用于檢測和診斷癌癥的抗體i-3859的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及新的、分離的抗CXCR4抗體在癌癥診斷中的用途。特別地，公開了用于診斷和/或預(yù)后與CXCR4表達(dá)相關(guān)的致癌疾病的方法。
【專利說明】用于檢測和診斷癌癥的抗體1-3859的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及在患者中預(yù)后和/或診斷和/或治療監(jiān)測(therapy monitoring)增殖性疾病的領(lǐng)域。更具體的，本發(fā)明涉及能夠特異性結(jié)合CXCR4的抗體，以及所述抗體用于檢測和診斷與CXCR4表達(dá)相關(guān)的病理性過度增殖性致癌疾病(pathologicalhyperproliferative oncogenic disorders)的用途、和相應(yīng)的方法。在某些實(shí)施方案中，所述疾病是與CXCR4相對于正常而言升高的表達(dá)相關(guān)的致癌疾病，或任何其它與CXCR4過表達(dá)相關(guān)聯(lián)的病理學(xué)。本發(fā)明最終包括至少含有這種抗體的產(chǎn)物和/或組合物或試劑盒，以用于某些癌癥的預(yù)后和/或診斷和/或治療監(jiān)測。
【背景技術(shù)】
[0002]趨化因子是小的分泌肽，特別是免疫反應(yīng)期間其控制著白細(xì)胞沿被稱為趨化因子梯度的配體化學(xué)梯度的遷移(Zlotnick A.等人，2000)?；谄銷H2-端半胱氨酸殘基的位置、及與G蛋白偶聯(lián)受體(其兩個(gè)主要亞家族被命名為CCR和CXCR)的結(jié)合，趨化因子被分為兩個(gè)主要的亞家族，CC和CXC。到目前為止人們已發(fā)現(xiàn)了超過50個(gè)人趨化因子和18個(gè)趨化因子受體。
[0003]許多癌癥具有復(fù)雜的趨化因子網(wǎng)絡(luò)，其影響腫瘤的免疫細(xì)胞浸潤以及腫瘤細(xì)胞生長、存活、遷移和血管生成。免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞自身表達(dá)趨化因子受體，并可以響應(yīng)趨化因子梯度。人類癌癥活檢樣本和小鼠癌癥模型的研究表明癌細(xì)胞趨化因子受體的表達(dá)與轉(zhuǎn)移能力的增加相關(guān)。來自不同癌癥類型的惡性細(xì)胞具有不同的趨化因子受體表達(dá)譜，但是趨化因子受體4 (CXCR4)是最常發(fā)現(xiàn)的。來自至少23種不同類型的上皮起源、間充質(zhì)起源和造血起源的人類癌癥的細(xì)胞表達(dá)CXCR4受體(Balkwill F.等人，2004)。
[0004]趨化因子受體4 (也稱為融合素、⑶184、LESTR或HUMSTR)作為包含352個(gè)或360個(gè)氨基酸的兩種同種型存在。同種型a具有Genbank登錄號NP_001008540所述的氨基酸序列，而同種型b具有Genbank登錄號NP_003458所述的氨基酸序列。殘基Asnll是糖基化的，殘基Tyr21是通過添加硫酸基團(tuán)修飾的，Cysl09和186通過二硫橋在受體的細(xì)胞外部分進(jìn)行結(jié)合(Juarez J.等人,2004)。
[0005]該受體由不同類型的正常組織、初始(nlii\e)、非記憶T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、B細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、初級單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、CD34+造血干細(xì)胞表達(dá)，且在心臟、結(jié)腸、肝、腎和腦中以低水平表達(dá)。CXCR4在白細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)(trafficking)、B細(xì)胞淋巴細(xì)胞生成和髓細(xì)胞生成中起關(guān)鍵作用。
[0006]CXCR4受體在大量癌癥中過表達(dá)，所述癌癥包括但不限于淋巴瘤、白血病、多發(fā)性骨髓瘤、結(jié)腸癌(Ottaiano A.等人，2004)、乳癌(Kato M.等人，2003)、前列腺癌(SunY.X.等人，2003)、肺癌(小細(xì)胞癌和非小細(xì)胞癌(Phillips R.J.等人，2003))、卵巢癌(Scotton C.J.等人,2002)、胰腺癌(Koshiba T.等人,2000)、腎癌、腦癌(Barbero S 等人，2002),成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和淋巴瘤。
[0007]迄今描述的CXCR4受體的唯一配體是間質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1 (SDF-1)或CXCL12。SDF-1在淋巴結(jié)、骨髓、肝、肺中大量分泌，腎、腦和皮膚分泌程度更少。CXCR4也被拮抗趨化因子識別，該拮抗趨化因子是III型人皰疹病毒編碼的病毒巨噬細(xì)胞炎癥蛋白II(vMIP-1I)。
