專利名稱：用于癌癥治療的抗-CTLA-4抗體和含有CpG基序的合成寡脫氧核苷酸聯(lián)合治療的制作方法
用于癌癥治療的抗-CTLA-4抗體和含有CpG基序 的合成寡脫氧核苷酸聯(lián)合治療相關(guān)申請本申請要求享有2005年7月7日提交的標題為"ANTI-CTLA-4 ANTIBODY AND CpG-MOTIF-CONTAINING SYNTHETICOLIGODEOXYNUCLEOTIDE COMBINATION THERAPY FOR CANCER TREATMENT" 的美國臨時申請系列號60/697082的優(yōu)先權(quán)，其完整內(nèi)容通過參考引 用并入本文。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及抗-CTLA-4抗體與CpG寡核苷酸組合在癌癥治療中 的應(yīng)用。發(fā)明背景癌癥治療的一個替代方案是靶向免疫系統(tǒng)("免疫療法")，替代和/ 或附加至靶向腫瘤本身。免疫療法的一個潛在益處是，通過增強患者 自身對腫瘤的免疫應(yīng)答，同時使對正常細胞的有害作用最小化，提供 提高的功效。細胞毒性T淋巴細胞-相關(guān)抗原4 (CTLA-4; CD152)是一種在激 活的T細胞上表達的細胞表面受體。CTLA-4的天然配體是B7.1 (CD80) 和B7.2 (CD86)，它們存在于抗原呈遞細胞(APC，包括樹突細胞，激 活的B-細胞，和單核細胞)上。CTLA-4是起下調(diào)節(jié)T-細胞激活和維持 免疫體內(nèi)穩(wěn)態(tài)作用的免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白的一個成員。更具體 地，認為在決定對抗原的應(yīng)答時，CD28和CTLA-4輸送由T細胞整合 的相對信號?？乖碳細胞受體的結(jié)果受CD28共刺激信號以及源自 CTLA-4的抑制信號的調(diào)節(jié)。它也由T細胞上的CD28或CTLA-4與在抗原呈遞細胞上表達的B7分子的相互作用決定。實驗證據(jù)表明，B7與CTU-4的結(jié)合，會向T細胞遞送負調(diào)節(jié)信 號，在動物模型中阻斷該負信號會導(dǎo)致增強的T細胞免疫功能和抗腫 瘤活性(Thompson和Allison, 1997， Immunity 7: 445-450; McCoy和 LeGros， 1999， Immunol. & Cell Biol. 77:1—10)。幾項研究已經(jīng)證 實，用抗鼠CTLA-4阻斷mAb治療小鼠，會顯著增強T細胞-介導(dǎo)的對 多種鼠實體瘤的殺傷，包括已建立的腫瘤，且可以誘導(dǎo)抗腫瘤免疫性 (Leach等，1996， Science 271:1734-1736; Kwon等，1997， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 8099-8103; Kwon等，1999， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:15074-15079; Yang等，1997 , Cancer Res. 57: 4036-4041; Hanson等的美國專利號6,682, 736)。此外，人類中 CTLA-4的多態(tài)性已經(jīng)與自身免疫病如類風濕性關(guān)節(jié)炎和I型糖尿病的 風險增高相關(guān)聯(lián)。另外，Allison等的美國專利5, 811, 097涉及施用CTLA-4阻斷 劑來降低腫瘤細胞生長。國際公開號W0 00/37504 (在2000年6月29 日公開)涉及人抗-CTLA-4抗體，和那些抗體在治療癌癥中的應(yīng)用。WO 01/14424 (在2001年3月1日7〉開)涉及其它人抗-CTLA-4抗體， 和這些抗體在治療癌癥中的應(yīng)用。WO 93/00431 (在1993年1月7日 公開)涉及用能與CTLA-4-Ig融合蛋白反應(yīng)的單克隆抗體調(diào)節(jié)細胞相 互作用。W0 00/32231 (在2000年6月8日公開)涉及CTLA-4阻斷劑 與腫瘤疫苗的組合用于刺激T-細胞。W0 03/086459涉及使用CTLA-4 抗體促進記憶應(yīng)答的方法。因而，本領(lǐng)域已經(jīng)證實了治療開發(fā)的潛力， 所述治療包含抑制CTLA-4結(jié)合，以增強和/或延長抗腫瘤應(yīng)答。細菌DM具有激活B細胞和天然殺傷細胞的免疫刺激作用 (Tokunaga, T.， 等，1988. Jpn. J. Cancer Res. 79:682-686; Tokunaga, T.,等，1984, JNCI 72: 955-962; Messina, J. P.，等， 1991， J. Immunol. 147: 1759-1764;綜述見Krieg, 1998， In: Applied Oligonucleotide Technology, CA. Stein和A.M. Krieg,(編.)， John Wiley和Sons, Inc. ， New York, NY, pp. 431—448)。細菌DNA的免疫刺激作用，是在特定堿基背景(CpG基序)中存在未甲基化的 CpG二核苷酸的結(jié)果，它們在細菌DM中常見，但是在脊推動物DM中 甲基化且表現(xiàn)不足(underrepresented ) (Krieg等，1995 Nature 374:546-549; Krieg， 1999 Biochim, Biophys. Acta 93321 :1-10)。 用含有這些CpG基序的合成寡脫氧核苷酸(ODN)，可以模仿細菌DNA 的免疫刺激作用。這樣的CpGODN對人和鼠白細胞具有高度刺激作用， 會誘導(dǎo)B細胞增殖、細胞因子和免疫球蛋白分泌、天然殺傷(NK)細胞 溶解活性、ifn-y分泌、和樹突細胞(dc)和其它抗原呈遞細胞的激活 以表達共刺激分子和分泌細胞因子(尤其在促進Thl樣T細胞應(yīng)答的 發(fā)展中重要的Thl樣細胞因子)。天然磷酸二酯主鏈CpG ODN的免疫 刺激作用，是高度CpG特異性的，在于如果CpG基序被甲基化、改變 成GpC或以其它方式消除或改變，該作用會急劇降低(Krieg等，1995 Nature 374: 546-549; Hartmann等，1999 Proc, Natl. Acad. Sci USA 96: 9305-10)。以前認為，免疫刺激作用需要在嘌呤-噪呤-CpG-嘧啶-嘧啶序列的 背景中的CpG基序(Krieg等，1995 Nature 374: 546-549; Pisetsky， 1996 J. Immunol. 156:421-423; Hacker 等，1998 EMBO J. 17:6230—6240; Lipford等，1998 Trends in Microbiol. 6:496-500)。 但是，現(xiàn)在清楚了，小鼠淋巴細胞會非常好地應(yīng)答不在該背景中的磷 酸二酯CpG基序(Yi等，1998 J. Immunol. 160: 5898-5906)，這也 適用于人B細胞和樹突細胞(Hartmann等，1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10; Liang， 1996 J. Clin. Invest. 98:1119-1129)。一類CpG 0DN能有效地激活B細胞，但是相對較弱地誘導(dǎo)IFN-a 和NK細胞激活；該類型被稱作B類。B類CpG寡核苷酸通常被完全穩(wěn) 定化，且包括在某些優(yōu)選的堿基背景內(nèi)的未甲基化的CpG二核苷酸。 參見，例如，美國專利號6， 194， 388; 6, 207, 646; 6, 214, 806; 6， 218， 371; 6， 239, 116;和6， 339， 068。盡管抗-CTLA-4抗體或0DN的誘導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答的單獨應(yīng)用在癌癥 治療中具有巨大前景，仍然需要開發(fā)用這樣的免疫治療方案治療腫瘤更特別是實體瘤的新療法。 發(fā)明概述新治療方案的開發(fā)，尤其能增加或增強患者免疫系統(tǒng)的抗腫瘤活 性、同時減少現(xiàn)有化療劑的細胞毒性副作用的新治療方案的開發(fā)，是 必要的。本發(fā)明提供了這樣的方案。因而，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療需要這樣的治療的 患者的癌癥的方法，所述方法包含，給所述患者施用治療有效量的抗-CTLA-4抗體或其抗原結(jié)合部分，與治療有效量的CpG 0DN PF3512676 (CpG 7909 (也稱作ProMune); TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT; SEQ ID NO: 37)相組合。在一個實施方案中，該方法是非疫 苗方法。在一個實施方案中，每天、隔天、每周2次或每周施用所述CpG0DN,在一個實施方案中，所述治療是選自下述的療法新輔助療法， 輔助療法， 一線療法，二線療法，和三線療法。根據(jù)實施方案，所述癌癥選自腦癌，乳腺癌，子宮頸癌，結(jié)腸 直腸癌，皮膚T-細胞淋巴瘤，胃癌，頭頸部癌，肝癌，肺癌，黑素瘤， 急性髄細胞白血病，非霍奇金淋巴瘤，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌， 腎細胞癌，和肉瘤。在其它實施方案中，所述人抗-CTLA-4抗體的所述治療有效量范 圍是約0.1 mg/kg-50 mg/kg，或約0. 3 mg/kg-20 mg/kg，包括但不限 于選自下述的所述人抗-CTLA-4抗體的治療有效量至少1 mg/kg， 至少3 mg/kg，至少6 mg/kg，至少10 mg/kg，和至少15 mg/kg。在一個實施方案中，所述抗-CTLA-4抗體或其抗原結(jié)合部分，是 選自下述的至少一種抗體(a)具有約10—s或更大的對CTLA-4的結(jié)合 親和力的人抗體，且其會抑制CTLA-4與B7-l之間的結(jié)合和CTLA-4 與B7-2之間的結(jié)合；(b)具有包括至少一種人CDR序列的氨基酸序列 的人抗體，所述人CDR序列對應(yīng)源自選自以下的抗體的CDR序列4.1.1， 4.8.1， 4.10.2, 4.13.1， 4.14.3, 6.1.1， 11.2.1, 11.6.1， 11.7.1， 12. 3.1.1， 12. 9.1. 1，和10D1; (c)具有選自4.1.1， 4.8.1， 4. 10. 2， 4. 13. 1， 4. 14. 3， 6. 1. 1， 11. 2, 1, 11. 6. 1, 11. 7, 1， 12. 3. 1. 1， 12. 9.1. l，和10D1的抗體的重鏈和/或輕鏈的氨基酸序列的人抗體；(d) 抗體或其抗原結(jié)合部分，其與至少一種具有選自4.1.1， 4.8.1， 4. 10. 2， 4. 13. 1， 4.14, 3， 6. 1. 1， 11. 2. 1， 11. 6. 1, 11. 7. 1， 12. 3. 1.1， 12. 9. 1. 1，和10D1的抗體的氨基酸序列的抗體竟爭結(jié)合CTLA-4;和(e) 抗體或其抗原結(jié)合部分，其與至少一種具有選自4.1.1, 4.8.1， 4. 10. 2， 4. 13. 1, 4. 14. 3， 6. 1. 1， 11. 2. 1, 11. 6. 1， 11. 7.1， 12. 3. 1. 1， 12. 9. 1. l，和10D1的抗體的氨基酸序列的抗體交叉竟爭結(jié)合CTLA-4。在另一個實施方案中，所迷抗體是具有選自4.1.1， 4.13.1， 11. 2. l，和10D1的抗體的氨基酸序列的人抗體。在相關(guān)的實施方案中， 所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含重鏈和輕鏈，其中所述重鏈的重鏈可 變域和所述輕鏈的輕鏈可變域的氨基酸序列選自(a) SEQ ID NO: 3 的氨基酸序列和SEQ ID NO: 9的氨基酸序列；(b) SEQ ID NO: 15的氨 基酸序列和SEQ ID NO: 21的氨基酸序列；(c) SEQ ID NO: 27的氨基 酸序列和SEQ ID NO: 33的氨基酸序列；(d) SEQ ID NO: 1的核酸序列 編碼的氨基酸序列和SEQIDNO:7的核酸序列編碼的氨基酸序列；(e) SEQ ID NO: 13的核酸序列編碼的氨基酸序列和SEQ ID NO: 19的核酸 序列編碼的氨基酸序列；(f) SEQ ID NO:25的核酸序列編碼的氨基酸 序列和SEQ ID NO: 31的核酸序列編碼的氨基酸序列；和(g)抗體 10D1的可變域的氨基酸序列。在另一個相關(guān)的實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分是選自 下述的抗體(a)包含SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5， SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10， SEQIDNO. 11和SEQIDN0:12所述氨基酸序列的抗體;(b) 包含SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17， SEQ ID NO: 18， SEQ ID NO: 22， SEQ ID NO: 23和SEQ ID NO: 24所述氨基酸序列的抗體；和(c)包含SEQ ID NO: 28， SEQ ID NO: 29， SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34， SEQ ID NO: 35 和SEQ ID NO: 36所述氨基酸序列的抗體。在另一個相關(guān)的實施方案中，所迷抗體或其抗原結(jié)合部分包含具有SEQ ID NO: 27所述氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQ ID NO: 33 所述氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在另一個相關(guān)的實施方案中，所述抗體選自(a)包含SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 8所述氨基酸序列的抗體；(b)包含SEQ ID NO: 14 和SEQ ID N0:20所述氨基酸序列的抗體；和(c)包含SEQ ID NO: 26和 SEQ ID NO: 32所述氨基酸序列的抗體。在一個實施方案中，在施用所述CpGODN之前1-7天，施用所述 抗體。在該實施方案和其它實施方案中，在施用所述抗體后約1-100 天，施用所述CpG ODN。在一個實施方案中，皮下施用所述CpG ODN。在另一個實施方案中，以lmg-50mg/天的量，施用所述CpGODN。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于治療癌癥的藥物組合物，所述 組合物包含治療有效量的抗-CTLA-4抗體或其抗原結(jié)合部分，和治療 有效量的CpG ODN PF3512676，以及藥學(xué)可接受的栽體。本文將更詳細地描述本發(fā)明的這些和其它實施方案。本發(fā)明的每個限定可以包括本發(fā)明的多種不同實施方案。因此預(yù) 見到，涉及任意一個元素或元素的組合的本發(fā)明的每個限定，可以包 含在本發(fā)明的每個方面中。本發(fā)明的應(yīng)用不限于下面說明書所述的或 附圖解釋的構(gòu)造和組分排列的細節(jié)。本發(fā)明能包括其它實施方案，且 能以多種方式實施或?qū)崿F(xiàn)。本文使用的措辭和術(shù)語用于描述目的，不應(yīng)當視作限制，"包括"、 "包含，，、或"具有"、"含有"和其變體在本文中的應(yīng)用，意在包 括其后面列出的項目和其等同物以及另外的項目。附圖簡述結(jié)合附圖可以更好地理解本發(fā)明的之前概述、以及下面的詳細說 明。為了說明本發(fā)明，在附圖中顯示了目前優(yōu)選的實施方案。但是應(yīng) 當理解，本發(fā)明不限于所示的精確排列和手段。在附圖中

圖1,包括圖1A—1D，顯示了抗-CTLA-4抗體4. l.l的核苷酸和 氨基酸序列。圖1A顯示了 4. 1. 1重鏈的全長核苷酸序列(SEQ ID NO: 1)。圖1B顯示了 4. 1. 1重鏈的全長氨基酸序列(SEQ IDNO: 2)，以及 在括號"[]"之間指明的4. 1. 1重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO: 3)。每個4. 1. 1重鏈CDR的氨基酸序列加下劃線。CDR序列如下CDR1: GFTFSSHGMH (SEQ ID NO: 4); CDR2: VIWYDGRNKYYADSV (SEQ ID NO: 5); 和CDR3: GGHFGPFDY (SEQ ID NO: 6)。圖IC顯示了 4. 1. 1輕鏈的核苷 酸序列(SEQ ID NO: 7)。圖ID顯示了全長4. 1. 1輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 8)，以及在括號"[]"之間指明的可變區(qū)(SEQ ID NO: 9)。 每個CDR的氨基酸序列指明如下CDR1 : RASQSISSSFLA (SEQ ID NO: 10); CDR2: GASSRAT (SEQ ID NO: 11);和CDR3: CQQYGTSPWT (SEQ ID NO: 12)。圖2，包括圖2A-2D，顯示了抗-CTLA-4抗體4.13.1的核苷酸和 氨基酸序列。圖2A顯示了 4. 13. 1重鏈的全長核苷酸序列(SEQIDN0: 13)。圖2B顯示了 4. 13. 1重鏈的全長氨基酸序列(SEQ ID NO: 14)， 以及在括號"[]"之間指明的4. 13. 1重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO: 15)。每個4.13.1重鏈CDR的氨基酸序列加下劃線。CDR序列如 下CDR1: GFTFSSHGIH (SEQ ID NO:16); CDR2: VIWYDGRNKDYADSV (SEQ IDNO:12);和CDR3: VAPLGPLDY (SEQ ID NO: 18)。圖2C顯示了 4.13.1 輕鏈的核苷酸序列(SEQ IDNO: 19),圖2D顯示了全長4. 13.1輕鏈的 氨基酸序列(SEQ ID NO: 20)，以及在括號"[]"之間指定的可變區(qū) (SEQ IDN0:21)。每個CDR的氨基酸序列指明如下CDR1 : RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 22); CDR2: GASSRAT (SEQ ID NO: 23);和CDR3: CQQYGRSPFT (SEQ ID NO: 24)。圖3，包括圖3A-3D，顯示了抗-CTLA-4抗體11. 2. 1的核苷酸和 氨基酸序列。圖3A顯示了 11.2.1重鏈的全長核苷酸序列(SEQIDN0: 25)。圖3B顯示了 11.2. l重鏈的全長氨基酸序列(SEQ ID NO: 26)， 以及在括號"[]"之間指明的11. 2. 1重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ IDNO: 27)。每個11.2. 1重鏈CDR的氨基酸序列加下劃線。CDR序列如 下CDR1: GFTFSSYGMH (SEQ ID NO: 28); CDR2: VIWYDGSNKYYADSV (SEQ ID NO:29);和CDR3: DPRGATLYYYYYGMDV (SEQ ID NO: 30)。圖3C顯示 了 11. 2. 1輕鏈的核苷酸序列(SEQ ID NO: 31)。圖3D顯示了全長11.2.1 輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO: 32)，以及在括號"[]"之間指明的 可變區(qū)(SEQ ID NO: 33)。每個CDR的氨基酸序列指明如下CDR1 : RASQSINSYLD (SEQ ID NO: 34); CDR2: AASSLQS (SEQ ID NO:35);和 CDR3: QQYYSTPFT (SEQ ID NO:36)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及治療癌癥的新治療方法，其包含共同施用抗-CTLA-4 抗體和CpG ODN (即，CpG ODN PF3512676)的組合。根據(jù)本發(fā)明要治 療的癌癥包括、但不限于，膀胱癌，腦腫瘤，乳腺癌，子宮頸癌，結(jié) 腸直腸癌，胃腸癌，頭頸部癌，肝細胞癌，霍奇金病，卡波西肉瘤， 急性和慢性白血病，皮膚T-細胞白血病，髓細胞和淋巴細胞白血病， 肺癌(包括非小細胞肺癌)，黑素瘤，非霍奇金淋巴瘤，卵巢癌，胰腺 癌，前列腺癌，腎細胞癌，皮膚鱗狀細胞癌，甲狀腺癌，和其它類型 的癌和肉瘤(例如，脂肪肉瘤，骨肉瘤)，以及許多其它。在多種不同 的實施方案中，該方法包含，施用與所述抗體組合的CpG ODN PF3512676,用于癌癥的新輔助療法、輔助療法、 一線療法、二線療法 或三線療法。在本發(fā)明中可釆用的抗體和生產(chǎn)它們的方法，描述在2000年6 月29日公開為WO 00/37504的國際申請?zhí)朠CT/US99/30895, 2002年 4月12日公開的歐洲專利申請?zhí)朎P 1262193 Al，現(xiàn)在授權(quán)為美國專 利號6, 682, 736的美國專利申請?zhí)?9/472, 087，現(xiàn)在公開為美國專利 申請公開號2002/0086014的美國專利申請?zhí)?9/948， 939中(例如， MDX-OIO， Medarex， Princeton, NJ)，它們各自整體通過參考引用并 入本文。盡管本文提供了與這些抗體有關(guān)的氨基酸和核酸序列的信息， 進一步的信息可以參見美國專利號6, 682, 736，以及公開的申請WO00/37504， EP 1262193，和US2002/0086014;在那些申請中所述的序 列通過參考引用并入本文。