專利名稱：一種檢測秦川牛ampd1基因連鎖突變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，具體涉及基因單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的檢測，特別涉及一種快速檢測秦川牛腺苷一磷酸脫氨酶1 (AMPDl)基因內(nèi)含子11區(qū)域第19416位和第 19421位單核苷酸多態(tài)性的PCR-SSCP(PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性)方法，該方法利用聚丙烯酰胺凝膠電泳對包含該單核苷酸多態(tài)性位點的基因序列進行檢測，并對其進行片段分離，利用凝膠成像系統(tǒng)分析其片段多態(tài)性，再結(jié)合測序技術(shù)，從而準確確定其SNPs。
背景技術(shù)：
通過對SNP進行分析，我們可以從遺傳學的角度來很好的解釋個體表型所造成的差異。SNP和其他分子標記相比較而言，分辨率最高也最為豐富，幾乎可以覆蓋到整個基因組范圍，遺傳上相對比較穩(wěn)定。在動物基因組中SNP分布廣泛，每一個核苷酸發(fā)生突變的概率大約為10_9，編碼區(qū)位置可發(fā)生突變，5'端、3'端、非編碼區(qū)以及內(nèi)含子區(qū)域也可以發(fā)生突變。雖然SNP的檢測方法有很多種，但是各有其自身的特點，而且大多數(shù)方法以聚合酶鏈式反應(yīng)為主要基礎(chǔ)，利用堿基差異造成的DNA片段的各種差異來進行SNP檢測和分析。目前，實驗室工作人員主要采用以下幾種不同的方法來發(fā)現(xiàn)SNPs:即直接測序法、PCR-RFLP法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)等。在這些SNPs檢測技術(shù)中，直接測序法是最為準確的SNPs檢測方法，測序法檢測單核苷酸多態(tài)性的效率可以達到100%。但是，因為需要用到專門的大型測序儀器，而且需要有熟練操作儀器的技術(shù)工作人員，還需要有豐富的測序經(jīng)驗，更為重要的是直接測序的檢測費用極其昂貴，對實驗人員來說，直接測序無疑不是一種應(yīng)用于生產(chǎn)實際的理想SNPs檢測方法；PCR-RFLP法是利用限制性內(nèi)切酶可以識別DNA特異位點，并可在特異位點進行識別切割的特點，將其切割成不同大小的片段，從而來判斷其多態(tài)性。這種檢測方法準確，重復(fù)性高，但是堿基的替換、插入、缺失可以產(chǎn)生或者消除一個特定的酶切位點，從而改變了用這種酶切割之后產(chǎn)生片段的大小和數(shù)目，所以當遇到?jīng)]有合適的內(nèi)切酶可以直接切割特異位點時，這種方法就顯得無能為力；AS-PCR方法作為一種新型的SNPs檢測方法，在未來的應(yīng)用領(lǐng)域中具有非常的前景，但是，該方法需要設(shè)計特別的引物，且只能針對特定的基因位點，同時，檢測過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應(yīng)用的特點；而引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)技術(shù)檢測SNPs位點，需要平板讀數(shù)儀、基因芯片、微球陣列技術(shù)和質(zhì)譜儀等檢測平臺，對于一般的分子實驗室來說可實施性不強。綜上所述，現(xiàn)有的幾種方法均不是一種檢測SNPs的理想的遺傳標記方法。而基于 PCR的單鏈構(gòu)象多態(tài)性是以構(gòu)象為基礎(chǔ)的檢測基因組中單核苷酸突變的方法。它的基本原理是單鏈DNA片段呈現(xiàn)復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，當有一個堿基發(fā)生改變時，會或多或少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受到的阻力大小不同。因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，可以非常敏銳地將構(gòu)象上有差異的分子分離開。該技術(shù)以其高度的靈敏性(甚至一個堿基的改變也可通過不同的帶型檢測出來)、操作的簡便性(整個實驗過程在1 2小時內(nèi)就能完成)和應(yīng)用范圍的廣泛性， 已成為人類和動物遺傳育種中快速、靈敏探測已知基因突變位點，識別未知基因突變的一項新技術(shù)。