[0008]CXCR4/SDF-1軸在癌癥中起關(guān)鍵作用，直接參與導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的遷移、侵入。實(shí)際上，癌細(xì)胞表達(dá)CXCR4受體，它們遷移并進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)。然后，癌細(xì)胞被滯留(arrested)在產(chǎn)生高水平SDF-1的器官中的血管床中，在那里其增殖、誘導(dǎo)血管生成和形成轉(zhuǎn)移性腫瘤(MurphyPM.,2001 )0該軸也通過激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)的激酶(ERK)途徑(Barbero S.等人，2003)和血管生成(Romagnani P.，2004)參與細(xì)胞增殖。實(shí)際上，CXCR4受體及其配體SDF-1通過刺激VEGF-A表達(dá)顯然地促進(jìn)了血管生成，其轉(zhuǎn)而增加了 CXCR4/SDF-1的表達(dá)(BachelderR.E.等人，2002)。還已知與腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞(TAM)聚集在腫瘤的缺氧區(qū)域，經(jīng)刺激后與腫瘤細(xì)胞合作，并促進(jìn)血管生成。據(jù)觀察缺氧選擇性地上調(diào)包括TAM的各種細(xì)胞類型中CXCR4的表達(dá)(Mantovani A.等人，2004)。最近證實(shí)CXCR4/SDF-1軸調(diào)節(jié)CXCR4+造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞(HSC)的轉(zhuǎn)運(yùn)/歸巢，可在新生血管形成中起作用。證據(jù)顯示除了 HSC之外，功能性CXCR4也在來自其它組織(組織定向干細(xì)胞=TCSC)的干細(xì)胞上表達(dá)，因此SDF-1可在器官/組織再生所需的化學(xué)引誘(chemottracting) CXCR4+TCSC中起關(guān)鍵作用，但是這些TCSC也可以是癌癥發(fā)展的細(xì)胞起源(癌癥干細(xì)胞理論)。對于人類白血病，和最近對于幾種實(shí)體腫瘤，比如腦和乳房，證實(shí)了癌癥的干細(xì)胞起源。存在幾個(gè)可以衍生自正常CXCR4+組織/器官特異性干細(xì)胞的CXCR4+的腫瘤實(shí)例，比如白血病、腦腫瘤、小細(xì)胞肺癌、乳癌、肝胚細(xì)胞瘤、卵巢癌和宮頸癌(Kucia M.等人，2005)。
[0009]使用針對CXCR4受體的單克隆抗體在體內(nèi)證實(shí)了通過干擾CXCR4受體可以靶向癌癥轉(zhuǎn)移(Muller A.等人 ，2001)。簡而言之，已表明針對CXCR4受體(單抗173R&D系統(tǒng))的單克隆抗體顯著地減少了 SCID小鼠中常位(orthotopic)乳癌模型(MDA-MB231)中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)量。另一個(gè)研究(Phillips R.J等人，2003)使用抗SDF-1的多克隆抗體也顯示SDF-1/CXCR4軸在常位肺癌模型(A549)的轉(zhuǎn)移中起決定性作用，但是在該研究中，其對于腫瘤生長和血管生成都沒有作用。幾個(gè)其它研究也描述了使用CXCR4的SiRNA雙鏈體(Liang Z.等人，2005)生物穩(wěn)定的CXCR4肽拮抗劑(Tamamura H.等人，2003)對體內(nèi)轉(zhuǎn)移的抑制，或使用CXCR4的小分子拮抗劑如AMD3100(Rubin J.B.等人，2003 ；De Falco V.等人，2007)或單抗(專利W02004/059285A2)對體內(nèi)腫瘤生長的抑制。因此，CXCR4是經(jīng)驗(yàn)證的用于癌癥的治療靶。
[0010]趨化因子受體2(CXCR2)是另一種趨化因子受體，也被描述為腫瘤學(xué)中感興趣的靶。實(shí)際上，CXCR2在幾種腫瘤細(xì)胞類型中傳遞自分泌細(xì)胞生長信號，也可以通過促進(jìn)血管生成間接地影響腫瘤生長(Tanaka T.等人2005)。
[0011]CXCR2趨化因子受體包含360個(gè)氨基酸。其主要在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，尤其是在新生血管形成期間。幾種趨化因子結(jié)合CXCR2受體:CXCL5、-6、-7、IL-8、GR0-a、-0和Y，其屬于ERL+促血管生成趨化因子。所述CXCR2受體與CXCR4受體共享序列同源性:37%的序列同一性和48%的序列同源性。CXCR2/配體軸參與幾種腫瘤生長機(jī)制，比如轉(zhuǎn)移(Singh RK.等人，1994)、細(xì)胞增殖(Owen J.D.等人，1997)和ERL+趨化因子介導(dǎo)的血管生成(StrieterR.M.等人，2004)。最后，與腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞是炎癥誘導(dǎo)的腫瘤生長的關(guān)鍵元素，趨化因子比如CXCL5、IL-8和GRO-a啟動嗜中性粒細(xì)胞的募集。[0012]二聚化作為調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體功能的常見機(jī)制出現(xiàn)，所述G蛋白偶聯(lián)受體是趨化因子受體(Wang J.