在現(xiàn)在公開為美國專利申請公開號2003/0086930的美國專利申 請?zhí)?0/153， 382中，討論了這些抗體治療多種不同癌癥的某些應(yīng)用， 該申請如同整體闡述一樣通過參考引用并入本文。在本發(fā)明中使用的CpG免疫刺激寡核苷酸是B類CpG免疫刺激寡 核苷酸。B類CpG免疫刺激寡核苷酸已經(jīng)描述在USP 6， 194， 388 Bl和 6， 239， 116 Bl中，它們分別在2001年2月27日和2001年5月29日 授權(quán)。本發(fā)明的CpG免疫刺激寡核苷酸稱作CpG 0DN PF3512676,并 通過下述核苷酸序列定義5' TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT 3' (SEQ ID NO:37) CpG ODN PF3512676會強烈激活人B細胞，并對干擾素-oti秀導(dǎo)具 有微小作用。如本文更詳細描述的，CpG ODN PF3512676可具有同質(zhì) 的或嵌合的主鏈，包括但不限于磷酸二酯和硫代磷酸酯主鏈連接。在另一個實施方案中，抗體-CpG ODN PF3512676組合與至少一種 其它治療劑一起施用，所述其它治療劑例如、但不限于不針對CTLA-4 的其它單克隆抗體(例如，AVASTIN (貝伐單抗)，MYELOTARG (吉姆單 抗)，BEXXAR (托西莫單抗)，RITUXAN (美羅華)，HERCEPTIN (曲妥 單抗))，或具有類似作用的蛋白配體；激活抗原呈遞細胞(樹突細胞， 巨噬細胞，B細胞，單核細胞)的試劑，包括l型干擾素(例如，干擾 素oc和P);干擾素y; bcg;提供任意和所有形式的肺瘤抗原的試 劑，包括蛋白抗原，肽抗原，全細胞裂解物和其衍生物；遺傳編碼的 抗原(例如，腺病毒編碼的抗原)；已經(jīng)在體內(nèi)或離體被改變以增強其 免疫性質(zhì)的免疫系統(tǒng)的細胞組分(例如，自體樹突細胞，淋巴細胞，熱 激蛋白，等)；化療劑，例如、但不限于，環(huán)磷酰胺，甲氨蝶呤，依托 泊苷，阿霉素，紫杉烷，氟尿嘧啶，阿糖胞苷(AraC)，和含鉑試劑，以 及許多其它試劑。抗原的實例包括PSA抗原(例如，PR0STVAC/TRIC0M) 和黑素瘤-衍生的gpl00抗原。該組合還可以與細胞因子或生長因子 (例如但不限于GM-CSF)聯(lián)合施用。在一個實施方案中，治療方法是非疫苗方法。本文使用的非疫苗方法是指，CpG ODN PF3512676和抗-CTLA-4抗體的組合不與外源抗 原一起使用以刺激對抗原的免疫應(yīng)答。但是，非疫苗方法可以包括刺 激對內(nèi)源抗原的免疫應(yīng)答。內(nèi)源抗原包括由癌細胞或腫塊在體內(nèi)表達、 釋放或脫落的那些抗原。 1.定義除非在本文中另外限定，本發(fā)明所使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語應(yīng)具有 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的意義。而且，除非上下文另外需要， 單數(shù)形式術(shù)語應(yīng)包括復(fù)數(shù)形式，復(fù)數(shù)形式術(shù)語應(yīng)包括單數(shù)形式。通常， 本文所述與細胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、遺傳 學(xué)和蛋白核酸化學(xué)和雜交相關(guān)的術(shù)語以及這些技術(shù)，是本領(lǐng)域所熟知 和通常使用的。除非另外說明，本發(fā)明的方法和技術(shù)通常根據(jù)本領(lǐng)域所公知的方 法進行，并且在本說明書通篇引用和討論的各種通用和更專業(yè)的參考 文獻中有所描述。這樣的參考文獻包括，例如，Sambrook和Russell， Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)， A廳bel et al. ， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (2002)， 以及Harlow和Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1990)，通過 參考引用并入本文。如本領(lǐng)域通常的做法或如本文所述，酶促反應(yīng)和 純化技術(shù)根據(jù)廠商的說明進行。本文描述的與分析化學(xué)、合成有機化 學(xué)以及藥物和藥劑化學(xué)相關(guān)的術(shù)語及其實驗室操作和技術(shù)，是本領(lǐng)域 所公知的并在本領(lǐng)域中通常使用。標準技術(shù)用于化學(xué)合成、化學(xué)分析、 藥物制備、配制和遞送以及對患者的治療。如本文所用的，下列每個術(shù)語具有在該節(jié)中伴隨其的含義。 本文所使用的冠詞"一個(種)"指一個(種)或多于一個(種)(即， 至少一個(種))該冠詞的語法對象。作為實例，"一種成分"指一種成 分或一種以上成分。如本文所使用的，20種常規(guī)氨基酸和它們的縮寫遵從常規(guī)的用 法。參見Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub和 D. R. Gren，編.，Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))， 它通過參考引用并入本文。在本文中使用常規(guī)表示法描述多肽序列多肽序列的左手端是氨 基末端；多肽序列的右手端是羧基末端。"保守的氨基酸置換"是指，其中氨基酸殘基被具有相似化學(xué)特 性(例如電荷性或者疏水性)的側(cè)鏈R基的另 一氨基酸殘基所置換。通 常，保守的氨基酸置換不會實質(zhì)性地改變蛋白質(zhì)的功能特性。在兩個 或者多個氨基酸序列通過保守置換而彼此不同的情況下，序列同一性 百分比或者相似程度可被上調(diào)，以校正置換的保守性質(zhì)。進行這種調(diào) 節(jié)的方法，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的。參見，例如Pearson, Methods Mol. Biol. 243: 307-31 (1994)。具有相似化學(xué)特性的側(cè)鏈的氨基組的實例包括，1)脂肪族側(cè)鏈 甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；2)脂肪族一羥基側(cè)鏈 絲氨酸和蘇氨酸；3)含有酰胺的側(cè)鏈天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香 族側(cè)鏈苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)堿性側(cè)鏈賴氨酸、精氨酸 和組氨酸；6)酸性側(cè)鏈天冬氨酸和谷氨酸以及7)含硫側(cè)鏈半胱 氨酸和蛋氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸置換組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨 酸，苯丙氨酸-酪氨酸，賴氨酸-精氨酸，丙氨酸-纈氨酸，谷氨酸-天 冬氨酸、以及天冬酰胺-谷氨酰胺?；蛘撸Ｊ靥鎿Q是在Gonnet等，Science 256:1443-45 (1992) (通過參考引用并入本文)中公開的PAM250對數(shù)似然矩陣 (log-likelihoodmatrix)中具有正值的任意改變。"中度保守的"替 換是在PAM250對數(shù)似然矩陣中具有非負值的任意改變。優(yōu)選的氨基酸置換是如下這些(l)減少對蛋白水解的敏感性，(2) 減少對氧化作用的敏感性，(3)改變形成蛋白復(fù)合物的結(jié)合親和力，以 及(4)賦予或者修飾該類似物的其它物理化學(xué)或功能特性。包含置換、 缺失和/或插入的類似物可以包括除了天然存在的肽序列外的序列的各種突變型蛋白。例如，單個或者多個氨基酸置換(優(yōu)選保守的氨基酸的多肽部分中)進行。保守的氨基酸置換應(yīng)不實質(zhì)性改變母序列的結(jié)構(gòu) 特征(例如，替代氨基酸應(yīng)不傾向于打破母序列中出現(xiàn)的螺旋或者破壞 表征母序列的其它類型二級結(jié)構(gòu))?，F(xiàn)有技術(shù)公認的多肽的二級和三級結(jié)構(gòu)的例子描述于Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton， Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden和J. Tooze編， Garland Publishing,New York,N. Y. (1991));和Thornton等，Nature 354:105 (1991)，各自通過參考引用并入本文。多肽的序列相似性(也稱作序列同一性)通常使用序列分析軟件 測定。蛋白分析軟件利用對各種置換、缺失和其它修飾(包括保守的氨 基酸置換)賦予的相似性衡量來匹配類似序列。例如，GCG含有"Gap" 和"BestfU"等程序，其可以使用缺省參數(shù)來測定緊密相關(guān)的多肽(例 如來自不同生物物種的同源多肽)之間的、或野生型蛋白質(zhì)與其突變型 蛋白質(zhì)之間的序列同源性或序列同一性。參見例如GCG 6. l版本。多 肽序列也可以通過使用GCG 6. 1版本中的FASTA程序，使用默認參數(shù) 或推薦參數(shù)進行比較。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供了查詢和研 究的序列之間的最佳重疊區(qū)域的比對和序列同一性百分比(Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000))。當將本發(fā)明的序列與含有來自不同有機體的大 量序列的數(shù)據(jù)庫進行比較時，另外一種優(yōu)選的算法是使用默認參數(shù)的 計算機程序BLAST,尤其是blastp或tblasm。參見例如Altschul等， J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Altschul等，Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997)，通過參考引用并入本文。完整的"抗體"包括通過二硫鍵相互連接的至少兩個重鏈(H)和兩 個輕鏈(U。概述參見Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W.， ed. ， 2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989))(為所有目的，整體通過參考引用并入本文)。每一重鏈由重鏈可變區(qū)(HCVR或VH)和重鏈恒定 區(qū)(Ch)組成。重鏈恒定區(qū)由CH1、 CH2和CH3三個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。每個輕 鏈由輕鏈可變區(qū)(LCVR或Vl)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由 一個結(jié) 構(gòu)域G構(gòu)成。Vh和W區(qū)可以進一步劃分為高變區(qū)(稱作互補性決定區(qū) (CDR))以及散布于其中的更為保守的區(qū)域(稱為構(gòu)架區(qū)(FR))。每個 Vh和Vl由三個CDR和四個FR組成，從氨基末端到羧基末端按照下列順 序排列FR1、 CDR1， FR2、 CDR2， FR3、 CDR3， FR4。氨基酸到各個結(jié) 構(gòu)域的分配根據(jù)下列定義Kabat， Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health , Bethesda， MD (1987和1991))，或Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia等，Nature 342: 878-883 (1989)。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合域。抗體的恒定 區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白向宿主組織或因子的結(jié)合，包括免疫系統(tǒng)的各 種不同細胞(例如，效應(yīng)細胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一組分(Clq)。術(shù)語"抗體"可包括完整抗體的抗原結(jié)合部分，它保留了完整抗體 的特異性結(jié)合抗原(例如CTLA-4)的能力?？乖Y(jié)合部分可以通過重組 DNA技術(shù)或通過對完整抗體的酶法或化學(xué)切割來生產(chǎn)?？乖Y(jié)合部分的實例包括(i)Fab片段，即由VL、 VH、 CL和CHl 結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)F(ab。2片段，即包括由鉸鏈區(qū)的二硫鍵 連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CHI結(jié)構(gòu)域組成的Fd 片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(v)由VH 結(jié)構(gòu)域組成的單域抗體("dAb")，如Ward等，Nature 341:544-546 (1989)所述；和(vi)分離的互補性決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段 的兩個結(jié)構(gòu)域(VH和VL)是由分開的基因編碼，但是它們可以使用重組 技術(shù)通過合成的連接物結(jié)合在一起，使它們可制備成為單一蛋白鏈， 其中Vh和VL區(qū)域配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv));參見例如 Bird等Science 242:423-426 (1988);和Huston等Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988))。這種單鏈抗體也包括在術(shù) 語"抗體"之內(nèi)。"雙特異性抗體"具有2種不同的結(jié)合特異性，參見，例如，美 國專利號5， 922， 845和美國專利號5, 837, 243; Zeilder J. Immunol. 163:1246-1252 (1999); Somasundaram Hum. Antibodies 9:47-54 (1999); Keler Cancer Res. 57:4008-4014 (1997)。例如，本發(fā)明 提供了雙特異性抗體，其具有一個對細胞表面抗原(例如人CTLA-4) 的結(jié)合位點，和對效應(yīng)細胞表面上的Fc受體的第二個結(jié)合位點。本發(fā) 明也提供了多特異性抗體，其具有至少3個結(jié)合位點。術(shù)語"雙特異性抗體"還包括"雙體"。雙體是二價的、雙特異性抗 體，其中Vh和^結(jié)構(gòu)域在單一多肽鏈上表達，但是使用連接物，該連 接物太短而不允許同一鏈上的2個結(jié)構(gòu)域之間配對，從而迫使結(jié)構(gòu)域 與另一條鏈上的互補結(jié)構(gòu)域配對，并建立2個抗原結(jié)合位點(參見，例 如，Holliger等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); Poljak等，Structure 2: 1121-1123 (1994))。本文中可互換使用的術(shù)語"人抗體"或者"人序列抗體"，包括 具有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)(如果存在)的抗 體。本發(fā)明的人序列抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨 基酸殘基(例如通過體外隨機或位點專一誘變或者體內(nèi)體細胞突變所 引入的突變)。但是，本文所使用的術(shù)語"人抗體"不意在包括"嵌合" 抗體，所述"嵌合"抗體中來源于其它哺乳類物種的種系(例如小鼠) 的CDR序列已經(jīng)被嫁接到人構(gòu)架序列上(即"人源化的"或者primatizedtm抗體)。本文所使用的術(shù)語"嵌合抗體"指含有來自兩種或者多種不同抗 體的區(qū)域的抗體。在一個實施方案中， 一個或者多個CDR來源于人抗 -CTLA-4抗體。在另一個實施方案中，所有的CDR來源于人抗-CTLA-4 抗體。在另一個實施方案中，來源于一種以上的人抗-CTLA-4抗體的 CDR組合在嵌合人抗體內(nèi)。例如，嵌合抗體可以包括來源于笫一人抗 -CD40抗體的輕鏈的CDR1 、來源于第二人抗-CTLA-4抗體的輕鏈的CDR2 和來源于第三人抗-CTLA-4抗體的輕鏈的CDR3，并且重鏈的CDR可以 來源于一種或者多種其它抗-CD40抗體。此外，構(gòu)架區(qū)可以來源于同樣的抗-CTLA-4抗體之一或者來源于一個或者多個不同的人。而且，正如前述所討論的，嵌合抗體包括含有來源于一個以上物 種的種系序列的部分的抗體。本文關(guān)于抗體使用的術(shù)語"竟爭"是指，第 一抗體或其抗原結(jié)合部 分與第二抗體或其抗原結(jié)合部分竟爭結(jié)合，其中在有第二抗體存在下 第一抗體與它的同源表位的結(jié)合，與在沒有第二抗體存在下第一抗體 的結(jié)合相比，可檢測地下降?；蛘?，在有第一抗體存在下第二抗體與 它的表位的結(jié)合也可檢測地下降，可以如此，但不需要如此。也就是 說，第一抗體可以抑制第二抗體與它的表位的結(jié)合，而第二抗體不抑 制第一抗體與它的相應(yīng)表位的結(jié)合。但是，當每種抗體可檢測地抑制 另一種抗體與它的同源表位或配體的結(jié)合時，無論是相同程度、更大 或更小程度，都認為抗體彼此"交叉竟爭"與它們各自表位的結(jié)合。 例如，交叉竟爭抗體可以結(jié)合本發(fā)明的抗體(例如，3.1.1， 4.1.1， 4.8.1， 4.10.2， 4.13.1， 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1， 11.6.1, 11.7.1， 12. 3. 1.1，和12.9.1.1)所結(jié)合的表位或表位的一部分。竟爭和交叉 竟爭抗體都包含在本發(fā)明中。無論這種竟爭或交叉竟爭的發(fā)生機理如何(例如，位阻，構(gòu)象變化，或結(jié)合共同表位或其一部分，等)，技術(shù)人 員基于本文提供的教導(dǎo)會明白，這樣的竟爭和/或交叉竟爭抗體都包括 在內(nèi)且可以用于本文公開的方法中。術(shù)語"表位"包括能夠特異性結(jié)合免疫球蛋白或T細胞受體的任 何蛋白質(zhì)決定簇。表位決定簇通常由具有化學(xué)活性的表面分子結(jié)群例 如氨基酸或糖側(cè)鏈組成，并且通常具有特異性的三維結(jié)構(gòu)特征以及特 異性的電荷特征。構(gòu)象和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于，在有變性溶劑存在 下，與前者的結(jié)合會喪失，但是與后者的結(jié)合不會，本文所使用的短語"特異性結(jié)合"指如蛋白質(zhì)、核酸、抗體等化 合物識別和結(jié)合樣本中的特定分子，但實質(zhì)上不識別或結(jié)合其它分子。 例如，識別和結(jié)合樣本中的同源配體的抗體或者肽抑制劑(例如結(jié)合其 同源抗原CTLA-4的抗-CTLA4抗體)，但實質(zhì)上不識別和結(jié)合樣本中的 其它分子。因此，在指定的檢測條件下，指定的結(jié)合部分(例如，抗體或其抗原結(jié)合部分)優(yōu)先與特定目標分子結(jié)合，而不以顯著量與測試樣 本中存在的其它成分結(jié)合。許多檢測形式可用于選擇能與目標分子特異性結(jié)合的抗體。例如，使用固相ELISA免疫檢測、免疫沉淀反應(yīng)、 BIAcore以及蛋白印跡分析來識別能與CTLA-4特異性反應(yīng)的抗體。典 型地，特異性或者選擇性的反應(yīng)至少是背景信號或噪聲的兩倍，更典 型超過10倍背景，更為具體地，當平衡解離常數(shù)(K。) <1 )iM、優(yōu)選 <100 nM和最優(yōu)選《10 nM時，稱抗體"特異性結(jié)合"抗原。 術(shù)語"KD"指特定抗體-抗原相互作用的平衡解離常數(shù)。 本文所使用的"基本上純的"指，目標物種是存在的占優(yōu)勢的物 種(即，基于摩爾，它比組合物中的任何其它單獨的物種更豐富)，優(yōu) 選基本上純的級分是這樣的組合物，其中目標物種(例如抗-CTLA-4抗 體)占存在的所有大分子物種的至少約50%(基于摩爾)。通常，基本 上純的組合物含有超過約80%的組合物中存在的所有大分子物種，更 優(yōu)選超過約85%、 90%、 95%和99%。最優(yōu)選地，目標物種純化到基中組:物基本上由單一^分子物種^成。^ ',"', 、 本文使用的術(shù)語"有效量"或"治療有效量"是指，當施用給哺乳動 物、優(yōu)選人時，與在沒有該化合物的情況下檢測到的反應(yīng)相比會介導(dǎo) 可檢測的治療反應(yīng)的量。通過許多本領(lǐng)域公知的方法，包括，例如， 本文公開的這些方法，可以容易地評價治療反應(yīng)，例如、但不限于， 腫瘤生長的抑制和/或減小(包括腫瘤大小停滯)，腫瘤大小，轉(zhuǎn)移等。 