具有效應功能的抗cxcr4抗體及其用于治療癌癥的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及通過施用能夠誘導效應功能的抗CXCR4單克隆抗體治療癌癥的方法。
【專利說明】具有效應功能的抗CXCR4抗體及其用于治療癌癥的用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及通過施用能夠誘導效應功能的抗CXCR4單克隆抗體治療癌癥的方法?！颈尘凹夹g】
[0002]趨化因子是小的分泌肽，特別是免疫反應期間其控制著白細胞沿被稱為趨化因子梯度的配體化學梯度的遷移(Zlotnick A.等人，2000)?；谄銷H2-端半胱氨酸殘基的位置、及與G蛋白偶聯(lián)受體(其兩個主要亞家族被命名為CCR和CXCR)的結合，趨化因子被分為兩個主要的亞家族，CC和CXC。到目前為止人們已發(fā)現(xiàn)了超過50個人趨化因子和18個趨化因子受體。
[0003]許多癌癥具有復雜的趨化因子網(wǎng)絡，其影響腫瘤的免疫細胞浸潤以及腫瘤細胞生長、存活、遷移和血管生成。免疫細胞、內皮細胞和腫瘤細胞自身表達趨化因子受體，并可以響應趨化因子梯度。人類癌癥活檢樣本和小鼠癌癥模型的研究表明癌細胞趨化因子受體的表達與轉移能力的增加有關。來自不同癌癥類型的惡性細胞具有不同的趨化因子受體表達譜，但是趨化因子受體4 (CXCR4)是最常發(fā)現(xiàn)的。來自至少23種不同類型的上皮起源、間充質起源和造血起源的人類癌癥的細胞表達CXCR4受體(Balkwill F.等人，2004)。
[0004]趨化因子受體4 (也稱為融合素、⑶184、LESTR或HUMSTR)作為包含352個或360個氣基酸的兩種同種型存在。殘基Asnll是糖基化的，殘基Tyr21是通過添加硫酸基團修飾的，Cysl09和186通過二硫橋在受體的細胞外部分進行結合(Juarez J.等人,2004)。
[0005]該受體由不同類型的正常組織、天然的(naive)、非記憶T細胞、調節(jié)性T細胞、B細胞、嗜中性粒細胞、內皮細胞、初級單核細胞、樹突細胞、自然殺傷(NK)細胞、CD34+造血干細胞表達，且在心臟、結腸、肝、腎和腦中以低水平表達。CXCR4在白細胞轉運(trafficking)、B細胞淋巴細胞生成和髓細胞生成中起關鍵作用。
[0006]CXCR4受體在大量癌癥中過表達，所述癌癥包括但不限于淋巴瘤、白血病、多發(fā)性骨髓瘤、結腸癌(Ottaiano A.等人，2004)、乳癌(Kato M.等人，2003)、前列腺癌(SunY.X.等人，2003)、肺癌(小細胞癌和非小細胞癌(Phillips R.J.等人，2003))、卵巢癌(Scotton C.J.等人,2002)、胰腺癌(Koshiba T.等人,2000)、腎癌、腦癌(Barbero S 等人，2002),成膠質細胞瘤和淋巴瘤。
[0007]迄今描述的CXCR4受體的唯一配體是間質細胞衍生因子-1 (SDF-1)或CXCL12。SDF-1在淋巴結、骨髓、肝、肺中大量分泌，腎、腦和皮膚分泌程度更少。CXCR4也被拮抗趨化因子識別，該拮抗趨化因子是III型人皰疹病毒編碼的病毒巨噬細胞炎癥蛋白II(vMIP-1I)。
[0008]CXCR4/SDF-1軸在癌癥中起關鍵作用，直接參與導致轉移的遷移、侵入。實際上，癌細胞表達CXCR4受體，它們遷移并進入系統(tǒng)循環(huán)。然后，癌細胞被滯留(arrested)在產(chǎn)生高水平SDF-1的器官中的血管床中，在那兒其增殖、誘導血管生成和形成轉移性腫瘤(MurphyPM.,2001 )0該軸也通過激活細胞外信號調節(jié)的激酶(ERK)途徑(Barbero S.等人，2003)和血管生成(Romagnani P.，2004)參與細胞增殖。實際上，CXCR4受體及其配體SDF-1通過刺激VEGF-A表達顯然地促進了血管生成，其轉而增加了 CXCR4/SDF-1的表達(BachelderR.E.等人，2002)。還已知與腫瘤相關的巨噬細胞(TAM)聚集在腫瘤的缺氧區(qū)域，經(jīng)刺激后與腫瘤細胞合作，并促進血管生成。據(jù)觀察缺氧選擇性地上調包括TAM的各種細胞類型中CXCR4的表達(Mantovani A.等人，2004)。最近證實CXCR4/SDF-1軸調節(jié)CXCR4+造血干細胞/祖細胞(HSC)的轉運/歸巢，可在新生血管形成中起作用。證據(jù)顯示除了 HSC之外，功能性CXCR4也在來自其它組織(組織定向干細胞=TCSC)的干細胞上表達，因此SDF-1可在器官/組織再生所需的化學引誘(chemottracting) CXCR4+TCSC中起關鍵作用，但是這些TCSC也可以是癌癥發(fā)展的細胞起源(癌癥干細胞理論)。對于人類白血病，和最近對于幾種實體腫瘤，比如腦和乳房，證實了癌癥的干細胞起源。存在幾個可以衍生自正常CXCR4+組織/器官特異性干細胞的CXCR4+的腫瘤實例，比如白血病、腦腫瘤、小細胞肺癌、乳癌、肝胚細胞瘤、卵巢癌和宮頸癌(Kucia M.等人，2005)。
[0009]使用針對CXCR4受體的單克隆抗體在體內證實了通過干擾CXCR4受體可以靶向癌癥轉移(Muller A.等人，2001)。簡而言之，已表明針對CXCR4受體(單抗173R&D系統(tǒng))的單克隆抗體顯著地減少了 SCID小鼠中常位(orthotopic)乳癌模型(MDA-MB231)中淋巴結轉移的數(shù)量。另一個研究(Phillips R.J等人，2003)使用抗SDF-1的多克隆抗體也顯示SDF-1/CXCR4軸在常位肺癌模型(A549)的轉移中起決定性作用，但是在該研究中，其對于腫瘤生長和血管生成都沒有作用。幾個其它研究也描述了使用CXCR4的SiRNA雙鏈體(Liang Z.等人，2005)生物穩(wěn)定的CXCR4肽拮抗劑(Tamamura H.等人，2003)對體內轉移的抑制，或使用CXCR4的小分子拮抗劑如AMD3100(Rubin J.B.等人，2003 ；De Falco V.等人，2007)或單抗(專利W02004/059285A2)對體內腫瘤生長的抑制。因此，CXCR4是經(jīng)驗證的用于癌癥的治療靶。
