。
[0128]圖3.用于測定HEK293T細(xì)胞中密蛋白之內(nèi)源性表達(dá)的Western印跡分析。
[0129]使用可商購的抗-CLDN3(A) (Invitrogen, Cat N0.34-1700)、抗-CLDN4 (A) (Zymed,32-9400)、抗-CLDN6(A) (ARP, 01-8865)和抗-CLDN9 (A) (Santa Cruz, sc-17672)抗體，通過Western印跡測試分別以編碼CLDN3、CLDN4、CLDN6和CLDN9的核酸轉(zhuǎn)染的或者模擬轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞的蛋白質(zhì)裂解液。所述抗體僅在各自的HEK293T轉(zhuǎn)化體中檢出與抗體對應(yīng)的靶標(biāo)的表達(dá)。在未轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞中，未觀察到這些密蛋白的任何內(nèi)源性表達(dá)。
[0130]圖4.用于測定可商購抗CLDN抗體之特異性的流式細(xì)胞術(shù)分析。通過流式細(xì)胞術(shù)測定可商購的抗CLDN抗體與分別轉(zhuǎn)染了編碼CLDN3、CLDN4、CLDN6和CLDN9之核酸的或者未轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞的結(jié)合。僅可商購的抗CLDN3抗體對其靶標(biāo)是特異性的。
[0131]圖5.用于測定根據(jù)本發(fā)明制備的抗CLDN抗體之特異性的流式細(xì)胞術(shù)分析。
[0132]通過流式細(xì)胞術(shù)測定來自單克隆的雜交瘤細(xì)胞亞克隆之上清液中的抗體與編碼CLDN6、CLDN3、CLDN4或CLDN9的載體和編碼熒光標(biāo)志物的載體共轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞的結(jié)
入
口 ο
[0133](A)來自單克隆的雜交瘤亞克隆F3-6C3-H8之上清液中的抗體與轉(zhuǎn)染了 CLDN6的細(xì)胞(但不與分別轉(zhuǎn)染了 CLDN3、CLDN4和CLDN9的細(xì)胞)特異性地結(jié)合。相反，來自單克隆的雜交瘤亞克隆F4-4F7-F2之上清液中的抗體與轉(zhuǎn)染了 CLDN6或CLDN9的細(xì)胞結(jié)合。來自單克隆雜交瘤亞克隆F3-6C3-H8之上清液中的抗體還與轉(zhuǎn)染了 CLDN6的(I143V)_SNP變體的細(xì)胞結(jié)合。
[0134](B)來自單克隆雜交瘤亞克隆F3-7B3-B4之上清液中的抗體與轉(zhuǎn)染了 CLDN6、CLDN3或CLDN9的細(xì)胞結(jié)合。來自單克隆雜交瘤亞克隆F3-3F7-A5之上清液中的抗體與轉(zhuǎn)染了 CLDN6、CLDN4或CLDN9的細(xì)胞結(jié)合。
[0135]圖6.抗 CLDN6 鼠單克隆抗體 muMAB59A、60A、61D、64A、65A、66B 和 67A 的結(jié)合特異性。
[0136]使用瞬時(shí)表達(dá)相應(yīng)的人密蛋白的HEK293T細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)分析抗CLDN6抗體與人CLDN6、3、4、9和CLDN6SNP (單核苷酸多態(tài)性)變體I143V的結(jié)合。與熒光標(biāo)志物共轉(zhuǎn)染HEK293T以區(qū)分未轉(zhuǎn)染的(Ql和Q3群)和轉(zhuǎn)染的(Q2和Q4群)細(xì)胞。所使用的抗體濃度是飽和結(jié)合CLDN6的濃度(25μ g/ml)。用抗人密蛋白-6 (R&D Systems, MAB3656)、人密蛋白-3(R&D Systems,MAB4620)和人密蛋白_4(R&D Systems,MAB4219)的可商購單克隆抗體確證人 CLDN6、3、4、9 和 CLDN6-SNP (I143V)的表達(dá)。
[0137]圖7.抗 CLDN6 鼠單克隆抗體 muMAB59A、60A、61D、64A、65A、66B 和 67A 的相對親和力。
[0138]通過流式細(xì)胞術(shù)分析抗CLDN6抗體與穩(wěn)定表達(dá)于HEK293細(xì)胞表面上的人CLDN6之結(jié)合以測定相對親和力。在飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，以抗體的濃度對FACS信號(熒光強(qiáng)度的中位值)作圖。通過非線性回歸計(jì)算EC50(在平衡時(shí)與一半的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的抗體濃度)。CLDN6特異性的抗體muMAB59A、60A、61D、64A、65A、66B和67A表現(xiàn)出非常低的EC50值(EC50200至500ng/ml)，并且在低濃度達(dá)到飽和結(jié)合。
[0139]圖8.抗 CLDN6 鼠單克隆抗體 muMAB59A、60A、61D、64A、65A、66B 和 67A 的補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(CDC)活性。[0140]使用檢測未裂解細(xì)胞中內(nèi)源性ATP的螢光素酶依賴的測定分析抗CLDN6抗體的CDC活性。因此，用不同濃度的muMAB59A、60A、61D、64A、65A、66B和67A處理穩(wěn)定表達(dá)人CLDN6 的 CHO-Kl 細(xì)胞。MuMAB59A、60A、61D、64A、65A、66B 和 67A 表現(xiàn)出劑量依賴的 CDC 活性，并在低濃度下誘導(dǎo)CDC。
[0141]圖9.抗CLDN6鼠單克隆抗體muMAB65A和66B對內(nèi)源性表達(dá)CLDN6之NEC8和NEC8LVTS254(CLDN6敲低(knock-down))細(xì)胞的補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(CDC)。
[0142]抗CLDN6抗體muMAB65A和66B以劑量依賴的方式誘導(dǎo)對NEC8細(xì)胞的CDC。通過使用NEC8LVTS254細(xì)胞(CLDN6敲低)證明muMAB65A和66B的靶標(biāo)特異性。 [0143]圖10.在使用植入腫瘤細(xì)胞系NEC8之小鼠的早期治療異種移植模型中，muMAB59A、60A、61D、64A、65A、66B和67A的治療作用。該模型使用無胸腺的Nude-Foxnlnu小鼠中的內(nèi)源性表達(dá)CLDN6的NEC8異種移植物。與鹽水對照組相比，在植入NEC8細(xì)胞的小鼠中，muMAB59A、60A、61D、64A、65A、66B和67A顯示出腫瘤生長抑制。
[0144]圖11.抗CLDN6嵌合單克隆抗體chimAB61D、64A、67A和89A的結(jié)合特異性。
[0145]使用穩(wěn)定表達(dá)相應(yīng)人密蛋白的HEK293細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)分別分析抗CLDN6抗體與人CLDN6、3、4和9的結(jié)合。所使用的抗體濃度是飽和結(jié)合的濃度(25 μ g/ml)。分別用可商購的抗人密蛋白-3 (R&D Systems,MAB4620)和人密蛋白_4(R&D Systems,MAB4219)的單克隆抗體以及CLDN6/9反應(yīng)性鼠單克隆抗體muMAB5F2D2確證人CLDN3、4、6和9的表達(dá)。在沒有一抗(primary antibody)的相同條件下進(jìn)行陰性對照。
[0146]圖12.抗 CLDN6 嵌合單克隆抗體 chimAB61D、64A、67A 和 89A 與 HEK293-CLDN6 細(xì)胞的相對親和力。
[0147]通過流式細(xì)胞術(shù)分析抗CLDN6抗體與HEK293細(xì)胞表面上穩(wěn)定表達(dá)的人CLDN6的結(jié)合以測定相對親和力。在飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，將抗體的濃度相對于FACS信號(熒光強(qiáng)度的中位值)作圖。通過非線性回歸計(jì)算EC50(在平衡時(shí)與一半的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的抗體濃度)。CLDN6特異性的抗體chimAB64A和89A表現(xiàn)出非常低的EC50值(EC50 450~600ng/ml)，并且在低濃度達(dá)到飽和結(jié)合。ChimAB67A和61D分別顯示低的(EC501000ng/ml)和中等的(EC502300ng/ml)EC50 值。
[0148]圖13.抗CLDN6嵌合單克隆抗體chimAB61D、64A、67A和89A對NEC8細(xì)胞的相對親和力。
[0149]為測定抗CLDN6抗體與內(nèi)源性表達(dá)人CLDN6之腫瘤細(xì)胞的結(jié)合親和力，通過流式細(xì)胞術(shù)分析所述抗體與睪丸癌細(xì)胞系NEC8的結(jié)合。CLDN6特異性抗體chimAB64A和89A表現(xiàn)出非常低的EC50值(EC50 600~650ng/ml)，并且在低濃度下達(dá)到飽和結(jié)合，而chimAB61D 和 67A 分別表現(xiàn)出中等的(EC50 1700ng/ml)和高的(EC50 6100ng/ml) EC50 值。
[0150]圖14.抗CLDN6嵌合單克隆抗體chimAB61D、64A、67A和89A對0V90細(xì)胞的相對親和力。
[0151]為測定抗CLDN6抗體與內(nèi)源性表達(dá)人CLDN6之腫瘤細(xì)胞的結(jié)合親和力，通過流式細(xì)胞術(shù)分析所述抗體與卵巢癌細(xì)胞系0V90的結(jié)合。CLDN6特異性抗體chimAB64A和89A表現(xiàn)出非常低的EC50值(EC50 550~600ng/ml)，并且在低濃度下達(dá)到飽和結(jié)合。ChimAB61D和 67A 顯示中等的 EC50 值(分別為 EC50 1500ng/ml 和 EC50 2300ng/ml)。
[0152]圖15.抗CLDN6嵌合單克隆抗體chimAB61D、64A、67A和89A對NEC8野生型和NEC8敲低細(xì)胞的補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(CDC)活性。
[0153]使用檢測未裂解細(xì)胞中內(nèi)源性ATP的螢光素酶依賴的測定分析抗CLDN6抗體的⑶C活性。因此，用不同濃度的chimAB61D、64A、67A和89A處理異位表達(dá)螢光素酶的NEC8野生型細(xì)胞(NEC8LVTS277)。在NEC-8細(xì)胞上，chimAB61D、64A、67A和89A以劑量依賴的方式表現(xiàn)出CDC活性，而在NEC-8CLDN6敲低細(xì)胞(NEC8LVTS254)中，這些抗體都沒有誘導(dǎo)非特異性的細(xì)胞裂解。該結(jié)果證明了 chimAB61D、64A、67A和89A的靶標(biāo)特異性效應(yīng)功能。
[0154]圖16.抗CLDN6嵌合單克隆抗體chimAB61D、64A、67A和89A對NEC8野生型和NEC8敲低細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒作用(ADCC)活性。
[0155]使用檢測未裂解細(xì)胞中內(nèi)源性ATP的螢光素依賴的測定分析抗CLDN6抗體的ADCC活性。因此，用不同濃度的chimAB61D、64A、67A和89A處理NEC-8野生型細(xì)胞(NEC8LVTS277)。ChimAB61D、64A、67A和89A表現(xiàn)出劑量依賴的ADCC活性，并且甚至在低抗體濃度下誘導(dǎo)ADCC。為了證明靶標(biāo)特異性，使用了具有穩(wěn)定CLDN6敲低的NEC8細(xì)胞(NEC8LVTS254)。
[0156]圖17.在使用植入腫瘤細(xì)胞系NEC8之小鼠的早期治療異種移植模型中抗CLDN6鼠單克隆抗體muMAB61D、64A和67A的治療性長期作用。
[0157]該模型使用無胸腺的Nude-Foxnlnu小鼠中的內(nèi)源性表達(dá)CLDN6的NEC8異種移植物。用CLDN6特異性的抗體治療小鼠46天。治療之后，監(jiān)控腫瘤生長60天。即便是在終止免疫治療之后，用鼠單抗muMAB61D、64A和67A治療的小鼠沒有顯示出任何腫瘤生長。
[0158]圖18.在使用植入腫瘤細(xì)胞系NEC8之小鼠的早期治療異種移植模型中抗CLDN6鼠單克隆抗體muMAB89A的治療性作用。
[0159]該模型使用無胸腺的Nude-Foxnlnu小鼠中的內(nèi)源性表達(dá)CLDN6的NEC8異種移植物。散點(diǎn)表示無胸腺的Nude-Foxnlnu小鼠中NEC8異種移植物的早期治療過程中不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)所植入腫瘤的體積。與鹽水對照組相比，muMAB89A在植入NEC8細(xì)胞的小鼠中顯示出腫瘤生長抑制(A)。分別用PBS (作為對照)和CLDN6特異性抗體治療小鼠47天。再監(jiān)控腫瘤生長51天。在研究結(jié)束時(shí)，與PBS對照相比，在以muMAB89A治療的小鼠中沒有可檢出的腫瘤⑶。
[0160]圖19.在使用植入腫瘤細(xì)胞系NEC8之小鼠的晚期治療異種移植模型中抗CLDN6鼠單克隆抗體muMAB64A的治療性作用。
[0161]散點(diǎn)表示無胸腺的Nude-Foxn Inu小鼠中NEC8異種移植物的晚期治療過程中不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)所植入腫瘤的體積。與抗體和鹽水對照組相比，用鼠單克隆抗CLDN6抗體muMAB64A的免疫治療顯示對實(shí)體NEC8異種移植物之腫瘤生長的抑制。
[0162]圖20.在使用植入腫瘤細(xì)胞系NEC8之小鼠的晚期治療異種移植模型中抗CLDN6鼠單克隆抗體muMAB64A的治療性長期作用。
[0163]植入15天之后，用CLDN6特異性抗體muMAB64A治療小鼠45天。再監(jiān)控腫瘤生長49天(A)。存活圖顯示用CLDN6特異性抗體muMAB64A治療之小鼠的存活延長(B)。
[0164]圖21.在使用植入腫瘤細(xì)胞系NEC8之小鼠的晚期治療異種移植模型中，抗CLDN6鼠單克隆抗體muMAB61D、67A和89A的治療性作用。散點(diǎn)表示晚期NEC8異種移植物的治療過程中不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)所植入NEC8腫瘤的體積。與鹽水和抗體對照組相比，用鼠單克隆抗CLDN6抗體muMAB61D、67A和89A實(shí)現(xiàn)了對腫瘤生長的抑制。[0165]圖22.在使用植入腫瘤細(xì)胞系NEC8之小鼠的晚期治療異種移植模型中，抗CLDN6鼠單克隆抗體muMAB61D、67A和89A的治療性長期作用。
[0166]植入之后17天，用CLDN6特異性抗體muMAB61D、67A和89A治療小鼠42天。再監(jiān)控腫瘤生長49天(A)。存活圖顯示用CLDN6特異性抗體muMAB61D和67A治療之小鼠的存活延長(B)。
[0167]圖23.在使用植入腫瘤細(xì)胞系NEC8野生型和具有穩(wěn)定CLDN6敲低的NEC8細(xì)胞之小鼠的晚期治療異種移植模型中抗CLDN6鼠單克隆抗體muMAB64A和89A的治療性作用。
[0168]MuMAB64A和89A僅在植入NEC8野生型而非植入NEC8CLDN6敲低細(xì)胞之小鼠中顯示治療性作用，這證明了抗體的體內(nèi)靶標(biāo)特異性。
[0169]圖24.chimMAB61D、64A、67A和89A的高分辨率表位作圖。
[0170]丙氨酸突變體被命名為“野生型殘基號丙氨酸”或在野生型丙氨酸的情況下命名為“野生型殘基號甘氨酸”，其中以單個(gè)字母的代碼給出氨基酸。CLDN6的第一細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸F35、G37、S39以及可能的T33對于與CLDN6特異性嵌合抗體chimAB61D、64A、67A和89A的相互作用是重要的。殘基140對于chimAB89A的結(jié)合是至關(guān)重要的，并且它有助于chimAB61D和67A的結(jié)合。此外，CLDN6的第二細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的L151有助于與chimAB67A的相互作用。盡管免疫熒光實(shí)驗(yàn)確證了 CLDN6突變體P28A、W30A、G49A、L50A、W51A、C54A和C64A的表達(dá)，但它們沒有顯示膜染色。因此，我們不能排除我們的抗體與這些氨基酸的相互作用。總之，在此定義的表位與我們使用CLDN6的ECl結(jié)構(gòu)域之DNA和肽的免疫策略相一致。
[0171]圖25.本發(fā)明的CLDN6特異性抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列的比對。以方框描畫出CDR 序列(HCDR1、HCDR2 和 HCDR3)的輪廓。
[0172]圖26.本發(fā)明的CLDN6特異性抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的比對。以方框描畫出CDR 序列(LCDR1、LCDR2 和 LCDR3)的輪廓。
[0173]圖27.抗 CLDN6 嵌合單克隆抗體 chimAB64A、mAb206_LCC、mAb206-SUBG 和mAb206-SUBS的結(jié)合特異性。
[0174]使用分別經(jīng)人CLDN6、3、4和9瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞通過流式細(xì)胞術(shù)分析抗CLDN6的結(jié)合特異性。為了區(qū)分轉(zhuǎn)染的與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞群體，用熒光標(biāo)志物作為報(bào)道分子共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。所使用的抗體濃度是飽和結(jié)合的濃度(100 μ g/ml)。分別用可商購的抗人密蛋白-3(R&D Systems, MAB4620)和抗人密蛋白-4(R&D Systems, MAB4219)的單克隆抗體以及CLDN6/9反應(yīng)性鼠單克隆抗體muMAB5F2D2確證人CLDN3、4、6和9的表達(dá)。嵌合單克隆抗體 chimAB64A、mAb206-LCC、mAb206-SUBG 和 mAb206_SUBS 分別顯示出與 CLDN6 結(jié)合而不與CLDN3、4和9相互作用。
[0175]圖28.抗 CLDN6 嵌合單克隆抗體 chimAB64A、mAb206_LCC、mAb206-SUBG 和mAb206-SUBS對HEK293-CLDN6細(xì)胞的相對結(jié)合親和力。
[0176]通過流式細(xì)胞術(shù)分析抗CLDN6抗體與在HEK293細(xì)胞表面上穩(wěn)定表達(dá)的人CLDN6的結(jié)合以測定相對親和力。在飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，以抗體的濃度對FACS信號(熒光強(qiáng)度的中位值)作圖。通過非線性回歸計(jì)算EC50(在平衡時(shí)與一半的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的抗體濃度)。CLDN6特異性抗體表現(xiàn)出類似低的EC50值，并且在低濃度達(dá)到飽和結(jié)合。
[0177]圖29.抗 CLDN6 嵌合單克隆抗體 chimAB64A、mAb206_LCC、mAb206-SUBG 和mAb206-SUBS對NEC8細(xì)胞的相對結(jié)合親和力。
[0178]為測定抗CLDN6抗體與內(nèi)源性表達(dá)人CLDN6之腫瘤細(xì)胞的結(jié)合親和力，通過流式細(xì)胞術(shù)分析所述抗體與睪丸癌細(xì)胞系NEC8的結(jié)合。與CLDN6特異性抗體chimAB64A、mAb206-SUBG和mAb206_SUBS相比，輕鏈組合變體mAb206_LCC對NEC8細(xì)胞顯示出三倍更強(qiáng)的結(jié)合親和力。在所有的情況下，在低濃度達(dá)到飽和結(jié)合。
[0179]圖30.抗 CLDN6 嵌合單克隆抗體 chimA B64A、mAb206_LCC、mAb206-SUBG 和mAb206-SUBS對0V90細(xì)胞的相對結(jié)合親和力。
[0180]通過流式細(xì)胞術(shù)分析抗CLDN6抗體與人卵巢癌細(xì)胞系0V90的結(jié)合親和力。CLDN6特異性抗體表現(xiàn)出類似低的EC50值。輕鏈組合變體mAb206-LCC顯示出與0V90細(xì)胞最強(qiáng)
的結(jié)合。
[0181]圖31a.抗 CLDN6 嵌合單克隆抗體 chimAB64A、mAb206-LCC 和 mAb206-SUBG 對 NEC8野生型細(xì)胞和NEC8敲低細(xì)胞的補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(CDC)活性。
[0182]使用檢測未裂解細(xì)胞中內(nèi)源性ATP的螢光素酶依賴的測定分析抗CLDN6抗體的CDC活性。因此，用不同濃度的chimAB64A、mAb206-LCC和mAb206_SUBG處理異位表達(dá)螢光素酶的NEC8野生型細(xì)胞。在NEC-8細(xì)胞中，抗體以劑量依賴的方式表現(xiàn)出CDC活性，而在NEC-8CLDN6敲低細(xì)胞中，這些抗體都沒有誘導(dǎo)非特異性的細(xì)胞裂解。該結(jié)果證明了chimAB64A、mAb206-LCC和mAb206_SUBG的靶標(biāo)特異性效應(yīng)功能。
[0183]圖31b.抗 CLDN6 嵌合單克隆抗體 chimAB64A、mAb206_LCC、mAb206-SUBG 和mAb206-SUBS對NEC8細(xì)胞的補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(OTC)活性。
[0184]抗體以劑量依賴的方式表現(xiàn)出⑶C活性。與chimAB64A相比，氨基酸替換變體mAb206-SUBG和mAb206_SUBS對NEC8細(xì)胞顯示出類似的CDC。
[0185]圖32a.抗 CLDN6 嵌合單克隆抗體 chimAB64A、mAb206_LCC、mAb206-SUBG 和mAb206-SUBS對NEC8和0V90細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒作用(ADCC)活性。
[0186]使用檢測未裂解細(xì)胞中內(nèi)源性ATP的螢光素酶依賴的測定分析抗CLDN6抗體的ADCC活性。因此，用不同濃度的抗CLDN6的嵌合抗體處理NEC8和0V90細(xì)胞。所有的抗體在兩種腫瘤細(xì)胞系中顯示出劑量依賴性ADCC活性并且甚至在低抗體濃度下誘導(dǎo)ADCC。
[0187]圖32b.抗 CLDN6 嵌合單克隆抗體 chimAB64A、mAb206-LCC 和 mAb206_SUBG 對 NEC8野生型和NEC8敲低細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒作用(ADCC)活性。
[0188]為了證明靶標(biāo)特異性，使用了具有穩(wěn)定CLDN6敲低的NEC8細(xì)胞。
[0189]圖33.在使用植入腫瘤細(xì)胞系NEC8之小鼠的晚期治療異種移植模型中抗CLDN6嵌合單克隆抗體mAb206-LCC、mAb206-SUBG和mAb206_SUBS的治療作用。
[0190]模型使用了無胸腺Nude-Foxnlnu小鼠中的NEC8異種移植物。植入17天之后,用CLDN6特異性抗體mAb206-LCC、mAb206-SUBG和mAb206_SUBS治療小鼠并監(jiān)控腫瘤生長。散點(diǎn)表示小鼠中NEC8異種移植物的晚期治療過程中不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)所植入腫瘤的體積。與抗體對照組相比，嵌合單克隆抗CLDN6抗體mAb206-LCC、mAb206-SUBG和mAb206_SUBS顯示出腫瘤生長的抑制。
[0191]圖34.在使用植入腫瘤細(xì)胞系NEC8之小鼠的晚期治療異種移植模型中抗CLDN6嵌合單克隆抗體mAb206-LCC、mAb206-SUBG和mAb206_SUBS的治療作用。
[0192]與圖33相比，生 長曲線更詳細(xì)地顯示出，嵌合單克隆抗CLDN6抗體能夠抑制腫瘤生長(A)。存活圖顯示用CLDN6特異性抗體治療之小鼠的存活延長(B)。
[0193]圖 35.chimAB64A、mAb206_LCC、mAb206_SUBG 和 mAb206_SUBS 的高分辨率表位作圖。
[0194]丙氨酸突變體被命名為“野生型殘基號丙氨酸(wildtype residue numberalanine) ”，其中以單個(gè)字母的代碼給出氨基酸。CLDN6的第一細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸F35、G37、S39以及可能的T33對于與CLDN6特異性嵌合抗體的相互作用是重要的。chimAB64A、mAb206-LCC、mAb206-SUBG 和 mAb206_SUBS 顯示出相同的結(jié)合形式。
[0195]圖36.在使用植入腫瘤細(xì)胞系NEC8之小鼠的轉(zhuǎn)移異種移植模型中抗CLDN6鼠單克隆抗體muMAB64A的治療作用。
[0196]在轉(zhuǎn)移模型中將NEC8細(xì)胞注入無胸腺Nude-Foxnlnu小鼠尾靜脈中。植入3天之后，用CLDN6特異性抗體muMAB64A治療小鼠。8周之后制備肺并且通過PCR分析腫瘤負(fù)荷。與PBS對照組相比，鼠單克隆抗CLDN6抗體muMAB64A顯示出抑制腫瘤生長。
[0197]圖37.使用單克隆抗體chimAB64A、mAb206_LCC和mAb206_SUBG對人癌組織和正常組織的免疫組織化學(xué)染色。
[0198]與正常組織相比，在來自卵巢癌和睪丸癌的組織切片上觀察到強(qiáng)的均勻的染色。檢測了惡性上皮細(xì)胞群體的非常強(qiáng)的膜染色，而鄰近的基質(zhì)上皮細(xì)胞和非惡性上皮細(xì)胞未被染色。這些結(jié)果清楚地顯示出，我們的CLDN6特異性抗體與來源于腫瘤患者的惡性細(xì)胞特異性結(jié)合。(解釋:被抗體染色的組織數(shù)目/被分析組織的數(shù)目)。
[0199]術(shù)語的定義
[0200]為了使本發(fā)明可被更容易地理解，首先定義了某些術(shù)語。在整個(gè)詳細(xì)描述中闡述另一些定義。
[0201]在整個(gè)本說明書和所附的權(quán)利要求書中，除非上下文中另外要求，詞語“包括/包含(comprise) ”以及變化形式將被理解為意指包括所陳述的數(shù)目、整數(shù)或步驟或者數(shù)目、整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其他數(shù)目、整數(shù)或步驟或者數(shù)目、整數(shù)或步驟的組。除非本文中另外指明或者與上下文明確地相矛盾，描述本發(fā)明的上下文中(尤其是在權(quán)利要求書的上下文中)使用的沒有數(shù)量詞修飾的名詞要解釋為一個(gè)/種或更多個(gè)/種。本文中數(shù)值的引用范圍僅是意在充當(dāng)單獨(dú)參照落入該范圍的每個(gè)分別的數(shù)值的快捷方法。除非本文中另外指明，每個(gè)單獨(dú)的值均如同其在本文中被單獨(dú)引用而被并入本說明書。除非本文中另外指明或者與上下文明確地相矛盾，可以以任何合適的順序進(jìn)行本文中所描述的所有方法。除非另外要求，本文中提供的任何和全部實(shí)施例或示例性語言(例如，“例如”)的使用僅意在更好地舉例說明本發(fā)明，并不對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本說明書中沒有應(yīng)當(dāng)被解釋為表明對實(shí)施本發(fā)明至關(guān)重要的任何不要求保護(hù)之要素的語言。
[0202]密蛋白是一個(gè)蛋白質(zhì)家族，是緊密連接的最重要組分，所述緊密連接建立控制上皮細(xì)胞之間的胞間空間中的分子流的細(xì)胞旁屏障(paracellular barrier)。密蛋白是4次跨膜的跨膜蛋白質(zhì)，其N端和C端均位于胞質(zhì)中。第一細(xì)胞外環(huán)由平均53個(gè)氨基酸組成，而第二細(xì)胞外環(huán)由約24個(gè)氨基酸組成。CLDN6和CLDN9是CLDN家族中最相似的成員。
[0203]本文中使用的術(shù)語“CLDN”意為密蛋白，并且包括CLDN6、CLDN9、CLDN4和CLDN3。優(yōu)選地，CLDN是人CLDN。