和Norcross M，2008)。已經(jīng)表明響應(yīng)趨化因子結(jié)合的同源二聚化和異源二聚化是啟動和改變許多趨化因子受體的信號傳導(dǎo)所需要的。不斷有證據(jù)支持所述受體二聚體或寡聚體可能是趨化因子受體的基本功能單元的概念。在沒有配體的情況下，發(fā)現(xiàn)了趨化因子受體二聚體，并且趨化因子誘導(dǎo)受體二聚體的構(gòu)象變化。已知CXCR4與例如8 阿片類受體(DOR) (Hereld D., 2008)或 CCR2 (Percherancier Y.等人，2005)形成同源二聚體，也形成異源二聚體。在后一個(gè)實(shí)例中，源自CXCR4的跨膜結(jié)構(gòu)域的肽通過阻斷配體誘導(dǎo)的所述二聚體的構(gòu)象轉(zhuǎn)換而抑制活化(Percherancier Y.等人,2005)。另一個(gè)研究表明CXCR4-TM4肽(CXCR4的跨膜區(qū)的合成肽)降低了 CXCR4同源二聚體的原體(protomer)之間的能量轉(zhuǎn)移，并且抑制了惡性細(xì)胞中SDF-1誘導(dǎo)的遷移和肌動蛋白聚合(Wang J.等人，2006)。最近，也描述了 CXCR7與CXCR4形成功能性異源二聚體，并且增強(qiáng)了 SDF-1誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)(Sierro F.等人，2007)。組成型異源二聚體的其它實(shí)例包括顯示CXCRl和CXCR2相互作用以及形成各自同源二聚體的研究。對于它們中任一個(gè)與另一 GPCR(a (IA)腎上腺素受體)都沒有記錄到相互作用，表明CXCRl和CXCR2相互作用的特異性(Wilson S.等人，2005)。
[0013]如前所述，CXCR4和CXCR2受體是令人感興趣的腫瘤靶點(diǎn)。干擾那些受體將通過減少腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、腫瘤細(xì)胞遷移和侵入、腫瘤對嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的募集和通過抑制CXCR4癌癥干細(xì)胞，以非常有效的方式抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。
[0014]兩個(gè)單克隆抗體，指515H7和414H5，其結(jié)合CXCR4同源二聚體和CXCR4/CXCR2異源二聚體兩者，并在兩者中誘導(dǎo)構(gòu)象變化，其具有強(qiáng)抗腫瘤活性，并已在之前得到描述(參見TO2010/037831)。此外，本 申請人:已證實(shí)這種CXCR4/CXCR2異源二聚體的存在。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明旨在提供至少一種在癌癥模型中缺少任何體內(nèi)活性的試劑，其可用作致癌疾病的診斷或預(yù)后 工具，特別是特征在于CXCR4表達(dá)的那些、或者由異常CXCR4表達(dá)所介導(dǎo)的那些。
[0016]已公布的專利申請W02010/125162公開了兩個(gè)抗CXCR4單克隆抗體，稱為515H7和301aE5，以及其在HIV治療領(lǐng)域的用途。
[0017]出人意料的，本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)證實(shí)所述抗體301aE5 (在本說明書中也指301E5，或通過參考已保藏的雜交瘤，更優(yōu)選地指1-3859:出于本申請的目的，這些術(shù)語是相似的)在癌癥治療領(lǐng)域不具有任何體內(nèi)活性，這與其它呈現(xiàn)強(qiáng)抗腫瘤活性的抗體515H7相反(如W02010/037831中所述)。特別地，1-3859并不阻止CXCR4配體與受體的結(jié)合。
[0018]此外，本 申請人:發(fā)現(xiàn)抗體1-3859能夠:
[0019]i )識別單體的CXCR4 ；
[0020]ii)識別作為CXCR4/CXCR4同源二聚體的CXCR4 ；
[0021]iii)識別作為 CXCR4/CXCR2 異源二聚體的 CXCR4 ；
[0022]iv)從細(xì)胞裂解物(Iysat)中免疫沉淀CXCR4 ；
[0023]V)通過突光激活細(xì)胞分選(Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS)識別表達(dá)CXCR4的細(xì)胞表面上的CXCR4 ;和[0024]vi )通過免疫組織化學(xué)方法識別CXCR4。
[0025]因?yàn)榭贵w1-3859的這些之前從未公開的新特性，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)所述抗體可用于鑒定表達(dá)CXCR4的細(xì)胞以及，特別是，表達(dá)CXCR4的腫瘤細(xì)胞。
[0026]因此，本發(fā)明涉及所述抗體在檢測表達(dá)CXCR4的疾病存在和/或定位中的用途。本發(fā)明也可應(yīng)用在表達(dá)CXCR4的疾病的診斷和/或預(yù)后，優(yōu)選在體外。所述表達(dá)CXCR4的疾病優(yōu)選是癌癥。