[0010]也已經(jīng)描述了能夠指導與CXCR4的相互作用、從而抑制CXCR4激活的鼠單克隆抗體。通過如下干預發(fā)生這種抑制:i)在配體SDF-1的細胞膜上特異性結合受體CXCR4，ii)GTPyS的細胞膜上特異性結合受體CXCR4，iii)CXCR4介導的cAMP產(chǎn)生的調節(jié)，和iv)CXCR4受體介導的細胞內鈣庫調節(jié)的動員(參見，W02010/037831)。
[0011]但是，這些抗體或SiRNA都不能導致表達CXCR4的癌細胞的殺死。因而，仍存在癌癥復發(fā)的風險，應當停止CXCR4的靶向治療。因而，需要直接靶向表達CXCR4的細胞的制劑，其能夠殺死所述表達CXCR4的細胞。
[0012]本發(fā)明涉及關于靶向CXCR4抗體的從未被鑒定的新型特性。

【發(fā)明內容】

[0013]事實上，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)針對CXCR4的人或人源化抗體能夠誘導針對表達CXCR4的細胞的效應功能，因此引發(fā)針對所述細胞的細胞毒性作用。
[0014]更具體地，本發(fā)明涉及誘導針對表達CXCR4的癌細胞的效應功能的方法。
[0015]如現(xiàn)有技術所述，轉移性表達CXCR4的腫瘤的治療涉及抑制遷移、侵入、增殖或血管生成，而非直接殺死表達CXCR4的細胞。與之截然相反的是，本發(fā)明涉及誘導引發(fā)表達CXCR4的靶細胞死亡的細胞毒性作用。具體而言，本發(fā)明提供人或人源化單克隆抗體，其能誘導針對表達CXCR4的癌細胞的一種或多種效應功能，從而實現(xiàn)殺死所述細胞。因此，本發(fā)明憑借人或人源化單克隆抗體通過誘導針對表達CXCR4的癌細胞的一種或多種效應功能，提供治療癌癥的方法。
[0016]在第一方面，本發(fā)明涉及使用結合CXCR4的人或人源化抗體，或其包含CH2的結合片段殺死表達CXCR4的癌細胞的方法；所述人或人源化抗體包含重鏈可變結構域，重鏈可變結構域包含分別含有序列SEQ ID N0.1、2和3的CDR區(qū)CDR-HU CDR-H2和CDR-H3 ；以及包含輕鏈可變結構域，輕鏈可變結構域包含分別含有序列SEQ ID N0.4、5和6的⑶R區(qū)⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ;其中所述方法包括在效應細胞或補體成分存在時誘導所述人或人源化抗體的至少一種效應功能的步驟。 [0017]在另一方面，本發(fā)明涉及結合CXCR4的人或人源化抗體，或其包含CH2的結合片段；其中所述人或人源化抗體包含重鏈可變結構域，重鏈可變結構域包含分別含有序列SEQID N0.1、2和3的CDR區(qū)CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3 ;以及包含輕鏈可變結構域，輕鏈可變結構域包含分別含有序列SEQ ID N0.4、5和6的⑶R區(qū)⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ;通過在效應細胞或補體成分存在時誘導至少一種效應功能，制備用于殺死表達CXCR4的癌細胞的組合物中的用途。
[0018]在又一方面，本發(fā)明也涉及結合CXCR4的人或人源化抗體，或其包含CH2的結合片段；所述人或人源化抗體包含重鏈可變結構域，重鏈可變結構域包含分別含有序列SEQ IDN0.1、2和3的CDR區(qū)CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3 ；以及包含輕鏈可變結構域，輕鏈可變結構域包含分別含有序列SEQ ID N0.4、5和6的⑶R區(qū)⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ;通過在效應細胞或補體成分存在時誘導至少一種效應功能，用以殺死表達CXCR4的癌細胞。
[0019]更具體而言，本發(fā)明涉及治療癌癥的方法，所述方法通過使用結合CXCR4的人或人源化抗體、或其包含CH2的結合片段殺死表達CXCR4的癌細胞；所述人或人源化抗體包含重鏈可變結構域，重鏈可變結構域包含分別含有序列SEQ ID N0.1、2和3的⑶RgOTR-Hl、CDR-H2和CDR-H3 ；以及包含輕鏈可變結構域，輕鏈可變結構域包含分別含有序列SEQ IDN0.4、5和6的⑶R區(qū)⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ;其中所述方法包括在效應細胞或補體成分存在時，誘導所述人或人源化抗體的至少一種效應功能的步驟。
[0020]在另一方面，本發(fā)明涉及結合CXCR4的人或人源化抗體，或其包含CH2的結合片段；其中所述人或人源化抗體包含重鏈可變結構域，重鏈可變結構域包含分別含有序列SEQID N0.1、2和3的CDR區(qū)CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3 ;以及包含輕鏈可變結構域，輕鏈可變結構域包含分別含有序列SEQ ID N0.4、5和6的⑶R區(qū)⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ;通過在效應細胞或補體成分存在時誘導至少一種效應功能，以制備通過殺死表達CXCR4的癌細胞治療癌癥的組合物中的用途。