[0204]術(shù)語“CLDN6”優(yōu)選地表示人CLDN6，并且特別是表示(i)核酸，其包含編碼SEQ IDNO:2之氨基酸序列或編碼SEQ ID NO:8之氨基酸序列的核酸序列，例如，包含SEQ ID NO:1之核酸序列的核酸，或者(ii)蛋白質(zhì)，其包含SEQ ID NO:2之氨基酸序列或包含SEQ IDNO:8之氨基酸序列。CLDN6的第一細(xì)胞外環(huán)優(yōu)選地包含SEQ ID NO:2中所示或SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的氨基酸28至80，更優(yōu)選氨基酸28至76，例如，SEQ ID NO: 7中所示的氨基酸序列。CLDN6的第二細(xì)胞外環(huán)優(yōu)選地包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列或SEQ IDNO:8中所示氨基酸序列的氨基酸138至160，優(yōu)選氨基酸141至159，更優(yōu)選氨基酸145至157，例如SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列。所述第一和第二細(xì)胞外環(huán)優(yōu)選地形成CLDN6的胞外部分。 [0205]術(shù)語“CLDN9”優(yōu)選地表示人CLDN9，并且特別是表示(i)核酸，其包含編碼SEQ IDNO:9之氨基酸序列的核酸序列，或者(ii)蛋白質(zhì)，其包含SEQ ID NO:9之氨基酸序列。CLDN9的第一細(xì)胞外環(huán)優(yōu)選地包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列的氨基酸28至76XLDN9的第二細(xì)胞外環(huán)優(yōu)選地包含SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列的氨基酸141至159。所述第一和第二細(xì)胞外環(huán)優(yōu)選地形成CLDN9的胞外部分。
[0206]術(shù)語“CLDN4”優(yōu)選地表示人CLDN4，并且特別是表示(i)核酸，其包含編碼SEQ IDNO: 10之氨基酸序列的核酸序列，或者(ii)蛋白質(zhì)，其包含SEQ ID NO: 10之氨基酸序列。CLDN4的第一細(xì)胞外環(huán)優(yōu)選地包含SEQ ID NO: 10中所示氨基酸序列的氨基酸28至76。CLDN4的第二細(xì)胞外環(huán)優(yōu)選地包含SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列的氨基酸141至159。所述第一和第二細(xì)胞外環(huán)優(yōu)選地形成CLDN4的胞外部分。
[0207]術(shù)語“CLDN3”優(yōu)選地表示人CLDN3，并且特別是表示(i)核酸，其包含編碼SEQ IDNO: 11之氨基酸序列的核酸序列，或者(ii)蛋白質(zhì)，其包含SEQ ID NO:11之氨基酸序列。CLDN3的第一細(xì)胞外環(huán)優(yōu)選地包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的氨基酸27至75。CLDN3的第二細(xì)胞外環(huán)優(yōu)選地包含SEQ ID NO:11中所示氨基酸序列的氨基酸140至158。所述第一和第二細(xì)胞外環(huán)優(yōu)選地形成CLDN3的胞外部分。
[0208]上文中描述的CLDN序列包括所述序列的任何變體，特別是突變體，剪接變體，構(gòu)象，同種型，等位基因變體，物種變體和物種同源物，特別是天然存在的變體。等位基因變體表示基因正常序列的改變，其重要性通常是不清楚的。完整的基因序列通常鑒定出給定基因的很多等位基因變體。物種同源物是給定核酸或氨基酸序列的具有不同物種來源的核酸或氨基酸序列。術(shù)語“CLDN”應(yīng)包括(i) CLDN剪接變體，(ii) CLDN轉(zhuǎn)錄后修飾變體，特別是包括具有不同糖基化(例如，N-糖基化狀態(tài))的變體，(iii) CLDN構(gòu)象變體，(iv) CLDN癌相關(guān)的和CLDN非癌相關(guān)的變體。優(yōu)選地，CLDN以其天然構(gòu)象存在。
[0209]已發(fā)現(xiàn)CLDN6表達(dá)于例如卵巢癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮膚癌、黑色素瘤、頭頸癌、肉瘤、膽管癌、腎細(xì)胞癌和膀胱癌。CLDN6是特別優(yōu)選的靶標(biāo)，用于預(yù)防和/或治療卵巢癌(特別是卵巢腺癌和卵巢畸胎癌)、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，特別是鱗狀細(xì)胞肺癌和腺癌)、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮膚癌(特別是基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌)、惡性黑色素瘤、頭頸癌(特別是惡性多形性腺瘤)、肉瘤(特別是滑膜肉瘤和癌肉瘤)、膽管癌、膀胱癌(特別是移行細(xì)胞癌和乳頭狀癌)、腎癌(特別是腎細(xì)胞癌，包括明細(xì)胞腎細(xì)胞癌和乳頭狀腎細(xì)胞癌)、結(jié)腸癌、小腸癌(包括回腸癌，特別是小腸腺癌和回腸腺癌)、睪丸胚胎性癌、胎盤絨毛膜癌、子宮頸癌、睪丸癌(特別是睪丸精原細(xì)胞瘤、睪丸畸胎瘤和胚胎性睪丸癌)、子宮癌、生殖細(xì)胞腫瘤(例如畸胎癌或胚胎性癌，特別是睪丸的生殖細(xì)胞腫瘤)、及其轉(zhuǎn)移形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，與CLDN6表達(dá)相關(guān)的癌疾病選自卵巢癌、肺癌、轉(zhuǎn)移性卵巢癌和轉(zhuǎn)移性肺癌。優(yōu)選地，所述卵巢癌是癌或腺癌。優(yōu)選地，所述肺癌是癌或腺癌，并且優(yōu)選地是細(xì)支氣管癌，例如細(xì)支氣管癌或細(xì)支氣管腺癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述與CLDN6表達(dá)相關(guān)的腫瘤細(xì)胞是此類癌的細(xì)胞。
[0210]術(shù)語“部分(portion) ”是指級分(fraction)。對于具體結(jié)構(gòu)(例如氨基酸序列或蛋白質(zhì))，術(shù)語其“部分”可表示所述結(jié)構(gòu)的連續(xù)或不連續(xù)級分。優(yōu)選地，氨基酸序列的部分包含所述氨基酸序列之氨基酸的至少I %、至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、優(yōu)選至少40 %、優(yōu)選至少50 %、更優(yōu)選至少60 %、更優(yōu)選至少70 %、甚至更優(yōu)選至少80 %以及最優(yōu)選至少90%。優(yōu)選地，如果所述部分是不連續(xù)的級分，所述不連續(xù)級分是由結(jié)構(gòu)的2、
3、4、5、6、7、8或更多個(gè)部分構(gòu)成，每個(gè)部分是連續(xù)的結(jié)構(gòu)元件。例如，氨基酸序列的不連續(xù)級分可由所述氨基酸序列的2、3、4、5、6、7、8或更多個(gè)(優(yōu)選不超過4個(gè))部分構(gòu)成，其中每個(gè)部分優(yōu)選地包含所述氨基酸序列的至少5個(gè)連續(xù)的氨基酸、至少10個(gè)連續(xù)的氨基酸、優(yōu)選至少20個(gè)連續(xù)的氨基酸、優(yōu)選至少30個(gè)連續(xù)的氨基酸。
[0211]術(shù)語“部分(part) ”和“片段(fragment) ”在本文中可互換使用，并且是指連續(xù)的元件。例如，結(jié)構(gòu)(例如氨基酸序列或蛋白質(zhì))的部分是指所述結(jié)構(gòu)的連續(xù)元件。結(jié)構(gòu)的部分(portion)、部分(part)或片段(fragment)優(yōu)選地包含所述結(jié)構(gòu)的一個(gè)或更多個(gè)功能特征。例如，表位或肽的部分(portion)、部分(part)或片段(fragment)優(yōu)選地與從其來源的表位或肽免疫等效。
[0212]在本發(fā)明的情況下，術(shù)語“CLDN的胞外部分”是指CLDN朝向細(xì)胞外空間的部分，并優(yōu)選地可從所述細(xì)胞的外側(cè)接近，例如通過位于細(xì)胞外的抗體而接近。優(yōu)選地，該術(shù)語是指CLDN的一個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞外環(huán)或其部分或者任何其他胞外部分(所述其他胞外部分優(yōu)選地是對所述CLDN特異性的)。優(yōu)選地，所述部分包含至少5、至少8、至少10、至少15、至少20、至少30或至少50個(gè)或者更多個(gè)氨基酸。
[0213]術(shù)語“與細(xì)胞表面相締合的CLDN”被理解為表示天然的CLDN，即非變性的、優(yōu)選天然折疊狀態(tài)的CLDN。優(yōu)選地，術(shù)語“與細(xì)胞表面相締合的CLDN”意為CLDN與所述細(xì)胞的質(zhì)膜相締合并位于所述質(zhì)膜，其中CLDN的至少一部分(優(yōu)選胞外部分)朝向所述細(xì)胞的細(xì)胞外空間，并且可從所述細(xì)胞的外側(cè)接近，例如通過位于細(xì)胞外的抗體接近。所述締合可以是直接或間接的。例如，所述締合可以是通過一個(gè)或更多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、一個(gè)或更多個(gè)脂質(zhì)錨，和/或通過與見于細(xì)胞質(zhì)膜外小葉(outer leaflet)的任何其他蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖或其他結(jié)構(gòu)的相互作用。例如，與細(xì)胞表面締合的CLDN可以是具有胞外部分的跨膜蛋白質(zhì)(SP，整合膜蛋白)或者可以是通過與其他蛋白質(zhì)(其為跨膜蛋白質(zhì))相互作用而與細(xì)胞表面相締合的蛋白質(zhì)。
[0214]如果CLDN6位于所述細(xì)胞的表面并且可被添加至細(xì)胞的CLDN6特異性的抗體接近并結(jié)合，則CLDN6與細(xì)胞表面相締合。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征的細(xì)胞是表達(dá)CLDN6的細(xì)胞。要理解的是，在細(xì)胞表達(dá)CLDN6的情況下，與所述細(xì)胞表面相締合的CLDN6可僅是所表達(dá)的CLDN6的一部分。
[0215]術(shù)語“帶有CLDN的細(xì)胞”優(yōu)選地意為所述細(xì)胞在其表面上帶有CLDN，即CLDN與所述細(xì)胞的表面相締合。
[0216]按照現(xiàn)有技術(shù)中通常的意義使用“細(xì)胞表面”或“細(xì)胞的表面”，并且因此包括可被蛋白質(zhì)和其他分子接近并結(jié)合的細(xì)胞的外側(cè)。
[0217]詞語“表達(dá)于細(xì)胞表面上的CLDN”意為細(xì)胞所表達(dá)的CLDN與所述細(xì)胞的表面相締
口 ο
[0218]根據(jù)本發(fā)明，如果表達(dá)和締合水平低于胎盤細(xì)胞或胎盤組織中的表達(dá)和締合，則CLDN6基本不表達(dá)于細(xì)胞中并且基本不與細(xì)胞表面相締合。優(yōu)選地，表達(dá)和締合的水平低于胎盤細(xì)胞或胎盤組織中表達(dá)和締合的10%，優(yōu)選低于5%、3%、2%、1%、0.5%,0.1%或0.05%，或者甚至更低。優(yōu)選地，如果表達(dá)和締合的水平超過非腫瘤發(fā)生性、非癌性的組織(除了胎盤組織之外)中的表達(dá)和締合水平的2倍(優(yōu)選1.5倍)并且優(yōu)選地不超過所述非腫瘤發(fā)生性、非癌性的組織中的表達(dá)和締合水平，則CLDN6基本不表達(dá)于細(xì)胞中并且基本不與細(xì)胞表面相締合。優(yōu)選地，如果表達(dá)或締合水平低于檢出限和/或如果表達(dá)或締合水平太低而使添加至細(xì)胞的CLDN6特異性抗體無法結(jié)合，則CLDN6基本不表達(dá)于細(xì)胞中并且基本不與細(xì)胞表面相締合。
[0219]根據(jù)本發(fā)明，如果表達(dá)和締合水平超過非腫瘤發(fā)生性、非癌性的組織(除了胎盤組織之外)中的表達(dá)和締合水平，優(yōu)選超過2倍，優(yōu)選10倍、100倍、1000倍或10000倍，則CLDN6表達(dá)于細(xì)胞中并且與細(xì)胞表面相締合。優(yōu)選地，如果表達(dá)和締合水平高于檢出限和/或如果表達(dá)和締合水平足夠高以使添加至細(xì)胞的CLDN6特異性抗體結(jié)合，則CLDN6表達(dá)于細(xì)胞中并且與細(xì)胞表面相締合。優(yōu)選地，表達(dá)于細(xì)胞中的CLDN6表達(dá)或暴露于所述細(xì)胞的表面上。
[0220]術(shù)語“膜筏(raft) ”是指位于細(xì)胞質(zhì)膜的外小葉區(qū)域中的富含鞘脂和膽固醇的膜微域(microdomain)。某些蛋白質(zhì)與這樣的結(jié)構(gòu)域相締合的能力及其形成“聚集體”或“焦點(diǎn)聚集體(focal aggregate) ”的能力可影響蛋白質(zhì)的功能。例如,被本發(fā)明的抗體結(jié)合之后，CLDN6分子轉(zhuǎn)位到這樣的結(jié)構(gòu)中，在質(zhì)膜中產(chǎn)生高密度的CLDN6抗原-抗體復(fù)合物。這樣的高密度的CLDN6抗原-抗體復(fù)合物可使CDC過程中的補(bǔ)體系統(tǒng)有效活化。
[0221]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“疾病”是指任何病理狀態(tài)，包括癌癥，特別是本文中所描述形式的癌癥。
[0222]根據(jù)本發(fā)明，“與表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征之細(xì)胞相關(guān)的疾病”意為與健康組織或器官中的狀態(tài)相比，病態(tài)的組織或器官的細(xì)胞中的表達(dá)和締合優(yōu)選地升高。升高是指升高至少10%，特別是至少20%、至少50%、至少100%、至少200%、至少500%、至少1000%、至少10000%或者甚至更高。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)以及與細(xì)胞表面的締合僅見于病態(tài)的組織，而健康組織中的表達(dá)被抑制。根據(jù)本發(fā)明，與表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征之細(xì)胞相關(guān)的疾病包括腫瘤疾病，例如癌疾病。此外，根據(jù)本發(fā)明，腫瘤疾病(例如癌疾病)優(yōu)選是這樣的疾病，其中腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞表達(dá)CLDN6并且以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征。
[0223]本文中使用的“腫瘤疾病”、“腫瘤相關(guān)疾病”或“腫瘤發(fā)生性疾病”包括以異常調(diào)節(jié)的細(xì)胞生長、增殖、分化、黏附和/或遷移為特征的疾病，其可導(dǎo)致腫瘤和/或腫瘤轉(zhuǎn)移的產(chǎn)生或產(chǎn)生所述腫瘤和/或腫瘤轉(zhuǎn)移的趨勢?！澳[瘤細(xì)胞”意為通過迅速的、不可控的細(xì)胞增殖而生長并且在引起該新生長的刺激消除之后繼續(xù)生長的異常細(xì)胞。
[0224]“ 腫瘤”意為通過快速的、不可控的細(xì)胞增殖而生長的并且在引起該新生長的刺激消除之后繼續(xù)生長的異常的細(xì)胞群或組織。腫瘤表現(xiàn)為部分或完全缺乏結(jié)構(gòu)性組織(structrual organization)和與正常組織的功能性協(xié)調(diào)，并且通常形成獨(dú)特的組織塊,所述腫瘤可以是良性的、惡化前的(pre-malignant)或惡性的。
[0225]優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的“腫瘤疾病”、“腫瘤相關(guān)疾病”或“腫瘤發(fā)生性疾病”是癌疾病(即，惡性疾病)，并且腫瘤細(xì)胞是癌細(xì)胞。優(yōu)選地，“腫瘤疾病”、“腫瘤相關(guān)疾病”或“腫瘤發(fā)生性疾病”以表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征的細(xì)胞為特征，并且腫瘤細(xì)胞表達(dá)CLDN6并且以CLDN6與其細(xì)胞表面締合為特征。
[0226]表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征的細(xì)胞優(yōu)選地是腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞，優(yōu)選本文中描述的腫瘤和癌的腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞。優(yōu)選地，這樣的細(xì)胞不是胎盤細(xì)胞。
[0227]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的癌疾病或癌癥選自:卵巢癌(特別是卵巢腺癌和卵巢畸胎瘤)、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，特別是鱗狀細(xì)胞肺癌和腺癌)、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮膚癌(特別是基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌)、惡性黑色素瘤、頭頸癌(特別是惡性多形性腺瘤)、肉瘤(特別是滑膜肉瘤和癌肉瘤)、膽管癌、膀胱癌(特別是移行細(xì)胞癌和乳頭狀癌)、腎癌(特別是腎細(xì)胞癌，包括明細(xì)胞腎細(xì)胞癌和乳頭狀腎細(xì)胞癌)、結(jié)腸癌、小腸癌(包括回腸癌，特別是小腸腺癌和回腸腺癌)、睪丸胚胎性癌、胎盤絨毛膜癌、子宮頸癌、睪丸癌(特別是睪丸精原細(xì)胞瘤、睪丸畸胎瘤和胚胎性睪丸癌)、子宮癌、生殖細(xì)胞腫瘤(例如畸胎癌或胚胎性癌，特別是睪丸的生殖細(xì)胞腫瘤)、及其轉(zhuǎn)移形式。
[0228]肺癌的主要類型是小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。有三種主要亞型的非小細(xì)胞肺癌:鱗狀細(xì)胞肺癌、腺癌和大細(xì)胞肺癌。腺癌占肺癌的約10%。與小細(xì)胞肺癌和鱗狀細(xì)胞肺癌(二者均傾向于位于更中心的位置)相反，這種癌通常見于肺的外周。
[0229]皮膚癌是皮膚上的惡性生長。最常見的皮膚癌是基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌和黑色素瘤。惡性黑色素瘤是嚴(yán)重類型的皮膚癌。它是由色素細(xì)胞(稱為黑素細(xì)胞)的不可控生長所引起的。
[0230]根據(jù)本發(fā)明，“癌(carcinoma) ”是始于器官襯里層(上皮細(xì)胞)的癌癥(cancer)。
[0231]“細(xì)支氣管癌”是肺的癌，被認(rèn)為源自終末細(xì)支氣管的上皮，其中腫瘤組織沿著肺泡壁延伸，并在肺泡中以小團(tuán)塊生長。在一些細(xì)胞中以及在肺泡中的物質(zhì)(其還包含裸露的細(xì)胞)中可展示出黏蛋白。
[0232]“腺癌”是源自腺組織的癌癥。該組織也是稱為上皮組織的較大組織分類的一部分。上皮組織包括皮膚、腺體以及內(nèi)襯于身體的腔和器官的多種其他組織。上皮在胚胎學(xué)上源自外胚層、內(nèi)胚層和中胚層。被分類為腺癌的細(xì)胞不一定必需是腺體的一部分，只要他們具有分泌特征即可。這種形式的癌可發(fā)生于一些高等哺乳動(dòng)物(包括人)中。分化良好的腺癌傾向于與其所來源的腺組織類似，而低分化的腺癌可以不是這樣。通過染色來自活檢的細(xì)胞，病理學(xué)家將確定腫瘤是否是腺癌或其他一些類型的癌癥。因?yàn)樯眢w內(nèi)腺體普遍存在的屬性，腺癌可源自身體的很多組織。雖然每種腺體可不分泌相同的物質(zhì)，只要細(xì)胞有外分泌功能，它就可被認(rèn)為是腺性的，并且它的惡性形式因而被命名為腺癌。只要有充足的時(shí)間，惡性腺癌侵襲其他組織并經(jīng)常轉(zhuǎn)移。卵巢腺癌是最常見類型的卵巢癌。它包括漿液性和黏液性腺癌、明細(xì)胞腺癌和子宮內(nèi)膜樣腺癌。
[0233]“囊腺癌”是表面上皮-間質(zhì)腫瘤(surface epithelial-stromal tumor)( 一種類型的卵巢癌)的惡性形式。
[0234]表面上皮-間質(zhì)腫瘤是被認(rèn)為源自卵巢表面上皮(改良腹膜(modifiedperitoneum))或源自異位子宮內(nèi)膜或輸卵管(Fallopian tube)(管)組織的一類卵巢腫瘤。該組腫瘤占所有卵巢腫瘤的絕大多數(shù)。
[0235]畸胎癌是指生殖細(xì)胞腫瘤，它是畸胎瘤與胚胎性癌或與絨毛膜癌或與這二者的混合物。絨毛膜癌是惡性的、滋養(yǎng)層的和侵襲性的癌，通常是胎盤的癌。它以早期血行擴(kuò)散至肺為特征。
[0236]肉瘤是導(dǎo)致中胚層增殖的結(jié)締組織(骨、軟骨、脂肪)的癌癥。這與上皮來源的癌不同?；と饬鍪呛币娦问降陌┌Y，其通常發(fā)生在臂或腿的關(guān)節(jié)附近。它是一種軟組織肉瘤。
[0237]腎細(xì)胞癌(renalcell carcinoma)(還稱為腎細(xì)胞癌(renal cell cancer)或腎細(xì)胞腺癌)是源自近曲小管(腎中過濾血液并除去廢物的非常小的管)之襯里的腎癌。目前，腎細(xì)胞癌是成人中最常見的腎癌類型，并且是所有生殖泌尿腫瘤中最致命的。腎細(xì)胞癌的獨(dú)特亞型是明細(xì)胞腎細(xì)胞癌和乳頭狀腎細(xì)胞癌。明細(xì)胞腎細(xì)胞癌是最常見形式的腎細(xì)胞癌。當(dāng)在顯微鏡下觀察時(shí)，組成明細(xì)胞腎細(xì)胞癌的細(xì)胞表現(xiàn)的非常蒼白或透明。乳頭狀腎細(xì)胞癌是第二常見的亞型。這些癌癥在一些(如果不是大多數(shù)的話)腫瘤中形成小的手指樣突出(finger-like projection)(稱為乳頭狀突起)。
[0238]生殖細(xì)胞腫瘤是源自生殖細(xì)胞的腫瘤。生殖細(xì)胞腫瘤可以是癌性或非癌性的腫瘤。生殖細(xì)胞通常發(fā)生于性腺(卵巢和睪丸)內(nèi)。源自性腺外(例如，頭中，口內(nèi)，頸，骨盆；在胎兒、嬰兒和幼兒中最常見于身體中線，特別是在尾骨的尖部)的生殖細(xì)胞腫瘤可以是源自胚胎發(fā)育過程中之錯(cuò)誤的出生缺陷。
[0239]兩種主要類型的生殖細(xì)胞腫瘤是精原細(xì)胞瘤和非精原細(xì)胞瘤，其中非精原細(xì)胞瘤包括:畸胎癌、胚胎性癌、卵黃囊瘤、絨毛膜癌和分化的畸胎瘤。來自非精原細(xì)胞的多數(shù)細(xì)胞系等同于胚胎性癌，即它們幾乎完全由在基礎(chǔ)條件下不分化的干細(xì)胞組成，盡管其中一些可以響應(yīng)于分化誘導(dǎo)劑(例如，視黃酸)。
[0240]“轉(zhuǎn)移”意為癌細(xì)胞從其初始位置擴(kuò)散至身體的其他部分。轉(zhuǎn)移的形成是非常復(fù)雜的過程，有賴于惡性細(xì)胞從原發(fā)腫瘤脫離，侵襲細(xì)胞外基質(zhì)，穿透內(nèi)皮基底膜以進(jìn)入體腔和血管，并隨后通過血液運(yùn)輸，然后浸潤靶器官。最終，新腫瘤在目標(biāo)位置的生長有賴于血管發(fā)生。甚至在除去原發(fā)腫瘤之后仍經(jīng)常發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞或組分可殘留并發(fā)展出轉(zhuǎn)移潛力。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“轉(zhuǎn)移”表示“遠(yuǎn)轉(zhuǎn)移(distalmetastasis) ”,其表不遠(yuǎn)離原發(fā)腫瘤和局部淋巴結(jié)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移。
[0241]繼發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤的細(xì)胞與原發(fā)性腫瘤中的細(xì)胞類似。這意味著例如如果卵巢癌轉(zhuǎn)移至肝，則所述繼發(fā)性腫瘤由異常的卵巢細(xì)胞(而不是異常的肝細(xì)胞)構(gòu)成。則肝中的腫瘤被稱為轉(zhuǎn)移性卵巢癌(而不是肝癌)。
[0242]“治療”意 為向?qū)ο笫┯帽疚闹忻枋龅幕衔锘蚪M合物以預(yù)防或清除疾病，包括使對象中的腫瘤的大小或腫瘤的數(shù)目降低；阻滯或減緩對象中的疾病；抑制或減緩對象中新疾病的發(fā)生；降低目前患有或以前曾患有疾病之對象中的癥狀和/或復(fù)發(fā)的頻率或嚴(yán)重程度；和/或延長(即，提高)所述對象的壽命。
[0243]術(shù)語“疾病的治療”包括疾病或其癥狀的治愈、縮短時(shí)程、改善、預(yù)防、減緩或抑制進(jìn)展或惡化，或者預(yù)防或延緩發(fā)生。
[0244]“有風(fēng)險(xiǎn)”意為鑒定為與一般人群相比具有高于正常發(fā)病(特別是癌癥)機(jī)會的對象(即，患者)。此外，已患有或目前患有疾病(特別是癌癥)的對象是具有升高的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的對象，因?yàn)檫@樣的對象可繼續(xù)發(fā)病。目前已患有或曾患有癌癥的對象還具有升高的癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。
[0245]術(shù)語“免疫治療”表示與特異性免疫反應(yīng)相關(guān)的治療。在本發(fā)明的情況下，術(shù)語例如“保護(hù)”、“預(yù)防”、“預(yù)防性的(prophylactic) ”、“預(yù)防的(preventive) ”或“保護(hù)性的(protective) ”表示在個(gè)體中預(yù)防或治療(或二者兼有)腫瘤的發(fā)生和/或增殖傳播。在本發(fā)明的情況中，術(shù)語“免疫治療”優(yōu)選地是指主動(dòng)腫瘤免疫或腫瘤接種。預(yù)防性施用免疫治療(例如，預(yù)防性施用本發(fā)明的組合物)優(yōu)選地對接受者進(jìn)行保護(hù)以避免發(fā)生腫瘤生長。治療性施用免疫治療(例如，治療性施用本發(fā)明的組合物)可導(dǎo)致抑制腫瘤的進(jìn)展/生長。這包括使腫瘤的進(jìn)展/生長減速(特別是破壞腫瘤的進(jìn)展)，這優(yōu)選地導(dǎo)致腫瘤的清除。治療性施用免疫治療可對個(gè)體進(jìn)行保護(hù)以避免例如現(xiàn)存腫瘤的播散或轉(zhuǎn)移。 [0246]術(shù)語“免疫(immunization) ”或“接種(vaccination) ”描述以誘導(dǎo)用于治療性或預(yù)防性原因的免疫應(yīng)答為目的向?qū)ο笫┯每乖倪^程。
[0247]可互換地使用術(shù)語“對象”、“個(gè)體”、“生物”或“患者”，其表示脊椎動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物。例如，在本發(fā)明的情況中，哺乳動(dòng)物是人、非人靈長類、家養(yǎng)的動(dòng)物(domesticatedanimal)(例如，犬、貓、綿羊、牛、山羊、豬、馬等)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠等)以及圈養(yǎng)的動(dòng)物(例如，動(dòng)物園的動(dòng)物)。本文中使用的術(shù)語“動(dòng)物”還包括人。術(shù)語“對象”還可包括患者，即，患有疾病(優(yōu)選與CLDN6之表達(dá)相關(guān)的疾病(優(yōu)選腫瘤發(fā)生性疾病(例如癌癥)))的動(dòng)物(優(yōu)選人)。
[0248]術(shù)語“佐劑”表示延長或增強(qiáng)或加速免疫應(yīng)答的化合物。本發(fā)明的組合物優(yōu)選地?zé)o需添加佐劑而發(fā)揮其作用。盡管如此，本申請的組合物可包含任何已知的佐劑。佐劑包含一組異質(zhì)的化合物，例如油乳劑(例如，弗氏佐劑)、無機(jī)化合物(例如，明礬(alum))、細(xì)菌產(chǎn)物(例如，百日咳桿菌(Bordetella pertussis)毒素)、脂質(zhì)體和免疫刺激復(fù)合物。佐劑的實(shí)例是單磷?；鵢脂質(zhì)-A(MPL SmithKline Beecham)。阜苷,例如QS21 (SmithKlineBeecham)、DQS21 (SmithKline Beecham ;TO96/33739)、QS7、QS17、QS18 和 QS-Ll (So 等，1997，Mol.Cells7:178-186)，不完全弗氏佐劑，完全弗氏佐劑，維生素E，montanid，明礬，CpG寡核苷酸(Krieg等，1995，Nature374:546-549)和多種由生物可降解的油(例如，角鯊烯和/或生育酚)制備的油包水型乳劑。