[0027]本發(fā)明的抗體1-3859的另一有利特性是其識別的表位與治療性單克隆抗體515H7的表位接近。更具體來說，如實(shí)驗(yàn)實(shí)施例所示，1-3859能夠與治療性抗體515H7競爭與其表位的結(jié)合。因此，例如所述1-3859抗體可用于篩選待用515H7單抗進(jìn)行治療的患者。特別是，本發(fā)明的抗體1-3859可用于檢驗(yàn)存在于患者細(xì)胞表面的CXCR4的構(gòu)象，其與抗體515H7識別的構(gòu)象相類似，表明所述患者適應(yīng)(amenable)基于抗體515H7的治療。
[0028]本發(fā)明的第一方面涉及以高親和性特異性結(jié)合CXCR4的分離的抗體、或其抗原結(jié)合片段或衍生物，所述抗體缺乏任何體內(nèi)活性。所述分離的抗體、或其抗原結(jié)合片段或衍生物可用于診斷或預(yù)后由CXCR4表達(dá)所介導(dǎo)的病理性過度增殖性致癌疾病的方法。特別地，所述分離的抗體可用于體內(nèi)成像。優(yōu)選的，本發(fā)明的分離的抗體結(jié)合人CXCR4。
[0029]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供分離的抗體、或其抗原結(jié)合片段或衍生物以用于檢測表達(dá)CXCR4的腫瘤的存在，其中所述抗體包含至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)，其選自包含氨基酸序列SEQ ID NOl至6的⑶R ;或序列與序列I至6在最佳比對后具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的至少 一個(gè)⑶R。
[0030]更優(yōu)選的，本發(fā)明包含根據(jù)本發(fā)明的獲自遺傳重組或化學(xué)合成的抗體、或其抗原結(jié)合片段或衍生物。
[0031]根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的抗體、或其衍生化合物或抗原結(jié)合片段，特征在于其由單克隆抗體組成。
[0032]本文所用的“單克隆抗體”意思是來源于幾乎同質(zhì)的抗體群的抗體。更特別地，除了可以以最小比例發(fā)現(xiàn)的很少可能天然出現(xiàn)的突變之外，群中的單個(gè)抗體是相同的。換句話說，單克隆抗體是由來源于單個(gè)細(xì)胞克隆(例如雜交瘤、用編碼同質(zhì)性抗體的DNA分子轉(zhuǎn)染的真核宿主細(xì)胞、用編碼同質(zhì)性抗體的DNA分子轉(zhuǎn)染的原核宿主細(xì)胞等)生長的同質(zhì)性抗體組成，其特征通常是一個(gè)且僅一個(gè)種類和亞類的重鏈，和僅一種類型的輕鏈。單克隆抗體是高度特異性且針對單一抗原的。另外，與通常包括針對各種決定簇或表位的各種抗體的多克隆抗體制劑相比，每個(gè)單克隆抗體針對抗原的單一表位。
[0033]典型的IgG抗體包含通過二硫鍵結(jié)合的兩條相同重鏈和兩條相同輕鏈。每個(gè)重鏈和輕鏈都包含恒定區(qū)和可變區(qū)。每個(gè)可變區(qū)包含三個(gè)被稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”(“⑶R”)或“超變區(qū)”的段，其主要負(fù)責(zé)與抗原的表位相結(jié)合。其通常按照從N端的順序編號被稱作CDR1、CDR2和CDR3?？勺儏^(qū)中較為高度保守的部分被稱作“框架區(qū)”。
[0034]存在三個(gè)重鏈⑶R和三個(gè)輕鏈⑶R。本文所用術(shù)語⑶R或⑶Rs表示，根據(jù)情況，包含負(fù)責(zé)抗體與其識別的抗原或表位的親和性結(jié)合的大多數(shù)氨基酸殘基的這些區(qū)中的一個(gè)或幾個(gè)、或者甚至全部這些區(qū)。
[0035]根據(jù)本發(fā)明，抗體的⑶R將根據(jù)IMGT編號系統(tǒng)來定義。從根據(jù)IMGT的⑶R推導(dǎo)出根據(jù)Kabat的⑶R，對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。根據(jù)Kabat的⑶R必須視作本發(fā)明范圍的一部分。
[0036]無論抗原受體、鏈類型或物種如何，都將MGT唯一的編號定義為比較可變結(jié)構(gòu)域[Lefranc M.-P., Immunology Todayl8, 509(1997)/Lefranc M.-P., TheImmunologist, 7, 132-136 (1999)/Lefranc,M.-P.,Pommie, C., Ruiz, M., GiudicelIi, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V.和 Lefranc, Dev.Comp.1mmunol.，27，55-77 (2003)]。在MGT唯一編號中，保守性氨基酸總是具有相同位置，例如半胱氨酸23(第I個(gè)CYS)、色氨酸41(保守性TRP)、疏水性氨基酸89、半胱氨酸104 (第2個(gè)CYS)、苯丙氨酸或色氨酸118 (J-PHE或J-TRP)。所述MGT唯一編號提供了框架區(qū)(FR1-1MGT:位置 I 至 26，F(xiàn)R2-MGT:39 至 55，F(xiàn)R3-MGT:66 至 104 和 FR4-1MGT:118 至 128)和互補(bǔ)決定區(qū)CDRl-頂GT:27至38，CDR2-MGT:56至65和CDR3-MGT:105至117的標(biāo)準(zhǔn)化定界。