本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，本文施用的化合物或組合物的有效量可 以變化，且可以基于許多因素容易地確定，例如所治療的疾病或病癥， 疾病的階段，治療的哺乳動物的年齡和健康和身體狀況，疾病的嚴重 性，施用的具體化合物，等。"治療有效量"或"有效量"意在定量將瘤形成病癥的一種或多種 癥狀可檢測地減輕至一定程度所需的試劑量，包括、但不限于1)癌 細胞數(shù)的減少；2)腫瘤大小的減??；3)對癌細胞向周圍器官中浸潤 的抑制(即，減慢至一定程度，優(yōu)選停止)；3)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制(即，減慢至一定程度，優(yōu)選停止)；4)抑制腫瘤生長至一定程度；5)在一 定程度上緩解或減輕與病癥有關(guān)的一種或多種癥狀；和/或6)緩解或 減輕與施用抗癌劑有關(guān)的副作用。結(jié)合本文提供的教導(dǎo)，通過選擇各種活性化合物和加權(quán)因子(例 如效力，相對生物利用度，患者體重，不利副作用的嚴重性和優(yōu)選的 給藥模式)，可以計劃有效的預(yù)防性或治療性處理方案，它不會造成 實質(zhì)的毒性，且仍然能完全有效地治療特定患者。任意特定應(yīng)用的有 效量，可以取決于所治療的疾病或病癥、疾病或病癥的嚴重性、和患 者的健康和大小等因素而變化。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以經(jīng)驗為主地確定CpGODNPF3512676、抗-CTLA-4抗體和/或其它治療劑的有效量， 不需要過度實驗。0DN和/或抗體單獨或一起的治療有效量，可以從動物模型最初確 定。治療有效劑量也可以從特定ODN和/或特定抗體的人數(shù)據(jù)確定，或 從已知會表現(xiàn)出類似的藥理學(xué)活性的其它化合物的人數(shù)據(jù)確定。腸胃 外給藥可能需要更高的劑量。應(yīng)用的劑量可以根據(jù)施用的化合物的相 對生物利用度和效力來調(diào)節(jié)。在上述方法和本領(lǐng)域熟知的其它方法的 基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)劑量來達到最大效能，是在普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。本文使用的術(shù)語"指導(dǎo)材料"包括出版物、錄音、圖表、或任意其 它表達介質(zhì)，它們可以用于傳達本發(fā)明的化合物、組合/或組合物在用 于影響、減輕或治療本文所述的各種疾病或病癥的藥盒中的有用性。 任選地或可選地，指導(dǎo)材料可以描述一種或多種減輕細胞、組織或哺 乳動物的疾病或病癥的方法，包括本文別處公開的方法。藥盒的指導(dǎo)材料可以例如附著在裝有本發(fā)明的化合物和/或組合 物的容器上，或可以與裝有化合物和/或組合物的容器一起運輸?；蛘?， 指導(dǎo)材料可以與容器分開運輸，意圖使接受者協(xié)作地使用指導(dǎo)材料和 化合物。本發(fā)明的ODN和/或抗體可以在藥劑分配器中提供。藥劑分配器是 限定多個藥物貯存隔室的包裝，每個隔室用于容納單個單元的藥劑。 完整的藥物療程裝在多個藥物貯存隔室中。限定多個藥物貯存隔室的包裝可以是任意類型的一次性藥物包裝 或卡片，其將藥劑容納在單個隔室中。例如，包裝是從卡片構(gòu)建的泡 軍包裝，其可以從堅硬的紙材料、泡罩片和背襯板制備。這樣的卡片 是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的。作為一個實例，藥劑分配器可以盛裝整個藥物療程。分配器可以 包括日期標記，以指明哪一天服用單個藥劑單元。它們可以沿著藥劑 包裝的第一側(cè)面進行標記。也可以標示劑量標記，例如沿著與藥劑包 裝第 一側(cè)面垂直的藥劑包裝第二側(cè)面，從而指明服用單個藥劑單元的 時間。單位劑量可以包含在泡軍式分配器中。除特別指出外，術(shù)語"患者，'或"受試者"可互換使用，指哺乳動物 例如人患者和非人靈長類動物，以及獸醫(yī)對象例如兔、大鼠和小鼠， 以及其它動物。優(yōu)選地，患者指人類。本文使用的"治療"指，降低患者經(jīng)歷的疾病癥狀(即，腫瘤生長和 /或轉(zhuǎn)移，或由免疫細胞的數(shù)量和/或活性介導(dǎo)的其它作用等)的頻率。 該術(shù)語包括，施用本發(fā)明的化合物或試劑來預(yù)防或延遲疾病的癥狀、并發(fā)癥或生化標記(例如，前列腺癌中PSA水平的升高)的發(fā)生，減輕 癥狀，或阻止或抑制疾病、病癥或障礙的進一步發(fā)展。治療可以是預(yù) 防性的(預(yù)防或延遲疾病的發(fā)生，或預(yù)防其臨床或亞臨床癥狀的出現(xiàn)) 或在疾病出現(xiàn)后治療性抑制或減輕癥狀。"聯(lián)合治療"包括施用CpG 0DN PF3512676和CTLA-4抗體，作為 意在提供這些治療劑共同作用的有益作用的特定治療方案的一部分， 組合的有益作用包括、但不限于，源自治療劑組合的藥代動力學(xué)的或 藥效學(xué)的共同作用。這些治療劑的聯(lián)合給藥，通常在限定的時間段內(nèi) 進行(通常是幾分鐘，幾小時，幾天或幾周，這取決于選擇的組合)。" 聯(lián)合治療"通常無意包括施用2種或多種這樣的治療劑作為偶然地和 任意地導(dǎo)致本發(fā)明組合的分開單一治療方案的一部分。"聯(lián)合治療"包括以順序方式施用這些治療劑，也就是說，其中在 不同時間施用每種治療劑，以及以基本上同時的方式施用這些治療劑 或至少2種治療劑。基本上同時給藥可以如下實現(xiàn)，例如，通過給受試者施用具有固定比例的每種治療劑的單個膠嚢，或多個每種治療劑 的單獨膠嚢。每種治療劑的順序的或基本上同時的給藥，可以通過任 意適當途徑來實現(xiàn)，包括、但不限于，經(jīng)口途徑，靜脈內(nèi)途徑，肌肉 內(nèi)、皮下途徑，和通過粘膜組織直接吸收。治療劑可以通過相同途徑或不同途徑來施用。例如，第一種治療劑(例如，CpG 0DN PF3512676) 可以通過皮下注射來施用，第二種試劑(例如，抗-CTLA-4抗體)可以 靜脈內(nèi)施用。此外，選定組合中的第一種治療劑可以通過靜脈內(nèi)注射 來施用，而組合中的其它治療劑可以經(jīng)口施用?；蛘撸?，2種治 療劑均可以經(jīng)口施用，或2種治療劑均可以通過靜脈內(nèi)注射施用。"聯(lián)合治療"也可以包括上述治療劑進一步與其它生物活性成分 (例如、但不限于，第二種不同的抗腫瘤試劑，樹突疫苗或其它腫瘤疫 苗)和非藥物治療(例如、但不限于，手術(shù)或放射治療)聯(lián)合施用。當聯(lián) 合治療還包含放射治療時，放射治療可以在任意適當?shù)臅r間進行，只 要達到治療劑和放射治療組合的共同作用的有益效果即可。例如，在 適當情況下，當從治療劑給藥中暫時去除放射治療(可能幾天或甚至 幾周)時，仍然達到有益效果。II.抗-CTLA-4抗體如本文前面別處所述，優(yōu)選的抗-CTLA-4抗體是特異性結(jié)合人 CTLA-4的人抗體。示例性的人抗-CTLA-4抗體詳細描述在2000年6 月29日公開的公開號為W0 00/37504的國際申請?zhí)朠CT/US99/30895, 2002年4月12日公開的歐洲專利申請?zhí)朎P 1262193 Al，和現(xiàn)在授權(quán) 給Hanson等美國專利號6, 682, 736的美國專利申請?zhí)?9/472,087， 以及公開為US2002/0086014的美國專利申請?zhí)?9/948, 939中，它們 的所有公開內(nèi)容特此通過參考引用并入本文。這樣的抗體包括、但不 限于，3.1. 1， 4.1.1， 4. 8.1， 4.10. 2， 4.13.1， 4.14. 3， 6.1.1， 11. 2.1， 11.6,1, 11.7.1， 12. 3.1. l，和12.9. 1.1，以及MDX-010。人抗體會 在本發(fā)明的治療方法中提供實質(zhì)的優(yōu)勢，因為預(yù)見到它們會使人患者 中與非人抗體的使用有關(guān)的免疫原性和變應(yīng)性反應(yīng)最小化。在WO 00/37504, EP 1262193，和美國專利號6, 682, 736以及美 國專利申請公開號US2002/0086014和US2003/0086930中，廣泛地討 論了本發(fā)明的有用的人抗-CTLA-4抗體的特征，其中所述的氨基酸和 核酸序列整體通過參考引用并入本文。簡而言之，本發(fā)明的抗體包括 具有以下抗體的氨基酸序列的抗體例如、但不限于，抗體3.1.1， 4.1.1， 4.8.1， 4.10.2， 4.13.1, 4.14.3， 6.1.1， 11.2.1， 11.6.1， 11.7.1， 12.3.1.1， 12. 9. 1. l，和MDX-010.本發(fā)明也涉及具有這些抗 體的重鏈和輕鏈的CDR的氨基酸序列的抗體，以及上述申請和專利所 述的具有CDR區(qū)中的變化的抗體。本發(fā)明也涉及具有這些抗體的重鏈 和輕鏈的可變區(qū)的抗體。在另一個實施方案中，抗體選自具有抗體 3.1.1， 4.1.1， 4.8.1， 4,10.2， 4. 13. 1, 4. 14. 3, 6.1.1， 11.2.1， 11.6.1， 11.7.1， 12. 3. 1.1，和12. 9. l，l，和MDX-010的重鏈和輕鏈的 全長、可變區(qū)或CDR氨基酸序列的抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明包含抗體-治療劑組合，其包含在>^開 為美國專利申請公開號2002/0086014和2003/0086930的美國專利申 請?zhí)?9/M8， 939和其中引用的參考文獻中公開的人抗-CTLA-4抗體， 包括、但不限于，MAb 10D1 (MDX-OIO， Medarex， Princeton, NJ)。 更優(yōu)選地，抗-CTLA-4抗體是MDX-Q1G?；蛘?，抗-CTLA-4抗體是 11.2.1 (Ticilim畫b; CP-675, 206)。在另一個實施方案中，VH的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 3， 15和 27所述的氨基酸序列。在另一個實施方案中，t包含SEQ ID N0:9， 21和33所述的氨基酸序列。更優(yōu)選地，Vh和Vl分別包含SEQIDN0:3 (VH 4.1. l)和SEQ ID NO: 9 (VL4.1. l)所述的氨基酸序列;SEQ ID NO: 15 (VH 4. 13. l)和SEQ ID NO: 21 (VL4.13.1)所述的氨基酸序列；和SEQ ID NO: 27 (VH 11.2. l)和SEQ ID NO: 33 (VL11. 2.1)所述的氨基酸序列。在另一個實施方案中，重鏈的氨基酸序列包含由包含SEQ ID NO: 1， 13，和25所述核酸序列的核酸編碼的氨基酸序列。在另一個實施方 案中，輕鏈包含由包含SEQIDN0:7， 19和31所述核酸序列的核酸編 碼的氨基酸序列。更優(yōu)選地，重鏈和輕鏈分別包含由包含下述核酸序列的核酸編碼的氨基酸序列SEQIDN0:1 (重鏈4. 1. 1)和SEQ ID NO: 7 (輕鏈4. 1. l)所述核酸序列；SEQ ID NO: 13 (重鏈4.13. 1)和SEQ ID NO: 19 (輕鏈4. 13. l)所述核酸序列;和SEQ ID NO: 25 (重鏈11. 2. 1) 和SEQ ID NO: 31 (輕鏈11. 2. 1)所述核酸序列。此外，抗體可以包含重鏈氨基酸序列，后者包含源自VH 3-30或 3-33基因、或其中的保守置換或體細胞突變的人CDR氨基酸序列?？?體也可以在它的輕鏈中包含CDR區(qū)，其源自A27或012基因，即，小 于5個、或小于IO個這樣的突變?？贵w也可以包含來自這些基因的構(gòu) 架區(qū)，包括相差小于5個、或小于IO個氨基酸的那些。也包括具有本 文所述構(gòu)架區(qū)的抗體，它們已經(jīng)突變來反映原始種系序列。在本發(fā)明的其它實施方案中，抗體會抑制CTLA-4和B7-1之間的 結(jié)合，CTLA-4和B7-2之間的結(jié)合，或二者。優(yōu)選地，抗體可以以約 100 nM或更低、更優(yōu)選約10 nM或更低，例如約5 nM或更低，更優(yōu) 選約2 nM或更低，或更優(yōu)選例如約1 nM或更低的IC5。，抑制與B7-l 的結(jié)合。類似地，抗體可以以約100nM或更低、更優(yōu)選約10nM或更 低，例如更優(yōu)選約5 nM或更低，更優(yōu)選約2 nM或更低，或更優(yōu)選例如 約1 nM或更低的IC5。，抑制與B7-2的結(jié)合。此外，在另一個實施方案中，抗-CTLA-4抗體具有對CTLA-4約 10—s的結(jié)合親和力，或更大的親和力，更優(yōu)選約10—9或更大的親和力， 更優(yōu)選約10—"或更大的親和力，更優(yōu)選約10—"或更大的親和力?？?CTLA-4抗體可以與具有選自4.1.1， 6.1. 1， 11.2, 1， 4.13.1 和4. 14. 3的抗體的重鏈和輕鏈氨基酸序列的抗體竟爭結(jié)合。此外，抗 -CTLA-4抗體可以與MDX-010抗體竟爭結(jié)合。在另一個實施方案中，抗體優(yōu)選地與具有抗體4.1.1， 4.13.1， 4. 14. 3， 6. 1.1.或11. 2. 1的重鏈和輕鏈序列、可變重鏈和可變輕鏈序 列、和/或重鏈和輕鏈CDR序列的抗體交叉竟爭。例如，抗體可以結(jié)合 具有選自4.1.1， 4,13.1， 4.14.3， 6.1.1，或11.2. l的抗體的重鏈和 輕鏈氨基酸序列、可變序列和/或CDR序列的抗體所結(jié)合的表位。在另 一個實施方案中，抗體與具有MDX-010的重鏈和輕鏈序列或抗原-結(jié)合序列的抗體交叉竟爭。在另一個實施方案中，使用包含下述重鏈和輕鏈的抗-CTLA-4抗 體實施本發(fā)明包含選自3.1.1， 4.1.1， 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1， 4.14.3， 6.1.1， 11.2.1， 11.6.1, 11.7.1， 12. 3. 1. 1，和12.9.1.1 的抗體的CDR-l、CDR-2、和CDR-3氨基酸序列的重鏈，包含選自3. 1. 1， 4.1.1, 4.8.1， 4.10.2， 4.13.1， 4.14.3， 6.1.1， 11.2.1， 11.6.1， 11.7.1， 12. 3. 1. l，和12. 9. 1. 1的抗體的CDR-1、 CDR-2、和CDR-3氨 基酸序列的輕鏈，或具有選自以下的所述CDR序列變化的序列保守 變化，其中所述保守變化選自將非極性殘基替換為其它非極性殘基， 將極性帶電荷的殘基替換為其它極性不帶電荷的殘基，將極性帶電荷 的殘基替換為其它極性帶電荷的殘基，和結(jié)構(gòu)類似的殘基的置換；非 保守置換，其中所述非保守置換選自將極性帶電荷的殘基置換為極 性不帶電荷的殘基，和將非極性殘基置換為極性殘基，添加和缺失。在本發(fā)明的另一個實施方案中，抗體在構(gòu)架區(qū)或CDR區(qū)中含有從 種系序列小于IO， 7， 5，或3個氨基酸變化。在另一個實施方案中， 抗體在構(gòu)架區(qū)中含有小于5個氨基酸變化，在CDR區(qū)中含有小于10 個變化。在一個優(yōu)選的實施方案中，抗體在構(gòu)架區(qū)中含有小于3個氨 基酸變化，在CDR區(qū)中含有小于7個變化。在一個優(yōu)選的實施方案中， 構(gòu)架區(qū)中的變化是保守的，CDR區(qū)中的變化是體細胞突變。在另一個實施方案中，抗體在重鏈和輕鏈CDR-1、 CDR-2和CDR-3 序列中與抗體3. 1. 1， 4. 1. 1， 4. 8. 1, 4. 10. 2， 4. 13. 1， 4. 14. 3， 6. 1. 1， 11.2.1， 11,6.1， 11.7.1， 12. 3. 1. l，和12. 9. 1. 1的CDR序列具有至 少80%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選 至少99%序列同一性。更優(yōu)選地，抗體在重鏈和輕鏈CDR-1、 CDR-2 和CDR-3序列中與抗體3.1.1,4.1.1,4. 8.1,4.10. 2,4.13.1,4.14. 3， 6.1.1， 11.2.1， 11.6.1， 11.7.1， 12.3.1. l，和12.9.1.1的序列具 有100%序列同一性。在另一個實施方案中，抗體在重鏈和輕鏈可變區(qū)序列中與抗體 3.1.1， 4.1.1， 4.8.1， 4.10.2， 4.13.1， 4,14.3， 6.1.1， 11.2.1，11.6.1， 11.7.1, 12. 3. 1. l,和12. 9. 1. 1的可變區(qū)序列具有至少80%、 更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95°y4、更優(yōu)選至少99% 序列同一性。更優(yōu)選地，抗體在重鏈和輕鏈可變區(qū)序列中與抗體 3.1.1， 4.1.1， 4.8.1， 4.10.2， 4.13.1， 4.14.3， 6.1.1， 11.2.1， 11. 6. 1, 11. 7. 1， 12. 3. 1. l，和12. 9. 1. 1的序列具有100%序列同一性。盡管可能優(yōu)選本文前面討論的抗-CTLA-4抗體，本領(lǐng)域的技術(shù)人 員基于本文所提供的公開內(nèi)容，將會理解本發(fā)明包括多種抗-CTLA-4 抗體，且不限于這些特定的抗體。更具體地，盡管優(yōu)選人抗體，但是 本發(fā)明不限于人抗體；相反，本發(fā)明包括各種有用的抗體而不管物種 起源，并且尤其包括嵌合人源化和/或靈長動物源化抗體。而且，盡管 本文示例的抗體通過使用轉(zhuǎn)基因哺乳動物(例如，含有人免疫所有組成 部分的小鼠)獲得，本領(lǐng)域的技術(shù)人員基于本文所提供的公開內(nèi)容，可 以理解本發(fā)明不限于通過這種方法或者通過其它任何特定方法產(chǎn)生的 抗體。取而代之的是，本發(fā)明包括通過任何方法產(chǎn)生的抗-CTLA-4抗 體，包括但不限于本領(lǐng)域已知的方法(例如篩選噬菌體展示文庫等)或 者在將來開發(fā)的用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗-CTLA-4抗體的方法?；诒疚?所提供的、以及在例如Bedian等的美國專利第6， 682， 736號、和美 國專利申請公開第2002/0088014號中廣泛公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域的技術(shù) 人員能夠輕易地產(chǎn)生和鑒定對于使用本文公開的新方法與治療劑聯(lián)合 治療乳腺癌有用的抗體。本發(fā)明包括用轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物產(chǎn)生的人抗體，即，公開于 Hanson等的U. S. 6, 682, 736中的XenoMouse (Abgenix， Inc., Fremont, CA)。另一個產(chǎn)生"人"抗體的轉(zhuǎn)基因鼠系統(tǒng)稱為"HuMAb-Mouse " (Medarex， Princeton, NJ)，它含有編碼非重排的人重鏈(jn和y)和 K輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，連同使內(nèi)源性 的jj和K鏈基因座失活的把向突變(Lonberg等Nature 368:856-859 (1994)以及美國專利第5,770,429號)。但是，本發(fā)明使用通過用任意轉(zhuǎn)基因哺乳動物制成的人抗-CTLA-4抗體，所述轉(zhuǎn)基因哺乳動物例如但不限于Kirin TC Mouse (Kirin Beer Kabushiki Kaisha， Tokyo, Japan),例如Tomizuka等，Proc Natl Acad Sci USA 97: 722 (2000); Kuroiwa等，Nature Biotechnol 18: 1086 (2000);Mikayama等的美國專利申請公開第2004/0120948號 所述以及前述的HuMAb-Mouse (Medarex， Princeton, NJ)和 XenoMouse (Abgenix， Inc. ， Fremont, CA)。因此，本發(fā)明包括4吏 用通過用任意轉(zhuǎn)基因或者其它非人動物制成的抗-CTLA-4抗體。此外，盡管生產(chǎn)人抗-CTLA-4抗體的優(yōu)選方法包含，使用含有人 免疫所有組成部分的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物制備抗體，本發(fā)明不限于該 方案。相反，本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，在本文提供的公開內(nèi)容的基礎(chǔ) 上，本發(fā)明包括使用對CTLA-4特異性的人或任何其它抗體的任意生產(chǎn) 方法，根據(jù)本領(lǐng)域已知的任意方法或者在將來開發(fā)的用于產(chǎn)生特異性 結(jié)合目標抗原的抗體的方法制備。人抗體可以通過下述方法制備，包括、但不限于，使用噬菌體展 示抗體文庫。使用這些技術(shù)，可以針對CTLA-4表達細胞、CTLA-4本 身、CTLA-4形式、其表位或肽、和其表達文庫產(chǎn)生抗體(見例如美國 專利5， 703， 057),然后可以篩選它們的上述活性。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法所使用的抗體不是完全的人 抗體，而是"人源化"的抗體。更具體地，鼠抗體或者源自其它物種 的抗體能通過用本領(lǐng)域公知的技術(shù)而被"人源化，，或者"靈長動物源 化"。參見例如Winter和Harris Immunol. Today 14: 43-46 (1993)， Wright等 Crit. Reviews in Immunol. 