[0249]根據(jù)本發(fā)明，樣品可以是任何根據(jù)本發(fā)明可使用的樣品，特別是生物樣品，例如組織樣品(包括體液)和/或細(xì)胞樣品，并且可以以常規(guī)方式獲得，例如通過組織活檢(包括鉆取活檢)以及通過取血、支氣管吸出物、痰、尿、糞便或其他體液。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“生物樣品”還包括生物樣品的級分。
[0250]術(shù)語“抗體”是指包含通過二硫鍵相互連接的至少兩個(gè)重(H)鏈和兩個(gè)輕(L)鏈的糖蛋白，并且包括包含其抗原結(jié)合部分的任何分子。術(shù)語“抗體”包括單克隆抗體及其片段或衍生物，包括但不限于人單克隆抗體、人源化單克隆抗體、嵌合單克隆抗體、單鏈抗體(例如，scFV s)和抗原結(jié)合的抗體片段(例如，F(xiàn)ab和Fab'片段)，并且還包括抗體的所有重組形式，例如原核細(xì)胞中表達(dá)的抗體、非糖基化的抗體以及本文中描述的任何抗原結(jié)合的抗體片段和衍生物。每個(gè)重鏈包含重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為VH)和重鏈恒定區(qū)。每個(gè)輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為VL)和輕鏈恒定區(qū)。VH和VL區(qū)還可再分為高變區(qū)(稱為互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determining region, (DR)),其間散布著更保守的區(qū)域(稱為框架區(qū)(framework region, FR))。VH和VL各自由三個(gè)⑶R和四個(gè)FR構(gòu)成，按照以下順序從氨基末端向羧基末端排列:FR1、⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq))的結(jié)合。
[0251]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“⑶R序列的至少一個(gè)”優(yōu)選地意為至少⑶R3序列。術(shù)語“抗體鏈的⑶R序列”優(yōu)選地表示抗體重鏈或輕鏈的⑶R1、⑶R2和⑶R3。
[0252]根據(jù)本發(fā)明，提及包含具體CDR序列(例如，具體的CDR3序列)的抗體鏈意為所述具體CDR序列形成所述抗體鏈的CDR區(qū)(例如CDR3區(qū))，即所述CDR區(qū)由所述具體CDR序列組成，或形成CDR區(qū)(例如，所述抗體鏈的CDR3區(qū))的一部分，即所述CDR區(qū)包含所述具體CDR序列。
[0253]如果根據(jù)本發(fā)明提到包含具體抗體重鏈和/或具體抗體輕鏈(例如，包含具體⑶R序列的鏈)，抗體的兩個(gè)重鏈和/或兩個(gè)輕鏈優(yōu)選地分別由具體抗體重鏈和/或具體抗體輕鏈構(gòu)成。
[0254]術(shù)語“人源化抗體”是指具有基本源自非人物種免疫球蛋白之抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子，其中分子的其余免疫球蛋白結(jié)構(gòu)基于人免疫球蛋白之結(jié)構(gòu)和/或序列?？乖Y(jié)合位點(diǎn)可包含與恒定結(jié)構(gòu)域融合的完整可變結(jié)構(gòu)域或僅包含移植到可變結(jié)構(gòu)域中合適框架區(qū)上的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)?？乖Y(jié)合位點(diǎn)可以是野生型或者可通過一個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換而被修飾，例如被修飾而更接近于人免疫球蛋白。人源化抗體的一些形式保持所有CDR序列(例如，含有小鼠抗體全部6個(gè)CDR的人源化小鼠抗體)。其他形式具有相對于初始抗體改變的一個(gè)或更多個(gè)⑶R。
[0255]術(shù)語“嵌合抗體”是指這樣的抗體，其中每個(gè)重鏈和輕鏈氨基酸序列的一部分與源自特定物種的抗體中的相應(yīng)序列同源，而所述鏈的其余區(qū)段與另一物種中相應(yīng)的序列同源。一般來說，輕鏈和重鏈的可變區(qū)都模擬源自一個(gè)哺乳動(dòng)物物種之抗體的可變區(qū)，而恒定部分與源自另一物種的抗體序列同源。這種嵌合形式的一個(gè)明顯的優(yōu)勢是與源自例如人細(xì)胞制備物的恒定區(qū)組合的可變區(qū)可便利地源自目前已知的使用容易獲得的來自非人宿主生物的B細(xì)胞或雜交瘤的來源。雖然可變區(qū)具有方便制備以及特異性不受來源影響的優(yōu)勢，但當(dāng)注射所述抗體時(shí)，人的恒定區(qū)比來自非人來源的恒定區(qū)引起更低可能性的人對象免疫應(yīng)答。然而，該定義 不限于這個(gè)具體的實(shí)例。
[0256]本文中使用的術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或者簡單地“結(jié)合部分”)是指抗體的一個(gè)或更多個(gè)片段，其保持與抗原特異性的結(jié)合能力。已證明可通過全長抗體的片度來進(jìn)行抗體的抗原結(jié)合功能。包括在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”之內(nèi)的結(jié)合片段的實(shí)例包括⑴Fab片段，由VL、VH、CL和CH結(jié)構(gòu)域組成的一價(jià)片段；(ii)F(ab' )2片段，包含通過鉸鏈區(qū)中二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)由VH和CH結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段，(V) dAb片段(Ward等，(1989)Nature341:544-546),其由VH結(jié)構(gòu)域組成；(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CTR),以及(vii)可任選地通過合成接頭(synthetic linker)連接的兩種或更多種分離的⑶R的組合。此外,盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(VL和VH)是不同基因編碼的，可使用重組方法通過合成接頭將它們連接，所述合成接頭使它們作為單個(gè)蛋白質(zhì)鏈而制造，其中VL和VH區(qū)配對以形成一價(jià)分子(被稱為單鏈 Fv (singeI chain Fv, scFv);參見例如 Bird 等(1988) Science242:423-426 和Huston 等(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-5883)。這樣的單鏈抗體也意在包括于術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”之中。另一個(gè)實(shí)例是結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)，其包含(i)與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽融合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽，(?)與鉸鏈區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)，以及(iii)與CH2恒定區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)。所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽可以是重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)。US2003/0118592和US2003/0133939中也公開了結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)。通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得這些抗體片段，篩選所述片段，以與完整抗體相同的方式使用所述片段。
[0257]術(shù)語“表位”是指分子中的抗原決定簇，即是指分子中被免疫系統(tǒng)識別(例如被抗體識別)的部分。例如，表位是被免疫系統(tǒng)識別的抗原上不連續(xù)的三維位點(diǎn)。在本發(fā)明的情況下，所述表位優(yōu)選地源自CLDN蛋白。表位通常由分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)(例如，氨基酸或糖側(cè)鏈)組成，并且經(jīng)常具有特異性的三維結(jié)構(gòu)特征，以及特異性的電荷特征。構(gòu)象和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于，在變性溶劑存在下，喪失與前者而非與后者的結(jié)合。蛋白質(zhì)(例如，CLDN)的表位優(yōu)選地包含所述蛋白質(zhì)的連續(xù)或不連續(xù)部分，并且長度優(yōu)選地是5至100、優(yōu)選5至50、更優(yōu)選8至30、最優(yōu)選10至25個(gè)氨基酸，例如，所述表位的長度可優(yōu)選地是
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 或 25 個(gè)氨基酸。
[0258]本文中使用的術(shù)語“不連續(xù)表位”意為蛋白質(zhì)抗原上的構(gòu)象表位，其是由蛋白質(zhì)的一級序列中的至少兩個(gè)不同區(qū)域形成的。
[0259]術(shù)語“雙特異性分子”意在包括具有兩個(gè)不同的結(jié)合特異性的任何試劑，例如蛋白質(zhì)、肽或者蛋白質(zhì)或肽的復(fù)合物。例如，所述分子可以與以下結(jié)合或相互作用:(a)細(xì)胞表面抗原，和(b)效應(yīng)細(xì)胞表面上的Fe受體。術(shù)語“多特異性”或“異種特異性分子”意在包括具有超過兩個(gè)不同的結(jié)合特異性的任何試劑，例如，蛋白質(zhì)、肽或者蛋白質(zhì)或肽的復(fù)合物。例如，所述分子可以與以下結(jié)合或相互作用:(a)細(xì)胞表面抗原，(b)效應(yīng)細(xì)胞表面上的Fe受體，和(C)至少一種其他成分。因此，本發(fā)明包括但不限于導(dǎo)向CLDN6以及導(dǎo)向其他靶標(biāo)(例如，效應(yīng)細(xì)胞上的Fe受體)的雙特異性、三特異性、四特異性和其他多特異性分子。術(shù)語“雙特異性抗體”還包括雙抗體(diabody)。雙抗體是二價(jià)、雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域表達(dá)于單個(gè)多肽鏈上，但使用的接頭太短從而無法使相同鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對，因而迫使所述結(jié)構(gòu)域與其他鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對并且產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見例如 Holliger, P.，等(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448 ；Poljak,R.J.，等(1994)Structure2:1121-1123)。
[0260]本文中使用的術(shù)語“異種抗體”是指兩個(gè)或更多個(gè)抗體、其衍生物或連接在一起的抗原結(jié)合區(qū)，其中至少兩個(gè)具有不同的特異性。這些不同的特異性包括對效應(yīng)細(xì)胞上的Fe受體的結(jié)合特異性，以及對靶細(xì)胞(例如，腫瘤細(xì)胞)上的抗原或表位的結(jié)合特異性。
[0261]本文中描述的抗體可以是人抗體。本文中使用的術(shù)語“人抗體”意在包括具有源自人種系免疫球蛋白序列之可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可包括不被人種系免疫球蛋白序列(例如，通過體外隨機(jī)或位點(diǎn)特異性誘變或者通過體內(nèi)體細(xì)胞突變而引入的突變)所編碼的氨基酸殘基。
[0262]本文中使用的術(shù)語“單克隆抗體”是指單個(gè)分子組成之抗體分子的制備物。單克隆抗體顯示對特定表位的單一結(jié)合特異性和親和力。在一個(gè)實(shí)施方案中，單克隆抗體由雜交瘤產(chǎn)生，所述雜交瘤包含與永生化細(xì)胞融合的獲自非人動(dòng)物(例如，小鼠)的B細(xì)胞。
[0263]本文中使用的術(shù)語“重組抗體”包括由重組方式制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有抗體，例如(a)從以免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)基因的或轉(zhuǎn)染色體動(dòng)物(例如，小鼠)或從其制備的雜交瘤中分離的抗體，(b)從轉(zhuǎn)化以表達(dá)抗體的宿主細(xì)胞中(例如，從轉(zhuǎn)染瘤(transfectoma)中)分離的抗體，(C)從重組的、組合的抗體文庫中分離的抗體，和(d)由涉及將免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。
[0264]本文中使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)染瘤”包括表達(dá)抗體的重組真核宿主細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞、NS/0細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞、植物細(xì)胞或真菌(包括酵母)細(xì)胞。
[0265]本文中使用的“異源抗體”是相對于產(chǎn)生所述抗體的轉(zhuǎn)基因生物而定義的。該術(shù)語是指這樣的抗體，其具有對應(yīng)于生物中所發(fā)現(xiàn)的但不組成轉(zhuǎn)基因生物的氨基酸序列或編碼性核酸序列，并且通常源自不同于所述轉(zhuǎn)基因生物的物種。
[0266]本文中使用的“異雜合抗體(heterohybrid antibody) ”是指具有不同生物來源之輕鏈和重鏈的抗體。例如，具有與鼠輕鏈相締合之人重鏈的抗體是異源雜合抗體。
[0267]本發(fā)明包括本文中描述的所有抗體和衍生物，其對于本發(fā)明的目的而言均包括于術(shù)語“抗體”中。術(shù)語“抗體衍生物”是指抗體的任何修飾形式，例如，抗體與其他試劑或抗體的綴合物或者抗體片段。
[0268] 本文中描述的抗體優(yōu)選地是分離的。本文中使用的“分離的抗體”意指這樣的抗體，其基本沒有具有不同抗原特異性的其他抗體(例如，與CLDN6特異性結(jié)合的分離抗體是這樣的抗體，其基本沒有與CLDN6以外的抗原特異性結(jié)合的抗體)。然而，與人CLDN6的表位、同種型或變體特異性結(jié)合的分離的抗體可以具有與其他相關(guān)抗原(例如，來自其他物種)(例如，CLDN6的物種同源物)的交叉反應(yīng)性。此外,分離的抗體可基本沒有其他細(xì)胞物質(zhì)和/或化學(xué)品。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，“分離的”單克隆抗體的組合表示具有不同特異性并且組合于明確界定的組合物中的抗體。
[0269]根據(jù)本發(fā)明，在標(biāo)準(zhǔn)測定(例如，本文中描述的測定)中，如果抗體與預(yù)先確定靶標(biāo)有顯著的親和力并且與所述預(yù)先確定的靶標(biāo)結(jié)合，則所述抗體能夠與所述預(yù)先確定的靶標(biāo)結(jié)合。優(yōu)選地，在流式細(xì)胞術(shù)分析(FACS分析)中(其中測定所述抗體與表達(dá)于完整細(xì)胞表面上的所述靶標(biāo)的結(jié)合)，如果抗體可檢測地與所述靶標(biāo)結(jié)合，則所述抗體能夠與所述革巴標(biāo)結(jié)合。優(yōu)選地，如果以10 μ g/ml或更低、5 μ g/ml或更低或者2 μ g/ml或更低的濃度存在，所述抗體可檢測地與所述靶標(biāo)結(jié)合。優(yōu)選地，如果以50nM或更低、30nM或更低或者15nM或更低的濃度存在，所述抗體可檢測地與所述靶標(biāo)結(jié)合。經(jīng)常通過平衡解離常數(shù)(Kd)測量“親和力”或“結(jié)合親和力”。優(yōu)選地，術(shù)語“顯著的親和力”是指以KT5M或更低、10_6M或更低、KT7M或更低、10-8Μ或更低、10-9Μ或更低、ΙΟ,Μ或更低、10-ηΜ或更低或者KT12M或更低的解離常數(shù)(Kd)與預(yù)先確定的靶標(biāo)結(jié)合。本發(fā)明的抗體優(yōu)選地具有6500ng/ml或更低、3000ng/ml 或更低、2500ng/ml 或更低、2000ng/ml 或更低、1500ng/ml 或更低、1000ng/ml或更低、500ng/ml或更低、400ng/ml或更低、300ng/ml或更低、200ng/ml或更低或者IOOng/ml或更低的與CLDN6結(jié)合的EC50值。[0270]在標(biāo)準(zhǔn)的測定中，如果抗體不具有對靶標(biāo)的顯著親和力并且不與所述靶標(biāo)顯著地結(jié)合，則所述抗體(基本)不能與所述靶標(biāo)結(jié)合。優(yōu)選地，在流式細(xì)胞術(shù)分析(FACS分析)中(其中測定所述抗體與表達(dá)于完整細(xì)胞表面上的所述靶標(biāo)的結(jié)合)，如果抗體不與靶標(biāo)可檢測地結(jié)合，則所述抗體(基本)不能與所述靶標(biāo)結(jié)合。優(yōu)選地，如果以高達(dá)2 μ g/ml、優(yōu)選高達(dá)5 μ g/ml、優(yōu)選高達(dá)10 μ g/ml、優(yōu)選高達(dá)20 μ g/ml、更優(yōu)選高達(dá)50 μ g/ml、特別是高達(dá)100 μ g/ml或高達(dá)150 μ g/ml、高達(dá)200 μ g/ml或者更高的濃度存在，則所述抗體不與所述革El標(biāo)可檢測地結(jié)合。優(yōu)選地，如果以高達(dá)15nM、優(yōu)選高達(dá)30nM、優(yōu)選高達(dá)50nM、優(yōu)選高達(dá)ΙΟΟηΜ、優(yōu)選高達(dá)150nM或高達(dá)170nM、高達(dá)300mM、高達(dá)600nM、高達(dá)ΙΟΟΟηΜ、高達(dá)1300nM或者更高的濃度存在，則所述抗體不與所述靶標(biāo)可檢測地結(jié)合。優(yōu)選地，如果以與抗體所結(jié)合靶標(biāo)飽和結(jié)合的濃度存在，則所述抗體不與所述靶標(biāo)(即，CLDN6)可檢測地結(jié)合。優(yōu)選地，如果抗體與所述靶標(biāo)以高于與預(yù)先確定之靶標(biāo)(所述抗體所能夠與其結(jié)合)結(jié)合之Kd的至少10倍、100倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍或IO6倍高的Kd結(jié)合，則抗體不具有對靶標(biāo)的顯著親和力。例如，如果抗體與所述抗體所能夠結(jié)合的所述靶標(biāo)相結(jié)合的Kd是10-7Μ，則抗體不具有顯著親和力的與靶標(biāo)結(jié)合的Kd可以是至少10-6Μ、10-5Μ、10-4Μ、10-3Μ、KT2M或101。
[0271]如果抗體能夠與預(yù)先確定的靶標(biāo)結(jié)合而不能與其他靶標(biāo)結(jié)合(即，在標(biāo)準(zhǔn)測定中對其他靶標(biāo)沒有顯著的親和力并且不與其他靶標(biāo)顯著地結(jié)合)，則所述抗體對所述預(yù)先確定的靶標(biāo)是特異性的。根據(jù)本發(fā)明，如果抗體能夠與CLDN6結(jié)合但不能與其他靶標(biāo)(特別是除CLDN6之外的密蛋白，例如CLDN9、CLDN4、CLDN3和CLDN1)結(jié)合，則所述抗體是CLDN6特異性的。優(yōu)選地，如果與CLDN6之外的密蛋白(例如，CLDN9、CLDN4、CLDN3和CLDN1)的親和力和結(jié)合沒有顯著超過與密蛋白不相關(guān)的蛋白質(zhì)(例如，牛血清白蛋白(bovine serumalbumin, BSA)、酪蛋白、人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)或非密蛋白的膜蛋白質(zhì)(例如，MHC分子或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體)或任何其他指定的多肽)的親和力和結(jié)合，則所述抗體是CLDN6特異性的。優(yōu)選地，如果抗體與所述靶標(biāo)以低于與預(yù)先確定之靶標(biāo)(所述抗體對其不是特異性的)結(jié)合之Kd的至少10倍、100倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍或IO6倍的Kd結(jié)合，則所述抗體對預(yù)先確定的靶標(biāo)是特異性的。例如，如果抗體與對其特異性靶標(biāo)之結(jié)合的Kd是1(TM，則與對其非特異性靶標(biāo)之結(jié)合的Kd可以是至少10-6Μ、10-5Μ、10-4Μ、10-3Μ、IO-2M或101。
[0272]可使用任何合適的方法實(shí)驗(yàn)性測定抗體與祀標(biāo)的結(jié)合；參見例如Berzofsky等，Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, ff.E.編，RavenPress New York, N Y(1984), Kuby, Janis Immunology, ff.H.Freeman and Company NewYork, N Y(1992)和本文中描述的方法?？墒褂贸Ｒ?guī)技術(shù)很容易地測定親和力,例如,通過平衡透析；通過使用BIACore2000儀器，使用制造商所描述的一般方法；通過使用放射標(biāo)記的革巴抗原的放射免疫測定；或通過技術(shù)人員已知的其他方法。例如，可通過Scatchard等，Ann N.Y.Acad.ScL, 51 =660(1949)的方法分析親和力數(shù)據(jù)。如果在不同條件(例如，鹽濃度、pH)下測量，所測量的具體抗體-抗原相互作用的親和力可以不同。因此，親和力的測量和其他抗原-結(jié)合參數(shù)(例如，KD、IC50)優(yōu)選地用抗體與抗原的標(biāo)準(zhǔn)化的溶液以及標(biāo)準(zhǔn)化的緩沖液制成。
[0273]本發(fā)明抗體的獨(dú)特特征是與細(xì)胞表面密蛋白6結(jié)合的能力。這已通過流式細(xì)胞術(shù)分析表達(dá)密蛋白6的細(xì)胞而被證明。[0274]為了測試單克隆抗體與表達(dá)密蛋白之活細(xì)胞的結(jié)合，可使用流式細(xì)胞術(shù)。簡單地說，將表達(dá)與膜締合之密蛋白(在標(biāo)準(zhǔn)的生長條件下生長)的細(xì)胞系與多個(gè)濃度的PBS(含有2%熱滅活的FCS和0.1% NaN3)中的抗體在4°C下混合30分鐘。清洗之后，在與一抗染色相同的條件下，使細(xì)胞與熒光標(biāo)記的二抗反應(yīng)。利用光和側(cè)向散射特性，可通過FACS分析樣品以對單種細(xì)胞圈門(gate)，并測定被標(biāo)記抗體的結(jié)合。
[0275]根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“結(jié)合”優(yōu)選地表示本文中定義的特異性結(jié)合。
[0276]本文中使用的“同種型”是指由重鏈恒定區(qū)基因所編碼的抗體類型(例如，IgM或IgGl)。
[0277]本文中使用的“同種型轉(zhuǎn)換”是指抗體的類型或同種型從一種Ig類型變?yōu)榱硪环NIg類型的現(xiàn)象。 [0278]本文中使用的應(yīng)用于對象的術(shù)語“天然的(naturally occurring) ”是指對象可在自然中找到的事實(shí)。例如，可已從天然來源中分離的存在于生物(包括病毒)中的并且已在實(shí)驗(yàn)室中被人刻意修飾的多肽或多核苷酸序列是天然的。
[0279]本文中使用的術(shù)語“重排的”是指重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的構(gòu)型，其中在實(shí)質(zhì)上編碼完整的VH或VL結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象中，V區(qū)段的位置分別緊鄰D-J或J區(qū)段?？赏ㄟ^比較種系DNA來鑒定重排的免疫球蛋白(抗體)基因座；重排的基因座將具有至少一個(gè)重組的七聚體/九聚體同源性元件。
[0280]本文中關(guān)于V區(qū)段而使用的術(shù)語“未重排的”或“種系構(gòu)型”是指這樣的構(gòu)型，其中V區(qū)段未重組，以使其緊鄰D或J區(qū)段。
[0281]本文中使用的術(shù)語“核酸分子”意在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但優(yōu)選地是雙鏈的DNA?？梢砸岳鏡NA的形式將核酸分子用于引入(即，轉(zhuǎn)染)細(xì)胞，所述RNA可通過體外轉(zhuǎn)錄從DNA模板制備。此外，在應(yīng)用之前，可通過穩(wěn)定序列、加帽和多聚腺苷酸化來修飾所述RNA。
[0282]根據(jù)本發(fā)明描述的核酸已優(yōu)選地被分離。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“分離的核酸”意為所述核酸是(i)體外擴(kuò)增的，例如通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR),
(ii)通過克隆重組產(chǎn)生的，(iii)純化的，例如通過切割和凝膠電泳分離，或者(iv)合成的，例如通過化學(xué)合成。分離的核酸是可用于重組DNA技術(shù)之操作的核酸。
[0283]根據(jù)本發(fā)明，核酸可單獨(dú)存在或與其他核酸聯(lián)合存在，所述其他核酸可以是同源的或異源的。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸與表達(dá)控制序列功能性連接，所述表達(dá)控制序列與所述核酸可以是同源或異源的，其中術(shù)語“同源的”意為所述核酸還天然地與表達(dá)控制序列功能性連接，而術(shù)語“異源的”意為所述核酸天然地不與表達(dá)控制序列功能性連接。
[0284]如果它們是彼此以這樣的方式共價(jià)連接以使所述核酸的表達(dá)或轉(zhuǎn)錄在所述表達(dá)控制序列的控制或影響之下，則核酸(例如，表達(dá)RNA和/或蛋白質(zhì)或肽的核酸)與表達(dá)控制序列彼此功能性連接。如果要將所述核酸翻譯成為功能性蛋白質(zhì)，那么用表達(dá)控制序列與編碼序列功能性連接，誘導(dǎo)所述表達(dá)控制序列導(dǎo)致所述核酸的轉(zhuǎn)錄，而不引起編碼序列中的移碼或者所述編碼序列不能被翻譯成為所需的蛋白質(zhì)或肽。
[0285]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“表達(dá)控制序列”包含啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、增強(qiáng)子和調(diào)芐基因轉(zhuǎn)錄或mRNA翻譯的其他控制元件。在本發(fā)明的一些具體的實(shí)施方案中，可調(diào)節(jié)所述表達(dá)控制序列。表達(dá)控制序列的精確結(jié)構(gòu)可作為物種或細(xì)胞類型的函數(shù)而不同，但通常包含5'-非轉(zhuǎn)錄的以及5'-和3'-非翻譯序列，其分別參與轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始，例如TATA框、加帽序列、CAAT序列等。更具體地說，5'-非轉(zhuǎn)錄的表達(dá)控制序列包含啟動(dòng)子區(qū)，其包含用于功能性連接的核酸之轉(zhuǎn)錄控制的啟動(dòng)子序列。表達(dá)控制序列還可包括增強(qiáng)子序列或上游激活子序列。