由于空位(gap)代表未占用的位置，⑶R-MGT長度(在括號之間顯示，并用點(diǎn)分開，例如[8.8.13])成為關(guān)鍵信息。在2D圖解中使用IMGT唯一編號，命名為IMGT Colliersde Perles [Ruiz, M.和 Lefranc, M.-P.，Immunogenetics, 53，857-883 (2002)/Kaas, Q.和Lefranc, M.-P.，Current Bioinformatics, 2，21-30 (2007)]，并在 IMGT/3D 結(jié)構(gòu) DB 中的 3D結(jié)構(gòu)中使用[Kaas, Q.，Ruiz, M.和 Lefranc, M.-P.，T cell receptor and MHC structuraldata.Nuc1.Acids.Res., 32, D208-D210 (2004)]。
[0037]更具體地，根據(jù)第一方面，本發(fā)明涉及能夠特異性結(jié)合CXCR4的抗體、或其抗原結(jié)合片段或衍生物，其包括i)重鏈，根據(jù)頂GT編號系統(tǒng)所定義的，其含有下列⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3中的至少一個(gè)，其中⑶R-Hl含有序列SEQ ID N0.1、⑶R-H2含有序列SEQ ID N0.2以及CDR-H3含有序列SEQ ID N0.3 ;和/或ii)輕鏈，根據(jù)IMGT編號系統(tǒng)所定義的，其含有下列 CDR-Ll、CDR-L2 和 CDR-L3 中至少一個(gè)，其中 CDR-Ll 含有序列 SEQ ID N0.4、CDR_L2含有序列SEQ ID N0.5以及CDR-L3含有序列SEQ ID N0.6。
[0038]在另一個(gè)實(shí)施方 案中，本發(fā)明也可被描述為抗體、或其抗原結(jié)合片段或衍生物，其包括:
[0039]-含有根據(jù)MGT所定義的下列三個(gè)⑶R的重鏈，分別為具有序列SEQID N0.1的CDR-H1、具有序列SEQ ID N0.2的CDR-H2和具有序列SEQ ID N0.3的CDR-H3，或者與序列SEQ ID N0.1、2或3分別經(jīng)最佳比對后具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列；和
[0040]-含有根據(jù)MGT所定義的下列三個(gè)⑶R的輕鏈，分別為具有序列SEQID N0.4的CDR-L1、具有序列SEQ ID N0.5的CDR-L2和具有序列SEQ ID N0.6的CDR-L3，或者與序列SEQ ID N0.4、5或6分別經(jīng)最佳比對后具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列。
[0041]在本發(fā)明的意義上，兩條核酸或氨基酸序列之間的“百分比同一性”指兩條進(jìn)行比較的序列之間在最佳比對后獲得的相同核苷酸或氨基酸殘基的百分比，該百分比是純粹統(tǒng)計(jì)學(xué)上的，并且兩條序列之間的差異沿其長度隨機(jī)分布。兩條核酸或氨基酸序列之間的比較通常在已對其進(jìn)行最佳比對后通過比較序列而進(jìn)行，所述比較能夠分段進(jìn)行或使用“比對窗口”進(jìn)行。用于比較的序列的最佳比對，除手工比較之外，還可以通過Smith和Waterman 的局部同源性算法(1981) (Ad.App.Math.2:482)、通過 Neddleman 和 Wunsch 的局部同源性算法(1970) (J.Mol.Biol.48:443)、通過Pearson和Lipman的相似性搜索法(1988) (Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:2444)或通過使用這些算法的計(jì)算機(jī)軟件(威斯康星遺傳學(xué)軟件包，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組，575Science Dr.，Madison, WI的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，或通過比較軟件BLAST NR或BLAST P)進(jìn)行。
[0042]通過比較兩條最佳比對的序列確定兩條核酸或氨基酸序列之間的百分比同一性，其中與用于兩條序列之間最佳比對的參考序列相比，待比較的核酸或氨基酸序列可具有添加或缺失。通過如下方法計(jì)算百分比同一性:確定兩條序列之間相同氨基酸或核苷酸殘基的位置數(shù)目，將相同位置的數(shù)目除以在比對窗口中的位置總數(shù)，并將結(jié)果乘以100以獲得兩條序列之間的百分比同一性。
[0043]例如，從網(wǎng)站http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html 上可獲得的 BLAST程序“BLAST2 序列”(Tatusova 等人，“Blast2sequences_a new tool for comparingprotein and nucleotide sequences”，F(xiàn)EMS Microbiol, 1999, Lett.174:247_250)，可以與缺省參數(shù)一起使用(特別是參數(shù)“開放空位罰分”:5，和“延伸空位罰分”:2 ;所選的矩陣是例如程序建議的“BL0SUM62”矩陣)；直接通過所述程序計(jì)算兩條待比較序列之間的百分比同一I"生。