[0021]在又一方面，本發(fā)明還涉及結合CXCR4的人或人源化抗體，或其包含CH2的結合片段；所述人或人源化抗體包含重鏈可變結構域，重鏈可變結構域包含分別含有序列SEQ IDN0.1、2和3的CDR區(qū)CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3 ；以及包含輕鏈可變結構域，輕鏈可變結構域包含分別含有序列SEQ ID N0.4、5和6的⑶R區(qū)⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ;通過在效應細胞或補體成分存在時誘導至少一種效應功能，通過殺死表達CXCR4的癌細胞用于治療癌癥。
[0022]本文所用術語“抗體”在最廣泛意義上和特別地包括下述任何同種型(isotype)的單克隆抗體(包括全長單克隆抗體):如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，多克隆抗體，多特異性抗體(multispecific antibodies),嵌合抗體和抗體片段。通過例如在曬菌體或類似載體中篩選重組抗體文庫、或者使用抗原或編碼抗原的核酸以免疫動物等重組方法，可生成與特異性抗原反應的抗體。
[0023]“多克隆抗體”是指存在一種或更多其它不同抗體或其間所產(chǎn)生的抗體。一般來說，存在若干產(chǎn)生不同抗體的其它B淋巴細胞時，由B淋巴細胞產(chǎn)生多克隆抗體。多克隆抗體通常通過經(jīng)免疫的動物直接獲得。
[0024]本文所用的“單克隆抗體”，是獲自一群實質上均質性抗體(homogeneousantibodies)的抗體，即除去可以以小量存在的可能天然發(fā)生的突變之外，形成這個群體的抗體基本上相同。換言之，單克隆抗體由源于單一細胞克隆(例如雜交瘤、使用編碼均質性抗體的DNA分子轉染的真核宿主細胞、用編碼均質性抗體的DNA分子轉染的原核宿主細胞等)生長的均質性抗體組成。這些抗體針對單一表位，因此是高度特異的。
[0025]“表位”是抗原上結合抗體的位點。它可以通過連續(xù)的殘基形成，或者通過折疊抗原蛋白使不連續(xù)的殘基極為靠近而形成。在暴露于變性溶劑時，由連續(xù)的氨基酸形成的表位通常得以保留，然而在所述暴露中，由不連續(xù)的氨基酸形成的表位通常丟失。[0026]優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體。
[0027]典型的抗體包含通過二硫鍵結合的兩條相同重鏈和兩條相同輕鏈。每個重和輕鏈都包含恒定區(qū)和可變區(qū)。每個可變區(qū)包含三個被稱為“互補決定區(qū)”(“⑶R”)或“超變區(qū)”的段，其主要負責與抗原的表位相結合。其通常按照從N端的順序編號被稱作 CDR1、CDR2 和 CDR3(見 Lefranc M.-P., Immunology Todayl8, 509 (1997)/LefrancΜ.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) /Lefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V.和 Lefranc, Dev.Comp.1mmunol.，27，55-77 (2003))。可變區(qū)中較為高度保守的部分被稱作“框架區(qū)”。
[0028]如本文所用，“VH”或“VH”指抗體的免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’、或F(ab’)2片段的重鏈。關于“VL”或“VL”指抗體的免疫球蛋白輕鏈的可變區(qū)，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’、或F(ab，)2片段的輕鏈。
[0029]抗體恒定結構域不直接參與抗體與抗原結合，但顯示各種效應功能。與免疫球蛋白不同分類相對應的重鏈恒定區(qū)分別命名為α、δ、ε、Y和μ。抗體或免疫球蛋白根據(jù)其重鏈的恒定區(qū)的氨基酸序列可被分成不同類，即，IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM,這些中的幾個可被進一步分成亞類(同種型)，例如，IgGl、IgG2、IgG3和IgG4 ;IgAl和IgA2(見W.E.Paul,編，1993，F(xiàn)undamental Immunology, Raven Press,紐約，紐約)。
[0030]木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個相同的抗原結合片段稱為Fab片段，每個具有單一的抗原結合位點和殘留的“Fe”片段。雖然免疫球蛋白重鏈的Fe結構域的邊界可變，但人IgG重鏈Fe結構域通常限定為:從根據(jù)EU索引(index)在鉸鏈區(qū)Cys226或Pro230位置的氨基酸殘基處延伸至其包含重鏈CH2和CH3結構域的羧基端(Edelman等人，The covalentstructure of an entire gammaG immunoglobulin molecule, PNAS1969;63:78-85)。為清楚起見，此處應該指明:根據(jù)EU索引的Cys226/Pro230殘基與在Kabat編號系統(tǒng)(Kabatnumbering system)的 Cys239/Pro243 殘基、以及根據(jù) IMGT 的鉸鏈殘基 Cysll/Prol5 相對應。
[0031]術語“鉸鏈區(qū)”一般定義為從人IgGl的Glu216至Pro230的延伸(Burton, MolImmunol, 22:161-206, 1985)。通過將形成重鏈間S-S鍵的第一個和最后一個半胱氨酸殘基放置在相同位置，可將其它IgG同種型的鉸鏈區(qū)與IgGl序列相比對。人IgGFc部分的“CH2結構域”(也被稱作“C Y 2”結構域)通常從約氨基酸231延伸至約氨基酸340。所述CH2結構域獨特之處在于其與另一結構域并不緊密配對。而是兩個N-連接的分支糖鏈被插入至完整天然IgG分子的兩個CH2結構域之間。據(jù)推測，糖可提供結構域-結構域配對的替代，幫助穩(wěn)定 CH2 結構域(Burton, MoI Immunol, 22:161-206，1985)?！癈H3 結構域”包括在 Fe部分C端殘基至CH2結構域的延伸(即，從IgG的約氨基酸殘基341至約氨基酸殘基447)。