[0286]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“啟動(dòng)子”或“啟動(dòng)子區(qū)”表示這樣的核酸序列，其位于被表達(dá)核酸序列的上游(5')，并且通過提供對RNA聚合酶的識別和結(jié)合位點(diǎn)而控制序列的表達(dá)?！皢?dòng)子區(qū)”還可包含識別和結(jié)合參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)之其他因子的位點(diǎn)。啟動(dòng)子可控制原核或真核基因的轉(zhuǎn)錄。此外，啟動(dòng)子可以是“可誘導(dǎo)型的”并且可以響應(yīng)于誘導(dǎo)劑而起始轉(zhuǎn)錄，或者如果轉(zhuǎn)錄不受誘導(dǎo)劑控制，所述啟動(dòng)子可以是“組成型的”。如果不存在誘導(dǎo)劑，在可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制之下的基因不表達(dá)或僅少量表達(dá)。在誘導(dǎo)劑存在下，所述基因被打開或轉(zhuǎn)錄水平升高。這一般是通過特定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合所介導(dǎo)的。
[0287]根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的啟動(dòng)子包括SP6、T3和T7聚合酶的啟動(dòng)子、人U6RNA啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子及其人工的雜合啟動(dòng)子(例如，CMV)，其中一部分或一些部分與其他細(xì)胞蛋白質(zhì)(例如，人GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶))的基因啟動(dòng)子的一部分或一些部分融合，并且包含或不包含額外的內(nèi)含子。
[0288]根據(jù)本發(fā)明，以最通常的意義使用術(shù)語“表達(dá)”，其包括產(chǎn)生RNA或產(chǎn)生RNA和蛋白質(zhì)/肽。它還包括核酸的部分表達(dá)。此外，可以瞬時(shí)地或穩(wěn)定地進(jìn)行表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語表達(dá)還包括“異常表達(dá)”或“不正常表達(dá)”。
[0289]根據(jù)本發(fā)明， “異常表達(dá)”或“不正常表達(dá)”意為與參比相比(優(yōu)選與非腫瘤發(fā)生性的正常細(xì)胞或健康的個(gè)體中的狀態(tài)相比)表達(dá)改變(優(yōu)選升高)。表達(dá)的升高是指升高至少10%，特別是至少20%，至少50%或至少100%。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)僅見于患病的組織，而健康組織中的表達(dá)被抑制。
[0290]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明，核酸分子(在適當(dāng)情況下)與啟動(dòng)子(其控制核酸的表達(dá))存在于載體中。在此以其最常用的意義使用的術(shù)語“載體”，其包括用于核酸的任何中間媒介物(vehicle)，其使所述核酸例如被引入原核和/或真核細(xì)胞，并且在適當(dāng)情況下被整合進(jìn)入基因組。這類載體優(yōu)選地在所述細(xì)胞中復(fù)制和/或表達(dá)。載體包括質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體或病毒基因組。本文中使用的術(shù)語“質(zhì)?！蓖ǔ１硎究瑟?dú)立于染色體DNA而復(fù)制的染色體外遺傳物質(zhì)的構(gòu)建體,通常為環(huán)狀DNA雙鏈體。
[0291]對于表達(dá)抗體的載體，可使用其中抗體重鏈和輕鏈存在于不同的載體中的載體類型或者其中重鏈和輕鏈存在于同一載體中的載體類型。
[0292]要這樣解釋本文中給出的關(guān)于特定核酸和氨基酸序列(例如，序列表中的序列)的教導(dǎo)，以使其還表示所述特定序列的修飾形式(即，變體)，其導(dǎo)致功能性等同于所述特定序列的序列，例如，氨基酸序列表現(xiàn)出與所述特定氨基酸序列相同或相似的特性，并且編碼氨基酸序列的核酸序列表現(xiàn)出與所述特定核酸序列所編碼的氨基酸序列相同或相似的特性。一個(gè)重要的特性是保持抗體與其靶標(biāo)的結(jié)合，或者維持抗體的效應(yīng)功能，例如CDC和/或ADCC。優(yōu)選地，當(dāng)在抗體中替換所述特異性序列時(shí)，相對于特定序列而修飾的序列保持所述抗體與靶標(biāo)的結(jié)合，并且優(yōu)選保持本文中描述的所述抗體的功能。
[0293]類似地，要這樣解釋本文中給出的關(guān)于特定抗體或產(chǎn)生特異性抗體之雜交瘤的教導(dǎo)，以使其還表示以氨基酸序列和/或核酸序列為特征的抗體，所述氨基酸序列和/或核酸序列是與所述特定抗體的所述氨基酸序列和/或核酸序列相比較而修飾的，但在功能上是等同的。一個(gè)重要的特性是保持抗體與其靶標(biāo)的結(jié)合或維持抗體的效應(yīng)功能。優(yōu)選地，當(dāng)用相對于特定序列修飾的序列替換抗體中的特定序列時(shí)，保持所述抗體與靶標(biāo)的結(jié)合，并且優(yōu)選保持本文中描述的所述抗體的功能，例如CDC介導(dǎo)的裂解或ADCC介導(dǎo)的裂解。
[0294]本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，可修飾高變區(qū)和可變區(qū)(特別是CDR的序列)而不失去與靶標(biāo)結(jié)合的能力。例如，CDR區(qū)會與本文中指定的抗體相同或高度同源。對于“高度同源”，考慮可在⑶R中進(jìn)行I至5(優(yōu)選I至4，例如I至3或者I或2)個(gè)替換。此外，可修飾高變區(qū)和可變區(qū)，以使其顯示出與本文中具體公開的抗體區(qū)域基本同源。
[0295]要理解的是，本文中描述的特定核酸還包括為在具體宿主細(xì)胞或生物中優(yōu)化密碼子使用而修飾的核酸。生物之間密碼子使用的差異可導(dǎo)致涉及異源基因表達(dá)的很多問題。通過改變原序列的一個(gè)或更多個(gè)核苷酸的密碼子優(yōu)化可導(dǎo)致要在其中表達(dá)所述核酸的同源或異源宿主中核酸表達(dá)的優(yōu)化(特別是翻譯效率的優(yōu)化)。
[0296]根據(jù)本發(fā)明，核酸序列、氨基酸序列或肽的變體、衍生物、修飾形式或片段優(yōu)選地分別具有從其來源的核酸序列、氨基酸序列或肽的功能特性。這樣的功能特性包括與其他分子的相互作用或結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸序列、氨基酸序列或肽的變體、衍生物、修飾形式或片段分別與從其來源的核酸序列、氨基酸序列或肽免疫等效。
[0297] 優(yōu)選地，特定核酸序列與相對于所述特定核酸序列而修飾的核酸序列或所述特定核酸序列之變體的核酸序列的同一性程度會為至少70 %，優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，甚至更優(yōu)選至少90 %或者最優(yōu)選至少95 %、96 %、97 %、98 %或99 %。對于CLDN6核酸變體，同一性的程度優(yōu)選以至少約300、至少約400、至少約450、至少約500、至少約550、至少約600或至少約630個(gè)核苷酸的區(qū)域給出。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，為全長的參比核酸序列(例如，序列表中給出的核酸序列)給出同一性程度。優(yōu)選地，這兩個(gè)序列能夠彼此雜交并形成穩(wěn)定的雙鏈體，雜交優(yōu)選在允許多核苷酸之間特異性雜交的條件(嚴(yán)格條件)下進(jìn)行。嚴(yán)格條件描述于例如 Molecular Cloning:A Laboratory Manual, J.Sambrook 等編，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor, New York,1989或者 Current Protocols in Molecular Biology, F.M.Ausubel 等編，John ffiley&Sons,Inc.，New York，并且是指例如在 65°C下在雜交緩沖液(3.5XSSC、0.02% Ficoll、0.02%聚乙烯吡咯烷酮、0.02%牛血清白蛋白、2.5mM NaH2PO4(pH7)、0.5% SDS、2mM EDTA)中的雜交。SSC是0.15M氯化鈉/0.15M檸檬酸鈉，pH7。雜交之后，清洗已被轉(zhuǎn)移了 DNA的膜，例如室溫下在2 X SSC中清洗，并隨后在高達(dá)68 °C的溫度下在0.1~0.5 X SSC/0.1 X SDS中清洗。
[0298]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“變體”還包括突變體，剪接變體，構(gòu)象，同種型,等位基因變體，物種變體和物種同源物，特別是天然存在的變體。等位基因變體涉及基因正常序列中的改變，其重要性通常不清楚。全基因測序通常鑒定給定基因的大量等位基因變體。物種同源物是給定核酸或氨基酸序列的具有不同物種來源的核酸或氨基酸序列。
[0299]對于本發(fā)明的目的而言，氨基酸序列的“變體”包含氨基酸插入變體、氨基酸添加變體、氨基酸缺失變體和/或氨基酸替換變體。在蛋白質(zhì)的N端和/或C端包含缺失的氨基酸缺失變體還稱為N端和/或C端截?cái)嘧凅w(truncation variant)。
[0300]氨基酸插入變體包括在特定氨基酸序列中插入單個(gè)或兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸。在具有插入的氨基酸序列變體的情況中，向氨基酸序列的特定位點(diǎn)中插入一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基，但是隨機(jī)插入并對所產(chǎn)生的產(chǎn)物進(jìn)行合適的篩選也是可能的。
[0301]氨基酸添加變體包含氨基和/或羧基末端融合一個(gè)或更多個(gè)氨基酸，例如1、2、3、
5、10、20、30、50或更多個(gè)氨基酸。
[0302]氨基酸缺失變體以從序列中除去一個(gè)或更多個(gè)氨基酸(例如，通過除去1、2、3、5、
10、20、30、50或更多個(gè)氨基酸)為特征。所述缺失可以在蛋白質(zhì)的任何位置。
[0303]氨基酸替換變體以序列中至少一個(gè)殘基被除去并在其位置中插入其他殘基為特征。優(yōu)選在氨基酸序列中同源蛋白質(zhì)或肽之間非保守的位置處修飾和/或優(yōu)選將氨基酸置換為其他具有相似特性的氨基酸。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)變體中的氨基酸改變是保守性氨基酸改變，即替換帶有類似電荷的或不帶電荷的氨基酸。保守性氨基酸改變涉及替換以其側(cè)鏈相關(guān)聯(lián)的氨基酸家族的一個(gè)。天然氨基酸通常分為四個(gè)家族:酸性的(天冬氨酸、谷氨酸)、堿性的(賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、非極性的(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不帶電的極性的(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時(shí)共同分類為芳族氨基酸。
[0304]關(guān)于根據(jù)SEQ ID NO:37的氨基酸序列，術(shù)語變體特別地涉及其中位置46處的半胱氨酸替換為除半胱氨酸之外的另一種氨基酸(例如如上所述的氨基酸，優(yōu)選甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、色氨酸、脯氨酸或亮氨酸)的序列。
[0305]特定氨基酸序列與相對于所述特定氨基酸而修飾的氨基酸序列或所述氨基酸序列的變體之間(例如，顯示基本同源的氨基酸序列之間)優(yōu)選的相似性程度、優(yōu)選的同一性會為至少70%，優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%或者最優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99%。優(yōu)選地為氨基酸區(qū)域給出相似性或同一性程度，所述區(qū)域?yàn)閰⒈劝被嵝蛄兄L的至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或約100%。例如，如果參比氨基酸序列由200個(gè)氨基酸組成，優(yōu)選地為至少約20、至少約40、至少約60、至少約80、至少約100、至少約120、至少約140、至少約160、至少約180或約200個(gè)氨基酸給出的相似性或同一性程度，優(yōu)選連續(xù)的氨基酸。對于CLDN6多肽變體，優(yōu)選地為至少約100、至少約120、至少約140、至少約160、至少約180、至少約200、至少約210個(gè)氨基酸的區(qū)域給出相似性或同一性程度。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，為全長的參比氨基酸序列(例如，序列表中所給出的氨基酸序列)給出相似性或同一性程度?？捎矛F(xiàn)有技術(shù)中已知的工具進(jìn)行用于確定序列相似性(優(yōu)選序列同一性)的比對，優(yōu)選使用最好的序列比對，例如使用Align，使用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置,優(yōu)選EMBOSS::needle、Matrix:Blosum62、Gap Openl0.0Λ Gap Extend0.5。
[0306]“序列相似性”表示相同或存在保守性氨基酸替換的氨基酸百分比。兩個(gè)多肽或核酸序列之間的“序列同一性”表示序列之間相同的氨基酸或核苷酸百分比。
[0307]在最佳比對之后，獲得“百分同一性”，該百分比是純統(tǒng)計(jì)學(xué)的，并且這兩個(gè)序列之間的差異在其整個(gè)長度上隨機(jī)地分布。通過任選地比對它們之后，比較這些序列，常規(guī)地進(jìn)行兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間的序列比較，所述比較是通過區(qū)段或“比較窗”進(jìn)行的，以鑒定和比較具有序列相似性的局部區(qū)域。除了手工進(jìn)行之外，可通過Smith and Waterman,1981, Ads App.Math.2,482 的局部同源性算法,通過 Neddleman and Wunsch, 1970, J.Mol.Biol.48,443 的局部同源性算法，通過 Pearson and Lipman, 1988, Proc.Natl Acad.Sc1.USA85，2444的相似性搜索法，或者通過使用這些算法的計(jì)算機(jī)程序(GAP，BESTFIT, FASTA,BLAST P, BLAST N and TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, GeneticsComputer Group, 575Science Drive, Madison, ffis.)來產(chǎn)生對用于比較之序列的最佳比對。
[0308]通過測定被比較的兩個(gè)序列之間相同位置的數(shù)目來計(jì)算百分同一性，將該數(shù)目除以所比較的位置數(shù)并使結(jié)果乘以100以獲得這兩個(gè)序列之間的百分同一性。
[0309]例如，可根據(jù)所涉殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性質(zhì)而進(jìn)行“保守性替換”。例如:(a)非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；(b)極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(C)帶正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸；以及(d)帶負(fù)電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。替換通?？稍诮M(a)~(d)之內(nèi)進(jìn)行。此外，根據(jù)甘氨酸和脯氨酸破壞α-螺旋的能力，它們可以彼此替換?？稍谝韵陆M之間進(jìn)行一些優(yōu)選的替換:(i) S和T ;(ii)P和G ;以及(iii)A、V、L和I。鑒于已知的遺傳代碼以及重組和合成DNA技術(shù)，技術(shù)人員可很容易地構(gòu)建編碼保守性氨基酸變體的DNA。
[0310]本發(fā)明包括這樣的抗體，其中在Fe區(qū)已進(jìn)行修改以改變所述抗體的功能或藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性。這樣的改變可導(dǎo)致Clq結(jié)合以及CDC或者Fe Y R結(jié)合以及ADCC的降低或升高?？衫缭谥劓満愣▍^(qū)的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基中進(jìn)行替換，因而，與修飾的抗體相t匕，導(dǎo)致效應(yīng)功能的改變，同時(shí)保持與抗原結(jié)合的能力，參見US5，624，821和US5，648，260。
[0311]可通過修飾Ig恒定結(jié)構(gòu)域或Ig樣恒定結(jié)構(gòu)域的補(bǔ)救受體(salvage recptor)表位來提高抗體的體內(nèi)半衰期，以使分子不包含完整的CH2結(jié)構(gòu)域或完整的Ig Fe區(qū)，參見US6, 121，022和”6，194,551。還可通過在Fe區(qū)中進(jìn)行突變來升高體內(nèi)半衰期，所述突變例如通過在位置252處以蘇氨酸替換亮氨酸，通過在位置254處以蘇氨酸替換絲氨酸，或者通過在位置256處以蘇氨酸替換苯丙氨酸，參見US6，277，375。
[0312]此外，可修飾抗體的糖基化模式以改變抗體的效應(yīng)功能。例如，可在轉(zhuǎn)染瘤中表達(dá)所述抗體，所述轉(zhuǎn)染瘤在Fe區(qū)的位置297處不添加通常與Asn連接的巖藻糖單位以增強(qiáng)Fe區(qū)對Fe受體的親和力，這反過來會導(dǎo)致NK細(xì)胞存在下升高的抗體ADCC，參見Shield等(2002) JBC, 277:26733。此外，可進(jìn)行半乳糖基化修飾以修飾CDC。
[0313]或者，在另一個(gè)實(shí)施方案中，可沿著抗CLDN6抗體的全部或部分編碼序列隨機(jī)引入突變(例如通過飽和誘變)，并且可篩選所產(chǎn)生的經(jīng)修飾的抗CLDN6抗體的結(jié)合活性。
[0314]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“細(xì)胞”或“宿主細(xì)胞”優(yōu)選地表示完整細(xì)胞，即具有完整膜的未釋放其正常的細(xì)胞內(nèi)成分(例如，酶、細(xì)胞器或遺傳物質(zhì))的細(xì)胞。完整細(xì)胞優(yōu)選地是活細(xì)胞(viable cell),即能夠進(jìn)行正常代謝功能的活細(xì)胞(living cell)。優(yōu)選地,根據(jù)本發(fā)明，所述術(shù)語表示可用外源性核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的任何細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語”細(xì)胞“包括原核細(xì)胞(例如，大腸桿菌(E.coli))或真核細(xì)胞(例如，樹突細(xì)胞、B細(xì)胞、CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、K562細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、HELA細(xì)胞、酵母細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞)。所述外源性核酸可見于細(xì)胞內(nèi)部(i)這樣的自由分散，(ii)并入重組載體，或者(iii)整合進(jìn)入宿主基因組或線粒體DNA。特別優(yōu)選哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，例如來自人、小鼠、倉鼠、豬、山羊和靈長類的細(xì)胞。所述細(xì)胞可以源自很多組織類型，并且包括原代細(xì)胞和細(xì)胞系。具體的實(shí)例包括角質(zhì)形成細(xì)胞、外周血白細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。在另一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞，特別是樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞。本文中使用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”優(yōu)選意指其中已引入重組表達(dá)載體的細(xì)胞。
[0315]包含核酸分子的細(xì)胞優(yōu)選地表達(dá)所述核酸所編碼的肽或蛋白質(zhì)。
[0316]術(shù)語“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”是指具有包含一個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)基因(優(yōu)選重鏈和/或輕鏈轉(zhuǎn)基因)或轉(zhuǎn)染色體(transchromosome)(整合或不整合到動(dòng)物的天然基因組DNA中)的基因組的動(dòng)物，并且其優(yōu)選能夠表達(dá)所述轉(zhuǎn)基因。例如，轉(zhuǎn)基因小鼠可具有人輕鏈轉(zhuǎn)基因以及人重鏈轉(zhuǎn)基因或人重鏈轉(zhuǎn)染色體，以使當(dāng)用CLDN6抗原和/或表達(dá)CLDN6的細(xì)胞免疫時(shí)，所述小鼠產(chǎn)生人抗-CLDN6抗體。人重鏈轉(zhuǎn)基因可被整合到小鼠的染色體DNA中(如轉(zhuǎn)基因小鼠(例如，HuMAb小鼠(例如，HCo7或HCol2小鼠))中的情況那樣)，或者可以染色體外維持人重鏈轉(zhuǎn)基因(如W002/43478中描述的轉(zhuǎn)染色體(例如，KM)小鼠中的情況那樣)。通過進(jìn)行V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換，這樣的轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠可以以能夠產(chǎn)生多同種型的抗CLDN6的人 單克隆抗體(例如，IgG、IgA和/或IgE)。
[0317]本文中使用的“降低”或“抑制”意為引起總體降低的能力，優(yōu)選5%或更高、10%或更高、20 %或更高、更優(yōu)選50 %或更高并且最優(yōu)選75 %或更高水平的降低，例如細(xì)胞增殖水平的降低。術(shù)語“抑制”或類似的詞語包括完全或基本完全的抑制，即降低至O或基本降低至O。
[0318]術(shù)語例如“升高”或“增強(qiáng)”優(yōu)選地表示升高或增強(qiáng)約至少10%、優(yōu)選至少20%、優(yōu)選至少30%、更優(yōu)選至少40%、更優(yōu)選至少50%、甚至更優(yōu)選至少80%并且最優(yōu)選至少100%。這些術(shù)語還可表示這樣的情況，其中在O時(shí)間沒有可檢出的某些化合物或病癥的信號，而在O時(shí)間之后的特定時(shí)間點(diǎn)有可檢出的某些化合物或病癥的信號。
[0319]術(shù)語“免疫等效”意為例如對于免疫作用的類型(例如誘導(dǎo)體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答)、所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和/或持續(xù)時(shí)間或者所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的特異性而言，免疫等效分子(例如免疫等效氨基酸序列)表現(xiàn)出相同或基本相同的免疫特性和/或發(fā)揮相同或基本相同的免疫作用。在本發(fā)明的情況中，術(shù)語“免疫等效”優(yōu)選地是相對于免疫的肽或肽變體的免疫作用或特性而使用的。特定的免疫特性是與抗體結(jié)合和(在適當(dāng)情況下)產(chǎn)生免疫應(yīng)答(優(yōu)選地通過刺激抗體的產(chǎn)生)的能力。例如，如果所述氨基酸序列在暴露于對象的免疫系統(tǒng)時(shí)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)(優(yōu)選抗體，其具有與參比氨基酸序列(例如，所述參比氨基酸序列形成CLDN6的一部分)反應(yīng)的特異性)，則所述氨基酸序列與參比氨基酸序列免疫等效。
[0320]在本文的情況中，術(shù)語“免疫效應(yīng)功能”包括免疫系統(tǒng)的組分所介導(dǎo)的任何功能，其導(dǎo)致抑制腫瘤生長和/或抑制腫瘤發(fā)生，包括抑制腫瘤的播散和轉(zhuǎn)移。優(yōu)選地，免疫效應(yīng)功能導(dǎo)致殺傷腫瘤細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的情況中的免疫效應(yīng)功能是抗體介導(dǎo)的效應(yīng)功能。這樣的功能包括補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(CDC)、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)、在帶有腫瘤相關(guān)抗原的細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡(例如，通過抗體與表面抗原的結(jié)合)和/或抑制帶有腫瘤相關(guān)抗原之細(xì)胞的增殖，優(yōu)選ADCC和/或CDC。因此，能夠介導(dǎo)一種或更多種免疫效應(yīng)功能的抗體優(yōu)選地能夠通過誘導(dǎo)CDC介導(dǎo)的裂解、ADCC介導(dǎo)的裂解、凋亡、同型黏著和/或吞噬作用(優(yōu)選通過誘導(dǎo)CDC介導(dǎo)的裂解和/或ADCC介導(dǎo)的裂解)介導(dǎo)對細(xì)胞的殺傷。抗體還可簡單地通過與腫瘤細(xì)胞表面上的腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合而發(fā)揮作用。例如，抗體可僅通過與腫瘤細(xì)胞表面上的腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合而阻斷腫瘤相關(guān)抗原的功能或誘
導(dǎo)凋亡。
具體實(shí)施方案
[0321]mAb作用的機(jī)制
[0322]盡管以下提供對作為本發(fā)明抗體治療效果之基礎(chǔ)的機(jī)制的考慮，但不認(rèn)為這是以任何方式限制本發(fā)明。
[0323]本文中描述的抗體可與免疫系統(tǒng)的組分相互作用，優(yōu)選通過ADCC或⑶C相互作用。本發(fā)明的抗體還可用于使有效負(fù)載(例如，放射性同位素、藥物或毒素)靶向以直接殺傷腫瘤細(xì)胞或可與常規(guī)化療劑協(xié)同使用，通過補(bǔ)充作用機(jī)制(可包括抗腫瘤免疫應(yīng)答，其可因化療劑對T淋巴細(xì)胞的毒性副作用而被破壞)攻擊腫瘤。然而，本發(fā)明的抗體還可通過簡單地與細(xì)胞表面的CLDN6結(jié)合(因而例如阻斷細(xì)胞的增殖)而發(fā)揮作用。
[0324]抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用
[0325]ADCC描述本文中描述的效應(yīng)細(xì)胞(特別是淋巴細(xì)胞)的細(xì)胞殺傷能力，這優(yōu)選地要求靶細(xì)胞被抗體所標(biāo)記。