[0044]對于表現(xiàn)出與參考氨基酸序列具有至少80%,優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的氨基酸序列而言，優(yōu)選的實(shí)例包括包含參考序列，某些修飾，特別是至少一個(gè)氨基酸的缺失、添加或置換，截短或延伸的那些。在置換一個(gè)或多個(gè)連續(xù)或不連續(xù)氨基酸的情況下，優(yōu)選其中被置換的氨基酸被“等同的”氨基酸所取代的置換。在此，表述“等同的氨基酸”指可能被結(jié)構(gòu)性氨基酸之一所置換的，然而并未改變相應(yīng)抗體的生物活性的任何氨基酸和下述限定的那些具體實(shí)例。
[0045]等同氨基酸可 根據(jù)其與被置換氨基酸的結(jié)構(gòu)同源性或根據(jù)可能產(chǎn)生的各種抗體之間生物活性的比較性測試結(jié)果而確定。
[0046]作為非限制性實(shí)例，下表1概述可進(jìn)行卻沒有引起相應(yīng)經(jīng)修飾的抗體的生物活性發(fā)生顯著改變的可能置換；在相同條件下，反向置換自然是可能的。
[0047]表1
[0048]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測CXCR4表達(dá)腫瘤的存在和/或定位的抗體、或其抗原結(jié)合片段或衍生物，所述抗體包含:i)含有下列3個(gè)⑶R的重鏈，所述⑶R分別為具有序列SEQ ID N0.1的CDR-Hl、具有序列SEQ ID N0.2的CDR-H2和具有序列SEQ ID N0.3的CDR-H3 ;和ii)含有下列3個(gè)⑶R的輕鏈，所述⑶R分別為具有序列SEQ ID N0.4的⑶R-L1、具有序列SEQ IDN0.5 的 CDR-L2 和具有序列 SEQ ID N0.6 的 CDR-L3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體、或其抗原結(jié)合片段或衍生物，其特征在于其選自: a)抗體，其具有含有下列3個(gè)⑶R的重鏈，所述⑶R分別為具有序列SEQID N0.1的CDR-Hl、具有序列SEQ ID N0.2的CDR-H2和具有序列SEQ ID N0.3的CDR-H3 ;以及含有序列SEQ ID N0.8的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； b)抗體，其具有含有序列SEQID N0.7的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；以及含有下列3個(gè)⑶R的輕鏈，所述CDR分別為具有序列SEQ ID N0.4的CDR-Ll、具有序列SEQ ID N0.5的CDR-L2和具有序列SEQ ID N0.6的CDR-L3 ;或 c)抗體，其具有含有序列SEQID N0.7的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；和含有序列SEQ ID N0.8的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)所述的抗體、或其抗原結(jié)合片段或衍生物，其用于體外或離體診斷或預(yù)后與CXCR4表達(dá)相關(guān)的致癌疾病。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的抗體、或其抗原結(jié)合片段或衍生物，其中所述抗體無體內(nèi)抗腫瘤活性。
5.一種用于在受試者中體外或離體檢測CXCR4表達(dá)腫瘤存在和/或定位的方法，所述方法包括步驟: (a)用能夠特異性結(jié)合CXCR4的抗體、或其抗原結(jié)合片段或衍生物接觸來自受試者的生物樣本；以及 (b)檢測所述抗體、或其抗原結(jié)合片段或衍生物與所述生物樣本的結(jié)合， 其中所述抗體、或其抗原結(jié)合片段或衍生物包含:i)含有下列3個(gè)CDR的重鏈，所述CDR分別為具有序列SEQ ID N0.1的CDR-H1、具有序列SEQ ID N0.2的CDR-H2和具有序列SEQ ID N0.3的CDR-H3 ;和ii)含有下列3個(gè)CDR的輕鏈，所述CDR分別為具有序列SEQ IDN0.4 的 CDR-Ll、具有序列 SEQ ID N0.5 的 CDR-L2 和具有序列 SEQ ID N0.6 的 CDR-L3。
6.一種用于在受試者中體外或離體檢測表達(dá)CXCR4的細(xì)胞的百分比的方法，所述方法包括步驟: (a)用能夠特異性結(jié)合CXCR4的抗體、或其抗原結(jié)合片段或衍生物接觸來自受試者的生物樣本；以及 (b)定量在所述生物樣本中表達(dá)CXCR4的細(xì)胞的百分比， 其特征在于所述抗體、或其抗原結(jié)合片段或衍生物包含:i)含有下列3個(gè)CDR的重鏈，所述CDR分別為具有序列SEQ ID N0.1的CDR-Hl、具有序列SEQ ID N0.2的CDR-H2和具有序列SEQ ID N0.3的⑶R-H3 ;和ii)含有下列3個(gè)⑶R的輕鏈，所述⑶R分別為具有序列 SEQ ID N0.4 的 CDR-Ll、具有序列 SEQ ID N0.5 的 CDR-L2 和具有序列 SEQ ID N0.6 的CDR-L3。