12:125-168 (1992)，和 Cabilly等的美國專利第4， 816， 567號，以及Mage和Lamoyi in Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp. 79-97， Marcel Dekker，Inc. , NewYork， NY (1987)?？梢岳斫?，基于本文所提供的公開內(nèi)容，用于本發(fā)明的抗體能從 轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物以及源自它們的雜交瘤獲得，但也能在除了雜交瘤之外的細胞系中表達。可得到的作為表達宿主的哺乳動物細胞系為本領(lǐng)域所公知，包括許多可獲自美國典型培養(yǎng)物中心(ATCC)的永生化細胞系，包括但不限 于中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，NSO, HeLa細胞，幼倉鼠腎(BHK)細胞， 猴腎細胞(COS)和人肝細胞癌細胞(例如Hep G2)。也可使用非哺乳動 物原核和真核細胞，包括細菌、酵母、昆蟲和植物細胞?？梢允褂帽绢I(lǐng)域所公知的各種表達系統(tǒng)，例如但不限于，在例如 Sambrook和Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)，和 Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons， NY (2002)中所描述的那些。這些表達系統(tǒng)尤其包括基于二氫 葉酸還原酶(DHFR)的系統(tǒng)。谷氨跣胺合成酶表達系統(tǒng)在歐洲專利號EP 216 846， EP 256 055,和EP 323 997以及歐洲專利申請?zhí)?9303964 中有全部或部分討論。在一個實施方案中，所使用的抗體在NS0細胞 中用谷氨酰胺合成酶系統(tǒng)(GS-NSO)制成。在另一個實施方案中，抗體 在CH0細胞中用DHFR系統(tǒng)制成。這兩種系統(tǒng)都為本領(lǐng)域所公知，尤其 在Barnes等的Biotech & Bioengineering 73: 261—270 (2001)和其 中引用的參考文獻中有所描述。對抗體CH2結(jié)構(gòu)域定點誘變以消除糖基化可能是優(yōu)選的，以便阻 止由非人糖基化引起的免疫原性、藥代動力學(xué)功能和/或效應(yīng)功能變 化。此外，通過酶(參見，例如，Thotakura等Meth. Enzymol. 138: 350 (1987))和/或化學(xué)方法(參見，例如，Hakimuddin等，Arch. Biochem. Biophys. 259:52 (1987))，可以將抗體去糖基化。此外，本發(fā)明包括使用含有改變的糖基化方式的抗-CTLA-4抗體。 基于本文所提供的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，與天然存 在的抗體相比，抗-CTLA-4抗體能被修飾成包括額外的、更少的或者 不同的糖基化位點。這種修飾在例如美國專利申請公開第 2003/0207336和2003/0157108號、以及國際專利公開第WO 01/81405 和00/24893號中有所描述。此外，本發(fā)明包括使用抗-CTLA-4抗體，而不論抗體上存在的糖 形(如果存在)。而且，用于廣泛地重新塑造存在于糖蛋白上的糖形的方法，在現(xiàn)有技術(shù)中已知，包括，例如在國際專利公開第WO 03/031464、 W098/58964和W099/22764號，以及美國專利申請公開笫 2004/0063911、 2004/0132640、 2004/0142856、 2004/0072290號，以 及Umana等的美國專利第6， 602， 684號中描述的那些。而且，本發(fā)明包括使用含有任何現(xiàn)有技術(shù)中已知的共價和非共價 修飾的抗-CTLA-4抗體，所述修飾包括但不限于，將多肽與各種非蛋 白質(zhì)聚合物(例如聚乙二醇、聚丙二醇、或聚氧化烯)之一按照例如美 國專利申請公開第2003/0207346和2004/0132640號、以及美國專利 第4， 640， 835、 4， 496， 689、 4,301， 144、 4, 670, 417、 4， 791， 192、 4, 179， 337號中描述的方式連接。此外，木發(fā)明包括使用抗-CTLA-4抗體、或其抗原結(jié)合部分、嵌 合蛋白質(zhì)(包括，例如人血清白蛋白多肽)、或其片段。不論嵌合蛋白 質(zhì)是否使用重組方法來生產(chǎn)，例如通過編碼嵌合蛋白質(zhì)的嵌合核酸的 克隆、或通過兩個肽部分的化學(xué)鍵連，本領(lǐng)域的技術(shù)人員一旦具有本 發(fā)明提供的教導(dǎo)便可以理解，該嵌合蛋白質(zhì)在現(xiàn)有技術(shù)是已知的，并 且該嵌合蛋白質(zhì)能夠賦予希望的生物特性，例如但不限于，增加本發(fā) 明的抗體的穩(wěn)定性和血清半衰期，因此這類分子也包括在本文中。用于本發(fā)明而生產(chǎn)的抗體不需要開始便具有特定的需要的同種 型。而是，所產(chǎn)生的抗體可以具有任何同種型，并且可以是此后使用 常規(guī)技術(shù)轉(zhuǎn)換的同種型。這些包括直接重組技術(shù)(參見，例如美國專利 4，816， 397)、和細胞-細胞融合技術(shù)(參見例如美國專利第5， 916,771 號)。本發(fā)明的抗體的效應(yīng)功能可以通過同種型轉(zhuǎn)換至IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgD、 IgA、 IgE或IgM來改變，而用于多種治療用途。 而且，通過4吏用例如雙特異物(bispecifics)、免疫毒素、或放射性標 記，可以避免細胞殺傷的補體依賴性。因此，盡管用于本發(fā)明的優(yōu)選抗體由具有3.1. 1， 4.1.1， 4.8.1， 4. 10. 2， 4. 13. 1， 4. 14. 3， 6. 1. 1， 11. 2.1， 11. 6.1， 11. 7. 1， 12. 3.1. 1， 12. 9. 1. 1，和MDX-010的氨基酸序列或例如其V區(qū)或CDR的序列的抗體例示，本發(fā)明絕不限于使用這些或任何其它特定的抗體。本發(fā)明包括組合施用本發(fā)明的任意抗-CTLA-4抗體和至少一種激素治療劑。優(yōu)選 地，抗體是4. 1.1， 4.13.1， 11. 2. 1，和/或MDX-OIO。但是，在本發(fā)明 的方法中，可以使用在本文別處所述的或本領(lǐng)域已知的或?qū)黹_發(fā)的 任意抗-CTLA-4抗體或其抗原結(jié)合部分。更具體地，人源化嵌合抗體， 源自任意物種的抗-CTLA-4抗體(包括在例如Casterman和Hamers的 美國專利號5， 759， 808和6， 765， 087中描述的從camel ids得到的單 鏈抗體)，以及任意人抗體，可以與治療劑相組合，用于實現(xiàn)本文公開 的新方法。本發(fā)明也包括尤其在國際專利公開號W0 00/37504 (2000年6月 29日公開);W0 01/14424 (2001年3月1日公開)；WO 93/00431 (1993 年1月7日公開)；和W0 00/32231 (2000年6月8日公開)中公開的這 樣的抗體。盡管抗體4.1.1, 4. 13. 1和11. 2. 1為lgG2抗體，且所述抗體 的可變區(qū)的序列提供在本文(圖1 — 3)，在本文參考和引入的申請和專 利中，可以理解，本文包括這些抗體的全長序列，以及包括SEQIDNO: 1一36中所列的序列并進一步包括任何恒定區(qū)的任意抗體的應(yīng)用，而 不論在本文別處更充分討論的同種型。同樣，包括MDX-010的全長序 列或其任意部分(包括編碼MDX-010的抗原結(jié)合部分的序列)的任意抗 體，可以與至少2種激素治療劑組合施用，從而治療前列腺癌。因而，本領(lǐng)域技術(shù)人員在獲知本文提供的教導(dǎo)后會容易地明白， 本發(fā)明的抗-CTLA-4抗體-治療劑組合可以包含眾多的抗-CTLA-4抗 體。而且，本領(lǐng)域的技術(shù)人員基于本文提供的內(nèi)容可以理解，本發(fā)明 不限于僅僅單一抗體的給藥相反，本發(fā)明包括與治療劑組合施用至 少一種抗-CTLA-4抗體，例如4.1. 1， 4.13. l和11. 2,1。而且，本發(fā) 明包括施用任意已知抗-CTLA-4抗體的任意組合，包括、但不限于， 施用治療劑與例如4，1.1， 4.13.1， 11.2. 1和MDX-010組合。因而， 抗-CTLA-4抗體的任意組合可以與至少一種治療劑組合，本發(fā)明包括任意這類組合及其改變。III. CpG 0DNCpG寡核苷酸含有被發(fā)現(xiàn)會引起免疫應(yīng)答的特定序列。這些特定 序列稱作"免疫刺激基序"，含有免疫刺激基序的寡核苷酸稱作"免疫刺 激寡核苷酸分子"和等同地"免疫刺激寡核苷酸"。免疫刺激寡核苷酸包 括至少一個免疫刺激基序，優(yōu)選地該基序是內(nèi)部基序。術(shù)語"內(nèi)部免 疫刺激基序"指比基序序列長至少一個核苷酸(在5'和3'末端)的寡 核苷酸序列內(nèi)基序序列的位置。CpG寡核苷酸包含至少一個未甲基化的CpG二核苷酸。含有至少 一個未甲基化的CpG 二核苷酸的寡核苷酸是含有胞嘧啶-鳥嘌呤二核 苷酸序列的寡核普酸分子(即，"CpGDNA"或含有通過磷酸鍵連接到3' 鳥嘌呤上的5'胞嘧啶的DNA)，且激活免疫系統(tǒng)。整個CpG寡核苷酸 可以是未曱基化的，或部分可以是未甲基化的，但是至少5' CG 3'的 C必須是未甲基化的。B類CpG寡核苷酸用下式表示5' X!CGX2其中X,和X2是核苷酸。在有些實施方案中，Xt可以是腺噪呤， 鳥嘌呤，或胸腺嘧啶，和/或l可以是胞嘧啶，腺嘌呤，或胸腺嘧咬。 B類CpG寡核苷酸也用下式表示其中X" X2， X3，和X4是核苷酸。X2可以是腺噪呤，鳥嘌呤，或胸 腺嘧啶。x3可以是胞嘧啶，腺嘌呤，或胸腺嘧啶。B類CpG寡核苷酸包括由至少下式代表的寡核苷酸其中Xn X2, l，和X4是核苷酸，且N是任意核苷酸，N,和R是 各自由約0-25個N組成的寡核苷酸序列。XJ2可以是選自下述的二 核苷酸GpT, GpG, GpA， ApA， ApT， ApG， CpT， CpA, CpG, TpA， TpT， 和TpG;XX可以是選自下述的二核苷酸TpT， ApT， TpG， ApG， CpG，TpC， ApC， CpC, TpA， ApA、和CpA。B類CpG寡核苷酸公開在PCT公開專利申請PCT/US95/01570和 PCT/US97/19791，和分別在2001年2月27日和2001年5月29日授 權(quán)的USP 6， 194， 388 Bl和USP 6， 239， 116 Bl中。免疫刺激寡核苷酸分子可以具有同質(zhì)主鏈(例如，完全磷酸二酯或 完全硫代磷酸酯)或嵌合主鏈。為本發(fā)明的目的，嵌合主鏈是指部分穩(wěn) 定的主鏈，其中至少一個核普酸間連接是磷酸二酯或磷酸二酯樣連接， 且其中至少一個其它核苷酸間連接是穩(wěn)定的核苷酸間連接，其中所述至少一個磷酸二酯或磷酸二酯樣連接和所述至少一個穩(wěn)定的連接是不 同的。由于已有報道boranophosphonate連接相對于磷酸二酯連接來 說是穩(wěn)定的，為所述主鏈的嵌合性質(zhì)的目的，boranophosphonate連 接可以分類為磷酸二酯樣或分類為穩(wěn)定的，這取決于其所處環(huán)境。例 如，在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的嵌合主鏈可包括至少一個褲酸 二酯(確酸二酯或磷酸二酯樣)連接和至少一個boranophosphonate (穩(wěn)定的)連接。在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的嵌合主鏈可以包 括boranophosphonate (磷酸二酯或磷酸二酯樣)連接和硫代磷酸酯 (穩(wěn)定的)連接。"穩(wěn)定的核苷酸間連接"是指與砩酸二酯核苷酸間連 接相比，相對能夠抵抗體內(nèi)降解(例如通過核酸外切酶或核酸內(nèi)切酶) 的核苷酸間連接。優(yōu)選的穩(wěn)定的核苷酸間連接包括但不限于硫代磷酸 酯，二硫代磷酸酯，膦酸甲酯，和曱基硫代彿酸酯。其它穩(wěn)定的核苷 酸間連接包括但不限于肽，烷基，去磷酸類型的連接，和其它上述連 接。修飾的主鏈例如硫代磷酸酯可以用亞磷酰胺或H-膦酸化學(xué)方法 用自動技術(shù)合成?？梢杂美缑绹鴮＠?， 469， 863中描述的方法制 備芳基-和烷基-膦酸；烷基磷酸三酯(其中帶電荷的氧部分烷基化)， 例如美國專利號5, 023， 243和歐洲專利號092, 574中所述，可以使用 商業(yè)可獲得的試劑用自動固相合成方法制備。制備其它DNA主鏈修飾 和取代的方法已有描述。Uhlmann E等(1990) Chem Rev 90: 544; Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1:165。制備嵌合寡核苷酸的方法也是已知的。例如Uhlmann等的專利中已經(jīng)描述了這些技術(shù)。混和主鏈修飾的ODN可以使用商業(yè)可獲得的DNA合成儀和標準亞 磷酰胺化學(xué)合成。(F. E. Eckstein, "Oligonucleotides and Analogues-A Practical Approach" IRL Press, Oxford, UK, 1991, 和M. D. Matteucci和M. H. Caruthers， Tetrahedron Lett. 21. 719 (1980))。偶聯(lián)以后，通過用Beaucage試劑(R. P. Iyer， W. Egan， J. B. Regan and S. L. Beaucage, J. Am. Chem. Soc. 112， 1253 (1990))(在乙腈中濃度為0. 075 M)或苯乙酰二硫化物(PADS)進行硫化 反應(yīng)，然后用乙酸酐，2，6-盧剔啶的四氫呋喃溶液(1:1:8; v:v:v)和 N-甲基咪唑(在四氫呋喃中濃度為16%)加帽，引入PS連接。該加帽 步驟在硫化反應(yīng)之后進行，以使在應(yīng)是硫代磷酸酯的位置上不希望的 磷酸二酯(P0)連接的形成降到最低限度。在磷酸二酯連接的引入過程 中，例如在CpG二核苷酸上，中間體磷-III通過用碘的水/吡咬溶液 處理被氧化。從固體支持物上切割下來并通過濃氨水的處理進行最后 的去保護(15小時，50n)以后，通過用NaCl梯度(例如緩沖液A:乙 腈/水=1: 4/v: v中NaH2P04濃度為10mM， pH6. 8; 緩沖液B:乙腈 /水=1: 4/v: v中NaH2P04濃度為10mM, NaCl濃度為1. 5M;在30分鐘 內(nèi)5到60。/。B，速度為1 ml/min)在Gen-Pak Fax柱(Millipore-Waters) 上進行HPLC，或通過毛細管凝膠電泳，分析0DN?？梢杂肏PLC或在 Source High Performance柱 (Amersham Pharmacia)上用FPLC純化 0DN。將HPLC—同質(zhì)級分合并，并通過C18柱或超濾進行脫鹽。用 MALDI-TOF質(zhì)謙對ODN進行分析，以證實計算的質(zhì)量。本發(fā)明的寡核苷酸還可以包括其它修飾。它們包括非離子的DNA 類似物，例如烷基-和芳基-磷酸(其中帶電荷的膦酸氧被烷基或芳基取 代)，磷酸二酯和烷基磷酸三酯，其中帶電荷的氧部分被烷基化。在任 一末端或兩個末端含有二醇(例如四乙二醇或六乙二醇)的寡核苷酸， 還已顯示能基本上抵抗核酸酶降解。在有些實施方案中，所述寡核苷酸可以是柔性或半柔性寡核苷酸。 柔性寡核苷酸是具有部分穩(wěn)定主鏈的免疫刺激寡核苷酸，其中只在至少一個內(nèi)部嘧啶-噪呤二核普酸(YZ)的內(nèi)部或其緊鄰處存在磷酸二酯 或磷酸二酯樣核苷酸間連接。優(yōu)選YZ是YG，嘧啶-鳥嘌呤核苷(YG)二 核苷酸。所述至少一個內(nèi)部YZ 二核苷酸本身具有磷酸二酯或磷酸二酯 樣核苷酸間連接。緊鄰所述至少一個內(nèi)部YZ 二核苷酸存在的磷酸二酯 或磷酸二酯樣核苷酸間連接可以是在所述至少一個內(nèi)部YZ 二核苷酸 的5， ， 3，或同時在5，和3，。更具體地，磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間連接涉及"內(nèi)部二核 苷酸"。通常內(nèi)部二核苷酸是指任意一對通過核苷酸間連接相連的相 鄰核苷酸，其中該對核苷酸中的任何一個核苷酸都不是末端核苷酸， 即，該對核苷酸中沒有一個核苷酸是限定寡核苷酸的5，或3，末端的 核苷酸。因此n個核苷酸長的線性寡核苷酸具有總共n-l個二核苷酸， 只有n-3個內(nèi)部二核苷酸。內(nèi)部二核苷酸的每個核苷酸間連接都是內(nèi) 部核苷酸間連接。因此n個核苷酸長的線性寡核苷酸具有總共n-l個 核苷酸間連接，只有n-3個內(nèi)部核苷酸間連接。因此，策略性放置的 磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間連接指位于寡核香酸序列中任意一對 核苷酸之間的磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間連接。在一些實施方案 中，所述磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間連接不位于最接近5，或3， 末端的任何一對核苷酸之間。優(yōu)選緊鄰所述至少一個內(nèi)部YZ 二核苷酸存在的磷酸二酯或磷酸 二酯樣核苷酸間連接本身是內(nèi)部核苷酸間連接。因此對于序列NJZN" 其中^和N2每一個獨立于另一個是任意單個核苷酸，所述YZ 二核苷 酸具有磷酸二酯或磷酸二酯樣核普酸間連接，此外(a)當Ni是內(nèi)部核 苷酸的時候，^和Y通過磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間連接相連， (b)當N2是內(nèi)部核苷酸的時候，Z和N2通過磷酸二酯或砩酸二酯樣核苷 酸間連接相連，或者(c)當K是內(nèi)部核苷酸的時候，Ni和Y通過砩酸二 酯或磷酸二酯樣核苷酸間連接相連，并且當N2是內(nèi)部核苷酸的時候， Z和A通過磷酸二酯或砩酸二酯樣核苷酸間連接相連。據(jù)信根據(jù)本發(fā)明的柔性寡核苷酸與完全穩(wěn)定的寡核苷酸相比，對 核酸酶切割相對敏感。不受特定理論或機制的限制，認為本發(fā)明的柔性寡核苷酸相對于全長柔性寡核苷酸可被切割產(chǎn)生具有降低的或沒有 免疫刺激活性的片段。據(jù)信引入至少一個對核酸酶敏感的核苷酸間連 接，特別是在所述寡核苷酸中部附近，可以提供一個"關(guān)閉開關(guān)"， 它可以改變所述寡核苷酸的藥代動力學(xué)，以便減少所述寡核苷酸的最 大免疫刺激活性的持續(xù)時間。這在希望避免與慢性局部炎癥或免疫刺 激相關(guān)的損傷的組織和臨床應(yīng)用(例如腎)中可具有特殊的價值。半柔性寡核苷酸是具有部分穩(wěn)定主鏈的免疫刺激寡核苷酸，其中僅僅在至少一個內(nèi)部嘧咬一嘌呤(YZ) 二核苷酸內(nèi)存在磷酸二酯或磷酸 二酯樣核苷酸間連接。半柔性寡核苷酸與相應(yīng)的完全穩(wěn)定的免疫刺激 寡核苷酸相比，通常具有增強的免疫刺激效力。由于半柔性寡核苷酸 的更大效力，在一些實例中，為達到所希望的生物效果，與常規(guī)的完 全穩(wěn)定的免疫刺激寡核苷酸相比，半柔性寡核苷酸可以以更低的有效 濃度使用，并且具有更低的有效劑量。認為半柔性寡核苷酸的上述性質(zhì)通常隨著涉及內(nèi)部YZ 二核苷酸 的磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間連接的"劑量"的增加而增強。因 此認為，例如，通常對給定的具有4個內(nèi)部YZ二核苷酸的寡核苷酸序 列來說，具有4個內(nèi)部磷酸二酯或磷酸二酯樣YZ核苷酸間連接的寡核 苷酸比具有3個內(nèi)部磷酸二酯或磷酸二酯樣YZ核苷酸間連接的寡核苷 酸更具免疫刺激效果，后者又比具有2個內(nèi)部磷酸二酯或砩酸二酯樣 YZ核苷酸間連接的寡核普酸更具免疫刺激效果，后者又比具有1個內(nèi) 部磷酸二酯或磷酸二酯樣YZ核苷酸間連接的寡核苷酸更具免疫刺激 效果。重要的是，包括甚至1個內(nèi)部磷酸二酯或磷酸二酯樣YZ核普酸 間連接，經(jīng)常可優(yōu)于沒有內(nèi)部磷酸二酯或磷酸二酯樣YZ核苷酸間連 接。除了磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間連接的數(shù)目，沿著寡核普酸 長度上的位置分布也可影響效力。除了在優(yōu)選的內(nèi)部位置上的磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間連接 之夕卜，柔性和半柔性寡核苷酸通常還包括能抵抗降解的5，和3，末端。相應(yīng)的未修飾末端增強的適當修飾。例如，所述5，和3，末端可以通過在其中包括主鏈的至少一個磷酸修飾來穩(wěn)定。在優(yōu)選的實施方案中， 在每個末端所述主鏈的至少一個磷酸修飾獨立地是硫代磷酸酯，二硫 代磷酸酯，膦酸甲酯，或甲基硫代磷酸酯核苷酸間連接，在另一個實施方案中，所述可抵抗降解的末端包括一個或多個在3，末端通過肽 或酰胺鍵連接起來的核普酸單元。磷酸二酯核普酸間連接是在自然界中發(fā)現(xiàn)的寡核苷酸特征性的連 接類型。磷酸二酯核苷酸間連接包括磷原子，其側(cè)翼是兩個橋接的氧 原子，另外還通過兩個額外的氧原子結(jié)合， 一個帶電荷，另一個不帶 電荷。當縮短寡核苷酸的組織半衰期是重要的時候，磷酸二酯核苷酸 間連接是特別優(yōu)選的。磷酸二酯樣核苷酸間連接是含有磷的橋接基團，其在化學(xué)上和/或非對映異構(gòu)方面與砩酸二酯類似。與磷酸二酯相似性的衡量，包括 對核酸酶消化的易感性以及激活RNA酶H的能力。因此，例如磷酸二 酯(而不是硫代磷酸酯)寡核苷酸易被核酸酶消化，但是磷酸二酯和 硫代磷酸酯寡核苷酸都能夠激活RM酶H。