[0326] 當(dāng)抗體與腫瘤細(xì)胞上的抗原結(jié)合并且抗體Fe結(jié)構(gòu)域占用免疫效應(yīng)細(xì)胞表面上的Fe受體(FcR)時(shí)，ADCC優(yōu)選地發(fā)生。已鑒定多個(gè)家族的Fe受體，并且特定細(xì)胞群特征性地表達(dá)確定的Fe受體。ADCC可被視為直接誘導(dǎo)不同程度的即時(shí)腫瘤破壞的機(jī)制，其導(dǎo)致抗原呈遞以及腫瘤指導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)。優(yōu)選地，體內(nèi)誘導(dǎo)ADCC將導(dǎo)致腫瘤指導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答和宿主源性抗體應(yīng)答。
[0327]補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用
[0328]CDC是另一種抗體指導(dǎo)的細(xì)胞殺傷方法。IgM是補(bǔ)體激活的最有效同種型。通過經(jīng)典的補(bǔ)體激活途徑，IgGl和IgG3也均非常有效地指導(dǎo)⑶C。優(yōu)選地，在該級聯(lián)中，抗原-抗體復(fù)合物的形成導(dǎo)致所參與的抗體分子(例如，IgG分子)的(^2結(jié)構(gòu)域上暴露多個(gè)緊鄰的Clq結(jié)合位點(diǎn)(Clq是補(bǔ)體Cl的三個(gè)亞組分之一)。優(yōu)選地，這些暴露的Clq結(jié)合位點(diǎn)將之前低親和力的Clq-1gG相互作用轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂H和力的相互作用，這觸發(fā)與一系列其他補(bǔ)體蛋白相關(guān)的事件級聯(lián)，并導(dǎo)致蛋白水解釋放效應(yīng)細(xì)胞趨化/激活劑C3a和C5a。優(yōu)選地，補(bǔ)體級聯(lián)在膜攻擊復(fù)合物形成后結(jié)束，所述膜攻擊復(fù)合物在細(xì)胞膜中產(chǎn)生孔，其促進(jìn)水和溶質(zhì)自由進(jìn)出所述細(xì)胞。
[0329]抗體的產(chǎn)生
[0330]可通過多種技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的抗體，所述技術(shù)包括常規(guī)的單克隆抗體法，例如Kohler and Milstein,Nature256:495(1975)的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)。盡管優(yōu)選體細(xì)胞雜交法，原則上可采用用于產(chǎn)生單克隆抗體的其他技術(shù)，例如病毒或癌基因轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞或使用抗體基因文庫的噬菌體展示技術(shù)。
[0331]用于制備分泌單克隆抗體之雜交瘤的優(yōu)選動(dòng)物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。小鼠中的雜交瘤生產(chǎn)是非常完善的方法。分離用于融合的經(jīng)免疫脾細(xì)胞的免疫方案和技術(shù)是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。融合伴侶(例如，鼠骨髓瘤細(xì)胞)和融合方法也是已知的。
[0332]用于制備分泌單克隆抗體的雜交瘤的其他優(yōu)選動(dòng)物系統(tǒng)是大鼠和兔系統(tǒng)(例如描述于 Spieker-Polet 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.92:9348 (1995)，還參見 Rossi 等，Am.J.Clin.Pathol.124:295 (2005))。
[0333]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可使用帶有部分人免疫系統(tǒng)(而非小鼠系統(tǒng))的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠來生成抗CLDN6的人單克隆抗體。這些轉(zhuǎn)基因的和轉(zhuǎn)染色體的小鼠包括分別稱為HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且其在本文中統(tǒng)稱為“轉(zhuǎn)基因小鼠”?？砂凑誛02004 035607中對⑶20的詳細(xì)描述來在這樣的轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生人抗體。
[0334]用于生成單克隆抗體的另一個(gè)策略是從所定義策略的產(chǎn)生抗體之淋巴細(xì)胞中直接分離編碼抗體的基因，例如參見Babcock等，1996 ;A novel strategy for generatingmonoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies ofdefined strategy。對于重組抗體工程的細(xì)節(jié)還參見 Welschof and Kraus, Recombinantantibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 和 Benny K.C.Lo AntibodyEngineering ISBN1-58829-092-1。
[0335]免疫
[0336]如所描述的那樣可用載劑綴合的源自CLDN6序列的肽(其是重組表達(dá)的CLDN6抗原或其片段和/或表達(dá)CLDN6或其片段之細(xì)胞的富集的制備物)免疫接種小鼠以生成抗CLDN6抗體?；蛘撸捎肈NA編碼的全長人CLDN6或其片段免疫接種小鼠。在使用純化的或富集的CLDN6抗原制備物免疫接種不產(chǎn)生抗體的情況中，還可用表達(dá)CLDN6的細(xì)胞(例如，細(xì)胞系)免疫接種小鼠以促進(jìn)免疫應(yīng)答。
[0337]可在免疫方案的過程中監(jiān)控免疫應(yīng)答，其中通過尾靜脈或后眼眶取血來獲得血漿和血清樣品。具有足夠效價(jià)的抗CLDN6免疫球蛋白的小鼠可用于融合。在處死和取出脾之前3~5天，可用表達(dá)CLDN6的細(xì)胞腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)加強(qiáng)小鼠以升高分泌特定抗體之雜交瘤的比例。
[0338]生成產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤
[0339]為生成產(chǎn)生抗CLDN6單克隆抗體的雜交瘤，可分離獲自經(jīng)免疫小鼠的淋巴結(jié)或脾的細(xì)胞，并使其與合適的永生化細(xì)胞系(例如，小鼠骨髓瘤細(xì)胞系)融合。隨后可從所產(chǎn)生的雜交瘤中篩選抗原特異性抗體的產(chǎn)生。隨后可通過ELISA從各個(gè)孔篩選分泌抗體的雜交瘤。使用表達(dá)CLDN6的細(xì)胞，通過免疫熒光和FACS分析來鑒定對CLDN6具有特異性的抗體?？稍俅谓臃N分泌抗體的雜交瘤，再次篩選，并且如果其仍然是抗CLDN6單克隆抗體陽性，則可通過有限稀釋進(jìn)行亞克隆?？呻S后體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆以在組織培養(yǎng)基中生成用于表征的抗體。
[0340]生成產(chǎn)生單克隆抗體的轉(zhuǎn)染瘤
[0341]還可使用例如現(xiàn)有技術(shù)(Morrison，S.(1985) Science229:1202)中公知的重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合以在宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤中產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。
[0342] 例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，可將目的基因(例如，抗體基因)連接到表達(dá)載體(例如，真核表達(dá)質(zhì)粒(例如，w087/04462、w089/01036和EP338 841中公開的GS基因表達(dá)系統(tǒng)或現(xiàn)有技術(shù)中公知的其他表達(dá)系統(tǒng)所使用的真核表達(dá)質(zhì)粒))中?？蓪⒕哂兴寺〉目贵w基因的純化質(zhì)粒引入真核宿主細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞、NS/0細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞或HEK293細(xì)胞或者其他真核細(xì)胞，例如植物來源的細(xì)胞、真菌或酵母細(xì)胞。用于引入這些基因的方法可以是現(xiàn)有技術(shù)中所描述的方法，例如電穿孔、lipofectine、lipofectamine等。將這些抗體基因引入宿主細(xì)胞之后，可鑒定和選擇表達(dá)所述抗體的細(xì)胞。這些細(xì)胞代表轉(zhuǎn)染瘤，隨后可放大其表達(dá)水平并提高規(guī)模以產(chǎn)生抗體?？蓮倪@些培養(yǎng)上清液和/或細(xì)胞中分離和純化重組抗體。
[0343]或者，可在其他表達(dá)系統(tǒng)(包括原核細(xì)胞(例如微生物(例如大腸桿菌(E.coli)))中表達(dá)所克隆的抗體基因。此外，可在轉(zhuǎn)基因的非人動(dòng)物中產(chǎn)生抗體，例如在來自綿羊和兔的奶中，或在來自母雞的卵中，或在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生；參見例如Verma，R.，等(1998)J.1mmunol.Meth.216:165-181 ；Pollock,等(1999)J.1mmunol.Meth.231:147-157 ；和 Fischer, R.，等(1999)Biol.Chem.380:825-839。
[0344]使用部分抗體序列來表達(dá)完整抗體(即，人源化和嵌合化)。
[0345]a)嵌合化
[0346]當(dāng)用毒素或放射性同位素標(biāo)記后，鼠單克隆抗體可在人中被用作治療性抗體。非標(biāo)記的鼠抗體在人中是高度免疫原性的，當(dāng)重復(fù)應(yīng)用后導(dǎo)致治療作用的降低。主要的免疫原性是通過重鏈恒定區(qū)介導(dǎo)的。如果使各個(gè)抗體嵌合化或人源化，可降低或完全避免鼠抗體在人中的免疫原性。嵌合抗體是其中的不同部分來自不同動(dòng)物物種的抗體，例如具有來自鼠抗體可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體?？贵w的嵌合化是通過將鼠抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)與人重鏈和輕鏈恒定區(qū)相連接而實(shí)現(xiàn)的(例如,Kraus等在Methods in MolecularBiology series,Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 中所描述的那樣)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌合抗體是通過將人K-輕鏈恒定區(qū)與鼠輕鏈可變區(qū)相連接而生成的。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可通過將人λ-輕鏈恒定區(qū)與鼠輕鏈可變區(qū)相連接而生成嵌合抗體。優(yōu)選的用于生成嵌合抗體的重鏈恒定區(qū)是IgGl、IgG3和IgG4。其他優(yōu)選的用于生成嵌合抗體的重鏈恒定區(qū)是IgG2、IgA、IgD和IgM。
[0347]b)人源化
[0348]抗體主要通過位于6個(gè)重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)中的氨基酸殘基與目標(biāo)抗原相互作用。為此，在各個(gè)抗體之間，CDR中的氨基酸序列比CDR外的序列更多樣化。因?yàn)镃DR序列負(fù)責(zé)多數(shù)抗體-抗原相互作用，通過構(gòu)建包含從具有不同特性的不同抗體移植到框架序列上的來自特定天然抗體⑶R序列的表達(dá)載體，可表達(dá)模擬特定天然抗體之特性的重組抗體(參見例如 Riechmann, L.等(1998)Nature332:323-327 ；Jones, P.等(1986)Nature321:522-525 ；和 Queen，C.等(1989) Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.86:10029-10033)。這樣的框架序列可獲自包含種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫。這些種系序列會不同于成熟的抗體基因序列，因?yàn)樗鼈儾粫暾M裝的可變區(qū)基因，其是通過B細(xì)胞成熟過程中的V (D) J連接而形成的。在每個(gè)均勻地分布的可變區(qū)，種系基因序列還會不同于高親和力的二級全套抗體的序列。例如，體細(xì)胞突變在框架區(qū)I的氨基末端部分和在框架區(qū)4的羧基末端部分中相對罕見。此外，很多體細(xì)胞突變不明顯地改變抗體的結(jié)合特性。為此，并不必需獲得具體抗體的整個(gè)DNA序列以重新產(chǎn)生具有與原抗體相似結(jié)合特性的完整重組抗體(見W099/45962)?？缭紺DR區(qū)的部分重鏈和輕鏈序列通常足以用于該目的。所述部分序列被用于測定哪個(gè)種系可變區(qū)段和連接基因區(qū)段貢獻(xiàn)于重組的抗體可變基因。隨后將種系序列用于填充可變區(qū)的缺失部分。在蛋白質(zhì)成熟的過程中切除重鏈和輕鏈前導(dǎo)序列，其并不貢獻(xiàn)于最終抗體的特性。為了添加丟失的序列，可通過連接或PCR擴(kuò)增來將被克隆的cDNA序列與合成的寡核苷酸組合?；蛘?，可作為一組短的、重疊的、寡核苷酸來合成整個(gè)可變區(qū)，并通過PCR擴(kuò)增來組合以產(chǎn)生整個(gè)合成的可變區(qū)克隆。該過程具有某些優(yōu)勢，例如清除或包含特定的限制位點(diǎn)，或者優(yōu)化特定的密碼子。
[0349]使用來自雜交瘤的重鏈和輕鏈核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄物來設(shè)計(jì)重疊組的合成寡核苷酸以產(chǎn)生具有與天然序列相同氨基酸編碼能力的合成V序列。合成的重鏈和K鏈序列可以如下三種方式不同于天然序列:重復(fù)的核苷酸堿基串被中斷以促進(jìn)寡核苷酸合成和PCR擴(kuò)增;根據(jù) Kozak 規(guī)則(Kozak, 1991，J.Biol.Chem.266:19867-19870)并入最佳的翻譯起始位點(diǎn)；以及在翻譯起始位點(diǎn)的上游設(shè)計(jì)HindIII位點(diǎn)。
[0350]對于重鏈和輕鏈可變區(qū)，優(yōu)化的編碼和對應(yīng)的非編碼鏈序列大約在對應(yīng)的非編碼寡核苷酸的中點(diǎn)處被分解成30~50個(gè)核苷酸。因此，對于每條鏈，所述寡核苷酸可被組裝成為跨越150~400個(gè)核苷酸區(qū)段的重疊雙鏈組。隨后將匯集池(pool)用作模板以產(chǎn)生150~400個(gè)核苷酸的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。一般來說，單個(gè)可變區(qū)核苷酸組將被分解成兩個(gè)匯集池，其被分別擴(kuò)增以生成兩個(gè)重疊的PCR產(chǎn)物。隨后通過PCR擴(kuò)增將這些重疊的產(chǎn)物組合以形成完整的可變區(qū)。還可在PCR擴(kuò)增中理想地包括重鏈或輕鏈恒定區(qū)的重疊片段以生成很容易被克隆到表達(dá)載體構(gòu)建體中的片段。 [0351]隨后將所重建的嵌合化的或人源化的重鏈和輕鏈可變區(qū)與克隆的啟動(dòng)子、前導(dǎo)、翻譯起始、恒定區(qū)、3’非翻譯、聚腺嘌呤和轉(zhuǎn)錄終止序列組合以形成表達(dá)載體構(gòu)建體。重鏈和輕鏈表達(dá)構(gòu)建體可組合到單個(gè)載體中，共轉(zhuǎn)染、先后轉(zhuǎn)染或分別轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，隨后使所述宿主細(xì)胞融合形成表達(dá)這兩個(gè)鏈的宿主細(xì)胞。描述了用于構(gòu)建人IgGK表達(dá)載體的質(zhì)粒?？蛇@樣構(gòu)建所述質(zhì)粒，以使PCR擴(kuò)增的V重鏈和VK輕鏈cDNA序列可被用于重新構(gòu)建完整的重鏈和輕鏈小基因(minigene)。這些質(zhì)?？杀挥糜谕暾乇磉_(dá)人或嵌合IgGl，K或IgG4，K抗體?？蓸?gòu)建類似的質(zhì)粒用于表達(dá)其他重鏈同種型，或用于表達(dá)包含λ輕鏈的抗體。
[0352]因此，在本發(fā)明的另一方面中，使用本發(fā)明抗CLDN6抗體的結(jié)構(gòu)特征以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)相關(guān)的人源化抗CLDN6抗體，其保持至少一種本發(fā)明抗體的功能特性(例如，與CLDN6結(jié)合)。更具體地說，小鼠單克隆抗體的一個(gè)或更多個(gè)CDR區(qū)可與已知的人框架區(qū)和CDR重組地組合以產(chǎn)生本發(fā)明的其他重組設(shè)計(jì)的人源化抗CLDN6抗體。
[0353]與表達(dá)抗原之細(xì)胞的結(jié)合
[0354]使用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)合測定(例如，實(shí)施例中列出的測定(例如，ELISA、Western印跡、免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)分析))，可測定抗體與CLDN6結(jié)合的能力。
[0355]分離和表征抗體
[0356]為純化抗CLDN6抗體，可將所選擇的雜交瘤培養(yǎng)于兩升的旋轉(zhuǎn)瓶(spinner-flask)中用于單克隆抗體的純化?；蛘?，可在基于透析的生物反應(yīng)器中產(chǎn)生抗CLDN6抗體。可過濾上清液，(如果必要的話)濃縮，隨后用蛋白質(zhì)G-瓊脂糖凝膠(sepharose)或蛋白質(zhì)A-瓊脂糖凝膠進(jìn)行親和層析?？赏ㄟ^凝膠電泳和高效液相色譜驗(yàn)證被洗脫的IgG以確保純度。緩沖溶液可更換為PBS，并且可使用1.43的消光系數(shù)通過0D280測定濃度。可將單克隆抗體分裝并儲存于_80°C。
[0357]為了測定所選擇的抗CLDN6單克隆抗體是否與獨(dú)特的表位結(jié)合，可使用位點(diǎn)定向誘變或多位點(diǎn)定向誘變。
[0358]同種型測定
[0359]為測定純化抗體的同種型，可用多種商業(yè)化試劑盒(例如，Zymed, RocheDiagnostics)進(jìn)行同種型ELISA?？捎每剐∈驣g包被微滴定板的孔。封閉之后，使所述板與單克隆抗體或純化的同種型對照在環(huán)境溫度下反應(yīng)兩小時(shí)。隨后，可使所述孔與小鼠IgGl、IgG2a、IgG2b或IgG3、IgA或小鼠IgM特異性的過氧化物酶綴合的探針反應(yīng)。清洗之后，可用ABTS底物(lmg/ml)顯色,并分析405~650的0D?；蛘?可按照制造商的描述使用 IsoStrip 小鼠單克隆抗體同種型試劑盒(Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit)(Roche, Cat.N0.1493027)。
[0360]流式細(xì)胞術(shù)分析
[0361]為了證明經(jīng)免疫小鼠的血清中存在抗CLDN6抗體或者單克隆抗體與表達(dá)CLDN6的活細(xì)胞相結(jié)合，可使用流式細(xì)胞術(shù)。可將天然或轉(zhuǎn)染后表達(dá)CLDN6的細(xì)胞系和缺乏CLDN6表達(dá)的陰性對照(在標(biāo)準(zhǔn)生長條件下生長)與多種濃度的雜交瘤上清液中或含有1% FBS的PBS中的單克隆抗體混合，并可在4°C下孵育30分鐘。清洗之后，可在與一抗染色相同的條件下使APC或Alexa647標(biāo)記的IgG抗體與結(jié)合了 CLDN6的單克隆抗體結(jié)合。利用光和側(cè)向散射特性對單種活細(xì)胞進(jìn)行圈門，可用FACS儀通過流式細(xì)胞術(shù)分析樣品。為了在單次測量中從非特異性的結(jié)合物中區(qū)分CLDN6特異性的單克隆抗體，可應(yīng)用共轉(zhuǎn)染的方法。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染編碼CLDN6的質(zhì)粒，并可按照上文中的描述對熒光標(biāo)志物進(jìn)行染色。與抗體染色的細(xì)胞相比，可在不同的熒光通道中檢測經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。因?yàn)榇蠖鄶?shù)經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)這兩種轉(zhuǎn)基因，CLDN6特異性的單克隆抗體優(yōu)先與表達(dá)熒光標(biāo)志物的細(xì)胞結(jié)合，而非特異性抗體以與非轉(zhuǎn)染細(xì)胞相當(dāng)?shù)谋嚷式Y(jié)合。除了流式細(xì)胞術(shù)測定之外或替代該測定，可使用應(yīng)用熒光顯微鏡的替代測定。可按照上文的描述準(zhǔn)確地對細(xì)胞進(jìn)行染色，并通過熒光顯微鏡檢測。
[0362]免疫熒光顯微鏡檢查
[0363]為了證明經(jīng)免疫小鼠的血清中存在抗CLDN6抗體或單克隆抗體與表達(dá)CLDN6的活細(xì)胞結(jié)合，可使用免疫熒光顯微鏡分析。例如，在標(biāo)準(zhǔn)生長條件下，在補(bǔ)充有10%胎牛血清(fetal calf serum, FCS)、2mM L-谷氨酰胺、lOOIU/ml 青霉素和 100 μ g/ml 鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，使自然地或轉(zhuǎn)染之后表達(dá)CLDN6的細(xì)胞系和缺乏CLDN6表達(dá)的陰性對照生長于腔式載玻片(chamber slide)中。可隨后將細(xì)胞與甲醇或多聚甲醛固定，或者不處理。隨后，可使細(xì)胞與抗CLDN6的單克隆抗體在25°C下反應(yīng)30分鐘。清洗之后，可使細(xì)胞與Alexa555標(biāo)記的抗小鼠IgG 二抗(分子探針)在相同的條件下反應(yīng)?？呻S后通過熒光顯微鏡檢查細(xì)胞。
[0364]當(dāng)用甲醇固定或用多聚甲醛固定并用Triton X_100透化細(xì)胞之后，可觀察細(xì)胞中的總CLDN6水平?？稍诨罴?xì)胞和未透化的多聚甲醛固定的細(xì)胞中檢測CLDN6的表面定位。通過用緊密連接標(biāo)志物(例如Z0-1)共染色，可分析CLDN6與緊密連接的其他靶向。此外，可檢測抗體結(jié)合的作用和CLDN6在細(xì)胞膜中的定位。
[0365]Western 印跡
[0366]還可通過Western印跡測試抗CLDN6IgG與CLDN6抗原的反應(yīng)性。簡單地說，可制備來自表達(dá)CLDN6之細(xì)胞的細(xì)胞提取物和合適的陰性對照，并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳之后，所分離的抗原將被轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，封閉，用要測試的單克隆抗體探查?？墒褂每剐∈驣gG過氧化物酶檢測IgG結(jié)合，并用ECL底物顯色。
[0367]免疫組織化學(xué)[0368]可通過以技術(shù)人員公知的方式(例如，使用來自非癌組織或癌組織樣品的多聚甲醛或丙酮固定的冰凍切片或用多聚甲醛固定的石蠟包埋的組織切片，所述樣品獲自常規(guī)外科手術(shù)過程中的患者或者獲自用自然地或轉(zhuǎn)染之后表達(dá)CLDN6之細(xì)胞系接種的攜帶異種移植腫瘤的小鼠)進(jìn)行免疫組織化學(xué)來進(jìn)一步測試抗CLDN6小鼠IgG與CLDN6抗原的反應(yīng)性。對于免疫染色，可孵育與CLDN6反應(yīng)的抗體，隨后根據(jù)供應(yīng)商的使用說明用辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠或山羊抗兔抗體(DAKO)孵育。
[0369]抗體的體外吞噬和細(xì)胞殺傷活性
[0370]除了與CLDN6特異性地結(jié)合，可測試抗CLDN6抗體介導(dǎo)吞噬和殺傷表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征之細(xì)胞的能力。在體內(nèi)模型中篩選之前，單克隆抗體體外活性的測試將提供初始篩選。
[0371]抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC):
[0372]簡單地說，可通過Ficoll Hypaque密度離心純化來自健康供體的多形核細(xì)胞(polymorphonuclear cell, PMN)、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞或其他效應(yīng)細(xì)胞，隨后裂解所污染的紅細(xì)胞。可將經(jīng)清洗的效應(yīng)細(xì)胞懸于補(bǔ)充有10%熱滅活的胎牛血清或者作為替代地補(bǔ)充有5%熱滅活的人血清的PRMI中，以多種效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的比例與用51Cr標(biāo)記的表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征的靶細(xì)胞混合?；蛘?，可以用熒光增強(qiáng)的配體(BATDA)標(biāo)記靶細(xì)胞?？赏ㄟ^熒光計(jì)測量從死細(xì)胞釋放的銪與增強(qiáng)的配體的高度熒光的螯合物。 另一種作為替代的技術(shù)可利用螢光素酶轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞。所添加的熒光黃(lucifer yellow)隨后可僅被活細(xì)胞氧化。可隨后以多種濃度添加純化的抗CLDN6IgG?？墒褂脽o關(guān)的人IgG作為陰性對照。測定可在37°C下進(jìn)行4至20小時(shí)，這取決于所使用的效應(yīng)細(xì)胞?？赏ㄟ^測量培養(yǎng)物上清液中的51Cr釋放或EuTDA螯合物的存在來測定樣品的細(xì)胞溶解?；蛘?，熒光黃氧化所產(chǎn)生的發(fā)光可以是活細(xì)胞的量度。
[0373]還可在多種組合中測試抗CLDN6單克隆抗體以確定細(xì)胞溶解是否被多種單克隆抗體所加強(qiáng)。
[0374]補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(CDC):
[0375]使用多種已知的技術(shù)可測試單克隆的抗CLDN6抗體介導(dǎo)⑶C的能力。例如，可以以技術(shù)人員已知的方式從血液中獲得用于補(bǔ)體的血清。為了測定HiAb的CDC活性，可使用不同的方法。例如可測量51Cr釋放或可使用碘化丙唳(propidium iodide, PI)排除測定來評價(jià)升高的膜通透性。簡單地說，可清洗靶細(xì)胞，并且可用多種濃度的mAb在室溫下或在37°C下孵育5X 105/ml靶細(xì)胞10~30分鐘?？呻S后添加血清或血漿至終濃度為20% (v/v)，并在37°C下孵育細(xì)胞20~30分鐘?？蓪碜悦總€(gè)樣品的所有細(xì)胞添加至FACS管中的PI溶液中。隨后可通過使用FACSArray的流式細(xì)胞術(shù)分析立即分析該混合物。
[0376]在作為替代的測定中，可在黏附的細(xì)胞上測定CDC的誘導(dǎo)。在該測定的一個(gè)實(shí)施方案中，在測定前24小時(shí)，在組織培養(yǎng)平底微滴定板中以3X IO4/孔的密度接種細(xì)胞。次日，除去生長培養(yǎng)基，并以三個(gè)重復(fù)用抗體孵育所述細(xì)胞。用生長培養(yǎng)基或含有0.2%皂苷的生長培養(yǎng)基孵育對照細(xì)胞用于分別測定背景裂解和最大裂解。在室溫下孵育20分鐘之后，除去上清液，并向細(xì)胞中添加DMEM(預(yù)熱至37°C )中的20% (v/v)人血漿或血清，并在37°C下再孵育20分鐘。將來自每個(gè)樣品的所有細(xì)胞添加至碘化丙啶溶液(10 μ g/ml)中。隨后，用含有2.5 μ g/ml溴化乙錠的PBS替換上清液，并使用Tecan Satire在600nm測量以520nm激發(fā)后的突光發(fā)射。按以下計(jì)算比裂解(specific lysis)的百分比:％比裂解=(熒光樣品-熒光背景)/(熒光最大裂解-熒光背景)X 100。
