專利名稱：水稻根尖特異表達(dá)基因OsRTS2的啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及克隆水稻0sRTS2(riCe root tip specific 2)基因編碼區(qū)的上游啟動子核苷酸序列，該序列的功能在于能啟動下游編碼基因在水稻根冠表層細(xì)胞中的特異表達(dá)，以及能啟動下游編碼基因在水稻花藥中的特異表達(dá)。
背景技術(shù)：
根系是植物吸收水分、養(yǎng)分的重要器官。根的結(jié)構(gòu)大致可分為四部分根冠、分生區(qū)、伸長區(qū)和根毛區(qū)。細(xì)胞在分生區(qū)中不斷分裂增殖，新生的細(xì)胞分化和發(fā)育，形成根的各種組織。發(fā)育中的細(xì)胞體積增加，組成伸長區(qū)。發(fā)育完成的細(xì)胞體積不再迅速增加，在表皮位置的細(xì)胞上發(fā)生毛狀突起，組成根毛區(qū)。伸長區(qū)細(xì)胞體積增加形成壓力推動分生區(qū)向前移動，部分分生區(qū)細(xì)胞分化并覆蓋在根的尖端，起到保護(hù)和引導(dǎo)的作用，成為根冠。根尖由分生區(qū)和根冠組成，其核心為靜止中心。靜止中心細(xì)胞具有分化為其它細(xì)胞的潛在活性，以此為基礎(chǔ)產(chǎn)生組成根尖的表皮、皮層、中柱鞘、中柱、根冠細(xì)胞。研究根尖細(xì)胞的分化與發(fā)育，對了解、控制和改良根系的性狀具有重要意義。根系的發(fā)育是一個復(fù)雜的過程。目前的研究主要是基于雙子葉模式植物擬南芥 (Arabidopsis thaliana)的根系相關(guān)突變體展開的，而以水稻(Oryza sativa)為模式植物的禾本科作物的根系發(fā)育機(jī)制研究較少。遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是利用優(yōu)良基因(尤其是外源基因)改良物種的一條重要途徑。通過遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)改良物種除需要優(yōu)良基因資源外，還需要適用于目標(biāo)基因在最佳狀態(tài)下發(fā)揮功能的啟動子。國際國內(nèi)可供選擇用于農(nóng)作物性狀改良的功能基因的數(shù)量逐漸在增加。但是與之相比，可供選擇的啟動子數(shù)量和種類卻非常有限，尤其缺乏適用于改良農(nóng)作物性狀的啟動子。啟動子已經(jīng)成為采用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)改良物種的瓶頸之一。目前國際國內(nèi)用于農(nóng)作物遺傳轉(zhuǎn)化的啟動子主要是玉米泛素(ubiquitin)基因啟動子、水稻肌動蛋白 (actin)基因啟動子、病毒35S等組成型表達(dá)啟動子。它們調(diào)控目標(biāo)基因在所有組織中都表達(dá)，而且沒有時空限制。用這些啟動子調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)時，由于大量目標(biāo)蛋白在不需要的細(xì)胞中出現(xiàn)，往往容易造成物種形態(tài)和生理功能異常。雖然國際上也有少量特異啟動子分離克隆的報道，但是涉及的農(nóng)作物的種類很少，數(shù)量非常有限，而且我們不具有知識產(chǎn)權(quán)， 將受限于生產(chǎn)應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種水稻根尖特異表達(dá)基因0sRTS2的啟動子， 利用該啟動子(0sRTS2基因啟動子)能啟動外源基因在水稻根尖部位特異表達(dá)。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種水稻根尖特異表達(dá)基因0sRTS2的啟動子，該啟動子為SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。作為本發(fā)明的水稻根尖特異表達(dá)基因0sRTS2的啟動子的改進(jìn)啟動子還包括在SEQ IDNO :1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一個或多個核苷酸生成的突變體、 等位基因和衍生物。