在優(yōu)選的實施方案中，所 述磷酸二酯樣核苷酸間連接是boranophosphate (或等同地 boranophosphonate)連接。美國專利號5, 177, 198; 美國專利號 5, 859, 231;美國專利號6,160,109;美國專利號6, 207, 819; Sergueev等，(1998) J Am Chem Soc 120:9417-27。在另一個優(yōu)選 的實施方案中，所述磷酸二酯樣核苷酸間連接是非對映純的Rp硫代磷 酸酯。認為非對映純的Rp硫代磷酸酯比混合的或非對映純的Sp硫代 磷酸酯更容易被核酸酶消化且更好地激活RNA酶H。 CpG寡核苷酸的立 體異構(gòu)體是公開的PCT申請PCT/US99/17100(WO00/06588)的主題。應(yīng)當注意，為本發(fā)明的目的，術(shù)語"磷酸二酯樣核苷酸間連接"特別排 除二硫代磷酸酯和膦酸甲酯核苷酸間連接。如上所述，本發(fā)明的柔性和半柔性寡核苷酸可在C和G之間具有 磷酸二酯樣連接。磷酸二酯樣連接的一個例子是Rp構(gòu)象的硫代磷酸酯 連接。寡核苷酸P手性對于CpG寡核苷酸的免疫活性具有明顯相反的 影響，這取決于活性測量的時間點(Krieg等，2003 ，Oligonucleotides, 13 (6): 491-499)。在40分鐘的早期時間點，硫 代磷酸酯CpG寡核苷酸的Rp(而不是Sp)立體異構(gòu)體在鼠脾細胞中誘導(dǎo) JNK磷酸化。相反，當在44小時的晚期時間點測定時，Sp(而不是Rp) 立體異構(gòu)體具有刺激脾細胞增殖的活性。這種Rp和Sp立體異構(gòu)體的動力學(xué)和生物活性差異并不是由于細胞攝入的任何差異造成的，而很 可能是由于p手性的兩種相對的生物學(xué)作用。首先，Rp立體異構(gòu)體與 Sp相比在早期時間點具有增強的刺激免疫細胞的活性，表明Rp可能 更有效地與CpG受體TLR9相互作用或誘導(dǎo)下游信號傳導(dǎo)途徑。另 一方 面，RpPS-寡核苷酸與Sp相比更快的降解，會導(dǎo)致信號傳導(dǎo)的持續(xù)時 間短得多，使得在較晚時間點檢測的時候Sp PS-寡核苷酸表現(xiàn)出更具 生物活性。CpG 二核苷酸本身的p手性可獲得驚人強烈的效果。與立體隨機 的CpG寡核苷酸相比，其中單個CpG 二核苷酸以Rp相連的同源物活性 稍強，但是含有Sp連接的同源物對于誘導(dǎo)脾細胞增殖幾乎沒有活性。因此，寡核苷酸可以在主鏈組成上是異質(zhì)的，從而含有連接到一 起的聚合物單元的任何可能的組合。術(shù)語"寡核苷酸"還包括具有取代或修飾(例如在糖上)的寡核 苷酸。例如，它們包括具有在2，部位與除羥基以外的低分子量有機 基團共價結(jié)合和在5，部位與除磷酸基團或羥基以外的低分子量有機 基團共價結(jié)合的主鏈糖的核酸。因此，修飾的寡核普酸可以包括2'-0-烷基化核糖基團。此外，修飾的寡核苷酸可以包括取代核糖的阿拉伯 糖或2'-氟代阿拉伯糖等糖。本發(fā)明的免疫刺激寡核苷酸與天然RNA和DNA相比，可以包括各 種化學(xué)修飾和取代，涉及磷酸二酯核普酸間橋，或p-D-核糖單元?；?學(xué)修飾的實例是技術(shù)人員所公知的，描述在例如UhlmannE等(1990) Chem Rev 90:543; "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal， Ed， H咖ana Press, Totowa， USA 1993; Crooke ST等, (1996) Amiu Rev Pharmacol Toxicol 36:107—129; and Hunziker J等(1995) Mod Synth Methods 7: 331-417。與由天然DNA或RNA組 成的相同序列的寡核苷酸相比，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸可以具有一個 或多個修飾，其中每個修飾位于特定的磷酸二酯核苷酸間橋接和/或特 定的P-D-核糖單元。例如，本發(fā)明涉及寡核苷酸，其可能含有一個或多個修飾，其中 每個修飾獨立地選自a) 用修飾的核苷酸間橋接代替位于核苷酸3，和/或5，端的磷酸 二酯核苷酸間橋接，和b) 用去磷酸橋接代替位于核苷酸3，和/或5，端的磷酸二酯橋接。c) 用另一個單元代替糖磷酸主鏈的糖磷酸單元，和d) 用修飾的糖單元代替P-D-核糖單元。 寡核苷酸的化學(xué)修飾的更詳細的實施例如下所述 位于核苷酸3，端和/或5，端的磷酸二酯核苷酸間橋接可以被修飾的核苷酸間橋接替代，其中所述修飾的核苷酸間橋接例如選自硫 代磷酸酯，二硫代磷酸酯，NRW-亞磷酰胺，boranophosphate， ct-羥千基膦酸酯，磷酸鹽(d-Cj-O-烷基酯，磷酸鹽-[(C6-CJ芳基 -(d-CJ-0-烷基]酯，(d-Cs)烷基膦酸酯和/或(C6-C12)芳基膦酸酯橋 接，(C廣d2)-口-羥曱基-芳基(例如W095/01363中公開的)，其中(C6-C12) 芳基，(C6-C2。)芳基和(C「CH)芳基可選地被g素，烷基，烷氧基，硝基，氰基取代，且其中r和w彼此獨立地是氫，(d-CJ-烷基，(C6-C2。)-芳基，(C6-C14)-芳基-(d-Cs)-烷基，優(yōu)選的是氫，(d-Cs)-烷基，優(yōu)選 的是(d-")-烷基和/或甲氧乙基，或者W和112與攜帶它們的氮原子一 起形成5-6-元雜環(huán)，所述雜環(huán)可以另外含有選自0, S和N的其它雜 原子.位于核苷酸3，端和/或5，端的磷酸二酯橋接被去磷酸橋接替代 (去磷酸橋接描述在例如Uhlmann E和Peyman A "Methods in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal， Ed. ， Humana Press, Totowa 1993， Chapter 16， pp. 355 ff)，其中去磷酸橋接例如選自去磷酸橋接formacetal，3'-thioformacetal，甲基羥胺，將，亞甲基二甲基-亞肼基，二亞甲 基砜和/或甲硅烷基。糖磷酸主鏈(即糖磷酸主鏈由糖磷酸單元組成)上的糖磷酸單元 (即P -D-核糖和磷酸二酯核普酸間橋接一起形成糖磷酸單元)可以被 另一個單元替代，其中另一個單元例如適合于構(gòu)建"嗎啉代-衍生物" 寡聚物(如例如Stirchak EP等(1989) Oligonucleotides Res 17: 6129-41中所述)，也就是說，例如用嗎啉代-衍生物單元替代；或者 構(gòu)建聚酰胺寡核苷酸("PNA";如例如Nielsen PE等 (1994) Bioconjug Chem 5:3-7中所述)，也就是說，例如用PM主鏈單元例 如用2-氨乙基甘氨酸替代。P -核糖單元或P -D-2，-脫氧核糖單元可以被修飾的糖單元替代， 其中修飾的糖單元例如選自P-D-核糖，ot-D-2'-脫氧核糖，L-2'-脫 氧核糖，2'-F-2'-脫氧核糖，2'-F-阿拉伯糖，2'-0-(C「C6)烷基-核 糖，優(yōu)選地，2'-0-(CrC6)烷基-核糖是2'-0-曱基核糖，2'-0-(C2-C6) 鏈烯基-核糖，2'-
-核糖，2'-冊2-2'-脫氧核糖，木-呋喃糖，oc-阿拉伯呋喃糖，2，4-二脫氧-p-D-赤-己-他喃糖， 和碳環(huán)(在例如Froehler J (1992) Am Chem Soc 1H:8320中所述)和/或開鏈糖類似物(在例如Vandendriessche等 (l"3) Tetrahedron 49: 7223中所述)和/或二環(huán)糖類似物(在例如 Tarkov M等(1993) Helv Chim Acta 76: 481中所述)。在有些實施方案中，所述糖是2， -O-甲基核糖，特別對于通過磷 酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間連接相連的一個或兩個核苷酸。在本文所述的特定序列中，定義了一組修飾的堿基，例如字母Y 用于表示含有胞嘧啶或修飾的胞嘧啶的核苷酸，本文使用的修飾的胞 嘧啶是天然存在的或非天然存在的胞嘧啶的嘧咬堿基類似物，它可以 替代該堿基而不會削弱所述寡核苷酸的免疫刺激活性。修飾的胞嘧啶 包括但不限于5-取代的胞嘧啶(例如5-曱基-胞嘧啶，5-氟代-胞嘧咬， 5-氯代-胞嘧啶，5-溴代-胞嘧啶，5-硪代-胞嘧啶，5-羥基-胞嘧咬， 5-羥曱基-胞嘧啶，5-二氟甲基-胞嘧啶，和未取代的或取代的5-炔基-胞嘧啶)，6-取代的胞嘧啶，N4-取代的胞嘧啶(例如N4-乙基-胞嘧 啶)，5-氮雜-胞嘧啶，2-巰基-胞嘧啶，異胞嘧啶，假-異胞嘧啶，具 有稠環(huán)系統(tǒng)的胞嘧啶類似物(例如N， N，-亞丙基胞嘧啶或吩噁溱)， 和尿嘧啶和它的衍生物(例如5-氟代-尿嘧啶，5-溴代-尿嘧啶，5-溴 乙烯基-尿嘧啶，4-硫代-尿嘧啶，5-羥基-尿嘧啶，5-丙炔基-尿嘧啶)。 一些優(yōu)選的胞嘧啶包括5-甲基-胞嘧啶，5-氟代-胞嘧啶，5-羥基-胞 嘧啶，5-羥甲基-胞嘧啶，和N4-乙基-胞嘧啶。在本發(fā)明的另一個實 施方案中，所述胞嘧咬堿基被通用堿基(例如3-硝基吡咯，P-堿基)， 芳香環(huán)系統(tǒng)(例如氟苯或二氟苯)或氫原子(dSpacer)取代。字母Z用于表示鳥噪呤或修飾的鳥噪呤堿基。本文使用的修飾的 鳥嘌呤是天然存在的或非天然存在的鳥嘌呤的嘌呤堿基類似物，它可 以替代該堿基而不會削弱所述寡核苷酸的免疫刺激活性。修飾的鳥嘌 呤包括但不限于7-去氮鳥嘌呤，7-去氮-7-取代的鳥嚷呤(例如7-去氮 -7-(C廣C6)炔基鳥嘌呤)，7-去氮-8-取代的鳥嘌呤，次黃嘌呤，N廣取 代的烏嘌呤(例如N2-甲基-鳥嘌呤)，5-氨基-3-曱基-3H， 6H-噻唑并 [4，5-d]嘧啶-2， 7-二酮，2， 6-二氨基噪呤，2-氨基嘌呤，嘌呤，吲 哚，腺嘌呤，取代的腺嘌呤(例如N6-甲基-腺嘌呤，8-氧-腺嘌呤)8-取代的鳥嘌呤(例如8-羥基鳥嘌呤和8-溴代鳥嘌呤)，和6-硫代鳥嘌 呤。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述鳥噪呤堿基被通用堿基(例如 4-曱基-吲哚，5-硝基-吲哚，和K-堿基)，芳香環(huán)系統(tǒng)(例如苯并咪唑 或二氟-苯并咪唑，i-甲基-lH-[1, 2，4]三唑-3-羧酸酰胺)或者氫原子 (dSpacer)取代。所述寡核苷酸可以具有一個或多個可及的5，末端。能夠制備具 有兩個這樣的5，末端的修飾的寡核苷酸。這可以通過例如將兩個寡 核苷酸通過3， -3，連接相連起來產(chǎn)生具有一個或兩個可及的5，末端 的寡核苷酸來實現(xiàn)。所述3， -3，連接可以是彿酸二酯，硫代磷酸酯 或任意其它修飾的核苷酸間橋接。獲得這種連接的方法是本領(lǐng)域已知 的。例如，這種連接描述在Seliger，H.;等，01igonucleotide analogs with terminal 3'-3'-and 5'-5'-internucleotidic linkages asantisense inhibitors of viral gene expression, Nucleotides & Nucleotides (1991)， 10 (1-3), 469-77和Jiang,等，Pseudo-cyclic oligonucleotides: in vitro and in vivo properties, Bioorganic & Medicinal Chemistry (1999)， 7(12)， 2727-2735。此外，其中3，末端核苷酸之間的連接并非磷酸二酯、硫代磷酸 酯或其它修飾橋接的3， -3，連接的寡核苷酸可以用另外的間隔物制 備，例如三-或四-乙二醇磷酸部分(Durand， M.等，Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one (dA)12 and two (dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains, Biochemistry (1992)， 31(38)， 9197-204，美國專利號5658738，和 美國專利號5668265)?；蛘撸呛塑账徇B接物可以用標準的亞磷酰胺 化學(xué)，從乙二醇、丙二醇獲得，或得自脫堿基脫氧核糖(dSpacer)單元 (Fontanel, Marie Laurence 等,Sterical recognition by T4 polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5'-attached to oligonucleotides; 01igonucleotides Research (1994)， 22(11)， 2022-7)。非核苷酸連接物可以引入一次或多次，或者彼此組合，以使 要被連接的兩個0DN的3，末端之間具有任意希望的距離。所述寡核苷酸對降解具有部分抗性(例如是穩(wěn)定的)。"穩(wěn)定的寡 核苷酸分子"指對于體內(nèi)降解(例如通過外切或內(nèi)切核酸酶)相對具有 抗性的寡核苷酸。寡核苷酸穩(wěn)定可以通過主鏈修飾獲得。具有硫代磷 酸酯連接的寡核苷酸提供最大的活性，且保護寡核苷酸不被細胞內(nèi)的 外切或內(nèi)切核酸酶降解。其它修飾的寡核苷酸包括磷酸二酯修飾的寡 核苷酸，磷酸二酯和硫代鱗酸酯寡核苷酸的組合，膦酸甲酯，甲基硫 代磷酸酯，二硫代磷酸酯，對乙氧基，及其組合。在任一或兩個末端 含有二醇(例如四乙二醇或六乙二醇)的寡核苷酸，也已經(jīng)顯示可以基 本上抵抗核酸酶降解。所述免疫刺激寡核苷酸還可以在核苷酸或核苷酸類似物部分之間 含有一個或多個非常規(guī)連接。通常的核苷間連接是3'5'-連接。所有 其它連接都認為是非常規(guī)的核苷間連接，例如2'5'-， 5'5'-， 3'3'-,2'2'-， 2。'-連接。因此，命名2，到5，是根據(jù)核糖的碳原子選擇的。 但是，如果使用的是非天然糖部分，例如環(huán)擴大的糖類似物(例如己糖， 環(huán)己烯或吡喃糖)或雙環(huán)或三環(huán)糖類似物，則該命名根據(jù)單體的命名而 變化。在3，-脫氧-P-D-吡喃核糖類似物(也稱為p-DNA)中，單核普 酸例如通過4， 2，-連接相連。如果所述寡核苷酸含有一個3， 3，-連接，那么這種寡核苷酸可 具有兩個未連接的5，-末端。類似地，如果所述寡核苷酸含有一個5， 5，-連接，那么這種寡核苷酸可具有兩個未連接的3，-末端。未連接 的核苷酸末端的可及性可更好地被它們的受體接入。這兩類非常規(guī)的 連接(3， 3， -和5， 5， -)描述在Ramalho 0rtigao等 (Antisense Research and Development (1992) 2, 129-46)，其中具有3， 3，-連接的寡核苷酸據(jù)報道對核酸酶切割顯示出增強的穩(wěn)定性。在一個分子中也可以組合不同類型的連接，這可能導(dǎo)致寡聚物的 分枝。如果所述寡核苷酸的一部分在3，-末端通過3， 3，-連接與第 二寡核苷酸部分相連，在2，-末端通過2， 3，-連接與所述分子的第 三部分相連，會得到例如具有三個5，-末端的分枝(3， 3， -， 2， 3， -分枝)的寡核苷酸。x是例如<formula>formula see original document page 44</formula>x是例如 <formula>formula see original document page 44</formula>Y是例如:<formula>formula see original document page 44</formula>IV. CpG ODN PF3512676和抗-CTLA-4抗體聯(lián)合治療 本發(fā)明涉及聯(lián)合治療，其包含共同施用CpG ODN PF3512676和抗 -CTLA-4抗體，優(yōu)選包含尤其是抗體4. 1.1， 4. 13. 1，和11.2. 1， 10D1(MDX-OlO)的抗原-結(jié)合部分的抗體。在一個實施方案中，將抗-CTLA-4 抗體和CpG 0DN PF3512676的組合共同施用給患者來治療癌癥。 癌癥類型抗-CTLA-4抗體和CpG 0DN PF3512676的組合可以用于治療原發(fā) 性和繼發(fā)性(即，轉(zhuǎn)移性)癌癥。更具體地，在許多潛在的治療選擇中， CpG 0DN PF 3 512 6 7 6和抗-CTLA-4聯(lián)合治療可以用于治療腎細胞癌，乳 腺癌，結(jié)腸直腸癌，卵巢癌，非小細胞肺癌，黑素瘤，皮膚T-細胞淋 巴瘤，和NHL (包括緩慢進展的和侵襲性的)，以及許多其它。盡管這 些癌癥是優(yōu)選的，本發(fā)明涉及對許多種惡性細胞增殖障礙的治療，包 括、但不限于癌和肉瘤。其它實例包括卡波西肉瘤，滑膜肉瘤，幼紅 細胞瘤，間皮瘤，肝膽管(肝和膽管)瘤，原發(fā)性或繼發(fā)性腦瘤，肺癌 (NSCLC和SCLC),骨癌，皮膚癌，頭或頸癌，皮膚或眼內(nèi)黑素瘤，骨 癌，肛門區(qū)癌，胃癌，胃腸(胃，結(jié)直腸，和十二指腸)癌，結(jié)腸癌， 子宮癌，輸卵管癌，子宮內(nèi)膜癌，子宮頸癌，陰道癌，外陰癌，霍奇 金病，食道癌，小腸癌，內(nèi)分泌系統(tǒng)癌，.甲狀腺癌，甲狀旁腺癌，腎 上腺癌，軟組織肉瘤，尿道癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸癌，慢性或 急性髄細胞白血病，慢性或急性淋巴細胞性白血病，淋巴細胞性淋巴 瘤，膀胱癌，腎或輸尿管癌，腎盂癌，胰腺癌，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS) 腫瘤，包括原發(fā)性或繼發(fā)性CNS腫瘤，原發(fā)性CNS淋巴瘤，脊推腫瘤， 腦干膠質(zhì)瘤，成膠質(zhì)細胞瘤，腦膜瘤，成肌細胞瘤，星形細胞瘤，垂 體腺瘤，腎上腺皮質(zhì)癌，膽嚢癌，多發(fā)性骨髄瘤，膽管癌，纖維肉瘤， 神經(jīng)母細胞瘤，視網(wǎng)膜母細胞瘤，或一種或多種前述癌癥的組合。待治療的癌癥可以是難治的癌癥。本文使用的難治的癌癥是，對 開處的普通護理標準抵抗的癌癥。這些癌癥可能表現(xiàn)得最初對治療有 反應(yīng)(然后復(fù)發(fā))，或者它們可以對治療完全不反應(yīng)。普通護理標準 隨癌癥類型和在受試者中的進展程度而異。它可以是化療，免疫療法， 手術(shù)，或放射，或其組合。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道這樣的護理標準。 因此，根據(jù)本發(fā)明治療難治癌癥的受試者可能已經(jīng)暴露于對其癌癥的 另一種治療。或者，如果癌癥可能是難治的(例如，鑒于對癌細胞的分析或受試者的病史)，則受試者可能未暴露于另一種治療。難治癌癥的實例包括、但不限于白血病，黑素瘤，腎細胞癌，結(jié)腸癌，肝癌，胰腺癌，非霍奇金淋巴瘤，和肺癌。 治療類型本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白， 一旦獲知本文公開的教導(dǎo)，本發(fā)明包括CpG 0DN治療，聯(lián)合抗-CTLA-4抗體，連同或序貫(在前或在后)連 同手術(shù)、放療或二者，用于治療癌癥。也就是說，各種不同的治療可 以與抗-CTLA-4抗體-CpG 0DN PF3512676聯(lián)合治療相組合，本領(lǐng)域技 術(shù)人員在獲知本文提供的教導(dǎo)后會明白。在某些情況下，本發(fā)明的方法可以用于替代現(xiàn)有的手術(shù)操作或藥 物治療，盡管在其它情況下，本發(fā)明可以用于提高現(xiàn)有的治療這些疾 病的療法的功效。因此，聯(lián)合治療可以用于治療正在或?qū)邮苡绕?是癌癥治療的受試者。例如，所述試劑可以與另一種抗增殖(例如，抗 癌)治療組合地施用給受試者。合適的抗癌治療包括手術(shù)操作來去除肺 瘤塊，化療或局部放射。其它抗增殖治療可以在本發(fā)明的CpG 0DN PF3512676/抗-CTLA-4抗體組合治療之前、同時或之后施用。在施用 不同治療之間，也可以延遲幾小時、幾天，在有些情況下延遲幾周， 以便可以在其它治療之前或之后施用CpG 0DN PF3512676/抗-CTLA-4 抗體組合。本發(fā)明還預(yù)見到，在手術(shù)、放射或化療之前和之后，CpG 0DN PF3512676/抗-CTLA-4抗體組合在癌癥患者中的應(yīng)用。因而，本發(fā)明包括抗-CTLA-4抗體與CpG 0DN PF3512676組合作 為新輔助療法、輔助療法、 一線療法、二線療法和/或三線療法，在癌 癥的緩解誘導(dǎo)或維持治療中的應(yīng)用。也就是說，在一個實施方案中， 抗體-CpG ODN PF3512676組合可以作為新輔助療法，在例如腫瘤(例 如，前列腺癌，乳腺癌和肺癌)的手術(shù)切除之前共同施用。在另一個實 施方案中，抗體-CpG ODN PF3512676組合可以作為新輔助療法(即， 在手術(shù)前)和在手術(shù)后作為輔助療法施用。該組合可以用作一線治療， 替代其它試劑(例如，干擾素-ot)。本發(fā)明的方法和組合物不僅可以用于未治療的患者，而且可以用于治療對其它抗癌療法(例如但不限于單獨(或與其它抗癌劑組合)施用的CpG ODN PF3512676,或單獨(或與其它抗癌劑組合)施用的抗 -CTLA-4抗體)部分地或完全地無反應(yīng)的患者。在不同的實施方案中，本發(fā)明提供了可以用于治療患者的已經(jīng)顯示是或可能是難治的或?qū)χ?療不反應(yīng)的疾病或病癥的方法和組合物，其包含施用抗-CTLA-4抗體 和/或CpGODNPF3512676中的任一種或二者，其中治療被增強的免疫 應(yīng)答所改善。在一個實施方案中，該方法包含組合CpGODNPF3512676 和抗-CTLA-4抗體(優(yōu)選，抗體4.1.1，抗體4.13.1，抗體11.2.1， 抗體MDX-OIO，或其任意組合)。因而，例如，所述組合可以用于治療轉(zhuǎn)移性腎細胞癌，在細胞因 子-難治的患者中作為二線療法，在緩慢進展NHL中作為二線療法(與 美羅華進一步組合)，并在進展的NHL中在CHOP-R (環(huán)磷酰胺，多柔 比星，長春新堿，和潑尼松，與美羅華)中作為二線療法，以及其它。 