[0377]單克隆抗體抑制細(xì)胞增殖
[0378]為測試啟動(dòng)凋亡的能力，可例如在37 °C下將單克隆的抗CLDN6抗體與CLDN6陽性腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)染了 CLDN6的腫瘤細(xì)胞一起孵育約20小時(shí)?？墒斋@細(xì)胞，在膜聯(lián)蛋白-V(Annexin-V)結(jié)合緩沖液(BD biosciences)中清洗，與FITC或APC綴合的膜聯(lián)蛋白V(BD biosciences) 一起在黑暗中孵育15分鐘。將來自每個(gè)樣品的所有細(xì)胞添加至FACS管中的PI (10 μ g/ml于PBS中)溶液中，立即通過流式細(xì)胞術(shù)(見上文)進(jìn)行評價(jià)?；蛘?，可用可商購的試劑盒檢測單克隆抗體對細(xì)胞增殖的總體抑制。DELFIA細(xì)胞增殖試劑盒(Perkin-Elmer，Cat.N0.AD0200)是基于對微板中增殖細(xì)胞的DNA合成過程中5-溴-2'-脫氧尿苷(5-bromo_2 ' -deoxyuridine, BrdU)并入之測量的非同位素免疫測定。使用銪標(biāo)記的單克隆抗體檢測所并入的BrdU。為允許抗體檢測，使用固定液(fixsolution)固定細(xì)胞并使DNA變性。洗掉未結(jié)合的抗體,并向從標(biāo)記的抗體解離到溶液中的銪離子中添加DELFIA誘導(dǎo)劑，其中它們與DELFIA誘導(dǎo)劑的組分形成高度熒光的螯合物。所測得的熒光(在檢測中應(yīng)用時(shí)間分辨熒光測定)與每個(gè)孔的細(xì)胞中DNA的合成成比例。
[0379]臨床前研究
[0380]可在體內(nèi)模型中(例如，在以(可能在轉(zhuǎn)染之后)表達(dá)CLDN6的細(xì)胞系接種的攜帶異種移植腫瘤的免疫缺陷的小鼠中)測試與CLDN6結(jié)合的單克隆抗體以確定其在控制表達(dá)CLDN6之腫瘤細(xì)胞的生長中的效力。
[0381] 在將表達(dá)CLDN6之腫瘤細(xì)胞異種移植到免疫受損的小鼠或其他動(dòng)物中之后可使用本發(fā)明的抗體進(jìn)行體內(nèi)研究。可向無腫瘤小鼠施用抗體，隨后注射腫瘤細(xì)胞以測量抗體預(yù)防腫瘤形成或腫瘤相關(guān)癥狀的作用?？上蚝闪鲂∈笫┯每贵w以確定每種抗體降低腫瘤生長、轉(zhuǎn)移或腫瘤相關(guān)癥狀的治療效果?？贵w應(yīng)用可與其他物質(zhì)(例如，抑制細(xì)胞的藥物、生長因子抑制劑、細(xì)胞周期阻斷劑、血管發(fā)生抑制劑或其他抗體)的應(yīng)用相組合以測定組合的協(xié)同效力和潛在毒性。為分析本發(fā)明抗體所介導(dǎo)的毒性副作用，可用抗體或?qū)φ赵噭┙臃N動(dòng)物，并徹底地研究可能與CLDN6抗體治療相關(guān)的癥狀。體內(nèi)應(yīng)用CLDN6抗體的可能的副作用特別地包括表達(dá)CLDN6之組織(包括胎盤)中的毒性。在人和其他物種(例如，小鼠)中識別CLDN6的抗體特別地可用于預(yù)測在人中應(yīng)用單克隆CLDN6抗體所介導(dǎo)的潛在副作用。
[0382]表位作圖
[0383]可按照“EpitopeMapping Protocols (Methods in Molecular Biology) by GlennE.Morris ISBN-089603-375-9 和 “Epitope Mapping:A Practical Approach” PracticalApproach Series, 248by Olwyn M.R.Westwood, Frank C.Hay 中的詳細(xì)描述來進(jìn)行本發(fā)明抗體所識別表位的作圖。
[0384]1.與CLDN6結(jié)合的雙特異性/多特異性分子
[0385]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗CLDN6抗體可被衍生化或與其他功能分子(例如，其他肽或蛋白質(zhì)(例如，F(xiàn)ab'片段))相連接以生成與多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)或目標(biāo)表位結(jié)合的雙特異性或多特異性分子。例如，本發(fā)明的抗體可與一個(gè)或更多個(gè)其他結(jié)合分子(例如，其他抗體、肽或結(jié)合模擬物)功能性地連接(例如，通過化學(xué)偶連、基因融合、非共價(jià)締合等)。[0386]因此，本發(fā)明包括雙特異性和多特異性分子，其包含至少一個(gè)對CLDN6的第一結(jié)合特異性和對第二目標(biāo)表位的第二結(jié)合特異性。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述第二目標(biāo)表位是Fe受體(例如,人Fe- Y RI (⑶64)或人Fe- α受體(⑶89),或者T細(xì)胞受體(例如，⑶3)。因此，本發(fā)明包括能夠與表達(dá)Fc-Y R、Fc_a R或Fe-eR之效應(yīng)細(xì)胞(例如，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或多形核細(xì)胞(PMN))以及與表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征之靶細(xì)胞相結(jié)合的雙特異性和多特異性分子。這些雙特異性和多特異性分子可將表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征之細(xì)胞靶向效應(yīng)細(xì)胞，并且可觸發(fā)Fe受體介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞活性，例如吞噬表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征的細(xì)胞、抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒作用(ADCC)、細(xì)胞因子釋放或生成超氧陰離子。
[0387]本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子還可包括除了抗Fe結(jié)合特異性和抗CLDN6結(jié)合特異性之外的第三結(jié)合特異性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第三結(jié)合特異性是抗增強(qiáng)因子(enhancement factor, EF)部分,例如與參與細(xì)胞毒活性并因而升高對祀細(xì)胞的免疫應(yīng)答之表面蛋白質(zhì)相結(jié)合的分子?！翱乖鰪?qiáng)因子部分”可以是抗體、功能性抗體片段或與給定分子(例如，抗原或受體)相結(jié)合的配體，并因而導(dǎo)致增強(qiáng)對Fe受體或靶細(xì)胞抗原的結(jié)合決定簇作用?！翱乖鰪?qiáng)因子部分”可與Fe受體或靶細(xì)胞抗原結(jié)合?；蛘?，所述抗增強(qiáng)因子部分可與這樣的實(shí)體結(jié)合，所述實(shí)體不同于以第一和第二結(jié)合特異性結(jié)合的實(shí)體。例如，所述抗增強(qiáng)子因子部分可與細(xì)胞毒T細(xì)胞(例如，通過⑶2、⑶3、⑶8、⑶28、⑶4、⑶40、ICAM-1或?qū)е律邔Π屑?xì)胞之免疫應(yīng)答的其他免疫細(xì)胞)相結(jié)合。
[0388]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子包含作為結(jié)合特異性的至少一個(gè)抗體(包括例如Fab、Fab'、F(ab' ) 2、Fv或單鏈Fv)。所述抗體還可以是輕鏈或重鏈二聚體或其任何最小片段(例如，Ladner等，US4, 946，778中描述的單鏈構(gòu)建體或Fv)。所述抗體還可以是US2003/0118592和US2003/0133939中公開的結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)。
[0389]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子包含對存在于效應(yīng)細(xì)胞表面上的Fe-YR或Fe-a R的結(jié)合特異性，以及對靶細(xì)胞抗原(例如，CLDN6)的第二結(jié)合特異性。
[0390]在一個(gè)實(shí)施方案中，通過單克隆抗體提供對Fe受體的結(jié)合特異性，所述結(jié)合不被人免疫球蛋白G(IgG)所阻斷。本文中使用的術(shù)語“IgG受體”是指位于I號染色體上的八個(gè)Y-鏈基因中的任一個(gè)。這些基因編碼總共12個(gè)跨膜或可溶的受體同種型，其分為三個(gè)Fe- Y 受體類別:Fc- Y RI (CD64)、Fe- y RII (CD32)和 Fe- y RIII (CD16)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Fe-Y受體是人高親和力Fe-Y RI。
[0391]在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過與人IgA受體(例如，F(xiàn)e- α受體(Fe-aRI (CD89)))結(jié)合的抗體提供對Fe受體的結(jié)合特異性，所述結(jié)合優(yōu)選地不被人免疫球蛋白A(IgA)所阻斷。術(shù)語“IgA受體”意在包括位于19號染色體上的一個(gè)α-基因(Fc-aRI)的基因產(chǎn)物。已知該基因編碼多種55至IlOkDa的選擇性剪接的膜同種型。Fc-aRI (⑶89)組成性地表達(dá)在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞上，但不表達(dá)在非效應(yīng)細(xì)胞群上。Fe-a RI對IgAl和IgA2都具有中度親和力，其在暴露于細(xì)胞因子(例如，G-CSF 或 GM-CSF)后升高(Morton, H.C.等(1996) Critical Reviewsin Immunologyl6:423-44 0)。已描述了四種Fe-a RI特異性的單克隆抗體(確認(rèn)為A3、A59、A62和A77)，其在IgA配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域以外結(jié)合Fc-aRI(Monteiro，R.C.等(1992)J.Tmmunol.148:1764)。
[0392]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性分子是包含兩個(gè)根據(jù)本發(fā)明的具有互補(bǔ)功能活性的單克隆抗體，例如，一個(gè)抗體主要通過誘導(dǎo)CDC發(fā)揮作用，而另一個(gè)抗體主要通過誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮作用。
[0393]本文中使用的“效應(yīng)細(xì)胞特異性抗體”是指與效應(yīng)細(xì)胞的Fe受體結(jié)合的抗體或功能性抗體片段。用于本發(fā)明的優(yōu)選的抗體在不被內(nèi)源性免疫球蛋白所結(jié)合的位點(diǎn)與效應(yīng)細(xì)胞的Fe受體結(jié)合。
[0394]本文中使用的術(shù)語“效應(yīng)細(xì)胞”是指參與免疫應(yīng)答之效應(yīng)期(而不是免疫應(yīng)答的識別和活化期)的免疫細(xì)胞。示例性的免疫細(xì)胞包括骨髓或淋巴來源的細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞(例如，B細(xì)胞和T細(xì)胞(包括細(xì)胞毒T細(xì)胞(cytolytic T cell，CTL))、殺傷細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、多形核細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。一些效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)特定的Fe受體并且執(zhí)行特定的免疫功能。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，效應(yīng)細(xì)胞能夠誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒作用(ADCC)，例如嗜中性粒細(xì)胞能夠誘導(dǎo)ADCC。例如，表達(dá)FcR的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞參與對靶細(xì)胞的特異性殺傷并且將抗原呈遞至免疫系統(tǒng)的其他組分，或者與呈遞抗原的細(xì)胞結(jié)合。在另一些實(shí)施方案中，效應(yīng)細(xì)胞可吞噬靶抗原、靶細(xì)胞或微生物?？赏ㄟ^體液因子(例如細(xì)胞因子)調(diào)節(jié)效應(yīng)細(xì)胞上特定FcR的表達(dá)。例如，已發(fā)現(xiàn)干擾素Y (IFN- Y )上調(diào)Fe- y RI的表達(dá)。這種增強(qiáng)的表達(dá)升高荷有Fe- Y RI之細(xì)胞對靶標(biāo)的細(xì)胞毒活性。效應(yīng)細(xì)胞可吞噬靶抗原或靶細(xì)胞或使其溶解。
[0395]“靶細(xì)胞”應(yīng)當(dāng)意為對象(例如，人或動(dòng)物)中可被本發(fā)明抗體所靶向的任何不合需要的細(xì)胞。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述靶細(xì)胞是表達(dá)或過表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征的細(xì)胞。表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征的細(xì)胞通常包括腫瘤細(xì)胞。
[0396]I1.免疫綴合物
[0397]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明以抗CLDN6抗體與治療部分或治療劑(例如，細(xì)胞毒素、藥物(例如，免疫抑制劑)或放射性同位素)綴合為特征。這樣的綴合物在本文中稱為“免疫綴合物”。包含一個(gè)或更多個(gè)毒素的免疫綴合物被稱為“免疫毒素”。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒劑包括對細(xì)胞有害并且特別是殺傷細(xì)胞的任何藥劑。實(shí)例包括泰素(taxol)、松胞菌素B(cytochalasin B)、短桿菌肽D(gramicidin D)、溴化乙錠、依米丁、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長春新堿、長春堿、秋水仙素、多柔比星、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、1-去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素，及其類似物或同系物。
[0398]用于形成本發(fā)明免疫綴合物的合適治療劑包括但不限于抗代謝物(例如，甲氨蝶呤、6-巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、氟達(dá)拉濱、5-氟尿嘧啶、達(dá)卡巴嗪)、烷化劑(例如，氮芥、塞替派、苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈佐星、絲裂霉素C和順式-二氯二氨鉬(II) (DDP)順鉬)、蒽環(huán)類(例如，柔紅霉素(以前稱為道諾霉素)和多柔比星)、抗生素類(例如，更生霉素(以前稱為放線菌素)、博來霉素、光神霉素和安曲霉素(anthramycin,AMC))和抗有絲分裂劑(例如，長春新堿和長春堿)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述治療劑是細(xì)胞毒劑或放射毒劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療劑是免疫抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療劑是GM-CSF。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述治療劑是多柔比星、順鉬、硫酸博來霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺或蓖麻毒蛋白A(ricin A)。
[0399]本發(fā)明的抗體還可與放射性同位素(例如，碘-131、釔-90或銦-111)綴合以生成用于治療CLDN6相關(guān)疾病(例如，癌癥)的細(xì)胞毒性的放射性藥品。本發(fā)明的抗體綴合物可用于修飾給定的生物應(yīng)答，并且藥物部分不被解釋為限于經(jīng)典的化療劑。例如，所述藥物部分可以是具有所需生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。這樣的蛋白質(zhì)可包括例如酶活性的毒素或其活性片段，例如相思豆毒蛋白(abrin)、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)，例如腫瘤壞死因子或干擾素-Y ;或者生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑，例如淋巴因子、白介素-1( “IL-1”)、白介素-2( “IL-2”)、白介素_6( “IL-6”)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細(xì)胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生長因子。 [0400]用于將這樣的治療部分與抗體綴合的技術(shù)是公知的，參見例如Arnon等，"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy",in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld 等(eds.), pp.243-56(AlanR.Liss,Inc.1985) ;Hellstrom 等，"Antibodies For Drug Delivery" , in ControlledDrug Delivery(2nd Ed.), Robinson 等(eds.), pp.623-53(Marcel Dekker, Inc.1987)；Thorpe, " Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review",in Monoclonal Antibodies' 84:Biological And Clinical Applications, Pincheraetal.(eds.), pp.475-506 (1985) ； " Analysis, Results, And Future Prospective OfTheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy" , in MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin等(eds.), pp.303-16 (AcademicPressl985), 和 Thorpe 等， "The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates" , Tmmunol.Rev.,62:119-58 (1982)。
[0401]在另一個(gè)實(shí)施方案中，將根據(jù)本發(fā)明的抗體與接頭-螯合劑(linker-chelator)(例如，替伊莫單抗(tiuxetan))相連接,這使得抗體與放射性同位素綴合。
[0402]II1.藥物組合物
[0403]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供含有本發(fā)明抗體之一或之組合的組合物(例如，藥物組合物)。可用可藥用載劑或稀釋劑以及根據(jù)常規(guī)技術(shù)(例如，Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,第 19 版，Gennaro 編，Mack Publishing C0.,Easton,PA, 1995中所公開的技術(shù))的任何其他已知輔料或賦形劑配制所述藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含以不同機(jī)制發(fā)揮作用的本發(fā)明的多種(例如，兩種或更多種)分離的抗體的組合，例如，主要通過誘導(dǎo)CDC而發(fā)揮作用的一種抗體與主要通過誘導(dǎo)凋亡而發(fā)揮作用的另一種抗體的組合。
[0404]還可在組合治療中(即與其他藥劑組合)施用本發(fā)明的藥物組合物。例如，所述組合治療可包括具有至少一種抗炎劑或至少一種免疫抑制劑的本發(fā)明組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的治療劑包括一種或更多種抗炎劑，例如甾體藥物或NSAID(非甾體抗炎藥)。優(yōu)選的藥劑包括例如阿司匹林和其他水楊酸鹽/酯、Cox-2抑制劑(例如，羅非昔布(萬絡(luò)(Vioxx))和塞來昔布(西樂德(Celebrex)))、NSAID例如布洛芬(美林(Motrin)、艾德維爾(Advil))、非諾洛芬(禮來痛保(Nalfon))、萘普生(消痛靈(Naprosyn))、舒林酸(奇諾力(Clinoril))、雙氯芬酸(扶他林(Voltaren))、吡羅昔康(費(fèi)唳(Feldene))、酮洛芬(奧魯?shù)?Orudis))、二氟尼柳(二氟尼柳(Dolobid))、萘丁美酮(瑞力芬(Relafen))、依托度酸(羅丁(Lodine))、奧沙普秦O惡丙嗪(Daypro))和吲哚美辛(消炎痛(Indocin))。
[0405]在另一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的治療劑包括引起調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的耗盡或功能失活的藥劑，例如低劑量的環(huán)磷酰胺(cyclophosphamid)、抗CTLA4抗體、抗IL2或抗IL2受體的抗體。
[0406]在另一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的治療劑包括一種或更多種化療劑，例如泰素衍生物、泰素帝、吉西他濱、5-氟尿嘧啶、多柔比星(阿霉素)、順鉬(普雷蒂諾(Platinol))、環(huán)磷酰胺(Cytoxan、Procytox、Neosar)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以與化療劑組合施用本發(fā)明的抗體，所述化療劑在患有癌癥(例如，本文中描述的癌癥類型)的患者中優(yōu)選地表現(xiàn)出治療效果。
[0407]在另一個(gè)實(shí)施方案中，可與放射治療和/或自體外周干細(xì)胞或骨髓移植聯(lián)合施用本發(fā)明的抗體。
[0408]本文中使用的“可藥用載劑”包括生理學(xué)上相容的任何和全部溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延緩劑等。優(yōu)選地，所述載劑適合靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊髓或表皮施用(例如，通過注射或輸注)。根據(jù)施用途徑，活性化合物(例如，抗體、雙特異性和多特異性分子)可被包被于這樣的材料中，所述材料保護(hù)所述化合物免受酸和可失活所述化合物之其他 天然條件的作用。
[0409]“可藥用鹽”是指保持母體化合物的所需生物活性且不賦予任何不期望的毒理學(xué)作用(參見例如 Berge，S.M，等(1977) J.Pharm.Sc1.66:1-19)的鹽。
[0410]所述鹽的實(shí)例包括酸加成鹽(acid addition salt)和堿加成鹽(base additionsalt)。酸加成鹽包括源自無毒性無機(jī)酸的鹽，所述無機(jī)酸例如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等，以及源自無毒有機(jī)酸的鹽，所述有機(jī)酸例如脂肪族單羧酸和二羧酸、苯基取代的烷酸、羥基烷酸、芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸等。堿加成鹽包括源自堿土金屬(例如，鈉、鉀、鎂、鈣等)，以及來自無毒性的有機(jī)胺(例如，N，N' -二芐基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等)的鹽。
[0411]可通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的多種方法施用本發(fā)明的組合物。技術(shù)人員會理解，施用途徑和/或方式會根據(jù)期望的結(jié)果而不同?？膳c載劑制備活性化合物，所述載劑會保護(hù)所述化合物免于迅速釋放，例如控釋制劑(包括植入劑、經(jīng)皮貼劑和微膠囊遞送系統(tǒng))?？墒褂每缮锝到獾?、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制備這種制劑的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛知曉的。參見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R.Robinson 編，MarcelDekker, Inc.，New York, 1978。
[0412]為了以某些施用途徑施用本發(fā)明的化合物，有必要用防止其失活的材料包被所述化合物或與所述化合物共施用。例如，可在合適的載劑(例如，脂質(zhì)體或稀釋劑)中向?qū)ο笫┯盟龌衔??？伤幱孟♂寗┌}水和水緩沖溶液。脂質(zhì)體包括水包油包水型CGF乳劑，以及常規(guī)脂質(zhì)體(Strejan 等(1984) J.Neuroimmunol.7:27)。
[0413]可藥用載劑包括無菌水溶液或分散體以及用于臨時(shí)制備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末。使用這樣的介質(zhì)和藥劑用于藥物活性物質(zhì)是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。除非常規(guī)介質(zhì)或藥劑與活性化合物不相容，均考慮將其用于本發(fā)明的藥物組合物中。還可將補(bǔ)充的活性化合物并入所述組合物中。
[0414]治療組合物通常必須是無菌的，并且在制造和儲存條件下是穩(wěn)定的?？勺鳛槿芤?、微乳劑、脂質(zhì)體或適于高藥物濃度的其他有序結(jié)構(gòu)來配制所述組合物。所述載劑可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適混合物的溶劑或分散介質(zhì)?？衫缤ㄟ^使用包衣(例如，卵磷脂)，通過維持所需的顆粒大小(在分散體的情況中)以及通過使用表面活性劑來維持合適的流動(dòng)性。在很多情況下，所述組合物中會優(yōu)選地包含等滲劑(例如，糖、多元醇(例如，甘露醇、山梨醇或氯化鈉)?？赏ㄟ^在所述組合物中包含延緩吸收的試劑(例如，單硬脂酸鹽和明膠)來實(shí)現(xiàn)可注射組合物的延長吸收。
[0415]可通過以所需的量將活性化合物并入合適的溶劑(其具有上文中所列舉成分之一或之組合)來按需要制備無菌可注射溶液，隨后無菌微孔過濾。
[0416]一般來說，通過將活性化合物并入無菌載劑來制備分散體，所述載劑含有基本分散介質(zhì)和所需的上文中所列舉的其他成分。在無菌粉末用于制備無菌可注射溶液的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，這產(chǎn)生來自其之前經(jīng)無菌過濾之溶液的活性成分加任何附加的期望成分的粉末。
[0417]調(diào)節(jié)劑量方案以提供最佳的期望應(yīng)答(例如，治療性應(yīng)答)。例如，可施用單次推注，可隨時(shí)間施用多個(gè)分開的劑量，或可按照治療情況之緊急程度所指示的那樣成比例地降低或升高劑量。以劑量單位形式配制胃腸外組合物對于方便施用和劑量均勻度來說是尤其有利的。本文中使用的劑量單位形式是指適合作為單一劑量用于要治療之對象的物理上離散的單位；每個(gè)單位含有與期望藥物載劑聯(lián)合的經(jīng)計(jì)算產(chǎn)生期望治療效果的預(yù)先確定量的活性化合物。