作為本發(fā)明的水稻根尖特異表達(dá)基因0sRTS2的啟動子的進(jìn)一步改進(jìn)啟動子還包括是在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列雜交、且具有相同功能的核苷酸序列。本發(fā)明還同時公開了上述水稻根尖特異表達(dá)基因0sRTS2的啟動子的用途用于組織特異表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記和發(fā)展雄性不育品系。本發(fā)明的啟動子是水稻根尖特異表達(dá)基因0sRTS2的基因編碼區(qū)的上游序列。通過構(gòu)建含有該啟動子的植物表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化到轉(zhuǎn)基因水稻中，對轉(zhuǎn)基因材料的普通葉、 劍葉、花和根等多種不同組織進(jìn)行了 GUS組織化學(xué)染色檢測，結(jié)果證實了該啟動子在根尖中的特異表達(dá)，并進(jìn)一步明確該啟動子的特異表達(dá)位置僅限于根冠外表面細(xì)胞，以及地上部的花藥。利用本發(fā)明的啟動子構(gòu)建轉(zhuǎn)基因水稻，具有如下優(yōu)點1、可以啟動下游基因特異性地高效表達(dá)于根冠表面，而不啟動該基因在根其它部位的表達(dá)。這種特性有助于以連接熒光蛋白等報告基因的方式將上述位置的細(xì)胞與周圍的其它細(xì)胞區(qū)分開來。2、可以啟動下游基因特異性地表達(dá)于花藥。這種特性有助于通過連接毒蛋白的方式使花藥細(xì)胞活性受限，制造在育種中具有重要意義的雄性不育品系。在本發(fā)明中，我們在0sRTS2啟動子的下游連接了一個報告基因(GUQ.由于GUS表達(dá)的部位可被染成藍(lán)色，所以可以直觀顯示出啟動子的組織特異性。該專利的應(yīng)用旨在將來啟動子下游接上特定的熒光標(biāo)記基因，使之特異增強表達(dá)于上述特定表皮細(xì)胞中，便于在活體條件下研究基因在植物根系早期發(fā)育中調(diào)控和互作關(guān)系。這種僅針對特定組織或細(xì)胞的靶向性遺傳標(biāo)記對相關(guān)研究具有很大的技術(shù)儲備價值。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖 1 是 pBIlOl. I-GUS plus 載體示意圖。圖 2 是 pCAMBIA1300_GUSplus 載體示意圖。圖3是0sRTS2啟動子融合⑶S基因轉(zhuǎn)基因材料的染色結(jié)果。圖中A，體視鏡照片顯示0sRTS2啟動子在根尖特定區(qū)域特異表達(dá)；B，樹脂切片顯示0sRTS2啟動子的表達(dá)位置僅限于根冠表層細(xì)胞；C，0sRTS2啟動子也在花藥中表達(dá)；D，根尖組織結(jié)構(gòu)劃分。bars = 500 μ m(A)，bar = 100 μ m(B，C)。
具體實施例方式本發(fā)明的以下實施例所使用分子生物學(xué)的方法均為已知的技術(shù)。在Ausubel編寫白勺 John Wiley and Sons 公司出片反的 Current Protocols in Molecular Biology，和 J· Sambrook 等編寫 Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)出片反白勺 Molecular Cloning :A Labortory Manual, 3rd ED.等文獻(xiàn)均有詳細(xì)的說明。實施例1、根據(jù)相關(guān)研究，獲知0sRTS2可能為根尖組織特異表達(dá)基因。根據(jù)0sRTS2基因編碼區(qū)的上游序列設(shè)計特異引物，以野生型Nipponbare的基因組DNA為模板，擴(kuò)增出全長 1342bp的0sRTS2基因啟動子，其核苷酸序列為SEQ ID NO 1所示(即如序列表所述)。
引物序列如下