當共同施用抗-CTLA-4抗體-CpG 0DN PF3512676組合時，這些療法的 組合也包含在本發(fā)明中，例如、但不限于，其中所述組合用于新輔助療 法、輔助療法、 一線療法、二線療法和三線療法或其任意組合。CpG ODN PF3512676可以與抗-CTLA-4抗體(如上所述)一起用于 緩解誘導(dǎo)，然后用單獨的CpG 0DN PF3512676進行維持治療。因而， 緩解誘導(dǎo)療法可能需要一個或多個重復(fù)循環(huán)的聯(lián)合CpG 0DN PF3512676/抗-CTLA-4抗體療法。但是， 一旦觀察到緩解(這將是醫(yī) 學(xué)從業(yè)人員顯而易見的)，受試者可以進行維持治療。這樣的維持治療 可以包含CpGODNPF3512676的單一療法。為了維持治療的目的，CpG ODN PF3512676可以每周施用1次或2次，或兩周1次，優(yōu)選皮下。盡管通過涉及輔助療法、 一線療法、二線療法和/或三線療法的方 法例示了本發(fā)明，包括施用包含共同施用CpG ODN PF3512676和抗 -CTLA-4抗體的組合，本領(lǐng)域技術(shù)人員在獲知本文提供的教導(dǎo)后會明 白，本發(fā)明不限于任何特定療法。相反，包含組合的CpG ODN PF3512676 和抗-CTLA-4抗體療法的方法包括在整個疾病和治療持續(xù)期間施用該 組合。更具體地，本文公開的新方法可以在轉(zhuǎn)移之前和之后以及為已經(jīng)變成化療劑難治的患者提供治療益處，因為抗體可以增強免疫應(yīng)答，包括由治療介導(dǎo)的任意應(yīng)答以及由CpG 0DN PF3512676介導(dǎo)的任意應(yīng) 答。因而，本發(fā)明不限于使用本發(fā)明的組合僅用于新輔助療法；相反, 本發(fā)明包括整個治療譜，包括、但不限于，癌癥的輔助療法、 一線療 法、二線療法和/或三線療法。這是因為，本文公開的數(shù)據(jù)表明，在治 療過程中的任意時間點，包含抗-CTLA-4抗體的免疫療法可以單獨地 或與至少一種其它試劑組合地提供治療益處。也就是說，通過施用本 發(fā)明的抗-CTLA-4抗體，可以增強介導(dǎo)腫瘤特異性抗原釋放的方法的 效力，例如細胞毒性療法(例如，放射，化療，等)，其中這樣的抗原暴 露于免疫系統(tǒng)。實際上，本文公開的數(shù)據(jù)還表明，所述抗體和CpGODN PF3512676的組合施用會介導(dǎo)協(xié)同效應(yīng)，用于治療癌癥，更具體地， 前列腺癌，乳腺癌，CRC，黑素瘤，胰腺癌，肺癌，NSCLC， NHL, RCC， 以及其它癌癥。因此，本發(fā)明提供了用于治療癌癥的重要的新治療劑， 從而增強患者的免疫系統(tǒng)，以提供抗腫瘤效果。在另一個實施方案中，共同施用CpG0DNPF3512676和抗-CTLA-4 抗體組合來增強和/或延長對腫瘤的免疫應(yīng)答。這是因為，本發(fā)明的 CpG ODN PF3512676 (作為尤其是TLR9激動劑)的抗肺瘤作用和抗 -CTLA-4抗體-介導(dǎo)的CTLA-4/B7信號傳遞的阻斷之間可能存在相互 作用，這導(dǎo)致比任一種單獨的試劑更有效的抗肺瘤效果。因而，不希 望受任何特定理論的約束，CpG ODN PF3512676和抗-CTLA-4抗體的 組合可以在腫瘤內(nèi)誘導(dǎo)比預(yù)期更強大的免疫應(yīng)答。不希望受任何特定 理論的約束，由例如B淋巴細胞的激活和提高的抗原呈遞細胞(例如， DC)功能介導(dǎo)的CpG ODN PF3512676抗腫瘤效果介導(dǎo)的肺瘤抗原的釋 放，以及由TLR9的激活介導(dǎo)的其它免疫增強效應(yīng)，可以增加抗-CTLA-4 的免疫治療效應(yīng)，包括減少或破壞對這樣的抗原的免疫耐受性。這可 能是因為，已經(jīng)證實施用抗體阻斷CTLA-4和CpG ODN PF3512676的免 疫激活會破壞耐受性(例如，逆轉(zhuǎn)或阻止對腫瘤抗原的無反應(yīng)性或耐受 性)，從而使腫瘤細胞對免疫攻擊更敏感。相反，部分地依賴于CTLA-4的調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的抑制作用，可能限制CpG免疫療法的有效性， 所以用抗-CTLA-4抗體阻斷這些效應(yīng)應(yīng)當會提高CpG的效能。因而， CpG ODN PF3512676和抗-CTLA-4抗體的組合可以提供潛在的累加或 協(xié)同效應(yīng)，從而提供對癌癥的重要的新的治療性處理。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了使用抗-CTLA-4抗體-CpG 0DN PF3512676組合來產(chǎn)生或增加抗腫瘤應(yīng)答的組合物和方法，其中CpG ODN PF3512676會增強一定量抗體的抗腫瘤應(yīng)答，所述抗體量在單獨 使用時，對于誘導(dǎo)相同水平的抗腫瘤應(yīng)答是次優(yōu)的。在某些實施方案 中，當CpG ODN PF3512676不與引起抗腫瘤應(yīng)答的抗體聯(lián)合使用時， 單獨施用CpG ODN PF3512676不會產(chǎn)生或增加抗胂瘤應(yīng)答。在替代實 施方案中，CpG ODN PF3512676和抗-CTLA-4抗體都可以單獨地和/ 或在聯(lián)合施用時引起抗腫瘤應(yīng)答。在某些實施方案中，CpG ODN PF3512676可以以累加方式增強抗 -CTLA-4抗體的作用(或者反之亦然)。在一個優(yōu)選的實施方案中，CpG ODNPF3512676會以協(xié)同方式增強抗-CTLA-4抗體的作用(或者反之亦 然)。在另一個實施方案中，抗-CTLA-4抗體會以累加方式增強CpGODN PF3512676的作用。優(yōu)選地，以協(xié)同方式增強作用。因而，在某些實 施方案中，本發(fā)明包括疾病治療或預(yù)防方法，其能提供比施用單獨的 CpG ODN PF3512676和單獨的抗-CTLA-4抗體更好的治療特性。本發(fā)明包括具有累加效力或累加治療效應(yīng)、同時減少或避免不希 望的或不利的效應(yīng)的聯(lián)合治療。本發(fā)明也包括協(xié)同組合，其中治療效 力大于累加，同時減低或避免不希望的或不利的效應(yīng)。在某些實施方 案中，本發(fā)明的方法允許治療或預(yù)防疾病和病癥，其中通過使用更低 劑量和/或更低頻率劑量的抗-CTLA-4抗體和/或CpG ODN PF3512676 來降低由施用單獨的抗-CTLA-4抗體和/或CpG ODN PF3512676造成 的不希望的或不利的效應(yīng)的發(fā)生率，同時維持或增強治療效力，優(yōu)選 地增加患者依從性，改善治療和/或降低不希望的或不利的效應(yīng)，由增 強的抗腫瘤應(yīng)答來改善治療。V.其它聯(lián)合治療基于本文提供的公開內(nèi)容，包括給患者施用抗-CTLA-4抗體的免 疫增強作用，和共同施用這樣的抗體與CpG 0DN PF3512676的組合的 組合累加或協(xié)同效應(yīng)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，本發(fā)明包括許多聯(lián)合 治療，其中抗體-CpG 0DN PF3512676與至少一種其它治療劑相組合地 施用給患者，從而提供治療益處。盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員在獲知本文提 供的教導(dǎo)后會容易地明白許多這樣的組合，現(xiàn)在討論幾種組合。但是， 本發(fā)明絕不限于這些組合，它們在本文中僅僅用于解釋目的?？贵w-CpG 0DN PF3512676和其它治療劑的共同施用(聯(lián)合治療)包 括共同施用抗-CTLA-4抗體、CpG 0DN PF3512676和一種或多種其它 治療劑，也包括共同施用2種或多種分開的藥物組合物， 一種包含抗 -CTLA-4抗體，另一種包含CpG 0DN PF3512676，且其它包含至少一 種其它治療劑。另外，盡管共同施用或聯(lián)合(共同)療法通常指抗體、 CpG 0DN PF3512676和其它治療劑彼此同時施用，它也包括同時、先 后或分開給藥該治療的單個組分。另外，當靜脈內(nèi)施用抗體且經(jīng)口 (例 如，化療劑)或通過皮下或肌肉內(nèi)注射施用抗癌劑時，應(yīng)當理解，所述 組合優(yōu)選地作為2種、3種或多種分開的藥物組合物來施用。當哺乳動物進行其它化療時，本領(lǐng)域眾所周知的化療劑可以與抗 -CTLA-4和CpG 0DN PF3512676組合使用。另外，可以使用生長因子 抑制劑，生物反應(yīng)修飾劑，烷基化試劑，嵌入抗生素，長春花生物堿， 紫杉烷，選擇性雌激素受體調(diào)控劑(SERMs)，血管發(fā)生抑制劑，以及 許多治療劑，下面描述了它們中的一些。血管發(fā)生抑制劑前面在本文別處已經(jīng)討論了血管發(fā)生抑制劑與抗-CTLA-4抗體的 組合應(yīng)用。此外，血管發(fā)生抑制劑包括、但不限于，貝伐單抗(AVASTIN; Genentech)， VEGF的一種人源化抗體.它可以與5FU組合使用，并用 于結(jié)腸或直腸的轉(zhuǎn)移性癌患者的一線治療。直接靶向血管發(fā)生因子或 它們的受體的試劑會通過打斷自分泌受體信號傳遞，提供在受體-感受 性血液惡性腫瘤中的更大活性的前景。貝伐單抗會持續(xù)中和循環(huán)VEGF，且可以用于治療骨髄增生異常綜合征(MDS)，淋巴瘤，急性髓細 胞白血病(AML)，和實體瘤。受體酪氨酸激酶(RTKI)，包括 PTK787/ZK222584 (Novartis)，正接受治療AML和其它受體-感受性 血液惡性腫瘤的評估。本發(fā)明也包括癌癥的治療，例如，腎癌，乳腺 癌，非霍奇金淋巴瘤，結(jié)腸直腸癌，等，其中使用抗-CTLA-4抗體和 CpG 0DN PF3512676的組合以及至少一種其它血管發(fā)生抑制劑，這樣 的抑制劑是本領(lǐng)域眾所周知的，或可以在將來開發(fā)。因而，抗血管發(fā)生劑，例如醒P-2 (基質(zhì)-金屬蛋白酶2)抑制劑， MMP-9 (基質(zhì)-金屬蛋白酶9)抑制劑，和COX-II (環(huán)氧合酶II)抑制 劑，可以與本發(fā)明的抗體-CpG 0DN PF3512676組合聯(lián)合使用。有用的 COX-II抑制劑的實例包括CELEBREX (塞來考昔)，伐地考昔，羅非 考昔，帕瑞考昔，地拉考昔，SD-8381，ABT-963，艾托考昔，lumiracoxib, BMS-347070, NS-398, RS 57067,美洛昔康。有用的基質(zhì)金屬蛋白酶 抑制劑的實例描述在國際專利公開號W0 96/33172; W0 96/27583; W0 98/07697， W0 98/03516， W0 98/34918， W0 98/34915, W0 98/33768， W0 98/30566， W0 90/05719， W0 99/52910, W0 99/52889， W0 99/29667， 歐洲專利申請?zhí)?80386 (1997年6月25日公開)，97304971. 1 (1997 年7月8日提交)，99308617. 2 (1999年10月29日提交)，606046 (1994 年7月13日公開)，931788 (1999年7月28日公開)，99302232. 1 (1999 年3月25日提交)，國際申請PCT/IB98/01113 (1998年7月21日提 交)，英國專利申請?zhí)?912961.1 (1999年6月3日提交)，美國臨時專 利申請?zhí)?0/148,464 (1999年8月12日提交)，和美國專利號 5， 863， 949，和5,861,510中。優(yōu)選的MMP-2和醒P-9抑制劑是具有微小的抑制MMP-1活性或沒 有該活性的那些。更優(yōu)選的是相對于其它基質(zhì)-金屬蛋白酶(即，MMP-l， 醒P-3，醒P-4，醒P-5，醒P-6,醒P-7，醒P-8, MMP-IO，醒P-ll，醒P-12， 和醒P-13)會選擇性地抑制醒P-2和/或匪P-9的那些。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑可將本文所述的治療和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑一起使用，例如可抑制EGFR (表皮生長因子受體)反應(yīng)的試劑，例如EGFR抗體、EGF抗體， 和作為EGFR抑制劑的分子；VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)抑制劑，例如 VEGF受體和可抑制VEGF的分子；和erbB2受體抑制劑，例如可結(jié)合 erbB2受體的有機分子或抗體，例如HERCEPTIN (Ge謹tech， Inc., San Francisco, CA)。在例如國際專利公開號WO 95/19970， WO 98/14451, WO 98/02434， 和美國專利號5， 747， 498中描述了 EGFR抑制劑，這些物質(zhì)可用于此處 所描述的本發(fā)明。EGFR抑制劑包括，但不限于，單克隆抗體C225、 抗-EGFR 22Mab (ImClone Systems Inc., New York, NY)和ABX-EGF (Abgenix Inc., remont ， CA)、化合物ZD-1839 (AstraZeneca)、 BIBX-1382(Boehringer Ingelheim) 、 MDX-447 (Medarexjnc ， An,dale， NJ)、和0LX-103 (Merck & Co. ， Whitehouse Station, NJ)，、 VRCTC-310 (Ventech Research)和EGF融合毒素(Seragen Inc., Hopkinton， MA)。這些EGFR抑制劑和其它EGFR抑制劑可用于 本發(fā)明。旨在抑制表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶(TK)的化合物，代 表了在本發(fā)明的方法中有效的一類相對新的抗腫瘤藥。許多人類癌癥 在細胞表面上表達EGFR家族的成員。當配體與EGFR結(jié)合時，會引起 細胞反應(yīng)級聯(lián)，導(dǎo)致細胞分裂增加，并影響癌發(fā)生和進展的其它方面， 包括血管生成、轉(zhuǎn)移擴散、和抑制細胞凋亡。EGFR-TK抑制劑可以選 擇性地靶向EGFR家族(EGFR(也稱為HERl或ErbB-1) 、 HER2/neu(也 稱為ErbB-2) 、 HER3(也稱為ErbB-3)或HER4 (也稱為ErbB-4))中的一 員，或者可以靶向其中的兩個或多個。適用于本發(fā)明的EGFR-TK抑制 劑包括gefitinib (IRESSA) ， erlotinib (TARCEVA) , CI-1033 (Pfizer) ， GW2016 (GlaxoSmi頻ine) ， EKB-569 (Wyeth)， PKI-166(Novartis) ， CP-724,714 (Pfizer), 和 BIBX-1382 (Boeringer-lngelheim)。其它EGFR-TK抑制劑在2001年6月18日 提交的美國專利申請?zhí)?9/883， 752中有所描述。除了 SU11248 (Sugen Inc. ， San Francisco, CA)以外，VEGF抑制劑也可以與抗體和CpG 0DN PF3512676組合聯(lián)合使用。VEGF抑制 劑描述在例如國際專利申請?zhí)朠CT/IB99/00797 (1999年5月3日提 交)、國際專利公開號WO 99/24440; WO 95/21613; WO 99/61422; WO 98/50356; WO 99/10349; W0 97/32856; W0 97/22596; W0 98/54093; W0 98/02438; W0 99/16755; W0 98/02437;美國專利號5,834,504; 5, 883, 113; 5， 886， 020;和5， 792， 783。在本發(fā)明中有用的一些特殊的 VEGF抑制劑的其它例子是IM862 (Cytranlnc. ， Kirkland， WA); IMC-lCll Imclone抗體，Genentech， Inc. ， SanFrancisco， CA的 抗-VEGF單克隆抗體；以及angiozyme，來自Ribozyme (Boulder， CO) 和Chiron (Emeryville, CA)的一種合成核酶。此外，ErbB2受體抑制劑，例如GW-282974 (Glaxo Wei 1 come pic), 和單克隆抗體AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc. ， Woodlands, TX)和2B-1 (Chiron),可以聯(lián)合抗體-CpG ODN PF3512676組合，例 如在國際專利公開號WO 98/02434; W0 99/35146; WO 99/35132; WO 98/02437; WO 97/13760; WO 95/19970;美國專利號5，587， 458，'和 5， 877， 305中描述的那些。在本發(fā)明中有用的ErbB2受體抑制劑還描 述在EP10W853 (在2000年8月23日公開)和國際專利公開第WO 00 / 44728號(2000年8月3日公開)。在前述PCT申請、美國專利、和 美國臨時申請中所述的erbB2受體抑制劑化合物和物質(zhì)、以及抑制 erbB2受體的其它化合物和物質(zhì)，可以與根據(jù)本發(fā)明的抗體一起使用。本發(fā)明的治療還可以與其它在治療異常細胞生長或癌癥中有用的 試劑一起使用，包括但不限于，能夠增強抗腫瘤免疫應(yīng)答的其它試劑， 例如其它的不同的CTLA4抗體、以及其它也能夠阻斷CTLA-4的試劑； 以及抗增殖劑，例如法呢基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑(例如，BMS 214662)， 和avP 3抑制劑例如cxvP 3抗體VITAXIN， ocvP5抑制劑，p53抑制 劑等。在將本發(fā)明的抗體與其它免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)合給藥時，免疫調(diào)節(jié)劑可 以選自例如樹突細胞激活劑，以及抗原呈遞的增強劑、T-細胞向性的 增強劑、腫瘤相關(guān)的免疫抑制因子的抑制劑，例如TGF-P (轉(zhuǎn)化生長因子P)和IL-IO。 IGF-1R抑制劑本發(fā)明包括下述方法，其包含CpGODNPF3512676與免疫療法(抗 -CTLA-4)的組合與其它試劑和療法進一步組合。也就是說，本領(lǐng)域技 術(shù)人員基于本文提供的公開內(nèi)容能明白，CpG ODN PF3512676療法和 抗-CTLA-4抗體聯(lián)合治療可以進一步與許多治療、手術(shù)、放射和其它 治療劑相組合，來治療患者。有許多治療劑，且已經(jīng)描述在例如，美國專利申請公開號 2004/0005318 ， 2003/0086930, 2002/0086014，和國際乂>開號W0 03/086459，它們都通過參考引用并入本文，以及其它。這樣的治療劑 包括、但不限于，拓樸異構(gòu)酶I抑制劑；其它抗體(美羅華，曲妥單 抗等)；化療劑例如、但不限于，imatinib (GLEEVEC，GLIVEC，或STI571; Novartis) ， sorafenib (BAY 43-9006; Bayer Pharmaceuticals Corp. /Onyx Pharmaceuticals)，受體酪氨酸激酶抑制劑，選擇性雌激 素受體調(diào)控劑(SERMs)，紫杉烷，長春花生物堿，替莫唑胺，血管發(fā)生 抑制劑，EGFR抑制劑，VEGF抑制劑，ErbB2受體抑制劑，抗增殖劑(例 如法呢基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑和ocvP 3抑制劑、otv0 5抑制劑、p53抑 制劑等)，免疫調(diào)控劑，細胞因子，腫瘤疫苗；腫瘤特異性抗原；樹突 細胞和干細胞療法；烷化劑，葉酸拮抗劑；嘧啶拮抗劑；蒽環(huán)類抗生 素；鉑化合物；共刺激分子(例如，CD4, CD25， PD-1， B7-H3, 4-lBB， 0X40， IC0S， CD30， HLA-DR， MHCII，和LFA)。放射療法放射療法可以與CpG 0DN PF3512676/抗-CTLA-4抗體聯(lián)合治療共 同施用。放射療法可以根據(jù)已知的用于治療乳腺癌的放射療法來進行。 用于放射療法的劑量和方案可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員輕易地確定，并 且是基于疾病的階段以及本領(lǐng)域已知的其它因素。治標劑本發(fā)明還包括，除了第一和第二成分外，在施用一種或多種這些 成分的同時或先后，施用其它治療劑。該治療劑包括鎮(zhèn)痛藥、癌癥疫苗、抗血管劑、抗增殖劑、止吐劑和止瀉劑。優(yōu)選的止吐劑包括鹽酸 昂丹司瓊、鹽酸格拉司瓊和甲氧氯普胺。優(yōu)選的止瀉劑包括地芬諾酯和阿托品(LOMOTIL)、洛哌丁胺(I醒ODIUM)和奧曲肽(SANDOSTATIN)。 基于干細胞的療法本文公開的抗體-CpG ODN PF3512676療法組合可以與干細胞移植 相組合，為癌癥患者提供治療益處。干細胞移植可以根據(jù)本領(lǐng)域已知 的方法進行。有些這樣的方法描述在 Appelbaum in Harrison's Principles of Internal Medicine, Chapter 14， Braunwald等， 編，第15版，McGraw-Hill Professional (2001),它通過參考引用 并入本文。因而，本發(fā)明的方法涉及已接受干細胞移植的哺乳動物中 的癌癥治療，該方法包括給哺乳動物施用一定量的人抗-CTLA-4抗體 與CpG ODN PF3512676組合，該抗體-CpG ODN PF3512676療法組合與 干細胞移植進一步組合，對治療癌癥有效。