[0032]包含單克隆抗體的IgG免疫球蛋白已經(jīng)被證明在每個重鏈的恒定區(qū)為N糖基化的。其在其兩條重鏈的每一條的CH2結構域上的Asn297上都含有單一的N連接的聚糖。如本文所用術語“N聚糖”指例如通過天冬酰胺-N-乙酰氨基葡萄糖連接附著至多肽的天冬酰胺殘基的N連接的寡糖。N聚糖有共同的Man3GlcNAc2的戊多糖核心(“Man”指甘露糖；“Glc”指葡萄糖；和“嫩(3”指N乙酰基；GlcNAc指的是N乙酰氨基葡萄糖)。
[0033]N聚糖的區(qū)別在于附著至Man3核心結構的含有外周糖(peripheral sugars)(例如,GlcNAc、半乳糖、巖藻糖和唾液酸)的分支(天線)的數(shù)目和性質(nature)。N聚糖根據(jù)其分支成分(例如高甘露糖、復合的或雜合的)進行分類。“復合，雙天線”型N聚糖通常具有附著至1，3甘露糖分支的至少一個GlcNAc和附著至三甘露糖(trimannose)核心的1，6甘露糖分支的至少一個GlcNAc。復合雙天線N聚糖也可具有包含“二分(bisecting)”GlcNAc和核心巖藻糖(〃Fuc〃)的鏈內置換?！岸諫lcNAc”為附著至成熟核心糖結構的β-1，4-甘露糖的GlcNAc殘基。
[0034]復合雙天線N聚糖也可具有以唾液酸可選地修飾的半乳糖("Gal")殘基。唾液酸添加至寡糖鏈由唾液酸轉移酶催化，但需要由半乳糖基轉移酶之前將一個或多個半乳糖殘基附著至末端N乙酰氨基葡萄糖。根據(jù)本發(fā)明的“唾液酸”包括5-N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuNAc)和5-輕乙酰神經(jīng)氨酸(NeuNGc)。
[0035]寡糖可含有O個(GO)、一個(Gl)或兩個(G2)半乳糖殘基，以及附著至或沒有附著至第一個GlcNac的一個巖藻糖。這些形式(forms)分別記為G0/G0F、G2/G2F、G1/G1F(見 Theillaud 的圖1, Expert Opin Biol Ther.,增刊 1: S15-S27, 2005)。換言之，當寡糖鏈的兩臂都含有半乳糖殘基時，每摩爾重鏈的最大摩爾半乳糖是2，當核心被巖藻糖基化(fucosylated)時所述結構被稱作G2F,當核心不是巖藻糖基化時所述結構被稱作G2。當一條臂具有末端半乳糖時，所述結構根據(jù)其是否被巖藻糖基化而被稱作GlF或Gl，當沒有末端半乳糖時，所述結構分別被稱作GOF或G0。
[0036]因此，分泌的IgG免疫球蛋白為顯示出糖殘基巖藻糖、半乳糖、唾液酸和二分N-乙酰氨基葡萄糖的可變添加的糖型(g I y Co forms )的異質性混合物。
[0037]Fe結構域在決定免疫球蛋白的生物學功能當中是重要的，這些生物學功能稱為“效應功能”。這些Fe結構域-介導的活性是通過免疫效應細胞介導的，如殺傷細胞、自然殺傷細胞和激活的巨噬細胞、或各種補體成分。這些效應功能涉及通過抗體的Fe結構域結合至所述受體或補體成分以激活所述效應細胞表面上的受體。 [0038]表述“抗體依賴的細胞介導的細胞毒性”、“抗體依賴的細胞細胞毒性”或“ADCC”指細胞毒性的形式，其中Ig結合至存在于某些細胞毒性效應細胞上的Fe受體(FcR)，使得這些細胞毒性效應細胞能夠特異性結合至帶有抗原的靶細胞，并隨后用細胞毒素殺死靶細胞。祀細胞的裂解是細胞外的，需要直接的細胞-細胞接觸，并且不涉及補體。[0039]細胞破壞(destruction)可通過例如裂解或吞噬作用發(fā)生?！凹毎拘孕毎睘楸磉_一種或多種FcR并執(zhí)行效應功能的白細胞。優(yōu)選地，所述細胞至少表達Fe YRIII并且執(zhí)行ADCC效應功能。介導ADCC的人白細胞的實例包括外周血單核細胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞；其中PBMC和NK細胞是優(yōu)選的。效應細胞可從其天然來源如從血液或PBMC中得以分離。能夠通過裂解方式破壞細胞的細胞毒性效應細胞包括，例如自然殺傷(NK)細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞和嗜中性粒細胞。
[0040]在各種人免疫球蛋白分類中，人IgGl和IgG3比IgG2和IgG4更有效地介導ADCC。
[0041]有利地是，本發(fā)明的人或人源化抗體或其包含CH2的片段，能夠通過誘導抗體依賴的細胞細胞毒性(ADCC)殺死表達CXCR4的癌細胞。
[0042]因此，在本發(fā)明方法的第一優(yōu)選的實施方案中，所述效應功能由抗體依賴的細胞細胞毒性(ADCC)組成。
[0043]換言之，根據(jù)本發(fā)明的用途特征在于所述效應功能由抗體依賴的細胞細胞毒性(ADCC)組成。
[0044]又換言之，根據(jù)本發(fā)明的人或人源化抗體特征在于所述效應功能由抗體依賴的細胞細胞毒性(ADCC)組成。
[0045]作為非限定性實例，可以提到下列用于評估或體外定量ADCC的方法:使用碘化丙唳(propidium iodide, PI)或|丐黃綠素(calcein)的血細胞計數(shù),51Cr或突光染料例如鈣黃綠素-AM、羧基突光素玻拍酸亞胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester,CFSE)、2’，7’- 二-(2羧乙基)-5-(和-6)-羧基熒光素(BCECF)或銪(Europium)，或通過測量如乳酸脫氫酶(LDH)的胞質酶或ATP的釋放。這些方法為本領域技術人員所熟知(見，例如Jiang 等人，“Advances in the assessment and control of the effector functionsof therapeutic antibodies”, Nat Rev Drug Discov.，10:101-110，2011，和其參考文獻),不需在此進一步詳述。