7.一種用于在來自受試者的表達(dá)CXCR4的腫瘤中體外或離體確定CXCR4表達(dá)水平的方法，所述方法包括步驟:(a)用能夠特異性結(jié)合CXCR4的抗體、或其抗原結(jié)合片段或衍生物接觸來自受試者的生物樣本；以及 (b)定量所述抗體、或其抗原結(jié)合片段或衍生物與所述生物樣本中的CXCR4的結(jié)合水平， 其特征在于所述抗體、或其抗原結(jié)合片段或衍生物包含:i)含有下列3個(gè)CDR的重鏈，所述CDR分別為具有序列SEQ ID N0.1的CDR-Hl、具有序列SEQ ID N0.2的CDR-H2和具有序列SEQ ID N0.3的⑶R-H3 ;和ii)含有下列3個(gè)⑶R的輕鏈，所述⑶R分別為具有序列 SEQ ID N0.4 的 CDR-Ll、具有序列 SEQ ID N0.5 的 CDR-L2 和具有序列 SEQ ID N0.6 的CDR-L3。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中優(yōu)選通過熒光激活細(xì)胞分選(FACS)或免疫組織化學(xué)(IHC)測量所述抗體、或其抗原結(jié)合片段或衍生物與CXCR4的結(jié)合水平。
9.一種用于體外或離體診斷或預(yù)后表達(dá)CXCR4的腫瘤的方法，所述方法包括步驟: (a)根據(jù)權(quán)利要求7或8確定CXCR4的表達(dá)水平，以及 (b)將步驟(a)的表達(dá)水平與來自正常組織或非CXCR4表達(dá)組織的CXCR4參考表達(dá)水平進(jìn)行比較。
10.一種用于體外或離體確定受試者腫瘤的評分的方法，所述方法包括步驟: (a)用能夠特異性結(jié)合CXCR4的抗體、或其抗原結(jié)合片段或衍生物接觸來自受試者的生物樣本； (b)定量所述抗體、或其抗原結(jié)合片段或衍生物與在所述生物樣本中的CXCR4的結(jié)合水平；以及 (c)通過將來自受試者的所述抗體、或其抗原結(jié)合片段或衍生物的結(jié)合的量化水平與合適的等級進(jìn)行比較，為腫瘤評分， 其特征在于，所述抗體、或其抗原結(jié)合片段或衍生物包括:i)含有下列3個(gè)CDR的重鏈，所述⑶R分別為具有序列SEQ ID N0.1的⑶R-Hl、具有序列SEQID N0.2的⑶R-H2和具有序列SEQ ID N0.3的⑶R-H3 ;和ii)含有下列3個(gè)⑶R的輕鏈，所述⑶R分別為具有序列 SEQ ID N0.4 的 CDR-Ll、具有序列 SEQ ID N0.5 的 CDR-L2 和具有序列 SEQ ID N0.6 的CDR-L3。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述合適的等級基于兩個(gè)參數(shù)，所述兩個(gè)參數(shù)是染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞的百分比。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11任一項(xiàng)所述的方法，其中所述合適的等級是0至8的等級，其中無反應(yīng)性評分為0，以及67-100%反應(yīng)比例的強(qiáng)反應(yīng)性評分為8。
13.一種用于體外或離體確定來自受試者的腫瘤狀態(tài)的方法，所述方法包括步驟: (a)根據(jù)權(quán)利要求10、11或12之一為來自受試者的腫瘤評分；和 (b)確定腫瘤狀態(tài)是評分3至8的[CXCR4(+)];或 (c)確定腫瘤狀態(tài)是評分0至2的[CXCR4(-)]。
14.根據(jù)權(quán)利要求10或11任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的合適的等級是0至3+的等級，其中無腫瘤細(xì)胞的膜反應(yīng)性評分為0，以及在10%以上的腫瘤細(xì)胞中的強(qiáng)烈完全的反應(yīng)性評分為3+。
15.一種用于體外或離體確定來自受試者的腫瘤狀態(tài)的方法，其中所述方法包括步驟: (a)根據(jù)權(quán)利要求10、11或14之一為來自受試者的腫瘤評分；和 (b)確定腫瘤狀態(tài)是2+或3+評分的[CXCR4(+)];或 (c)確定腫瘤狀態(tài)是O或1+評分的[CXCR4(-)]。
16.一種用于確定致癌疾病是否對使用抗CXCR4抗體、或其片段或衍生物的治療易感的方法，所述方法包括步驟: (a)根據(jù)權(quán)利要求13或15體外或離體確定受試者腫瘤的CXCR4狀態(tài)，和 (b)如果狀態(tài)是CXCR4(+)，則確定致癌疾病對使用抗-CXCR4抗體、或其片段或衍生物的治療易感。
17.一種用于選擇癌癥患者的方法，所述癌癥患者經(jīng)預(yù)測能夠或不能從施用治療量的CXCR4抑制劑中獲益，所述方法包括步驟: (a)根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法確定CXCR4的表達(dá)水平； (b)將之前步驟a)的表達(dá)水平與參考表達(dá)水平相比較；以及 (c)如果獲自(a)的表達(dá)水平與參考表達(dá)水平之比大于I，則選擇經(jīng)預(yù)測能夠從CXCR4抑制劑的治療性施用中獲益的患者；或者 (d)如果獲自(a)的表達(dá)水平與參考表達(dá)水平之比小于或等于1，則選擇經(jīng)預(yù)測不能夠從CXCR4抑制劑的治療性·施用中獲益的患者。