[0418]可藥用抗氧化劑的實(shí)例包括:(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁輕茴醚(butylated hydroxyanisole, BHA)、丁輕甲苯(butylated hydroxytoluene, BHT) >卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
[0419]對于治療性組合物，本發(fā)明的制劑包括合適的用于經(jīng)口、經(jīng)鼻、表面(包括口腔和舌下)、經(jīng)直腸、經(jīng)陰道和/或腸胃外施用的組合物。所述制劑可方便地以單位劑型存在并且可通過藥學(xué)領(lǐng)域中已知的任何方法來制備?？膳c載劑材料組合以產(chǎn)生單個(gè)劑型的活性成分的量會根據(jù)要治療的對象和具體的施用方式而不同?？膳c載劑材料組合以產(chǎn)生單個(gè)劑型的活性成分的量通常會是產(chǎn)生治療作用的組合物的量。
[0420]適于經(jīng) 陰道施用的本發(fā)明的制劑還包括以下含有現(xiàn)有技術(shù)中已知的合適載劑的制劑:子宮托(pessary)、塞子(tampon)、乳膏劑、凝膠劑、糊劑、泡沫劑、噴霧劑。本發(fā)明組合物的用于表面或經(jīng)皮施用的劑型包括散劑、噴霧劑、軟膏劑、糊劑、乳膏劑、洗劑、凝膠劑、溶液劑、貼劑和吸入劑?？稍跓o菌條件下將活性化合物與可藥用載劑以及與可能需要的任何防腐劑、緩沖劑或拋射劑混合。
[0421]本文中使用的詞語“腸胃外施用”和“腸胃外地使用”意為不同于腸胃和表面施用的施用方式，通常通過注射施用，所述注射包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。
[0422]可用于本發(fā)明藥物組合物的合適的水或非水載劑的實(shí)例包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合適的混合物、植物油(例如，橄欖油)和可注射的有機(jī)酯(例如,油酸乙酯)?？衫缤ㄟ^使用包衣材料(例如,卵磷脂)，通過維持所需的顆粒大小(在分散體的情況中)以及通過使用表面活性劑來維持合適的流動(dòng)性。
[0423]這些組合物還可含有輔料，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。可通過滅菌過程以及通過包含多種抗菌和抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚山梨酸等)來確保防止微生物的存在。還可在所述組合物中理想地包含等滲劑，例如糖、氯化鈉等。此外，可通過包含延緩吸收的試劑(例如，單硬脂酸鋁和明膠)來產(chǎn)生可注射藥物形式的延長吸收。
[0424]不管選擇何種施用途徑，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法，可將可以以合適的水化形式使用的本發(fā)明化合物和/或本發(fā)明組合物配制成可藥用劑型。
[0425]本發(fā)明組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可以不同，以獲得對于具體患者、組合物和施用方式來說有效達(dá)到期望治療應(yīng)答而對所述患者沒有毒性之量的活性成分。所選擇的劑量水平將取決于多種藥物代謝動(dòng)力學(xué)因素，包括所使用的本發(fā)明具體組合物的活性，施用途徑，施用時(shí)間，所使用的具體化合物的排泄速率，治療的持續(xù)時(shí)間，與所使用的具體組合物組合使用其他藥物、化合物和/或物質(zhì)，年齡，性別，體重，狀況，一般健康和被治療患者之前的病史，以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中公知的類似因素。
[0426]具有本領(lǐng)域普通技能的醫(yī)生或獸醫(yī)可很容易地確定所需的藥物組合物的有效量并開處方。例如，醫(yī)生或獸醫(yī)可使所述藥物組合物中使用的本發(fā)明化合物的劑量始于低于達(dá)到期望治療作用所需要的水平，并逐漸升高劑量，直至達(dá)到期望的作用。一般來說，本發(fā)明組合物的合適日劑量會是這樣的化合物量，其是有效產(chǎn)生治療作用的最低劑量。這樣的有效劑量通常會取決于上文中所描述的因素。所述施用優(yōu)選地是靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下施用，優(yōu)選地向臨近靶標(biāo)的位置施用。如果期望的話，可在整日中，以合適的間隔，作為2、3、4、5、6或更多個(gè)亞劑量，任選地以單位劑型，分別施用治療性組合物的有效日劑量。雖然可單獨(dú)施用本發(fā)明的化合物，優(yōu)選地作為藥物制劑(組合物)施用所述化合物。
[0427]在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過輸注(優(yōu)選長時(shí)間(例如，超過24小時(shí))緩慢連續(xù)輸注)施用本發(fā)明的抗體，以降低毒性的副作用。還可以通過在2至24小時(shí)(例如，2至12小時(shí))的時(shí)間段內(nèi)連續(xù)輸注來進(jìn)行所述施用。可按需要重復(fù)這樣的方案一次或更多次，例如6個(gè)月或12個(gè)月之后。施用后可通過使用祀向抗CLDN6抗體的抗特應(yīng)抗體(ant1-1diotypicantibody)在生物樣品中測量循環(huán)單克隆抗CLDN6抗體的量來確定或調(diào)節(jié)劑量。
[0428]在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過維持治療(例如，每周I次，為期6個(gè)月或更長)施用所述抗體。
[0429]在另一個(gè)實(shí)施方案中，可通過這樣的方案施用根據(jù)本發(fā)明的抗體，所述方案包括一次輸注抗CLDN6抗體，隨后輸注與放射性同位素綴合的抗CLDN6抗體。例如7至9天之后可重復(fù)所述方案。
[0430]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，以脂質(zhì)體配制本發(fā)明的治療性化合物。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體包括靶向部分。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過向臨近期望區(qū)域(例如，腫瘤的位置)的位置推注注射來遞送脂質(zhì)體中的治療性化合物。所述組合物必須是易于注射器注射的某種程度上的流體。它在制造和儲存的條件下必須是穩(wěn)定的，并且必須防止微生物(例如，細(xì)菌和真菌)的污染作用而保存。
[0431]在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以這樣配制本發(fā)明的抗體以防止或降低其轉(zhuǎn)運(yùn)通過胎盤。這可通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法(例如，通過抗體的聚乙二醇化或通過使用F (ab) 2 '片段)來進(jìn)行。還可參照"Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, Griffith B,Keenan J.(1992)Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulinconjugates.Resistance to enzymatic degradation.J.Tmmunol.Methods, 152: 177-190 ；和參照"Landor M.(1995)Maternal-fetal transfer of immunoglobulins, Ann.AllergyAsthma Tmmunol.74:279_283。
[0432]可通過客觀的腫瘤響應(yīng)(其可以是完全的或部分的)來測量腫瘤治療的“治療有效劑量”。完全響應(yīng)(complete response, CR)被定義為沒有疾病的臨床的、放射學(xué)的或其他證據(jù)。部分響應(yīng)(partial response, PR)來自降低總腫瘤大小超過50%。進(jìn)展的中位時(shí)間是表征客觀腫瘤響應(yīng)之持久性的量度。
[0433]還可通過穩(wěn)定腫瘤之進(jìn)展的能力來測量腫瘤治療的“治療有效劑量”?？稍陬A(yù)測在人腫瘤中之效力的動(dòng)物模型系統(tǒng)中評價(jià)化合物抑制腫瘤的能力。或者，可通過技術(shù)人員已知的體外測定，通過檢測化合物抑制細(xì)胞生長的能力或檢測凋亡來評價(jià)化合物的這種特征。治療有效量的治療性化合物可降低腫瘤大小，或者以其他方式在對象中改善癥狀。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)這樣的因素測定所述量:對象的身材大小、對象癥狀的嚴(yán)重程度以及所選擇的具體組合物或施用途徑。
[0434] 所述組合物必須是無菌的并且所述組合物是可通過注射器遞送之程度的流體。除了水，載劑可以是等滲緩沖鹽水溶液、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚丙二醇等)及其合適的混合物?？衫缤ㄟ^使用包衣(例如，卵磷脂)，通過維持所需的顆粒大小(在分散體的情況中)以及通過使用表面活性劑來維持合適的流動(dòng)性。在很多情況下，在所述組合物中優(yōu)選地包含等滲劑，例如糖、多元醇(例如，甘露醇或山梨醇)和氯化鈉?？赏ㄟ^在所述組合物中包含延緩吸收的試劑(例如，單硬脂酸鋁和明膠)來產(chǎn)生可注射組合物的長期吸收。
[0435]如上文中所描述的那樣，當(dāng)由惰性稀釋劑或可吸收的可食用載劑合適地保護(hù)所述活性化合物時(shí)，可經(jīng)口施用所述化合物。
[0436]IV.本發(fā)明的應(yīng)用和方法
[0437]本發(fā)明的抗體(包括本文中描述的免疫綴合物、雙特異性/多特異性分子、組合物和其他衍生物)具有多種治療效用，涉及與表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征之細(xì)胞相關(guān)疾病的治療。例如，可向培養(yǎng)物中的細(xì)胞(例如，體外或離體)或向人對象(例如，體內(nèi))施用所述抗體以治療或預(yù)防多種疾病，例如本文中描述的那些疾病。優(yōu)選的對象包括患有這樣疾病的人患者:所述疾病可通過殺傷患病的細(xì)胞(特別是以與正常細(xì)胞相比改變的CLDN6表達(dá)模式和/或改變的CLDN6與細(xì)胞表面締合模式為特征的細(xì)胞)而糾正或改善。
[0438]例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可用于治療患有腫瘤發(fā)生性疾病(例如，以存在腫瘤細(xì)胞為特征的疾病，所述腫瘤細(xì)胞表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征)的對象?？杀恢委熀?或預(yù)防的腫瘤發(fā)生性疾病的實(shí)例包括所有表達(dá)CLDN6的癌和腫瘤實(shí)體，包括本文中描述的那些。
[0439]根據(jù)本發(fā)明描述的藥物組合物和治療方法還可用于免疫或接種以預(yù)防本文中描述的疾病。
[0440]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可用于檢測CLDN6的水平或CLDN6的具體形式，或者在其膜表面上含有CLDN6之細(xì)胞的水平，所述水平可隨后與某些疾病或疾病癥狀(如上文所述)相聯(lián)系?；蛘?，所述抗體可用于耗盡表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征之細(xì)胞的功能或與其相互作用，因而表明這些細(xì)胞是重要的疾病中介物。這可通過將樣品和對照樣品與抗CLDN6抗體在允許所述抗體與CLDN6之間形成復(fù)合物的條件下相接觸而實(shí)現(xiàn)。在所述樣品和對照樣品(即，參比樣品)中檢測和比較抗體與CLDN6之間所形成的任何復(fù)合物。
[0441]可首先測試本發(fā)明的抗體與體外治療或診斷應(yīng)用相關(guān)的結(jié)合活性。例如，可按照本文中的描述使用流式細(xì)胞術(shù)測定法來測試所述抗體。
[0442]本發(fā)明的抗體可用于體內(nèi)或體外誘導(dǎo)一種或更多種以下生物活性:抑制表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征之細(xì)胞的生長和/或分化；殺傷表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征的細(xì)胞；在效應(yīng)細(xì)胞存在下介導(dǎo)表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征之細(xì)胞的吞噬或ADCC ;在補(bǔ)體存在下介導(dǎo)表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征之細(xì)胞的吞噬或ADCC ;介導(dǎo)表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征之細(xì)胞的凋亡；誘導(dǎo)同型黏著；和/或結(jié)合CLDN6之后誘導(dǎo)轉(zhuǎn)位到脂膜後(lipid raft)中。
[0443]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，體內(nèi)或體外使用所述抗體以治療、預(yù)防或診斷多種CLDN6相關(guān)疾病。除此之外，CLDN6相關(guān)疾病的實(shí)例還包括癌癥，例如本文中描述的癌癥。
[0444]如上文所述，可與一種或其他更多種的治療劑(例如，細(xì)胞毒劑、放射毒劑、抗血管發(fā)生劑或和免疫抑制劑)共施用本發(fā)明的抗CLDN6抗體以降低針對本發(fā)明抗體之免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。所述抗體可與所述治療劑(作為免疫復(fù)合物)相連接或者可與所述治療劑分別施用。在后一種情況(分別施用)下，可在所述治療劑之前、之后施用或與所述治療劑同時(shí)施用所述抗體，或者可與其他已知的治療(例如，抗癌治療(例如，放療))共施用所述抗體。除此之外，這樣的治療劑還包括抗腫瘤劑(如上文所列)。與化療劑共施用本發(fā)明的抗CLDN6抗體提供通過不同機(jī)制運(yùn)作而產(chǎn)生對腫瘤細(xì)胞之細(xì)胞毒作用的兩種抗癌劑。這樣的共施用可解決由于發(fā)生對藥物的抗性或腫瘤細(xì)胞抗原性的改變而引起的問題，其可導(dǎo)致它們不與所述抗體反應(yīng)。
[0445]在補(bǔ)體存在下，還可使用具有補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)(例如，IgGl、IgG2或IgG3或者IgM中與補(bǔ)體結(jié)合的部分)的本發(fā)明組合物(例如，抗體、多特異性和雙特異性分子和免疫綴合物)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用本發(fā)明的結(jié)合劑和合適的效應(yīng)細(xì)胞離體處理包含靶細(xì)胞的細(xì)胞群可輔之以添加補(bǔ)體或含有補(bǔ)體的血清。通過與補(bǔ)體蛋白結(jié)合，可提高對以本發(fā)明的結(jié)合劑包被的靶細(xì)胞的吞噬。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用本發(fā)明的組合物包被的靶細(xì)胞還可被補(bǔ)體所溶解。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物不激活補(bǔ)體。
[0446]還可與補(bǔ)體一起施用本發(fā)明的組合物。因此，包含抗體、多特異性或雙特異性分子和血清或補(bǔ)體的組合物在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。這些組合物是有利的，在于所述補(bǔ)體與所述抗體、多特異性或雙特異性分子緊鄰。
[0447]或者，可分別施用本發(fā)明的抗體、多特異性或雙特異性分子以及補(bǔ)體或血清。本發(fā)明的組合物與靶細(xì)胞的結(jié)合可導(dǎo)致CLDN6抗原-抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜的質(zhì)膜筏中。所述轉(zhuǎn)位產(chǎn)生可有效激活和/或增強(qiáng)CDC的高密度的抗原-抗體復(fù)合物。
[0448]包含本發(fā)明抗體組合物(例如，抗體和免疫綴合物)以及使用說明的試劑盒也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。所述試劑盒還可含有一種或更多種附加的試劑，例如免疫抑制試劑、細(xì)胞毒劑或放射毒劑，或者一種或更多種附加的本發(fā)明抗體(例如，具有補(bǔ)充活性的抗體)。
[0449]因此，可向用本發(fā)明抗體組合物治療的患者額外地施用(施用本發(fā)明的抗體之前、與其同時(shí)或之后)增強(qiáng)或擴(kuò)大本發(fā)明抗體之治療作用的其他治療劑(例如，細(xì)胞毒劑或放射毒劑)。
[0450]在另一些實(shí)施方案中，可用(通過例如用細(xì)胞因子治療對象)調(diào)節(jié)(例如，增強(qiáng)或抑制)Fc-y或Fc-α受體之表達(dá)或活性的藥劑額外地治療對象。優(yōu)選地細(xì)胞因子包括粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-Y (IFN- Y )和腫瘤壞死因子(TNF)。用于升高本文中描述的抗體和藥物組合物之治療效果的其他重要試劑是β_葡聚糖(β-glucan)，其是支鏈葡萄糖殘基的同多糖，并且是由多種植物和微生物(例如，細(xì)菌、藻類、真菌、酵母和谷物)產(chǎn)生的。還可使用生物所產(chǎn)生的β_葡聚糖片段。優(yōu)選地，所述β-葡聚糖是β (1,3)葡萄糖的聚合物，其中主鏈葡萄糖單位的至少一些(例如，主鏈葡萄糖單位的3~6% )具有分支,例如β (I, 6)分支。
[0451]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于在樣品中檢測CLDN6抗原之存在或者測量CLDN6抗原之量的方法，其包括在允許所述抗體或其部分與CLDN6之間形成復(fù)合物的條件下使所述樣品和對照樣品與特異性結(jié)合CLDN6的抗體相接觸。隨后檢測復(fù)合物的形成，其中所述樣品與對照樣品相比，復(fù)合物形成之間的差異指示所述樣品中存在CLDN6抗原。
[0452]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于體內(nèi)或體外檢測表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征之細(xì)胞的存在或?qū)ζ淞窟M(jìn)行定量的方法。所述方法包括(i)向?qū)ο笫┯门c可檢測標(biāo)志物綴合的本發(fā)明組合物；和(ii)使所述對象暴露于用于檢測所述可檢測標(biāo)志物的方法以鑒定含有表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征之細(xì)胞的區(qū)域。
[0453]上文中描述的方法可特別地用于診斷CLDN6相關(guān)疾病和/或CLDN6轉(zhuǎn)位相關(guān)疾病，例如癌疾病。優(yōu)選地，樣品中CLDN6的量高于對照樣品中CLDN6的量指示所述樣品所來源的對象(特別是人)中存在CLDN6相關(guān)疾病。
[0454]當(dāng)用于上文中所描述的方法時(shí)，可為本文中描述的抗體提供發(fā)揮以下功能的標(biāo)記物:(i)提供可檢測信號；(ii)與第二標(biāo)記物相互作用以修飾所述第一或第二標(biāo)記物所提供的可檢測信號，例如FRET(突光共振能力轉(zhuǎn)移，F(xiàn)luorescence Resonance EnergyTransfer) ；(iii)通過電荷、疏水性、形狀或其他物理參數(shù)影響遷移率(例如，電泳遷移率)，或者(iv)提供捕獲部分，例如親和力、抗體/抗原或離子絡(luò)合。適合作為標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)例如熒光標(biāo)記物、發(fā)光標(biāo)記物、發(fā)色團(tuán)標(biāo)記物、放射性同位素標(biāo)記物、同位素標(biāo)記物,優(yōu)選穩(wěn)定的同位素標(biāo)記物、同量異位素標(biāo)記物(isobaric label)、酶標(biāo)記物、顆粒標(biāo)記物(特別是金屬顆粒標(biāo)記物、磁性顆粒標(biāo)記物、聚合物顆粒標(biāo)記物)、小有機(jī)分子(例如，生物素、受體的配體或結(jié)合分子(例如，細(xì)胞黏附蛋白或卵磷脂))、可通過使用結(jié)合劑檢測包含核酸和/或氨基酸殘基的標(biāo)記物序列等。標(biāo)記物非限制性地包括硫酸鋇、碘西他酸、碘番酸、胺碘苯丙酸鈣、泛影酸鈉、泛影葡胺、甲泛葡胺、酪泮酸鈉和放射診斷劑(包括正電子發(fā)射體，(例如氟_18和碳-11)、Y發(fā)射體(例如，碘-123、锝_99m、碘-131和銦-111)、核磁共振核素(例如，氟和釓))。
[0455]在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過將化合物與抗體相連接，本發(fā)明的免疫綴合物可用于將化合物(例如，治療劑、標(biāo)記物、細(xì)胞毒素、放射毒素、免疫抑制劑等)靶向具有與其表面締合之CLDN6的細(xì)胞。因此，本發(fā)明還提供用于離體或體外定位表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征之細(xì)胞(例如，循環(huán)腫瘤細(xì)胞)的方法。
[0456]通過以下實(shí)施例進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明，所述實(shí)施例不被解釋為限制本發(fā)明的范
圍。
[0457]實(shí)施例
[0458]本文中描述或以本身已知的和例如在Sambrook等，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第 2 版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor, N.Y.中所描述的方式實(shí)施本文中使用的技術(shù)和方法。除非具體指明，根據(jù)制造商的信息實(shí)施所有方法(包括試劑盒和試劑的使用)。
[0459]實(shí)施例1:使用實(shí)時(shí)RT-PCR在正常組織、癌性組織和細(xì)胞系中對CLDN6表達(dá)進(jìn)行
定量
[0460]使用RNeasy Mini Kit (Qiagen)從冷凍的組織標(biāo)本和癌細(xì)胞系中提取總細(xì)胞RNA，根據(jù)制造商的說明，以dT18寡核苷酸為引物用Superscript II (GIBCO/Lifetech)逆轉(zhuǎn)錄。通過在30個(gè)循環(huán)的PCR中擴(kuò)增p53轉(zhuǎn)錄物而測試所獲得的cDNA的完整性。以HPRT歸一化之后，使用Λ Λ CT計(jì)算對CLDN6的表達(dá)進(jìn)行定量。
[0461]對于每種正常組織類型，測試來自三個(gè)個(gè)體的組織。在40個(gè)循環(huán)的RT-PCR之后，僅可在正常組織中檢測到痕量的CLDN6轉(zhuǎn)錄物。輕度超過表達(dá)截?cái)嘀档奈ㄒ徽＝M織是胎盤。
[0462]與正常組織相反，我們發(fā)現(xiàn)來自卵巢癌(腺癌)、肺癌(NSCLC，在腺癌中具有最高頻率和表達(dá)水平)、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮膚癌(基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌)、惡性黑色素瘤、頭頸癌(惡性多形性腺瘤)、肉瘤(滑膜肉瘤和癌肉瘤)、膽管癌、腎細(xì)胞癌(明細(xì)胞癌和乳頭狀癌)、子宮癌以及癌細(xì)胞系Α2780 (卵巢癌)、NIH-0VCAR3 (卵巢癌)、HCT-116 (結(jié)腸癌)、EF0-27 (卵巢癌)、CPC-N (SCLC)、NC1-H552 (NSCLC)、SNU-1 (胃癌)、ΚΑΤΟΠΙ (胃癌)、YAPC (胰腺癌)、AGS (胃癌)、FU97(胃癌)、MKN7(胃癌)。
[0463]實(shí)施例2:使用Western印跡分析對正常組織、癌性組織和細(xì)胞系中的CLDN6表達(dá)進(jìn)行定量
[0464]對于Western印跡分析,使用從以Laemmli裂解緩沖液裂解的細(xì)胞中提取的20 μ g總蛋白質(zhì)。在還原性樣品緩沖液(Roth)中稀釋提取物，進(jìn)行SDS-PAGE，隨后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Pall)上。用與CLDN6 (ARP)和β-肌動(dòng)蛋白(Abeam)反應(yīng)的多克隆抗體進(jìn)行免疫染色，隨后通過用辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠和山羊抗兔二抗(Dako)檢測一抗。
[0465]對于每個(gè)正常的組織類型，測試來自多達(dá)5個(gè)個(gè)體的組織裂解液。在所分析的任何正常組織中未檢出CLDN6蛋白表達(dá)。與正常組織相反，在來自卵巢癌和肺癌的樣品中檢出了高表達(dá)的CLDN6蛋白。在NIH-0VCAR3(卵巢癌)、MKN7(胃癌)、AGS(胃癌)、CPC-N(SCLC)、HCT-116 (結(jié)腸癌)、FU97 (胃癌)、NEC8 (睪丸胚胎性癌)、JAR (胎盤絨毛膜癌)、JEG3 (胎盤絨毛膜癌)、BEWO(胎盤絨毛膜癌)和PA-1 (卵巢畸胎瘤)中檢出CLDN6表達(dá)。
[0466]實(shí)施例3:在正常組織和癌性組織中免疫組織化學(xué)(IHC)分析CLDN6表達(dá)
[0467]在加熱板(HI1220，Leica)上以58°C孵育石蠟包埋的組織切片(4μm)1小時(shí)。通過RT下在Roticlear (Roth)中孵育載玻片2Χ 10分鐘而從切片中除去石蠟。隨后，使切片在梯度的醇(99%、2Χ96%、80%和70%，每次5分鐘)中脫水。通過在120°C (15psi (磅每平方英寸))下在1OmM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)+0.05%吐溫-20中煮沸載玻片15分鐘而進(jìn)行抗原修復(fù)。煮沸載玻片之后直接在PBS中孵育5分鐘。在RT下，用MeOH中的0.3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性15分鐘。為了避免非特異性結(jié)合，用PBS中的10%山羊血清在RT下封閉載玻片30分鐘。隨后，在4°C下用CLDN6特異性的多克隆抗體(1 μ g/ml) (ARP)過夜孵育載玻片。次日，在RT下用PBS清洗載玻片(3X5分鐘)，并在RT下用100 μ l二抗(PowerVision聚HRP-抗兔IgG即用型(ImmunoLogic))孵育1小時(shí)。隨后，在RT下用PBS清洗載玻片(3X5分鐘)。通過使用來自Vector Laboratories (Burlingame)的VECTOR NovaRED Substrate Kit SK-4800進(jìn)行最后的染色。在RT下用蘇木精復(fù)染切片90秒。用梯度的醇(70%、80%、2X96%和99%，每次5分鐘)脫水以及在二甲苯中孵育10 分鐘之后,用 X_tra Kit (Medite Histotechnic)封片。
[0468]在來自肺、卵巢、胃、結(jié)腸、胰腺、肝、十二指腸或腎的正常組織中未檢出CLDN6蛋白表達(dá)。與正常組織相反，在來自卵巢癌、肺癌、皮膚癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌(移行細(xì)胞癌)、子宮頸癌、睪丸癌、(精原細(xì)胞瘤)和子宮癌的組織切片上觀察到了強(qiáng)的或至少顯著的染色。在惡性表皮細(xì)胞群的質(zhì)膜，染色顯著增強(qiáng)，而臨近的間質(zhì)和非惡性上皮細(xì)胞是陰性的。這些結(jié)果表明CLDN6蛋白質(zhì)位于惡性細(xì)胞的質(zhì)膜。
[0469]實(shí)施例4:生成抗CLDN6的鼠抗體
[0470]a.生成編碼全長CLDN6和CLDN6片段的表達(dá)載體