AMPD屬于多基因家族，其成員有三個，AMPDl是家族成員之一。AMPDl基因存在于所有的真核生物中，但主要是在肌肉中表達，特別是在骨骼肌中高水平的進行表達，并且與肌肉中肌苷酸代謝有關(guān)。目前，關(guān)于動物AMPDl基因遺傳變異的研究國內(nèi)外主要集中在鼠、 雞和豬等動物上，未見牛AMPDl基因遺傳變異或SWs研究的相關(guān)報道。目前中國地方黃牛， 特別是秦川牛AMPDl基因遺傳變異領(lǐng)域的研究匱乏，該基因的功能研究及其遺傳變異與生長和胴體性狀(如體高、體斜長、腰角寬、空腹24h宰前活重、胴體重、屠宰率等性狀)關(guān)聯(lián)的研究仍是空白。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題和缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測秦川牛 AMPDl基因連鎖突變的PCR-SSCP方法，該檢測方法操作簡單、快速、成本低，而且檢測的精確度高，便于推廣應(yīng)用。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種檢測秦川牛AMPDl基因連鎖突變的PCR-SSCP方法，以包含AMPDl基因的待測秦川牛全基因組 DNA 序列為模板,在 2XReaction Mix、ddH20、Forward primer、Reverse primer,Golden DNA polymerase、DNA模板存在的情況下，設(shè)計聚合酶鏈式反應(yīng)引物，在PCR 反應(yīng)程序下進行擴增，擴增后將PCR產(chǎn)物放于98°C高溫下變性lOmin，從而使DNA雙鏈充分變性為DNA單鏈。然后再對變性后的擴增片段進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)分析，并鑒定其多態(tài)片段，得秦川牛AMPDl基因第11內(nèi)含子區(qū)域第19416位和第19421 位分別發(fā)生了 T > C和A > G的單核苷酸多態(tài)性。所述的聚合酶鏈式反應(yīng)引物為上游引物5'-AACCCTCAGGCTCACCCA-3‘ 18bp ；下游引物5'-GGGCTTAGGGCTCTTGGA-3‘ 18bp。所述的PCR 反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性 5min，94°C 30s，60°C 40s, 72°C 40s，共 36 個循環(huán)，最后72°C延伸10min，4°C保存。所述的PCR反應(yīng)體系是15 μ L反應(yīng)體系包括ddH20 6. 1 μ L，2XReaction Mix 7· 5 μ L，上游引物 0· 3 μ L，下游引物 0· 3 μ L，Golden DNA polymerase 0. 2 μ L，含 AMPDl 基因序列的DNA模板0.6 μ L。所述的檢測AMPDl基因單核苷酸多態(tài)性的方法，聚丙烯酰胺凝膠的質(zhì)量濃度為 10%。本發(fā)明根據(jù)AMPDl基因的序列設(shè)計引物，以秦川牛的基因組DNA為模板，進行PCR 擴增，并對PCR產(chǎn)物進行測序，測序后得到秦川牛的AMPDl基因的部分序列。與NCBI公布的序列進行比較發(fā)現(xiàn)在g. 19416T > C和g. 19421A > G兩個位置存在SNPs多態(tài)性。針對上述的SNPs多態(tài)性，本發(fā)明還公開了其篩查和檢測方法，通過設(shè)計特定的引物，構(gòu)建混合DNA樣品池，PCR擴增，擴增產(chǎn)物直接測序，特定的聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定， 能夠簡單、快速、低成本、精確的檢測其單核苷酸的多態(tài)性。
本發(fā)明對秦川牛的SNPs基因型進行了檢測和基因頻率分析，對上述SNPs位點與秦川牛生長和胴體性狀進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明該連鎖突變位點能夠作為秦川牛生長和胴體性狀的分子標記。


圖1為秦川牛血樣基因組DNA電泳檢測圖。圖2為秦川牛AMPDl基因第11內(nèi)含子PCR產(chǎn)物1. 5%瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3為秦川牛AMPDl基因第11內(nèi)含子PCR產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。下面結(jié)合