當所述方法包含千細胞移植時，可在哺乳動物的免疫系統(tǒng)已從移 植中恢復(fù)后，例如在移植后1至12個月的時間段，施用第一劑抗體-CpG ODNPF3512676治療試劑組合。在某些實施方案中，在移植后的1至3 個月、或1至4個月的時間段，施用第一劑?；颊呖山邮芨杉毎浦?和預(yù)備治療。本發(fā)明也涉及哺乳動物中的癌癥的治療方法，其包括步驟(i)在哺 乳動物中進行干細胞移植，和(ii)施用有效量的人抗-CTLA-4抗體與 有效量的CpG 0DN PF3512676組合。優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。干 細胞移植可以是同種異體干細胞移植或自體干細胞移植。此外，細胞 移植包括淋巴細胞從相同患者和/或HLA-匹配供體的過繼轉(zhuǎn)移。此外，本發(fā)明的方法可以與放射療法和干細胞移植相組合，以及 與本文所述的、本領(lǐng)域已知的或?qū)黹_發(fā)的任意治療的任意組合相組 合。如本文前面別處指出的，當抗-CTLA-4抗體與標準的癌癥治療(例 如，尤其是，化療方案)相組合時，可以減少施用的化療劑的劑量 (Mokyr， M.等Cancer Research 58: 5301-5304 (1998))。這是因為，本文公開的用于治療癌癥的抗-CTLA-4抗體和免疫增強核苷酸(例 如CpG ODN PF3512676 )的組合應(yīng)用，可以介導(dǎo)細胞死亡，或以其它 方式提供CTLA-4阻斷和核苷酸的TLR9激動作用之間的協(xié)同效應(yīng)。不 希望受任何特定理論的約束，被抗-CTLA-4抗體、CpGODNPF3512676、 或其組合增強或延長的免疫應(yīng)答介導(dǎo)的胂瘤細胞死亡，可能在抗原呈 遞途徑中產(chǎn)生增加水平的腫瘤特異性抗原，且抗-CTLA-4抗體會介導(dǎo) 對其增強的免疫應(yīng)答，從而CpG ODN PF3512676和抗體的共同施用會介導(dǎo)針對腫瘤抗原的免疫應(yīng)答的累加或協(xié)同的增加。可以通過腫瘤特 異性抗原的細胞死亡釋放導(dǎo)致與抗-CTLA-4-CpG ODN PF3512676協(xié)同增強免疫應(yīng)答的其它聯(lián)合治療是，放射，手術(shù)，化療，和施用本領(lǐng)域熟 知的和本文例示的多種抗腫瘤劑，以及其它。這些方案和本文別處所 述的其它方案中的每一種，會通過腫瘤細胞死亡(這可能將肺瘤抗原 供給宿主抗原呈遞途徑)，在宿主中建立腫瘤特異性抗原的來源。因 此，本文公開的聯(lián)合治療可以提供增加的肺瘤特異性抗原的來源，從 而提供增加的對肺瘤的免疫應(yīng)答，這又為患者提供治療益處。VI.給藥方案可調(diào)整給藥方案以提供最適合的想要的反應(yīng)。例如，可施用單次 推注，在一段時間可施用幾個分開的劑量，或可根據(jù)治療狀況的緊急 按比例減少或增加劑量。以劑量單位形式配制腸胃外施用的組合物以 方便施用和統(tǒng)一劑量是特別有利的。此處使用的劑量單位形式是指物 理上分開的單位，其適合作為用于被治療的哺乳動物受試者的單位劑 量；每一個單位含有經(jīng)計算可產(chǎn)生想要的治療效果的預(yù)先確定量的活 性化合物以及所需的藥物栽體。本發(fā)明的劑量單位的規(guī)格受制于并直 接依賴于(a)抗體的獨特性質(zhì)和要達到的特定治療性或預(yù)防性效果，和 (b)配制這種活性化合物用于治療個體內(nèi)的敏感性領(lǐng)域內(nèi)內(nèi)在的限制。因而，本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本文提供的公開內(nèi)容會明白，根據(jù)治 療領(lǐng)域眾所周知的方法可以調(diào)節(jié)劑量和給藥方案。也就是說，可以容 易地確立最大耐受劑量，也可以確定為患者提供可檢測的治療益處的有效量，正如可確定施用每種試劑來為患者提供可檢測的治療益處的 暫時需要。因此，盡管本文例示了某些劑量和給藥方案，這些實例絕 不限制在實踐本發(fā)明時可以為患者提供的劑量和給藥方案。此外，本 領(lǐng)域技術(shù)人員在獲知本文提供的教導(dǎo)后會明白，通過本領(lǐng)域已知的評 判癌癥治療效能的多種方法，和本文包括的這些方法，以及將來開發(fā) 的方法，可以評判治療益處，例如、但不限于，可檢測的肺瘤大小和/ 或轉(zhuǎn)移的減少，和復(fù)發(fā)時間的增加，以及許多其它參數(shù)。要注意的是，劑量值可根據(jù)待緩和的病癥的類型和嚴重性來變化， 并且可包括單一或多個劑量?？梢赃M一步理解，對于任何特定受試者， 應(yīng)該根據(jù)個體所需和施用或監(jiān)督該組合物給藥的人的專業(yè)判斷來隨著 時間調(diào)整具體的給藥方案，這里所列的劑量范圍只是用于示例，而并 非要限制要求保護的組合物的范圍或?qū)嵤?。例如，可以基于藥代動?學(xué)的或藥效學(xué)的參數(shù)來調(diào)節(jié)劑量，這可以包括臨床效應(yīng)，例如毒性效 應(yīng)和/或?qū)嶒炇抑怠Ｒ蚨?，本發(fā)明包括患者內(nèi)的劑量增加，如本領(lǐng)域技 術(shù)人員所確定的。確定抗體的適宜劑量和給藥方案，是相關(guān)領(lǐng)域眾所 周知的，且本領(lǐng)域技術(shù)人員在獲知本文公開的教導(dǎo)后可以理解。0DN給藥根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的標準給藥方案，可以施用CpG 0DN PF3512676。用于粘膜或局部遞送的CpG 0DN PF3512676施用劑量通常 是約1 ng-100 mg/給藥，這取決于應(yīng)用可每天、每周或每月給予， 和其間的任何其它時間量。更典型地，粘膜或局部劑量范圍是約100 Mg-50mg/給藥，最典型約1-10mg，施用2-4次，間隔數(shù)天或數(shù)周。用于誘導(dǎo)全身免疫應(yīng)答目的的腸胃外遞送的本文所述化合物的施 用劑量可典型地是有效粘膜劑量的2-1， 000倍，更典型地2-100倍， 最典型地5-50倍。當與其它治療劑(例如本發(fā)明的抗體)組合施用CpG ODN PF3512676時，或在專門的遞送栽體中時，用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的腸胃 外(包括皮下)遞送的CpGODNPF3512676的劑量范圍通常是約10 p g-1000 mg/給藥，這取決于應(yīng)用可每天、每周或每月給予，和其間的任何其它時間量。更典型地，用于這些目的的腸胃外劑量范圍是約1-500 mg/給藥，最典型約5-100mg，施用2-4次，間隔數(shù)天或數(shù)周。 但是，在有些實施方案中，可以以上述典型劑量的5-10， OOO倍的范圍， 使用用于這些目的的腸胃外劑量。在有些實施方案中，以共IO-40mg的量，每周施用ODN—次?？?以以每次5或10 mg的劑量施用ODN，從而導(dǎo)致多次推注或注射，這 取決于要施用的總量。例如，如果要施用的總量是10 mg，這可以通 過例如2 x 5 mg注射劑量來施用。作為另一個實例，如果要施用的 總量是40 mg，這可以通過例如4 x 10 mg注射劑量來施用?？贵w給藥根據(jù)本發(fā)明施用的抗體的治療有效量的示例性非限制性范圍是， 至少約0. lmg/kg，至少約0. 3mg/kg，至少約lmg/kg，至少約5mg/kg, 至少約6mg/kg，至少約10mg/kg，至少約15mg/kg，至少約20mg/kg， 至少約30 mg/kg，或至少約50 mg/kg。例如，抗體的治療有效量范圍 可以是約0， 1-30 mg/kg，或例如約0. 3-25 mg/kg，或例如約1-20 mg/kg: 或例如約3-20 mg/kg，或例如約5-20 mg/kg，或例如約10-20 mg/kg， 或約3-15 mg/kg，或約5-15 mg/kg，或約10-15 mg/kg。在另一個實施方案中，抗體的施用劑量是至少0. 3mg/kg，優(yōu)選 至少1 mg/kg，更優(yōu)選至少3 mg/kg，更優(yōu)選至少5 mg/kg，優(yōu)選至少 6mg/kg,更優(yōu)選至少10 mg/kg，更優(yōu)選至少15 mg/kg，和更優(yōu)選至少 20 mg/kg。此外，通過靜脈內(nèi)輸注施用的抗體的劑量范圍是約0.1mg/kg-50 mg/kg，更優(yōu)選約0. 3 mg/kg-20 mg/kg，更優(yōu)選約1 mg/kg-15 mg/kg、 更優(yōu)選約3 mg/kg-15 mg/kg，更優(yōu)選約6 mg/kg-15 mg/kg。在一個 實施方案中，以作為無菌水溶液的靜脈內(nèi)制劑施用抗體，所述溶液含 有在適當緩沖系統(tǒng)中的約5-20 mg/ml抗體。此外，示例性的劑量增加方案可以用于確定最大耐受劑量(MTD), 評判與施用抗體-CpG ODN PF3512676聯(lián)合治療有關(guān)的劑量限制毒性 (DLT)(如果存在)等，其包含施用遞增的劑量，例如、但不限于約0.1 mg/kg， 0.3 mg/kg， 1 mg/kg， 3 mg/kg， 6 mg/kg， 7 mg/kg， 10 mg/kg， 12 mg/kg， 15 mg/kg，或超過15 mg/kg，或其任意組合，更優(yōu) 選地，施用0. 1 mg/kg， 0. 3 mg/kg， 1 mg/kg， 3 mg/kg， 6 mg/kg， 10mg/kg， 15mg/kg或20mg/kg的連續(xù)劑量，并評判患者的毒性(如 果存在)，以及治療效力，以及其它參數(shù)。這樣的測定劑量方案的毒 性和效能的研究是本領(lǐng)域眾所周知的。 施用時間CpG ODN PF3512676可以與本發(fā)明的抗-CTLA-4抗體基本上同時 或先后施用。當同時施用時，ODN和抗體可以在相同或分開的制劑中， 盡管它們在同時施用。術(shù)語"基本上同時"是指，化合物在彼此相隔數(shù) 分鐘內(nèi)施用(例如，彼此相隔1Q分鐘內(nèi))，且意在包括間斷給藥和連 續(xù)給藥，但是如果連續(xù)給藥，間隔時間僅僅是短時間段(例如，醫(yī)學(xué)從 業(yè)人員分別施用2種化合物所需的時間)。本文使用的同時施用和基本 上同時施用可互換使用。先后施用指在時間上分開施用ODN和抗體。 施用這些化合物之間的時間間隔有意地長于彼此緊接著、沒有故意延 遲地分別施用2種藥物所需的時間。因而，共同施用包括施用抗體和 CpG ODN PF3512676的任意時間組合，使得二者的施用會介導(dǎo)對患者 的治療益處，它可檢測地大于在沒有另一種試劑的情況下施用任一種 試劑。CpGODN可以在施用抗體之前、同時或之后(或其任意組合)施用， 反之亦然。CpGODN可以每天(包括每天施用一次或多次)、隔天、每3 天、每4天、每5天、每6天、或每周、每月、每2個月、每3個月、 每4個月、每5個月、每6個月、或每年施用。抗體可以每天、隔天、 每3天、每4天、每5天、每6天、每周、每2周、每月、或每20 天、每25天、每28天、每30天、每40天、每50天、每2個月、每 70天、每80天、每3個月、每6個月、或每年施用?？梢允┯脝蝹€ 劑量或多個劑量的抗體?；蛘?，可以施用至少一個劑量、或至少3、 6、 或12個劑量。例如可以施用多個劑量。ODN和抗體的施用可以交替。在一個實施方案中，部分劑量通過靜脈推注給藥，剩余的通過抗體制劑的輸注給藥。例如，抗體的靜脈內(nèi)注射可以以推注實現(xiàn)，剩余 的預(yù)定抗體劑量可以通過靜脈內(nèi)注射給藥。預(yù)定劑量的抗體可以在例如約1.5小時至約5小時的期間內(nèi)給藥。在一個實施方案中，CpG 0DN PF3512676和抗體共同施用，其中 CpG 0DN PF3512676以本文所述的劑量施用，優(yōu)選腸胃外(例如，通過 皮下或靜脈內(nèi)途徑)。在另一個實施方案中，首先施用抗-CTLA-4抗體 來阻斷會限制CpG 0DN的效能的抑制作用。在該實施方案中，抗-CTLA-4 抗體的給藥優(yōu)選地在CpG ODN之前1周-1天，最優(yōu)選在CpG ODN之前 2-3天。在另一個實施方案中，首先施用CpG ODN來引發(fā)免疫系統(tǒng)，以具 有對抗-CTLA-4抗體和任意其它免疫療法或可與其聯(lián)合施用的其它療 法(例如，肺瘤疫苗等)更好的免疫激活應(yīng)答。在該實施方案中，CpG ODN 的給藥優(yōu)選地在抗-CTLA-4抗體之前1周-1天，最優(yōu)選在抗-CTLA-4 抗體之前2-3天。盡管在施用CpG ODN PF3512676和抗-CTLA-4抗體之間可以使用 任意合適的靜止期，本發(fā)明不需要等待期，抗體和CpGODNPF3512676 可以基本上同時地共同施用。因而，在一個實施方案中，抗體作為單 次注射來施用，CpGODNPF3512676在抗體之前或之后約1-7天施用。在多天或多周周期中，抗體或抗體片段可以與CpGODNPF3512676 一起施用。多天周期是2， 3， 4， 5, 6， 7， 8， 9， IO或更多天的周期， 或2, 3, 4或更多周的周期?？贵w或其片段可以在這樣的周期的首日 施用，隨后在多周周期的每周的首日施用CpG ODN PF3512676。例如， CpGODNPF3512676可以在3周周期的第1， 7和14天施用。3周周期 可以重復(fù)l、 2、 3次或更多次。在整個治療之前，可以施用單獨的ODN 或抗體，例如用于引發(fā)免疫系統(tǒng)或使受試者對隨后的治療更有反應(yīng)。如通過本領(lǐng)域公知的方法所確定的，可以提供額外周期的抗體和 CpG ODN PF3512676。但是，本發(fā)明不限于施用CpG ODN PF3512676 與抗-CTLA-4抗體組合的這些或任何特定劑量或給藥方案。相反，相 關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員使用眾所周知的方法，可以容易地確定施用抗體和CpG 0DN PF3512676的最佳劑量、途徑和方案?？贵w-CpG 0DN PF3512676組合可以作為新輔助療法，在手術(shù)、放 療或任何其它治療之前施用，以便敏化腫瘤細胞或以其它方式賦予患 者治療益處。另外，該組合可以作為新輔助療法在局部治療(例如，手 術(shù)，放射，或二者)后共同施用。此外，該組合可以作為二線療法來施用，例如、但不限于， 一旦 任意一線療法已經(jīng)失敗?；蛘撸摻M合可以與一線療法同時施用，和 或在一線療法期間的任意點，其可以在初始治療后施用。這是因為， 一旦一線療法已經(jīng)失敗， 一旦全身性的輔助療法已經(jīng) 失敗等，抗-CTLA-4抗體和CpG 0DN PF3512676的組合可以提供治療 益處。因而，本發(fā)明包括聯(lián)合施用抗體和CpG 0DN PF3512676，含或 不含其它療法，包括、但不限于，激素(例如，抗雄激素，芳香酶抑制 劑，等)，放療，和任意其它治療劑(化療，信號抑制療法，以及其它) 等，本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本文提供的公開內(nèi)容會明白。VII.藥物組合物本發(fā)明也涉及制品(例如適合靜脈內(nèi)施用的劑型)，其包含對治 療癌癥有效量(例如，至少1 mg/kg,至少3 mg/kg，至少5 mg/kg， 至少10 mg/kg，至少15 mg/kg,或至少20 mg/kg)的人抗-CTLA-4抗 體和治療有效量的CpG 0DN PF3512676。在某些實施方案中，制品包 含裝栽人抗-CTLA-4抗體、CpG 0DN PF3512676的一個或多個容器和 用于治療癌癥的標簽和/或說明書。本發(fā)明包括制備和使用如下藥物組合物，其包括本發(fā)明的人抗 -CTLA-4抗體作為活性成分，并聯(lián)合或不聯(lián)合CpG 0DN PF3512676。 該藥物組合物可以由單獨的每種活性成分組成，作為至少一種活性成 分的組合(例如，有效劑量的抗-CTLA-4、有效劑量的CpG 0DN PF3512676)，以適合患者給藥的形式，或者該藥物組合物可含有活性 成分和一種或多種藥學(xué)可接受的載體、 一種或多種附加(活性和/或非 活性)成分、或其某些組合。CpG 0DN PF3512676可以直接施用給受試者，或可以與核酸遞送 復(fù)合物聯(lián)合施用。核酸遞送復(fù)合物是指與靶向工具(例如導(dǎo)致更高的結(jié) 合乾細胞的親和力的分子)結(jié)合的(例如離子地或共價地結(jié)合；或包裹 在其中)核酸分子。核酸遞送復(fù)合物的實例包括與甾醇(例如膽固醇)、 脂質(zhì)(例如陽離子脂質(zhì)，病毒顆粒或脂質(zhì)體)、或靶細胞特異性結(jié)合刑 (例如由靶細胞特異性受體識別的配體)結(jié)合的寡核苷酸。優(yōu)選的復(fù)合 物在體內(nèi)足夠穩(wěn)定，以防止在被乾細胞內(nèi)化之前顯著的解偶聯(lián)。但是， 復(fù)合物可以在適當條件下在細胞內(nèi)切割，使核酸以功能形式釋放。已經(jīng)描述了用于將抗原和寡核苷酸遞送至表面的遞送栽體或遞送 裝置。CpG 0DN PF3512676和/或抗原和/或其它治療劑可以單獨施用 (例如，在鹽水或緩沖液中)，或使用本領(lǐng)域已知的任意遞送栽體。例 如，已經(jīng)描述了下述遞送栽體Cochleates; Emulsomes， ISC0M;脂 質(zhì)體；活細菌栽體(例如，沙門氏菌，大腸桿菌，Bacillus cal邁atte-guerin,志賀氏菌，乳桿菌)；活病毒栽體(例如，痘苗病 毒，腺病毒，單純皰滲)；微球；寡核苷酸疫苗；聚合物；聚合物環(huán)； 蛋白體；氟化鈉；轉(zhuǎn)基因植物；病毒顆粒；病毒樣顆粒，和陽離子脂 質(zhì)，肽，或與多陰離子寡核苷酸具有電荷相互作用的其它載體。其它遞 送載體是本領(lǐng)域已知的，有些其它實例在下面載體的討論中提供。在一個實施方案中，腸胃外(例如，靜脈內(nèi))施用在含水溶液中的 抗體，而通過皮下注射施用CpG 0DN PF3512676。 CpG 0DN PF3512676 的優(yōu)選制劑和劑型描述在美國專利申請公開號US2004/0198680，它的 公開內(nèi)容整體通過參考引用并入本文。但是，基于本文提供的公開內(nèi) 容，技術(shù)人員可以理解本發(fā)明不限于這些或任何其它制劑、劑量、給 藥途徑等。相反，本發(fā)明包括施用抗體與CpG 0DN PF3512676組合的 任何制劑或方法，包括但不限于，經(jīng)過不同的給藥途徑分別以不同制 劑分開施用每種活性劑，例如，靜脈內(nèi)施用抗-CTLA-4抗體，同時皮 下共同施用CpG 0DN PF3512676,以及其它。因此，接下來的討論描 述了各種不同的制劑，用于實施本發(fā)明的方法，包括聯(lián)合CpG 0DN PF3512676的任意抗-CTLA-4抗體的給藥，但是本發(fā)明不限于這些制劑，而是包括本領(lǐng)域技術(shù)人員在具有本文所提供的用于本發(fā)明的方法 的教導(dǎo)后能輕易確定的任何制劑?？蓪⒂糜诒景l(fā)明的抗體摻入適合施用給受試者的藥物組合物中。一般地，該藥物組合物包含抗體和藥學(xué)可接受的載體。如此處所用的， "藥學(xué)可接受的載體"包括生理學(xué)上相容的任何和所有溶劑、分散介 質(zhì)、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。藥學(xué)可接 受的栽體的例子包括水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、葡萄糖、海藻糖、 甘油、乙醇等中的一種或多種及其組合。在許多情況下，優(yōu)選地在組 合物中包含等滲劑，例如，糖類、多元醇例如甘露糖醇、山梨醇或氯 化鈉。藥學(xué)可接受的物質(zhì)例如潤濕劑或少量輔助物質(zhì)例如潤濕劑或乳 化劑、防腐劑或緩沖劑，會增加抗體或抗體部分的保質(zhì)期或效力。所述抗體可以各種形式存在。這些形式包括，例如，液體、半固 體和固體劑型，例如液體溶液(例如，可注射和可輸注的溶液)、分 散體或懸浮物、片劑、丸劑、粉劑、脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選的形式依賴 于想要的施用和治療應(yīng)用模式。 一般優(yōu)選的組合物以可注射的或可輸 注的溶液的形式存在，例如和用于利用其它抗體進行的人被動免疫的 組合物相似的組合物。優(yōu)選的施用模式是腸胃外(例如，靜脈內(nèi)、皮 下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi))模式。在優(yōu)選的實施方案中，通過靜脈內(nèi)輸注或注 射施用抗體。在其它優(yōu)選的實施方案中，通過肌內(nèi)或皮下注射施用抗 體。在生產(chǎn)和貯存條件下，治療性組合物一般必須是無菌的和穩(wěn)定的。 可將組合物配制為溶液、微乳、分散體、脂質(zhì)體或其它適合高藥物濃 度的有序結(jié)構(gòu)?？赏ㄟ^將抗體以所需要的量摻入具有上面例舉的成分 之一或其組合的合適溶劑中，如所要求的，然后進行過濾滅菌來制備 無菌的可注射溶液。 一般地，通過將活性化合物摻入無菌載體中來制 備分散體，所述載體包含基本的分散介質(zhì)和所需要的來自上述成分的 其它成分。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉劑的情況下，優(yōu)選的 制備方法是真空干燥和冷凍干燥，由事先無菌過濾的溶液產(chǎn)生活性成 分加上任何額外的所需成分的粉末。可通過例如使用包衣例如卵磷脂，在分散體的情況下通過保持所要求的顆粒大小以及通過使用表面活性 劑來保持溶液的合適的流動性?？赏ㄟ^將延遲吸收的試劑例如單硬脂 酸鹽或明膠包括入組合物中帶來可注射組合物的延長吸收?？赏ㄟ^各種本領(lǐng)域已知的方法施用抗體和/或CpG ODN PF3512676，所述方法包括，但不限于，口服、腸胃外、粘膜、經(jīng)吸入、 局部、口含、鼻和直腸。對于許多治療性應(yīng)用，優(yōu)選的施用途徑/模式 是經(jīng)皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或輸注。