18.一種用于體外或離體確定治療方案的效果的方法，所述治療方案旨在于在患有CXCR4相關(guān)致癌疾病的受試者中緩解所述疾病，所述方法包括步驟: (a)根據(jù)權(quán)利要求7或8，在第一生物樣本中確定CXCR4的第一表達(dá)水平，所述第一生物樣本對應(yīng)于所述治療的第一時(shí)間點(diǎn)； (b)根據(jù)權(quán)利要求7或8，在第二生物樣本中確定CXCR4的第二表達(dá)水平，所述第二生物樣本對應(yīng)于所述治療的第二較后的時(shí)間點(diǎn)； (c)計(jì)算獲自步驟(a)的所述第一表達(dá)水平與獲自步驟(b)的所述第二表達(dá)水平之比；以及 (d)當(dāng)步驟(C)之比大于I時(shí)，確定所述治療方案的效果為高；或者 (e)當(dāng)步驟(C)之比小于或等于，第二表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上相似于或，確定所述治療方案的效果為低。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述治療方案旨在于在患有CXCR4相關(guān)致癌疾病的受試者中緩解所述疾病，所述治療方案包括向所述受試者施用CXCR4抑制劑。
20.一種用于檢測表達(dá)CXCR4的腫瘤的存在和/或定位的試劑盒，所述試劑盒包括下列中的至少一個(gè): a)抗體、或其抗原結(jié)合片段或衍生物，其包含:i)含有下列3個(gè)⑶R的重鏈，所述⑶R分別為具有序列SEQ ID N0.1的CDR-Hl、具有序列SEQ ID N0.2的CDR-H2和具有序列SEQID N0.3的⑶R-H3 ;和ii)含有下列3個(gè)⑶R的輕鏈，所述⑶R分別為具有序列SEQ ID N0.4的 CDR-Ll、具有序列 SEQ ID N0.5 的 CDR-L2 和具有序列 SEQ ID N0.6 的 CDR-L3 ； b)抗體，其具有含有下列3個(gè)⑶R的重鏈，所述⑶R分別為具有序列SEQID N0.1的⑶R-H1、具有序列SEQ ID N0.2的⑶R-H2和具有序列SEQ ID N0.3的⑶R-H3 ;以及含有序列SEQ ID N0.8的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；c)抗體，其具有含有序列SEQID N0.7的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；以及含有下列3個(gè)⑶R的輕鏈，所述CDR分別為具有序列SEQ ID N0.4的CDR-Ll、具有序列SEQ ID N0.5的CDR-L2和具有序列SEQ ID N0.6的CDR-L3 ； d)抗體，其具有含有序列SEQID N0.7的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；和含有序列SEQ ID N0.8的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中所述抗體是標(biāo)記的。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21任一項(xiàng)所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括用于檢測所述抗體與CXCR4之間結(jié)合程度的試劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求20或21任一項(xiàng)所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括用于定量所述抗體與CXCR4之間結(jié)合水平的試劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求20或21任一項(xiàng)所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括: i)用于檢測所述抗體與CXCR4之間的結(jié)合程度的試劑；以及 ii)用于為CXCR4表達(dá)水平評分的陽性和陰性對照樣本。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括對鼠抗體特異的多克隆抗體，所述多克隆抗體優(yōu)選是標(biāo)記的。
26.根據(jù)權(quán)利要求20 或21任一項(xiàng)所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括: i)用于檢測所述抗體與CXCR4之間的結(jié)合程度的試劑； ii)已經(jīng)與對CXCR4抑制劑的易感性相關(guān)聯(lián)的對照水平；和/或 iii)已經(jīng)與對CXCR4抑制劑的抗性相關(guān)聯(lián)的對照水平。
【文檔編號】C07K16/28GK103717620SQ201280037703
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2012年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月29日
【發(fā)明者】C·珂蘭蓋-阿穆, A·茹阿諾 申請人:皮埃爾法布雷醫(yī)藥公司