和發(fā)明人給出的最佳實施方式對本發(fā)明做進一步的詳細說明， 以使公眾對發(fā)明內(nèi)容從整體上得到充分的理解，而并非對本發(fā)明保護范圍的限定。
具體實施例方式以下實施例中所用的主要試劑來源一、常用實驗試劑檸檬酸，檸檬酸鈉，葡萄糖，氯化鈉，氯化鉀，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，乙二氨四乙酸二鈉，瓊脂糖，鹽酸，硼酸，氫氧化鈉，蔗糖，氯仿，硝酸銀，丙烯酰胺，甲醛，Tris飽和酚，二甲基苯青FF，Tris，十二烷基磺酸鈉，無水乙醇，溴酚藍，N, N’ -亞甲雙丙烯酰胺，去離子甲酰胺，TEMED，核酸染料，蛋白酶K，DNA聚合酶，DNA Marker I，PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒等，均購自北京天根生化科技有限公司。二、試劑和溶液的配制試劑和溶液的配制方法具體如下(I)ACD 抗凝劑檸檬酸2. 4g，檸檬酸鈉6. 6g，葡萄糖7. 35g，加水定容至50mL蒸餾水中，采集血樣時，在新鮮血液中按一定比例加入A⑶。A⑶在血液貯存過程中能更好地保存DNA的天然狀態(tài)。O) PBS 緩沖液NaCl 4g，KCl 0. lg, Na2HPO4O. 72g，KH2PO4O. 12g，加滅菌過的蒸餾水定容至 500mL， 用pH試紙調(diào)pH至7. 4，120°C高壓滅菌20min。(3)0. 5mol/L EDTA稱量186. Ig乙二胺四乙酸二鈉倒入500mL滅菌蒸餾水中，在磁力攪拌器上攪拌使其溶解，溶解后定容至IOOOmL,用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值到8.0，120°C高壓滅菌20min。G) DNA 抽提液分別量取lmmol/L Tris · Cl IOOmL, 5mmol/L NaCl 40mL，0. 5mmol/LEDTA 400mL, 10%十二烷基磺酸鈉lOOmL，定容至1000mL。pH值用NaOH調(diào)為8. 0。⑶蛋白酶K加5mL滅菌蒸餾水，稀釋成20mg/mL，放入_20°C保存?zhèn)溆谩?6) 70% 乙醇
無水乙醇350mL，加蒸餾水150mL定容至500mL。(7) 10XTBE 緩沖液稱取Tris 54g,硼酸27. 5g，EDTA · Na23. 72g，加熱混勻，保存?zhèn)溆谩?幻40%的蔗糖水溶液40g蔗糖加入60g滅菌水中溶解，保存于4°C冰箱。(9) SSCP垂直電泳上樣緩沖液0. 025%溴酚藍，0. 025% 二甲基苯青FF，40%的蔗糖水溶液。(10) SSCP 變性劑95% 的去離子甲酰胺 9. 8mL，0. 5mol/L EDTA(調(diào) pH = 8. 0) 200 μ L，二甲苯青 FF 100 μ L，溴酚藍 100 μ Lo(11) 30% 丙烯酰胺稱取丙烯酰胺29g和N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺Ig加水至IOOmL,加熱使完全溶解，置于棕色瓶中4°C條件下保存?zhèn)溆谩Ｅ淙芤簳r需戴手套，以防止丙烯酰胺的神經(jīng)毒性作用。(1 10%過硫酸銨IOg過硫酸銨放入IOOmL滅菌水中，充分溶解后放入4°C儲存。最好現(xiàn)用現(xiàn)配。(13)染色液稱取0. 5g硝酸銀溶于500mL雙蒸水中，棕色瓶保存以避免硝酸銀發(fā)生氧化。(14)顯色液稱IOg氫氧化鈉，0. 2g無水碳酸鈉溶解于500mL雙蒸水中，用前加750 μ L甲醛。三、軟件工具(1)引物設(shè)計軟件Primer Premier 5. 0軟件結(jié)合Oligo 6. 0軟件自行設(shè)計引物；(2)序列分析軟件BioXM (Version 2. 6)軟件和DNA Star 7. 10軟件進行序列比對和突變位點分析；(3)統(tǒng)計分析軟件EXCELL用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計；SPASS 16. 0進行各性狀指標的統(tǒng)計和分析，以及差異顯著性檢驗。實施例1 秦川牛樣本采集、基因組DNA提取以及DNA樣品池的構(gòu)建一、實驗動物的采集2008年9月至11月在陜西省秦寶牧業(yè)發(fā)展有限公司，從秦川牛群體中隨機選取 30士2月齡的公牛屠宰，共采集秦川牛血樣215份。15mL全血中加入0. 5mL的A⑶抗凝劑， 上下顛倒混勻后置于冰盒中帶回實驗室，樣品放于-80°C保存?zhèn)溆?。二、牛血樣基因組DNA的提取過程血樣基因組DNA的提取，具體操作如下(1)將血樣從_80°C取出后，放于常溫下讓其慢慢的融化；在半凍融狀態(tài)下開始吸取800 μ L的血液于^iiL的滅過菌的離心管中；(2)再從PBS緩沖液中吸取800 μ L，使總體積達到1600 μ L，輕輕搖動IOmin ；(3)低溫下，12000rpm 離心 IOmin ；