[0046]通過“補體依賴的細胞毒性”或“CDC”，它在本文指這樣一種機制，其憑借特異性抗體結合至細胞表面的抗原，經(jīng)一系列包含血液中補體相關蛋白組的級聯(lián)(補體激活途經(jīng))觸發(fā)補體激活，導致靶細胞裂解。此外，通過激活補體生成的蛋白片段可誘導免疫細胞的遷移和激活。補體依賴的細胞毒性(⑶C)激活的第一步在于Clq蛋白結合至抗體的至少兩個Fe結構域?！癈lq”是包含免疫球蛋白Fe區(qū)的結合位點的多肽。Clq與兩個絲氨酸蛋白酶Clr和Cls —起形成復合物Cl，其為補體依賴的細胞毒性(⑶C)途經(jīng)的第一個成分。
[0047]在本發(fā)明的另一有利的實施方案中，人或人源化抗體或其包含CH2的片段，通過誘導補體依賴的細胞毒性(CDC)能夠殺死表達CXCR4的癌細胞。
[0048]因此，本發(fā)明也涉及上述方法，其中效應功能由補體依賴的細胞毒性(⑶C)組成。
[0049]換言之，根據(jù)本發(fā)明的用途特征在于所述效應功能由補體依賴的細胞毒性(CDC)組成。
[0050]又換言之，根據(jù)本發(fā)明的人或人源化抗體特征在于所述效應功能由補體依賴的細胞毒性(⑶C)組成。
[0051]有核細胞的細胞毒性根據(jù)CDC可通過幾種方法在體外定量，例如:臺盼藍排除法、使用碘化丙啶(PI)的流式細胞術、51Cr釋放、四唑鹽MTT的還原、氧化還原染料Alamar藍(redox dye Alamar blue)、細胞內 ATP 的流失、CellTiter-Glo、LDH 釋放或鈣黃綠素-AM釋放。這些方法為本領域技術人員所熟知(見，例如Jiang等人，“Advances in theassessment and control of the effector functions of therapeutic antibodies，，, NatRev Drug Discov.，10:101-110，2011，和其參考文獻)，不需在此進一步詳述。
[0052]在本發(fā)明的進一步有利的實施方案中，抗體依賴的細胞細胞毒性(ADCC)和補體依賴的細胞毒性(CDC)兩者都被誘導，即人或人源化抗體或其包含CH2的片段通過誘導抗體依賴的細胞細胞毒性(ADCC)和補體依賴的細胞毒性(CDC)兩者能夠殺死表達CXCR4的癌細胞。
[0053]在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明方法的效應功能由抗體依賴的細胞細胞毒性(ADCC)和補體依賴的細胞毒性(⑶C)組成。
[0054]換言之，根據(jù)本發(fā)明的用途特征在于所述效應功能由抗體依賴的細胞細胞毒性(ADCC)和補體依賴的細胞毒性(⑶C)組成。
[0055]又換言之，根據(jù)本發(fā)明的人或人源化抗體特征在于所述效應功能由抗體依賴的細胞細胞毒性(ADCC)和抗體依賴的細胞細胞毒性(ADCC)組成。
[0056]抗體的這兩個效應功能直接關聯(lián)抗體Fe部分與免疫細胞表面上特異性受體的結合，對于ADCC基本上為NK細胞、巨噬細胞、單核細胞上表達的Fe Y RIIIa(也稱為Fe Y RIIIA)和Fe Y RIIa(也稱為Fe Y RIIA)，以及對于CDC為補體級聯(lián)蛋白Clq。
[0057]抗體的Fe部分 和Fe Y R以及Clq之間的精確相互作用已經(jīng)被精確作圖，涉及這種相互作用的主要Fe結構域與CH2結構域相對應。Fe部分和Fe受體之間的親和性直接關聯(lián)至所觸發(fā)的免疫反應的程度。
[0058]如上所述，針對CXCR4的人或人源化抗體能夠誘導針對表達CXCR4的細胞的效應功能，因此導致針對所述細胞的細胞毒性作用。很顯然，效應功能的誘導越高，針對表達CXCR4的細胞的細胞毒性作用就越強。雖然某些抗體可表現(xiàn)天然升高的ADCC和/或CDC活性，在其它情況下可能有必要去工程化針對CXCR4的人或人源化抗體以提高抗體免疫反應以及更具體地為ADCC和/或CDC。這樣經(jīng)工程化的抗體也包括在本發(fā)明的范圍內。
[0059]有幾種方式去工程化和去提高抗體免疫反應以及更具體地為ADCC和/或⑶C，其中的大多數(shù)對ADCC而言基于直接增加Fe部分與同源Fe YR的結合。主要目標為增加與人Fe Y Ra和人Fe Y RIIa的結合，并降低與人Fe Y RIIb (降低免疫反應的抑制受體)的結合?？赏ㄟ^在Fe部分內突變個別氨基酸殘基或者通過修飾連接至CH2結構域天冬酰胺297的聚糖部分(moiety)以增加巖聚糖基化聚糖部分實現(xiàn)這個目標?？梢岳缤ㄟ^關閉(si RNA, K0,等；Toyohide Shinkawa 等人，The absence of fucosebut not the presence of galactose or bisecting N-acetyIglucosamine of humanIgGIcompIex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancingantibody-dependent cellular cytotoxicity.J.Biol.Chem2003;278:3466 - 3473)產(chǎn)生抗體的宿主細胞上的FUT8基因，或者產(chǎn)生抗體的細胞上過表達GlcNAc III轉移酶(見例如 Pablo Umana 等人，Engineered glycoforms of an antineuroblastoma IgGlwithoptimized antibody-dependent cellular cytotoxicity activity.Nat Biotechnol1999; 17:176-180)實現(xiàn)糖工程化(Glycoengineering)。