如果需要，可使用無針注射。如本 領(lǐng)域技術(shù)人員所意識到的，施用的途徑和/或模式將依所想要的結(jié)果而 發(fā)生變化?？烧{(diào)整給藥方案以提供最適合的想要的反應(yīng)。例如，可施用單次 推注，在一段時間可施用幾個分開的劑量，或可根據(jù)治療狀況的緊急 按比例減少或增加劑量。以劑量單位形式配制腸胃外施用的組合物以 方便施用和統(tǒng)一劑量是特別有利的。此處使用的劑量單位形式是指物 理上分開的單位，其適合作為用于被治療的哺乳動物受試者的單位劑 量；每一個單位含有經(jīng)計算可產(chǎn)生想要的治療效果的預(yù)先確定量的活 性化合物以及所需的藥物載體。本發(fā)明的劑量單位的規(guī)格受制于并直 接依賴于(a)抗體的獨特性質(zhì)和要達到的特定治療性或預(yù)防性效果，和 (b)配制這種活性化合物用于治療個體內(nèi)的敏感性領(lǐng)域內(nèi)內(nèi)在的限制。要注意的是，劑量值可根據(jù)待緩和的病癥的類型和嚴重性來變化， 并且可包括單一或多個劑量?？梢赃M一步理解，對于任何特定受試者， 應(yīng)該根據(jù)個體所需和施用或監(jiān)督該組合物給藥的人的專業(yè)判斷來隨著 時間調(diào)整具體的給藥方案，這里所列的劑量范圍只是用于示例，而并 非要限制要求保護的組合物的范圍或?qū)嵤Ｔ谝粋€實施方案中，抗體作為含有5或10 mg/ml抗體、以及乙 酸鈉、聚山梨酯80和氯化鈉的無菌水溶液(pH范圍在大約5至6)，以 靜脈內(nèi)制劑的形式給藥。優(yōu)選地，靜脈內(nèi)制劑是含有5或10mg/ml 抗體、以及20mM乙酸鈉、0. 2mg/ml聚山梨酯80和140mM氯化鈉的 無菌水溶液(pH為5.5)。在一個實施方案中，部分劑量通過靜脈內(nèi)推注給藥，剩余的通過抗體制劑的輸注給藥。例如，0. Olmg/kg抗體靜脈注射可以以推注實 現(xiàn)，剩余的預(yù)定抗體劑量可以通過靜脈注射給藥。預(yù)定劑量的抗體可 以在例如1. 5小時至2小時至5小時的期間內(nèi)給藥。本文所描述的藥物組合物的制劑可以通過藥學(xué)領(lǐng)域己知或以后將 開發(fā)的方法來制備。通常，該制備方法包括如下步驟將活性成分加 入栽體或一種或多種其它助劑，隨后，如果需要或希望，將產(chǎn)品定型 或包裝成為希望的單一或多劑量單位。本發(fā)明的藥物組合物可以作為單一單位劑量、或作為多個單一單 位劑量制備、包裝或銷售。如此處所使用的，"單位劑量，，是含有預(yù) 定量的活性成分的藥物組合物的離散量。活性成分的量通常相當于要 給予受治療者的活性成分的劑量或該劑量的適宜部分，例如，該劑量 的一半或三分之一。本發(fā)明的藥物組合物中的活性成分、藥學(xué)可接受的載體和任何附 加成分的相對量，根據(jù)要治療的受治療者的身份、大小和病癥而變化， 并進一步根據(jù)組合物的給藥途徑而變化。作為例子，該組合物可含有 介于0.1 %到100% (w/w)的活性成分。除了活性成分之外，本發(fā)明的藥物組合物可以進一步含有一種或 多種其它的藥物活性劑。特別預(yù)期的附加活性劑包括止吐劑、止瀉劑、 化療劑、細胞因子等。本發(fā)明的藥物組合物的控釋或持續(xù)釋放制劑可以使用傳統(tǒng)技術(shù)來 制備。如本文所使用的，藥物組合物的"胃腸外給藥"包括以下任何給 藥途徑，其特征在于物理地突破受治療者的組織，并將藥物組合物 經(jīng)過組織的破口給藥。因此胃腸外給藥包括但不限于，藥物組合物通 過注射組合物、通過手術(shù)切口應(yīng)用組合物、通過穿透組織的非手術(shù)傷 口應(yīng)用組合物等的給藥。特別地，預(yù)計胃腸外給藥包括但不限于，皮 下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、胸骨內(nèi)注射、以及腎透析輸注技術(shù)。適合胃腸外給藥的藥物組合物的制劑，包含活性成分與藥學(xué)上可 接受的載體組合，例如無菌水或無菌等滲鹽水。這樣的制劑可以以適合推注給藥或連續(xù)給藥的形式來制備、包裝或銷售。注射制劑可以單 位劑量形式制備、包裝或銷售，例如在安瓿中或在含有防腐劑的多劑 量容器中。用于胃腸外給藥的制劑包括但不限于，懸液、溶液、在油 性或水性媒介中的乳液、糊劑、以及可植入的持續(xù)釋放或生物可降解 的制劑，如下所討論的。這類制劑可進一步含有一種或多種附加成分， 包括但不限于助懸劑、穩(wěn)定劑或分散劑。在胃腸外給藥的制劑的一個 實施方案中，在重配組合物的胃腸外給藥之前，活性成分以干(即，粉 末或顆粒)形式提供，以與合適的媒介(例如，無菌無熱原水)進行重配。 本發(fā)明的組合物可以通過本領(lǐng)域已知的各種方法給藥。給藥的途 徑和/或模式取決于預(yù)期的結(jié)果而變化。活性化合物可以與保護化合 物防止快速釋放的載體一起制備，例如控釋制劑，包括植入劑、透皮 貼劑、和微嚢化遞送系統(tǒng)。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合 物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。許多關(guān)于這類制劑的制備方法描述在，例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed.， Marcel Dekker， Inc., New York, (1978)。藥物組合物優(yōu)選在GMP 條件下生產(chǎn)。藥物組合物可以以無菌可注射水性或油性懸液或溶液的形式制 備、包裝或銷售。該懸液或溶液可以根據(jù)已知技術(shù)來配制，并且可含 有除了活性成分之外的添加成分，例如本文所述的分散劑、潤濕劑或 懸浮劑。該無菌注射制劑可以使用無毒的胃腸外可接受的稀釋劑或溶 劑例如水或1， 3-丁二醇來制備。其它可接受的稀釋劑和溶劑包括但 不限于，林格氏溶液、等滲氯化鈉溶液、和例如合成的單酸或二酸甘 油酯的不揮發(fā)性油。其它有用的胃腸外給藥的制劑包括如下制劑其 含有微晶形式、脂質(zhì)體制劑形式的活性成分，或作為生物可降解聚合 物系統(tǒng)的成分。用于持續(xù)釋放或植入的組合物可以含有藥學(xué)上可接受 的聚合性或疏水性材料，例如乳液、離子交換樹脂、微溶聚合物、或 微溶鹽。本發(fā)明的抗-CTLA-4抗體/CpG 0DN PF3512676活性成分組合可以施用給動物，優(yōu)選人。施用的每種活性成分的準確劑量根據(jù)許多因素 而變化，包括但不限于，動物的類型和要治療的疾病狀態(tài)的類型、動 物的年齡和給藥途徑。本發(fā)明的抗體-CpG 0DN PF3512676組合可以與多種其它化合物(尤其是抗激素治療劑、細胞因子、化療和/或抗病毒藥物)共同給藥。 或者，化合物可以在抗體-CpGODNPF3512676組合之前一小時、 一天、一周、 一月或甚至更長時間給藥，或其任意排列。而且，化合物可以 在給予放射、干細胞移植、或給予任何治療劑(例如細胞因子、化療化 合物等)之后一小時、 一天、 一周、 一月或甚至更長時間給藥，或其任 意排列。頻率和給藥方案對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見，并且取 決于許多因素，例如但不限于，要治療的疾病的類型和嚴重程度、動 物的年齡和健康狀況、要給予的化合物的特性、不同化合物的給藥途 徑等。提供了展示共同施用抗體-CpG 0DN PF3512676來治療癌癥的方 法的幾個有教益的實施例，但是本發(fā)明絕不限于這些實施例，它們僅 僅用于解釋本發(fā)明包括的方法。VIII.藥盒本發(fā)明包括各種用于治療癌癥的藥盒，所述藥盒包括治療有效量 的本發(fā)明的人抗-CTLA-4抗體和治療有效量的CpG ODN PF3512676， 以及施藥器和指導(dǎo)材料，該指導(dǎo)材料描述了該組合實現(xiàn)本發(fā)明方法的 應(yīng)用。盡管在下文描述了示例性的藥盒，根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，其 它有用的藥盒的內(nèi)容物對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。這些藥盒 中的每一種均包括在本發(fā)明內(nèi)。木發(fā)明包括用于治療有此需要的患者的腎細胞癌的藥盒。該藥盒 包括本發(fā)明的人抗-CTLA-4抗體和CpG ODN PF3512676。該藥盒還包 括施藥器，包括但不限于注射器，用于將藥盒的成分給予患者。而且， 該藥盒含有指導(dǎo)材料，其列出關(guān)于應(yīng)用該藥盒治療患者的乳腺癌的有 關(guān)信息。更優(yōu)選地，該藥盒包括至少一種抗-CTLA-4抗體，其選自4.1.1，4.8.1， 4.10.2， 4.13.1， 4.14.3， 6.1.1， 11.2.1, 11.6.1， 11.7.1， 12.3.1.1， 12. 9. 1. l，和MDX-010，更優(yōu)選地，抗體是4. 13.1, 11.2.1， 和MDX-OIO。本發(fā)明包括，含有抗-CTLA-4抗體和CpG 0DN PF3512676的任意 組合的藥盒。盡管這樣的藥盒是優(yōu)選的，本發(fā)明不限于該特定組合。 此外，所述藥盒可以包含許多用于治療癌癥的其它試劑。這樣的試劑 如前面所述，包括化療化合物，癌癥疫苗，除了 CpG 0DN PF3512676 以外的TLR激動劑，其它CpG ODN，受體酪氨酸激酶抑制劑(例如、 但不限于，SU11248)，用于治療異常細胞生長或癌癥的試劑，通過結(jié) 合IGF-1R來抑制胂瘤生長的抗體或其它配體，化療劑(紫杉烷，長春 花生物堿，鉑化合物，嵌入抗生素，以及其它)，和細胞因子，以及其 它，以及用于治療例如在治療過程中產(chǎn)生的任意毒性的治標劑，例如、 但不限于，止瀉劑，止吐劑，等。通過參考以下實驗實施例來進一步詳細描述本發(fā)明。這些實施例 僅僅用于解釋目的，不是用于限制，除非另有說明。因此，本發(fā)明決 不能被解釋為限于以下實施例，而應(yīng)被解釋為包括從本文所提供的教 導(dǎo)而顯而易見的任何和所有變化。實施例1:抗-CTLA-4抗體與CpG 0DN PF3512676組合用于治療乳腺癌 在手術(shù)/放療(如果存在)后，按照確立的方案，給至少一個病損 可通過常規(guī)CT掃描或螺旋CT掃描精確地二維測量的患有轉(zhuǎn)移性乳腺 癌的患者施用CpG 0DN PF3512676。簡而言之，以0. 02-20 mg/kg， 最優(yōu)選皮下約0.2 mg/kg和靜脈內(nèi)2 mg/kg的劑量，皮下或靜脈內(nèi)施 用CpG 0DN PF3512676。在CpG ODN PF3512676治療之前7天或之后7天之間，以約10 mg/kg的劑量，另外給患者施用單次靜脈內(nèi)輸注(100mL/小時)本文所 述的抗-CTLA-4抗體11. 2. 1。28天后重復(fù)抗體治療，不升高抗-CTLA-4 抗體劑量，此后在沒有不可耐受的毒性或疾病進展的情況下，每28天重復(fù)一次，最多12個循環(huán)。在輸注抗-CTLA-4之前至少1.5小時，可給患者預(yù)先給藥抗組胺 藥(H1)。但是，盡管可以施用預(yù)先給藥，優(yōu)選地，通常不對患者預(yù)先 治療。更優(yōu)選地，給經(jīng)歷輸注反應(yīng)的患者施用抗組胺藥(Hl)和/或其它 治療措施。在治療過程中和之后，在適當時給予止吐劑和止瀉劑以及其它治 標療法。根據(jù)所確定的，與人抗-CTLA-4抗體11.2.1先后或同時施用CpG 0DN PF3512676 —次或反復(fù)多次?？?CTLA-4抗體提供在帶有橡膠塞子和鋁封的10ml透明玻璃小 瓶內(nèi)。每個小瓶含有5mg/ml(標稱裝量為50mg/小瓶)抗-CTLA-4抗 體的無菌水溶液，所述水溶液含有20 mM乙酸鈉、0. 2mg/ml聚山梨 酯80、和140mM氯化鈉，pH 5.5。CpG ODN PF3512676以多種不同濃度提供在藥學(xué)可接受的無菌的 無防腐劑的磷酸鹽緩沖鹽水溶液中，用于腸胃外給藥。如臨床上要求的那樣，對于所有患者，在給藥前評估ECOG性能狀 態(tài)、生命體征以及體重，用藥后可以重復(fù)評估生命體征。在第一天進 行身體檢查(包括眼科評估和自身免疫體征)。獲得用于血液學(xué)板(血細 胞比容、RBC計數(shù)、WBC計數(shù)、分類)、化學(xué)(堿性磷酸酶、鈣、氯、GGT、 LDH、鎂、磷、隨機葡萄糖、鈉、尿素、尿酸)、尿分析(血、蛋白)、 其它(活化部分凝血激酶時間[APTT]、凝血酶原時間(PT)、自身抗體板、 C反應(yīng)蛋白、TSH、 T3、 T4、淀粉酶、脂肪酶、血清C3、 C4、血清Ig 水平)的樣品。測定人抗-人抗體(HAHA)滴度基線，并在用藥前獲得藥代動力學(xué) (PK)標本。測量下列端點PK參數(shù)、HAHA、反應(yīng)速率和進展時間。進展時間 和總的生存率用Kaplan-Meier乘積極限法計算。等同方案盡管本發(fā)明參照特定的實施方案被公開，但4艮明顯，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可設(shè)計本發(fā)明的其它實施方案和變化，而不背離本發(fā)明的真實實 質(zhì)和范圍。所附的權(quán)利要求應(yīng)當理解為包括所有這些實施方案和等同 的變化。本文引用的每篇專利、專利申請和公開出版物的公開內(nèi)容，整體 通過參考引用并入本文。
權(quán)利要求
1. 治療需要這樣的治療的患者的癌癥的方法，所述方法包括，給所述患者施用治療有效量的抗-CTLA-4抗體或其抗原結(jié)合部分，與治療有效量的CpG ODN PF3512676相組合。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中每天、隔天、每周2次或每周1次施 用所述CpG 0DN PF3512676。
3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述治療是選自下述的療法新 輔助療法，輔助療法， 一線療法，二線療法，和三線療法。
4. 權(quán)利要求1， 2或3的方法，其中所述人抗-CTLA-4抗體的所 述治療有效量范圍是約0.1 mg/kg-50 mg/kg。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中所述人抗-CTLA-4抗體的所述治療有 效量范圍是約0. 3 mg/kg-20 mg/kg。
6，權(quán)利要求5的方法，其中所述人抗-CTLA-4抗體的所述治療 有效量選自至少1 mg/kg，至少3mg/kg，至少6mg/kg，至少10mg/kg， 和至少15 mg/kg。
7. 權(quán)利要求1-5或6的方法，其中所述癌癥選自乳腺癌，前列 腺癌，卵巢癌，胰腺癌，黑素瘤，肺癌，急性髄細胞白血病，結(jié)腸直 腸癌，腎細胞癌，皮膚T-細胞淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，胃癌，頭頸 部癌，肝癌，子宮頸癌，腦癌，和肉瘤。
8. 權(quán)利要求1-6或7的方法，其中所述抗-CTLA-4抗體或其抗 原結(jié)合部分是選自下述的至少一種抗體(a) 具有約10—8或更大的對CTLA-4的結(jié)合親和力的人抗體，且其 會抑制CTLA-4與B7-l之間的結(jié)合和CTLA-4與B7-2之間的結(jié)合；(b) 具有包括至少一種人CDR序列的氨基酸序列的人抗體，所述 人CDR序列對應(yīng)源自選自以下的抗體的CDR序列4.1.1， 4.8.1， 4. 10. 2， 4. 13. 1， 4. 14. 3， 6. 1. 1， 11. 2. 1， 11. 6. 1， 11. 7. 1， 12. 3. 1. 1， 12. 9. 1. l，和10D1;(c) 具有選自4.1.1， 4.8.1， 4,10.2， 4.13.1， 4.14.3， 6.1.1，11.2.1, 11.6.1, 11.7.1， 12.3.1.1， 12. 9. 1. l，和10D1的抗體的重 鏈和輕鏈的氨基酸序列的人抗體；(d) 抗體或其抗原結(jié)合部分，其與至少一種具有選自4.1.1， 4.8.1， 4.10.2， 4.13.1， 4.14.3， 6.1.1， 11.2.1, 11.6.1， 11,7.1， 12.3.1.1， 12. 9.1.1，和10D1的抗體的氨基酸序列的抗體竟爭結(jié)合 CTLA-4;和(e) 抗體或其抗原結(jié)合部分，其與至少一種具有選自4.1.1， 4.8,1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3， 6.1.1, 11.2.1， 11.6.1， 11.7.1， 12. 3. 1. 1， 12. 9. 1. l，和10D1的抗體的氨基酸序列的抗體交叉竟爭結(jié) 合CTLA-4。
9. 權(quán)利要求l-7或8的方法，其中所述抗體是具有選自4. 1. 1， 4. 13. 1, 11. 2. l，和10D1的抗體的氨基酸序列的人抗體。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含重 鏈和輕鏈，其中所述重鏈的重鏈可變域和所述輕鏈的輕鏈可變域的氨 基酸序列選自(a) SEQ ID NO: 3的氨基酸序列和SEQ ID N0:9的氨基酸序列;(b) SEQ ID NO: 15的氨基酸序列和SEQ ID NO: 21的氨基酸序列；(c) SEQ ID NO: 27的氨基酸序列和SEQ ID NO: 33的氨基酸序列；(d) SEQ ID N0:1的核酸序列編碼的氨基酸序列和SEQ ID NO: 7 的核酸序列編碼的氨基酸序列；(e) SEQ ID NO: 13的核酸序列編碼的氨基酸序列和SEQ ID NO: 19 的核酸序列編碼的氨基酸序列；(f) SEQ ID NO: 25的核酸序列編碼的氨基酸序列和SEQ ID NO: 31 的核酸序列編碼的氨基酸序列；和(g) 抗體10D1的可變域的氨基酸序列。
11. 權(quán)利要求9的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分是選自 下述的抗體(a)包含SEQ ID NO: 4， SEQ ID NO: 5， SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10， SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO: 12所述氨基酸序列的抗體；(b) 包含SEQ ID NO: 16， SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18， SEQ ID NO: 22， SEQ ID NO: 23和SEQ ID NO: 24所述氨基酸序列的抗體；和(c) 包含SEQ ID NO: 28， SEQ ID NO: 29， SEQ ID NO: 30， SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35和SEQ ID NO: 36所述氨基酸序列的抗體。
12. 權(quán)利要求9的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含具 有SEQ ID NO: 27所述氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQ ID NO: 33所述氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
13. 權(quán)利要求9的方法，其中所述抗體選自(a) 包含SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 8所述氨基酸序列的抗體；(b) 包含SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 20所述氨基酸序列的抗體；和(c) 包含SEQ ID NO: 26和SEQ ID NO: 32所述氨基酸序列的抗體。
14. 權(quán)利要求1-12或13的方法，其中在施用所述CpG ODN PF3512676之前1-7天，施用所述抗體。
15. 權(quán)利要求1-13或14的方法，其中在所述抗體后約1到100 天，施用所述CpG ODN PF3512676。
16. 權(quán)利要求1-14或15的方法，其中皮下施用所述CpG ODN PF3512676。
17. 權(quán)利要求1-15或16的方法，其中以1 mg-50 mg/天的量， 施用所述CpG ODN PF3512676。
18. 用于治療癌癥的藥物組合物，所述組合物包含治療有效量的 抗-CTLA-4抗體或其抗原結(jié)合部分，和治療有效量的CpG ODN PF3512676,以及藥學(xué)可接受的栽體。
全文摘要
本發(fā)明涉及施用抗-CTLA-4抗體，尤其針對人CTLA-4的人抗體，例如具有抗體3.1.1，4.1.1，4.8.1，4.10.2，4.13.1，4.14.3，6.1.1，11.2.1，11.6.1，11.7.1，12.3.1.1，12.9.1.1，和MDX-010的氨基酸序列的抗體，其與免疫刺激核苷酸即CpG ODN PF3512676相組合，用于治療癌癥。本發(fā)明涉及在疾病期間的任意點(例如在癌癥的任意階段)，施用抗-CTLA-4抗體和CpG ODN PF3512676的組合，作為對局限的或轉(zhuǎn)移的癌癥的新輔助療法、輔助療法、一線療法、二線療法和三線療法。
文檔編號A61K39/395GK101268101SQ200680032520
公開日2008年9月17日 申請日期2006年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月7日
發(fā)明者A·M·克萊格, D·C·漢森, D·R·J·瑞德特, J·U·B·瓊納利尤斯, J·格梅斯-納瓦羅 申請人:科利制藥集團公司;輝瑞大藥廠