(4)棄上清，重復(fù)上面的步驟，直到上清液變的清亮；(5)加入DNA抽提液800 μ L，緩慢搖動IOmin,于37°C水浴1. 5h ；(6)加蛋白酶K 5 μ L，混勻后在恒溫水浴箱中57°C過夜消化蛋白質(zhì)等，當溶液變得澄清透明時，便可拿出；(7)加入800 μ L的Tris飽和酚，放在冰上溫和搖動15min ；(8)低溫下，12000rpm 離心 IOmin ；(9)用大口徑槍頭小心吸取上清液到滅菌的離心管中；(10)加入400 μ L的Tris飽和酚和400 μ L的氯仿，放在冰上溫和搖動15min ；(11)低溫下，12000rpm 離心 IOmin ；(12)用大口徑槍頭小心吸取上清液到另一個滅菌的離心管中；(13)加入800 μ L的氯仿，放在冰上溫和搖動15min ；(14)低溫下，12000rpm 離心 IOmin ；(15)用大口徑槍頭小心吸取上清液到另一個滅菌的離心管中；(16)加入至少2倍體積的無水乙醇，上下顛倒數(shù)次使DNA析出；(17)低溫下，12000rpm離心lOmin，棄去乙醇；(18)加入70%的乙醇lmL，溫和搖動IOmin ；(19)低溫下，12000rpm離心lOmin，如有需要視情況可重復(fù)漂洗一次；(20)室溫下讓乙醇揮發(fā)干凈，加入一定量滅菌水溶解DNA，完全溶解后測定濃度和純度。三、紫外分光光度計測定DNA濃度和純度以50ng/ μ L作為標準DNA濃度，若測得的DNA濃度在50ng/ μ L左右，說明DNA 濃度符合實驗要求；濃度過高的需要稀釋成標準濃度；濃度過低的需重新提取DNA。若A26Qnm/A28Qnm比值在1. 6_2. O之間時，可判定DNA的純度基本符合要求。若 A260nm/A280nm比值小于1. 6或者大于2. O時，可判定純度不符合要求。必須對樣品DNA做進一步的純化，或重新提取DNA。四、瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量(1)將凝膠電泳槽洗干凈，插上梳子。(2)稱取0.5g的瓊脂糖，轉(zhuǎn)入三角瓶中，加入IXTBE 20mL使其懸浮，微波爐加熱 70秒，待溶液沸騰呈透明狀時拿出。(3)待三角瓶內(nèi)液體溫度不燙手時，按10 1的比例加入2μ L核酸染料，輕微搖動，防止出現(xiàn)氣泡。(4)混勻后，立即將瓊脂糖溶液倒入槽內(nèi)。如出現(xiàn)氣泡，立即用針頭或干凈的小槍頭將氣泡挑破。(5)放置一段時間后，用手觸摸(戴手套)如果完全冷卻凝固，拔掉梳子，將凝膠移入電泳槽中。(6)向電泳槽中加入1 XTBE緩沖液，使液面高出膠面5mm。(7)取DNA樣品3yL，加3μ L上樣緩沖液后，混勻上樣。(8) IOOV 電壓電泳 Ih。(9)在凝膠成像系統(tǒng)上觀察，如果電泳條帶清晰而規(guī)則，沒有明顯拖尾現(xiàn)象，說明提取的DNA效果較好，可以滿足實驗需要，否則需重新提取相應(yīng)樣品的DNA。五、混合DNA樣品池的構(gòu)建本實驗混合DNA樣品池的構(gòu)建方法如下將提取的基因組DNA，用紫外分光光度計測量每個DNA樣品濃度各3次，取平均值，再將樣品稀釋到終濃度為50ng/ μ L，10個DNA樣品中各取2 μ L快速構(gòu)建成DNA池。以池中DNA樣品為模板進行擴增，并送去測序，快速篩查基因的SNPs。結(jié)果秦川牛血樣基因組DNA的檢測結(jié)果見圖1。實施例2 秦川牛AMPDl基因第11內(nèi)含子的PCR擴增一、秦川牛AMPDl基因第11內(nèi)含子PCR引物的設(shè)計以NCBI數(shù)據(jù)庫中GenBank公布的牛(登錄號NC_007301)序列為參考，利用 Premier 5.0軟件結(jié)合Oligo 6. 0軟件設(shè)計秦川牛AMPDl基因第11內(nèi)含子的PCR引物(片段大小為，其引物序列如下上游引物5' -AACCCTCAGGCTCACCCA-3‘ 18bp ；下游引物5' -GGGCTTAGGGCTCTTGGA-3‘ 18bp。該引物對擴增了秦川牛AMPDl基因第11內(nèi)含子區(qū)域。二、PCR 擴增(I)PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系采用混合加樣法，實驗中我們通常是先計算出每一種成份所需要的量，然后再算出加樣總量，之后均等分裝到每一個PCR管，然后加入模板DNA，再瞬時離心后進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系如表1。表IPCR反應(yīng)體系