[0060]通過在抗體的恒定結構域產(chǎn)生單一或多個置換可獲得這樣的抗體，并因此增加其與Fe受體的相互作用。設計這樣突變的方法可見于例如Lazar等人(2006, PNAS, 103(11):4005-4010)和 Okazaki 等人(2004，J.Mo1.Biol.336(5): 1239-49)。
[0061]還可能使用經(jīng)專門工程化的細胞系用于產(chǎn)生改良的抗體。特別地，這些系已經(jīng)改變糖基化途經(jīng)的調節(jié)，從而導致抗體巖藻糖基化不足或者甚至完全去巖藻糖基化。這樣的細胞系和用于其工程化的方法公開于例如Shinkawa等人(2003，J.Biol.Chem.278 (5): 3466-3473)、Ferrara 等人(Biotechnol.Bioeng.93 (5): 851-61)。
[0062]增加ADCC的其它方法也已描述在Li等人(2006，Nat Biotechnol.24⑵:210-5)、Stavenhagen 等人(2008, Advan.Enzyme Regul.48:152-164)、Shields 等人(2001, J.Biol.Chem.，276(9):6591-6604);和 W02008/006554。 [0063]增加CDC 的方法已經(jīng)描述于 Idusogie 等人(2001, J Immunol.166 (4): 2571-5)、Dali，Acqua 等人(2006, J Immunol, 177 (2): 1129-38)、Michaelsen 等人(1990, ScandJ Immunol, 32(5):517-28)、fcekke 等人(1993，Mol Immunol, 30 (16): 1419-25)、Tan等人(1990, Proc;Natl.Acad.Sc1.USA, 87:162-166)和 Norderhaug 等人(1991, Eur JImmunol, 21(10):2379-84)。
[0064]一個詳細描述的技術是Kyowa開發(fā)的補體技術(Complement technology),其在于產(chǎn)生具有增強的CDC的嵌合人IgGl/IgG3Fc部分(見例如W02007/011041)。
[0065]描述用于增加ADCC和CDC的方法的參考文獻包括Natsume等人(2008，CancerRes.68(10):3863-3872)。這些參考文獻的每個的公開通過交叉引用包括在本文中。
[0066]這對本領域技術人員是顯而易見的，因為增強的ADCC和/或⑶C將引發(fā)殺死表達CXCR4的癌性細胞，所以其在癌癥治療領域特別受關注，因此其將明確限制癌癥復發(fā)的風險，CXCR4靶向的治療應該被停止。
[0067]通過表述“包含CH2的結合片段”，其應該理解為包含母體抗體的6個⑶R的抗體的任何片段或部分以及至少CH2結構域，其已知負責誘導效應功能。在最優(yōu)選的實施方案中，CH2必須是二聚的，也就是說其包含CH2的兩個拷貝。
[0068]在另一實施方案中，所述包含CH2的結合片段包括母體抗體的6個⑶R和至少CH2以及鉸鏈結構域。
[0069]在又一實施方案中，所述包含CH2的結合片段包括母體抗體的6個⑶R和至少CHl、鉸鏈和CH2結構域。
[0070]在另一實施方案中，所述包含CH2的結合片段包括母體抗體的6個⑶R和至少CHl和CH2結構域。
[0071]在又一實施方案中，所述包含CH2的結合片段包括母體抗體的6個⑶R和至少CH1、CH2和CH3結構域。
[0072]在還一實施方案中，所述包含CH2的結合片段包括母體抗體的6個⑶R和至少CH1、鉸鏈、CH2和CH3結構域，即全長Fe。
[0073]更優(yōu)選地，本發(fā)明包含通過遺傳重組或化學合成獲得的人源化抗體，其包含CH2的結合片段。
[0074]根據(jù)優(yōu)選的實施方案，根據(jù)本發(fā)明的人或人源化抗體特征在于其由單克隆抗體組成。
[0075]換言之，本發(fā)明的方法包括人或人源化抗體，或包含CH2的結合片段的用途，其根據(jù)MGT包含含有下列三個⑶R的重鏈，分別為⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3，其中:[0076]-⑶R-Hl包含序列SEQID N0.1，或與序列SEQ ID N0.1經(jīng)最佳比對后具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列；
[0077]-⑶R-H2包含序列SEQID N0.2，或與序列SEQ ID N0.2經(jīng)最佳比對后具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列；和
[0078]-⑶R-H3包含序列SEQID N0.3，或與序列SEQ ID N0.3經(jīng)最佳比對后具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列。
[0079]甚至更優(yōu)選，本發(fā)明的方法包括人或人源化抗體，或包含CH2的結合片段的用途，其根據(jù)頂GT包含含有下列三個⑶R的輕鏈，分別為⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3，其中:
[0080]-CDR-Ll包含序列SEQ ID N0.4，或與序列SEQ ID N0.4經(jīng)最佳比對后具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列；
[0081]-CDR-L2包含序列SEQ ID N0.5，或與序列SEQ ID N0.5經(jīng)最佳比對后具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列；和