[0471]通過化學(xué)合成(GENEART AG，Germany)制備編碼全長CLDN6 (NCBI登記號NP_067018.2，SEQ ID NO:2)的非天然的、密碼子優(yōu)化的DNA序列(SEQ ID NO:3)并將其克隆到pcDNA3.1/myc-His載體(Invitrogen,USA)中以產(chǎn)生載體p3953。插入終止密碼子使得CLDN6蛋白的表達(dá)不與載體所編碼的myc-His標(biāo)簽融合。使用可商購的抗CLDN6抗體(ARP, 01-8865 ；R&D Systems, MAB3656)，通過Western印跡、流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光分析測試CLDN6的表達(dá)。
[0472]此外，制備密碼子優(yōu)化的DNA序列(SEQ ID NO:4)并將其克隆到pcDNA3.1/myc-His載體中以產(chǎn)生載體p3974，所述DNA序列編碼與源自N端IgK前導(dǎo)序列的信號肽融合的CLDN6的推定的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域2 (extracellular domain2, EC2)片段(SEQ ID NO:6)，其后面有4個(gè)額外的氨基酸以確保正確的信號肽切割位點(diǎn)(SEQ ID NO:5) 0免疫之前，使用可商購的抗myc抗體(Cell Signaling,MAB2276),通過免疫突光顯微術(shù)在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的且用多聚甲醛(PFA)固定的CH0-K1細(xì)胞中確證EC2片段的表達(dá)。
[0473]b.生成穩(wěn)定表達(dá)CLDN6的細(xì)胞系
[0474]使用載體p3953，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)生成穩(wěn)定表達(dá)CLDN6的HEK293和P3X63Ag8U.1細(xì)胞系。
[0475]c.免疫
[0476]通過在第O、16和36天腹膜內(nèi)注射，用25 μ g p3974質(zhì)粒DNA以及4μ I PE1-甘露糖(PE1-Man ；in vivo-jetPEITM-Man,來自 PolyPlus Transfection)(含有 5%葡萄糖的H2O中的150mM PE1-Man) 一起免疫接種Balb/c小鼠。在第48和62天時(shí)，通過腹膜內(nèi)注射轉(zhuǎn)染了 P3953載體以穩(wěn)定表達(dá)CLDN6的P3X63Ag8U.1骨髓瘤細(xì)胞免疫接種小鼠。在注射之前，以3000拉德(rad)輻照第62天所施用的細(xì)胞。在第20和70天之間，使用以編碼CLDN6和GFP的核酸共轉(zhuǎn)染的CHO-Kl細(xì)胞，通過免疫熒光顯微術(shù)監(jiān)控小鼠血清中抗CLDN6抗體的存在。為此，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，在室溫(RT)下用1:100稀釋的來自經(jīng)免疫之小鼠的血清孵育PFA固定的或未固定的細(xì)胞45分鐘。清洗細(xì)胞，用Alexa555標(biāo)記的抗小鼠Ig抗體(Molecular Probes)孵育并進(jìn)行突光顯微術(shù)。
[0477]在獲自小鼠的血清樣品中檢測抗CLDN6的特異性抗體，以其為基礎(chǔ)產(chǎn)生雜交瘤F3-6C3-H8 ;見圖 2。
[0478]為生成單抗， 在進(jìn)行脾切除術(shù)之前4天，通過腹膜內(nèi)注射2 X IO7個(gè)以p3953載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞加強(qiáng)具有可檢出的抗CLDN6免疫應(yīng)答的小鼠。
[0479]d.生成產(chǎn)生抗CLDN6鼠單克隆抗體的雜交瘤
[0480]使用PEG1500 (Roche，CRL10783641001)，將從經(jīng)免疫小鼠中分離的6X IO7個(gè)脾細(xì)胞與3\107個(gè)小鼠骨髓瘤細(xì)胞系？3乂63八88.653(4了0:，0^1580)融合。在平底微量滴定板中以約5 X IO4個(gè)細(xì)胞/孔接種細(xì)胞，在含有10 %經(jīng)熱滅活的胎牛血清、I %雜交瘤融合和克隆添加劑(hybridoma fusion and cloning supplement,HFCS, Roche, CRLl 1363735) > IOmMHEPESUmM丙酮酸鈉、4.5%葡萄糖、0.1禮2-巰基乙醇、1父青霉素/鏈霉素以及I XHAT添加劑(Invitrogen，CRL21060)的PRMI選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)約2周。10至14天之后，通過流式細(xì)胞術(shù)篩選每個(gè)孔的抗CLDN6單克隆抗體。通過有限稀釋對分泌抗體的雜交瘤進(jìn)行亞克隆，并再次測試抗CLDN6的單克隆抗體。培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆以在組織培養(yǎng)基中生成少量用于表征的抗體。從來自保持母體細(xì)胞之反應(yīng)性(通過流式細(xì)胞術(shù)測試)的每個(gè)雜交瘤中選擇至少一個(gè)克隆。為每個(gè)克隆生成9小瓶細(xì)胞的庫并將其儲存于液氮中。
[0481]實(shí)施例5:雜交瘤上清液和單克隆抗體的結(jié)合特征
[0482]a.通過(i) Western印跡和(ii)流式細(xì)胞術(shù)分析對瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量控制
[0483](i)分別用編碼CLDN3、CLDN4、CLDN6和CLDN9的核酸轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞或者進(jìn)行模擬轉(zhuǎn)染。通過Western印跡測定HEK293T細(xì)胞中CLDN3、CLDN4、CLDN6和CLDN9的表達(dá)。為此，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)收獲細(xì)胞，進(jìn)行裂解。對裂解液進(jìn)行SDS-PAGE，印跡到硝酸纖維素膜上，在變性條件下，用與相應(yīng)的密蛋白C端特異性結(jié)合的抗_CLDN3(A) (Invitrogen, 34-1700)、抗-CLDN4(A) (Zymed，32-9400)、抗-CDLN6(A) (ARP, 01-8865)或抗 _CLDN9(A) (Santa Cruz,sc-17672)抗體染色。用過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育并用ECL試劑顯色之后，使用LAS-3000顯像儀(Fuji)進(jìn)行可視化。僅在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中(但未在對照細(xì)胞中)分別觀察到了 CLDN3、CLDN4、CLDN6和CLDN9之預(yù)期分子量的帶(圖3)，表明HEK293T細(xì)胞不內(nèi)源性地表達(dá)所研究的任何密蛋白，因而是用于測定CLDN6抗體的交叉反應(yīng)性的合適工具。
[0484](ii)使用識別天然表位的抗CLDN抗體(小鼠抗CLDN3IgG2a(R&D，MAB4620)、小鼠抗 CLDN4IgG2a(R&D，MAB4219)、小鼠抗 CLDN6IgG2b (R&D，MAB3656))，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步分析(i)的HEK293T細(xì)胞。以獲自Sigma的產(chǎn)品編號為M9144和M8894的抗體充當(dāng)同種型對照。分別使用以編碼CLDN3、CLDN4、CLDN6和CLDN9的核酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞分析這些抗CLDN抗體的特異性?？笴LDN4抗體表現(xiàn)出與CLDN3、CLDN6和CLDN9的交叉反應(yīng)性。抗CLDN3抗體與CLDN3特異性地結(jié)合(圖4)。
[0485]b.使用流式細(xì)胞術(shù)測定根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的單克隆抗體的特異性
[0486]用編碼不同CLDN蛋白的載體和編碼熒光標(biāo)志物的載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，使用0.05%胰蛋白酶/EDTA溶液收獲細(xì)胞，用FACS緩沖液(含有2%FCS和0.1 %疊氮化鈉的PBS)清洗。以2X IO5個(gè)細(xì)胞/孔將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到U-底微滴定板中，在4°C下用雜交瘤上清液孵育60分鐘。用FACS緩沖液清洗三次之后，用別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin, APC)綴合的抗小鼠 IgGl+2a+2b+3 特異性的二抗(Dianova,115-135-164)孵育細(xì)胞。隨后，將細(xì)胞清洗兩次，使用BDFACSArray通過流式細(xì)胞術(shù)對結(jié)合進(jìn)行評價(jià)(圖5)。以熒光標(biāo)志物的表達(dá)為橫軸，相對于縱軸上的抗體結(jié)合進(jìn)行作圖。以可商購的小鼠抗CLDN6IgG2b抗體(R&D，MAB3656)充當(dāng)陽性對照，并且以可獲自Sigma的產(chǎn)品編號為M8894的抗體充當(dāng)同種型對照。
[0487]來自單克隆的雜交瘤亞克隆F3-6C3-H2、F3-6C3-H8、F3-6C3-H9、F3-6C3-D8 和F3-6C3-G4 (都源自雜交瘤F3-6C3)的上清液中的抗體是CLDN6特異性的，并且不與CLDN9、CLDN3和CLDN4結(jié)合。圖5A示例性地顯示單克隆雜交瘤亞克隆F3-6C3-H8的結(jié)果。來自單克隆雜交瘤亞克隆F3-6C3-H8上清液中的抗體還與用CLDN6的(I143V)-SNP變體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞結(jié)合。來自單克隆雜交瘤亞克隆F4-4F7-F2之上清液中的抗體與CLDN6和CLDN9都結(jié)合(圖5A)。來自單克隆雜交瘤亞克隆F3-7B3-B4之上清液中的抗體與CLDN6、CLDN3和CLDN9結(jié)合(圖5B)。來自單克隆雜交瘤亞克隆F3-3F7-A5之上清液中的抗體與CLDN6、CLDN4和CLDN9 結(jié)合(圖 5B)。
[0488] 實(shí)施例6:生成和測試抗CLDN6的單克隆抗體
[0489]a.生成編碼CLDN6的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域I的表達(dá)載體
[0490]制備密碼子優(yōu)化的DNA序列(SEQ ID NO:12)并將其克隆到pcDNA3.l/myc-His載體中以產(chǎn)生載體P3973，所述DNA序列編碼與源自N端IgK前導(dǎo)序列的信號肽融合的CLDN6的推定的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域I (extracellular domainl, ECl)片段(SEQ ID NO:7)，其后面有4個(gè)額外的氨基酸以確保正確的信號肽切割位點(diǎn)(SEQ ID NO:13)0免疫之前，使用可商購的抗myc抗體(Cell Signaling，MAB2276)，通過免疫熒光顯微術(shù)在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的且用多聚甲醛(PFA)固定的CHO-Kl細(xì)胞中確證ECl片段的表達(dá)。
[0491]b.免疫
[0492]通過在第O和14天腹膜內(nèi)注射，用25 μ gp3973質(zhì)粒DNA以及4μ I PE1-甘露糖(PE1-Man ；in vivo-jetPEI?-Man,來自 PolyPlus Transfection)(含有 5%葡萄糖的水中的150mM PE1-Man) 一起免疫接種Balb/c小鼠。第28和44天，用KLH綴合的肽SEQ IDNO: 14 和 SEQ ID NO: 15 (在 PBS 中各自 100 μ g，JPT PeptideTechnologies GmbH, Germany)和 HPLC 純化的 PTO-CpG-ODN (25 μ g 于 PBS 中；5' -TCCATGACGTTCCTGACGTT ；Eurofins MWGOperon,Germany) —起皮下免疫接種小鼠。第64、77和97天,用2X IO7個(gè)以p3953載體轉(zhuǎn)染的P3X63Ag8U.1骨髓瘤細(xì)胞腹膜內(nèi)注射免疫接種小鼠。施用之前，用絲裂霉素C (2.5 μ g/ml，Slgma-Aldrlch，M4287)處理細(xì)胞。第 64和 97 天，與 HPLC 純化的 PTO-CpG-ODN(50 μ g 于PBS中)一起施用細(xì)胞,第77天,將與不完全弗氏佐劑(incomplete Freund' s adjuvant)
一起施用。
[0493]為生成單克隆抗體，在進(jìn)行脾切除術(shù)之前4天，通過腹膜內(nèi)注射2 X lO7個(gè)以p3953載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞加強(qiáng)具有可檢出的抗CLDN6免疫應(yīng)答的小鼠。
[0494]c.測試抗CLDN6的單克隆抗體
[0495]流式細(xì)胞術(shù)
[0496]為測試單克隆抗體與CLDN6及其同源物的結(jié)合，用相應(yīng)的編碼密蛋白的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析表達(dá)。為了區(qū)分轉(zhuǎn)染的和非轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，用熒光標(biāo)記物作為報(bào)道分子共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后，用0.05%胰蛋白酶/EDTA收獲細(xì)胞，用FACS緩沖液(含有2% FCS和0.1 %疊氮化鈉的PBS)清洗，以2X lO6個(gè)細(xì)胞/ml的濃度懸于FACS緩沖液中。在4°C下，將100 μ l細(xì)胞懸液與指定濃度的合適抗體一起孵育30分鐘。使用交叉反應(yīng)的抗體檢測CLDN6和CLDN9表達(dá)?？缮藤彽男∈罂姑艿鞍卓贵w抗 CLDN3(R&D，MAB4620)和抗 CLDN4(R&D，MAB4219)充當(dāng)陽性對照，而小鼠 lgG2a(Slgma，M9144)和lgG2b (Slgma，M8894)分別充當(dāng)同種型對照。用FACS緩沖液清洗細(xì)胞三次，并將其與APC綴合的抗小鼠lgGl+2a+2b+3a特異性的二抗(Dlanova，115-135-164) —起在4°C下孵育30分鐘。清洗細(xì)胞兩次，重懸于FACS緩沖液中。使用BD FACSArray通過流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)合。以熒光標(biāo)志物的表達(dá)為橫軸，相對于縱軸上的抗體結(jié)合進(jìn)行作圖。
[0497]CDC
[0498]向與抗CLDN6抗體一起孵育的靶細(xì)胞中添加人補(bǔ)體之后，通過測量未裂解細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)ATP的含量測定補(bǔ)體依賴性的細(xì)胞毒作用(CDC)。作為非常靈敏的分析方法，使用螢光素酶的發(fā)光反應(yīng)測量ATP。
[0499]用0.05%胰蛋白酶/EDTA收獲穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CLDN6的CH0-K1細(xì)胞(CH0-K1-CLDN6)，用X-Vlvol5培養(yǎng)基(Lonza，BE04-418Q)清洗兩次，以1X 1O7個(gè)細(xì)胞/ml的濃度懸于X_Vlvol5培養(yǎng)基中。將250 μ l的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到0.4cm電穿孔小槽(electroporatlon cuvette)中并將其與7 μ g體外轉(zhuǎn)錄的編碼螢光素酶的RNA(螢光素酶lVT RNA)混合。使用GenePulser Xcell (Blo Rad)以200V和300 μ F電穿孔細(xì)胞。電穿孔之后，將細(xì)胞懸于2.4ml預(yù)熱的含有10% (v/v)FCSU% (v/v)青霉素/鏈霉素和1.5mg/ml G418的具有GlutaMax-1的D-MEM/F12(1:1)培養(yǎng)基(lnvltrogen, 31331-093)中。將50 μ l/孔細(xì)胞懸液接種進(jìn)入白色96孔PP板中，在37°C和7.5% CO2下孵育。電穿孔之后24小時(shí)，以指定濃度向細(xì)胞中添加50 μ 160% RPMl (含有20mM HEPES)和40%人血清(獲自6位健康供體的混合血清)中的單克隆鼠抗CLDN6抗體。向總裂解對照中添加每孔10 μ lPBS中的8% (v/v)TrltonX-100,而向最大活細(xì)胞對照和向?qū)嶋H樣品中添加每孔10 μ l的PBS。在37°C和7.5% CO2下孵育80分鐘之后，每孔添加50 μ l熒光素混合物(ddH20中的3.84mg/ml D-熒光素、0.64U/ml ATP酶和160mM HEPES)。在RT下，將板在黑暗中孵育45分鐘。使用發(fā)光計(jì)(inflnlteM200, TECAN)測量發(fā)光。以積分?jǐn)?shù)字相對光單位(relatlvellght unlt，RLU)給出結(jié)果。
[0500]以200V和400 μ F電穿孔NEC8細(xì)胞，在含有10 % (v/v) FCS的具有GlutaMAX-1的RPMl1640 培養(yǎng)基(invltrogen，61870)中培養(yǎng)。
[0501]按以下計(jì)算比裂解:[0502]
【權(quán)利要求】
1.抗體，其包含: (i)抗體重鏈，所述抗體重鏈包含選自SEQID NO:34、36、38和40的抗體重鏈序列或其變體，優(yōu)選SEQ ID NO:36的抗體重鏈序列或其變體，以及 (ii)抗體輕鏈，所述抗體輕鏈包含選自SEQID NO:35、37、39、41、54和55的抗體輕鏈序列或其變體，優(yōu)選SEQ ID NO:35的抗體輕鏈序列或其變體。
2.權(quán)利要求1的抗體,其包含: (i)抗體重鏈，所述抗體重鏈包含SEQID NO:36的抗體重鏈序列或其變體，以及 (ii)抗體輕鏈，所述抗體輕鏈包含選自SEQID NO:35、54和55的抗體輕鏈序列或其變體。
3.權(quán)利要求1的抗體,其包含: (i)抗體重鏈，所述抗體重鏈包含SEQID NO:36的抗體重鏈序列或其變體，以及 (ii)抗體輕鏈，所述抗體輕鏈包含選自SEQID NO:54和55的抗體輕鏈序列或其變體。
4.權(quán)利要求1的抗體,其包含: (i)抗體重鏈，所述抗體重鏈包含SEQID NO:36的抗體重鏈序列或其變體，以及 (ii)抗體輕鏈，所述抗體輕鏈包含SEQID NO:35的抗體輕鏈序列或其變體。
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的抗體，其能夠與表達(dá)CLDN6之細(xì)胞表面所締合的CLDN6相結(jié)合并且基本不能與表達(dá)CLDN9之細(xì)胞表面所締合的CLDN9相結(jié)合。
6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的抗體，其基本不能與表達(dá)CLDN4之細(xì)胞表面所締合的CLDN4相結(jié)合和/或基本不能與表達(dá)CLDN3之細(xì)胞表面所締合的CLDN3相結(jié)合。
7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的抗體，其是CLDN6特異性的。
8.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的抗體，其中所述細(xì)胞是完整細(xì)胞，特別是非透化細(xì)胞。
9.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的抗體，其能夠與位于CLDN6的胞外部分中的表位相結(jié)合。
10.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的抗體，其中CLDN6具有SEQID NO:2的氨基酸序列或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
11.權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的抗體，其具有以下活性中的一種或更多種: (i)殺傷表達(dá)CLDN6的細(xì)胞， (ii)抑制表達(dá)CLDN6之細(xì)胞的增殖， (iii)抑制表達(dá)CLDN6之細(xì)胞的集落形成， (iv)介導(dǎo)已建立之腫瘤的緩解， (v)預(yù)防腫瘤的形成或再形成，和 (vi)抑制表達(dá)CLDN6之細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
12.權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的抗體，其表現(xiàn)出一種或更多種針對帶有天然構(gòu)象CLDN6之細(xì)胞的免疫效應(yīng)功能。
13.權(quán)利要求12的抗體，其中所述一種或更多種免疫效應(yīng)功能選自:補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(CDC)、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)、誘導(dǎo)凋亡、以及抑制增殖，優(yōu)選地，所述效應(yīng)功能是ADCC和/或⑶C。
14.權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)的抗體，其中所述一種或更多種活性或者一種或更多種免疫效應(yīng)功能是通過所述抗體與位于CLDN6的胞外部分中的表位相結(jié)合而誘導(dǎo)的。
15.權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)的抗體,其中所述表達(dá)CLDN6的細(xì)胞或帶有天然構(gòu)象CLDN6的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
16.權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的抗體，其中所述表達(dá)CLDN6的細(xì)胞或帶有天然構(gòu)象CLDN6的細(xì)胞是癌細(xì)胞。
17.權(quán)利要求16的抗體，其中所述癌細(xì)胞來自選自以下的癌癥:卵巢癌，特別是卵巢腺癌和卵巢畸胎癌；肺癌，包括小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，特別是鱗狀細(xì)胞肺癌和腺癌；胃癌；乳腺癌；肝癌；胰腺癌；皮膚癌，特別是基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌；惡性黑色素瘤；頭頸癌，特別是惡性多形性腺瘤；肉瘤，特別是滑膜肉瘤和癌肉瘤；膽管癌；膀胱癌，特別是移行細(xì)胞癌和乳頭狀癌；腎癌，特別是腎細(xì)胞癌，包括明細(xì)胞腎細(xì)胞癌和乳頭狀腎細(xì)胞癌；結(jié)腸癌；小腸癌，包括回腸癌，特別是小腸腺癌和回腸腺癌；睪丸胚胎性癌；胎盤絨毛膜癌；子宮頸癌；睪丸癌，特別是睪丸精原細(xì)胞瘤、睪丸畸胎瘤和胚胎性睪丸癌；子宮癌；生殖細(xì)胞腫瘤，例如畸胎癌或胚胎性癌，特別是睪丸的生殖細(xì)胞腫瘤；及其轉(zhuǎn)移形式。
18.權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的抗體，其是單克隆抗體、嵌合抗體、人抗體或人源化抗體，或者抗體的片段。
19.權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的抗體,其能夠與天然構(gòu)象CLDN6的一個(gè)或更多個(gè)表位相結(jié)合。
20.綴合物，其包含與治療劑偶聯(lián)的權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)的抗體。
21.權(quán)利要求20的綴合物，其中所述治療劑是毒素、放射性同位素、藥物或細(xì)胞毒劑。
22.藥物組合物， 其包含權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)的抗體和/或權(quán)利要求20或21的綴合物、以及可藥用載劑。
23.抑制細(xì)胞生長的方法，所述細(xì)胞表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征，所述方法包括將所述細(xì)胞與權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)的抗體和/或權(quán)利要求20或21的綴合物相接觸。
24.殺傷細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征，所述方法包括將所述細(xì)胞與權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)的抗體和/或權(quán)利要求20或21的綴合物相接觸。
25.在對象中治療或預(yù)防與細(xì)胞相關(guān)的疾病或病癥的方法，所述細(xì)胞表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征，所述方法包括向所述對象施用權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)的抗體、權(quán)利要求20或21的綴合物或者權(quán)利要求22的藥物組合物。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述疾病或病癥是腫瘤相關(guān)疾病。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述腫瘤相關(guān)疾病是癌癥。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述癌癥選自:卵巢癌，特別是卵巢腺癌和卵巢畸胎癌；肺癌，包括小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，特別是鱗狀細(xì)胞肺癌和腺癌；胃癌；乳腺癌；肝癌；胰腺癌；皮膚癌，特別是基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌；惡性黑色素瘤；頭頸癌，特別是惡性多形性腺瘤；肉瘤，特別是滑膜肉瘤和癌肉瘤；膽管癌；膀胱癌，特別是移行細(xì)胞癌和乳頭狀癌；腎癌，特別是腎細(xì)胞癌，包括明細(xì)胞腎細(xì)胞癌和乳頭狀腎細(xì)胞癌；結(jié)腸癌；小腸癌，包括回腸癌，特別是小腸腺癌和回腸腺癌；睪丸胚胎性癌；胎盤絨毛膜癌；子宮頸癌；睪丸癌，特別是睪丸精原細(xì)胞瘤、睪丸畸胎瘤和胚胎性睪丸癌；子宮癌；生殖細(xì)胞腫瘤，例如畸胎癌或胚胎性癌，特別是睪丸的生殖細(xì)胞腫瘤；及其轉(zhuǎn)移形式。
29.抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散的方法，所述細(xì)胞表達(dá)CLDN6并以CLDN6與其細(xì)胞表面相締合為特征，所述方法包括將所述細(xì)胞與權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)的抗體和/或權(quán)利要求20或21的綴合物相接觸 。
【文檔編號】C07K16/30GK103748112SQ201280022739
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2012年4月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月13日
【發(fā)明者】烏爾·沙欣, 厄茲萊姆·圖雷奇, 米夏埃爾·科斯洛夫斯基, 科登·沃爾特, 斯特凡·韋爾, 瑪麗亞·克羅伊茨貝格, 貝恩德·胡布納, 米夏埃爾·埃爾代連, 米夏埃爾·魏歇爾 申請人:加尼梅德藥物公司, 約翰內(nèi)斯·古滕伯格美因茲大學(xué)