(2) PCR反應(yīng)程序
PCR反應(yīng)程序見表2
表2PCR反應(yīng)程序
權(quán)利要求
1.一種檢測秦川牛AMPDl基因連鎖突變的PCR-SSCP方法，其特征在于，以包含AMPDl 基因的待測秦川牛全基因組DNA序列為模板，在2XReaction Mix^ddH2O,Forward primer、 Reverse primer,Golden DNA polymerase、DNA模板存在的情況下，設(shè)計聚合酶鏈式反應(yīng)引物，在PCR反應(yīng)程序下進行擴增，擴增后對PCR產(chǎn)物進行變性，然后再對變性后的擴增片段進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)分析，并鑒定其多態(tài)片段，得秦川牛AMPDl基因第11內(nèi)含子區(qū)域第19416位和第19421位分別發(fā)生了 T > C和A > G的單核苷酸多態(tài)性；所述的聚合酶鏈式反應(yīng)引物為 上游引物5' -AACCCTCAGGCTCACCCA-3‘ 18bp ； 下游引物5 ‘ -GGGCTTAGGGCTCTTGGA-3‘ 18bp。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測秦川牛AMPDl基因連鎖突變的PCR-SSCP方法，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性 5min，94°C 30s，60°C 40s，72°C 40s，共 36 個循環(huán)，最后 72°C延伸 10min，4°C保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測秦川牛AMPDl基因連鎖突變的PCR-SSCP方法，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)體系為總體積為15μ L的反應(yīng)體系，包括2 X Reaction Mix 7. 5 μ L，ddH20 6. 1 μ L，上游引物 0. 3 μ L，下游引物 0. 3 μ L，Golden DNA polymerase 0. 2 μ L，含 AMPDl 基因序列的 DNA 模板 0. 6 μ L0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測秦川牛AMPDl基因連鎖突變的PCR-SSCP方法，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝膠濃度為10%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測秦川牛AMPD1基因連鎖突變的PCR-SSCP方法，該方法是以包含AMPD1基因的待測秦川牛全基因組DNA序列為模板，在2×Reaction Mix、ddH2O、Forward primer、Reverse primer、Golden DNApolymerase、DNA模板存在的情況下，設(shè)計聚合酶鏈式反應(yīng)引物，在PCR反應(yīng)程序下進行擴增，擴增后對PCR產(chǎn)物進行變性，然后再進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)分析其片段，從而確定其單核苷酸多態(tài)性。該檢測方法操作簡單、快速、成本低，而且檢測的精確度高，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK102363803SQ20111011770
公開日2012年2月29日 申請日期2011年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月9日
發(fā)明者劉小林, 張慧林, 賀花 申請人:西北農(nóng)林科技大學