[0082]-CDR-L3包含序列SEQ ID N0.6，或與序列SEQ ID N0.6經(jīng)最佳比對后具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列。
[0083]在本發(fā)明的描述中，術語“多肽”、“多肽序列”、“肽”可互換。
[0084]無論抗原受體、鏈類型或物種如何，MGT唯一的編號已限定為比較可變結構域(Lefranc Μ.-P., Immunology Today18，509 (1997)/Lefranc M.-P., TheImmunologist, 7, 132-136 (1999)/Lefranc,M.-P.,Pommie,C., Ruiz,M., GiudicelIi, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V.和 Lefranc, Dev.Comp.1mmunol.，27，55-77(2003))。在MGT唯一編號中，保守性氨基酸總是具有相同位置，例如半胱氨酸23 (第一個CYS)、色氨酸41 (保守性TRP)、疏水性氨基酸89、半胱氨酸104 (第二個CYS)、苯丙氨酸或色氨酸118 (J-PHE或J-TRP)。所述MGT唯一編號提供了框架區(qū)(FRl-1MGT:位置 I 至 26，F(xiàn)R2-MGT:39 至 55，F(xiàn)R3-MGT:66 至 104 和 FR4-1MGT:118 至 128)和互補決定區(qū)(CDR1-頂GT:27 至 38，CDR2-1MGT:56 至 65 和 CDR3-1MGT:105 至 117)的標準化定界。由于空位(gap)代表未占用的位置，CDR-1MGT長度(在括號之間顯示，并用點分開，例如[8.8.13])成為決定性的信息。在2D圖解的圖表中使用IMGT唯一編號，命名為IMGT Colliers de Perles(Ruiz, Μ.和Lefranc, Μ.-P.，Immunogenetics, 53，857-883(2002)/Kaas, Q.和 Lefranc, Μ.-P.，Current Bioinformatics, 2，21-30 (2007))，以及在 IMGT/3D結構 DB 中的 3D 結構中使用 MGT 唯一編號(Kaas, Q.，Ruiz, M.和 Lefranc, M.-P.，T cellreceptor and MHC structural data.Nucl.Acids.Res.，32，D208-D210(2004))。
[0085]在本發(fā)明的意義上，兩條核酸或氨基酸序列之間的“百分比同一性”指兩條進行比較的序列之間在最佳比對后獲得的相同核苷酸或氨基酸殘基的百分比，該百分比是純粹統(tǒng)計學上的，并且兩條序列之間的差異沿其長度隨機分布。兩條核酸或氨基酸序列之間的比較傳統(tǒng)上在已對其進行最佳比對后通過比較序列而進行，所述比較能夠分段進行或使用“比對窗口”進行。用于比較的序列的最佳比對，除手工比較之外，可以通過Smith和Waterman 的局部同源性算法(1981) (Ad.App.Math.2:482)、通過 Neddleman 和 Wunsch 的局部同源性算法(1970) (J.Mol.Biol.48:443)、通過Pearson和Lipman的相似性搜索法(1988) (Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:2444)或通過使用這些算法的計算機軟件(威斯康星遺傳學軟件包，遺傳學計算機組，575Science Dr.，Madison, WI的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,或通過比較軟件BLAST NR或BLAST P)進行。
[0086]通過比較兩條最佳比對的序列確定兩條核酸或氨基酸序列之間的百分比同一性，其中與用于兩條序列之間最佳比對的參考序列相比，待比較的核酸或氨基酸序列可具有添加或缺失。通過如下方法計算百分比同一性:確定兩條序列優(yōu)選兩條全序列之間相同氨基酸核苷酸或殘基的位置數(shù)目，將相同位置的數(shù)目除以在比對窗口中的位置總數(shù)，并將結果乘以100以獲得兩條序列之間的百分比同一性。
[0087]例如，從網(wǎng)址http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html 上可獲得的 BLAST程序“BLAST2 序列”(Tatusova 等人，“Blast2sequences_a new tool for comparingprotein and nucleotide sequences”，F(xiàn)EMS Microbiol, 1999, Lett.174:247_250)，可以與缺省參數(shù)一起使用(特別是參數(shù)“開放空位罰分”:5，和“延伸空位罰分”:2;所選的矩陣是例如程序建議的“BL0SUM62”矩陣)；直接通過所述程序計算兩條待比較序列之間的百分比同一I"生。
[0088]對于顯示出與參考氨基酸序列具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的氨基酸序列而言，優(yōu)選的實例包括包含參考序列，某些修飾，特別是至少一個氨基酸的缺失、添加或置換，截短或延伸的那些。在置換一個或多個連續(xù)或不連續(xù)氨基酸的情況下，優(yōu)選其中被置換的氨基酸被“等同的”氨基酸所取代的置換。在此，表述“等同的氨基酸”指可能被結構性氨基酸之一所置換的，然而并未改變相應抗體的生物活性的任何氨基酸和下述限定的那些具體實例。
[0089]等同氨基酸可根據(jù)其與被置換氨基酸的結構同源性或根據(jù)可能產(chǎn)生的各種抗體之間生物活性的比較性測試結果而確定。
[0090]作為非限制性實例，下表1概述可進行的卻沒有引起相應經(jīng)修飾的抗體的生物活性發(fā)生顯著改變的可能置換；在相同條件下，反向置換自然是可能的。
[0091]表1
[0092]
【權利要求】
1.一種結合CXCR4的人源化抗體、或其含有CH2的結合片段，所述人源化抗體包含選自序列SEQ ID N0.7至10的重鏈可變結構域和選自序列SEQ ID N0.11至17的輕鏈可變結構域；在效應細胞或補體成分存在時，通過誘導至少一種效應功能殺死表達CXCR4的癌細胞，用于治療癌癥的方法中。
2.根據(jù)權利要求1所述的人源化抗體，其特征在于所述效應功能由抗體依賴的細胞細胞毒性(ADCC)組成。
3.根據(jù)權利要求1所述的人源化抗體，其特征在于所述效應功能由補體依賴的細胞毒性(CDC)組成。
4.根據(jù)權利要求1所述的人源化抗體，其特征在于所述效應功能由抗體依賴的細胞細胞毒性(ADCC)和補體依賴的細胞毒性(⑶C)組成。
5.根據(jù)權利要求1至4任一項所述的人源化抗體，其中所述人源化抗體選自: 包含序列SEQ ID N0.8的重鏈可變結構域和選自序列SEQ ID N0.11至17的輕鏈可變結構域的人源化抗體； 包含選自序列SEQ ID N0.7至10的重鏈可變結構域和序列SEQ ID N0.13的輕鏈可變結構域的人源化抗體； 包含序列SEQ ID N0.8的重鏈可變結構域和序列SEQ ID N0.13的輕鏈可變結構域的人源化抗體； 包含選自序列SEQ ID N0.18至21的重鏈和/或選自序列SEQ ID N0.22至28的輕鏈的人源化抗體； 包含序列SEQ ID N0.19的重鏈和/或選自序列SEQ ID N0.22至28的輕鏈的人源化抗體；` 包含選自序列SEQ ID N0.18至21的重鏈和/或序列SEQ ID N0.24的輕鏈的人源化抗體；和 包含序列SEQ ID N0.19的重鏈和/或序列SEQ ID N0.24的輕鏈的人源化抗體。
6.根據(jù)權利要求1至7任一項所述的人源化抗體，其特征在于所述抗體是IgGl。
7.根據(jù)權利要求1至6任一項所述的人源化抗體，其特征在于所述表達CXCR4的癌細胞由惡性血液細胞組成。
8.根據(jù)權利要求7所述的人源化抗體，其特征在于所述CXCR4惡性血液細胞選自淋巴瘤細胞、白血病細胞或多發(fā)性骨髓瘤細胞。
9.根據(jù)權利要求1至8任一項所述的人源化抗體，其特征在于所述效應細胞包含NK細胞、巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞或嗜酸性粒細胞。
10.根據(jù)權利要求1至9任一項所述的人源化抗體，其特征在于在4小時的孵育期后，所述人源化抗體誘導RAMOS淋巴瘤細胞上至少40%的ADCC水平。
11.根據(jù)權利要求1至10任一項所述的人源化抗體，其特征在于在NK細胞上沒有誘導顯著的ADCC。
12.根據(jù)權利要求1至11任一項所述的人源化抗體，其特征在于所述補體成分至少包含 Clq。
13.根據(jù)權利要求1至12任一項所述的人源化抗體，其特征在于在I小時的孵育期后，所述人源化抗體誘導RAMOS淋巴瘤細胞上至少30%、優(yōu)選至少50%、以及最優(yōu)選至少70%的CDC水平。
14.根據(jù)權利要求1至13任一項所述的人源化抗體，其特征在于在I小時的孵育期后，所述人源化抗體誘導NIH3T3CXCR4細胞上至少30%、優(yōu)選至少50%、以及最優(yōu)選至少70%的CDC水平。
15.根據(jù)權利要求1至14任一項所述的人源化抗體，其特征在于人源化抗體、或其含有CH2的結合片段結合至少一個人Fe Y R0
16.根據(jù)權利要求15所述的人源化抗體，其特征在于所述至少一個FcyR是人Fe Y RI。
17.根據(jù)權利要求16所述的人源化抗體，其特征在于所述人源化抗體根據(jù)Langmu’it?模式以I至IOnM之間的解離常數(shù)(KD)結合所述Fe YRI。
18.根據(jù)權利要求17所述的人源化抗體，其特征在于所述至少一個FcyR是人Fe Y RIIIAo
19.根據(jù)權利要求18所述的人源化抗體，其特征在于所述人源化抗體根據(jù)異質性配體模式以200至1000nM之間的解離常數(shù)(KD)結合所述Fe yRIIIA。
20.—種結合CXCR4的人源化抗體、或其含有CH2的結合片段，通過殺死表達CXCR4的癌細胞用于治療癌癥的方法中；所述人或人源化抗體包含選自序列SEQ ID N0.7至10的重鏈可變結構域和選自序列SEQ ID N0.11至17的輕鏈可變結構域；其中在效應細胞或補體成分存在時，誘導所述人或人源化抗體的至少一種效應功能。
21.根據(jù)權利要求20所述的人源化抗體，其特征在于所述癌癥由淋巴瘤組成。
22.一種用于篩選結合CXCR4的人源化抗體、或其含有CH2的結合片段的方法，所述人源化抗體或其含有CH2的結合片段在效應細胞或補體成分存在時，通過誘導至少一種效應功能用于殺死表達CXCR4的癌細胞，其中所述方法包括至少一個選自以下的選擇步驟: -在4小時的孵育期后，選擇誘導RAMOS淋巴瘤細胞上至少40%ADCC水平的抗體； -在I小時的孵育期后，選擇誘導RAMOS淋巴瘤細胞上至少30%、優(yōu)選至少50%以及最優(yōu)選至少70%CDC水平 的抗體； -在I小時的孵育期后，選擇誘導NIH3T3CXCR4細胞上至少30%、優(yōu)選至少50%以及最優(yōu)選至少70%CDC水平的抗體； -選擇根據(jù)Langmi*模式以I至IOnM之間的解離常數(shù)(KD)結合Fe y RI的抗體； -選擇根據(jù)異質性配體模式以200至1000nM之間的解離常數(shù)(KD)結合Fe Y RIIIA的抗體。
【文檔編號】C07K16/28GK103649120SQ201280030414
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2012年6月20日 優(yōu)先權日:2011年6月20日
【發(fā)明者】C·克林格-阿穆 申請人:皮埃爾法布雷醫(yī)藥公司