上游引物CGTGGGCTCGTACAAC下游引物CCCAAAGCTCTATCATATCAA野生型Nipponbare的基因組DNA的提取方法為將野生型水稻品種Nipponbare葉片用液氮冷卻研磨粉碎，用CTAB法提取基因組 DNA,具體過程如下1)往粉碎的組織中加入65°C預(yù)熱的2-ME/CTAB，混合使之充分濕潤，于65°C育 10 60min，不時混勻。2)用等體積的M 1氯仿/辛醇或氯仿/異戊醇抽提勻漿液，顛倒使充分混合， 于4°C，7500g離心5min，回收上層水相。3)在回收的上層相中加入1/10體積的65°C的CTAB/NaCl溶液，顛倒混勻。4)用等體積的氯仿/辛醇抽提，混勻，離心，回收上層水相。5)加入等體積的CTAB沉淀液，顛倒混勻。6)于 4"C，500g 離心 5min。7)移出上清，用高鹽的TE緩沖液重懸沉淀，如果沉淀難于重懸，于65°C溫育 30min,重復(fù)直至所有的或大部分沉淀溶解。8)加入0. 6體積的異丙醇沉淀核酸，充分混勻，于4°C 7500g,離心15min。9)用80%乙醇洗滌沉淀物，干燥，用盡可能少的TE緩沖液重懸(每克起始材料 0. 1 0. 5mL)。利用Prime Star DNA Polymerase把整個啟動子DNA序列擴(kuò)增出來利用 Takara 公司的 Prime Star DNA Polymerase,以野生型 Nipponbare 的基因組 DNA為模板(稀釋20倍)擴(kuò)增0sRTS2啟動子序列。反應(yīng)體系如下
5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+ Plus) 4 μ 1 dNTP Mixture (各 2.5 mM) 1 μ 1 上游引物(ΙΟμιη) Ιμ 下游引物(ΙΟμιη) Ιμ 基因組DNA模板 μ
無菌去離子水11.8 μ 1PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2. 5U/ μ 1) 0· 2 μ 1。在PTC200型PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下1)94°C 2min,2) 94 °C 10s3) 62-58 °C Ramp 2 V /s4) 72 °C 3min5)返回2)，循環(huán)30次
6) 72 "C 7min7)4°C 保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化和Pstl/Ncol酶切后在0. 8 %瓊脂糖凝膠上電泳并割膠回收目的條帶，回收的DNA片段經(jīng)Pstl/Ncol酶切插入同樣經(jīng)Pstl/Ncol酶切的 pCAMBIA1300-GUSplus載體(圖1)，連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，涂板培養(yǎng)。隨機(jī)挑取若干菌落，經(jīng)搖菌、抽提質(zhì)粒、Pstl/Ncol酶切、電泳檢測，挑取可切出正確長度 DNA片段的陽性單克隆測序。鑒定出的正確克隆經(jīng)I^stl/SacI酶切，切出的片段連接到同樣Pstl/SacI酶切的ρΒΙΙΟΙ. I-GUS plus載體(圖1)，連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α 感受態(tài)細(xì)胞，涂板培養(yǎng)。隨機(jī)挑取若干菌落，經(jīng)搖菌、抽提質(zhì)粒、Pstl/^acI酶切、電泳檢測， 挑取可切出正確長度DNA片段的菌株為陽性單克隆。酶切鑒定為陽性的單克隆菌液擴(kuò)繁后抽質(zhì)粒，即為0sRTS2P-GUSplus質(zhì)粒。該質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞。該農(nóng)桿菌菌株用于水稻轉(zhuǎn)基因。上述實驗過程中使用的載體均根據(jù)常用載體按照常規(guī)方法改造而來。將 PCAMBIA1305. 1上的⑶S plus序列用PCR的方法擴(kuò)增出，上游引物5’端頭加了 BamH I和 Kpn I酶切接頭，下游引物5’端頭加了 Mc I酶切接頭。PCR產(chǎn)物用BamH I/Sac I酶切后連入用相同酶切的ρΒΙΙΟΙ. 3中，獲得的載體稱為ρΒΙΙΟΙ. I-GUS plus。所用引物序列為GUS plus-up AACGGATCCACGGTACCATGGTAGATCTGAGGGTAAATTTCGUS plus-low ACGGAGCTCTCACACGTGATGGTGATGGTGATGGρΒΙΙΟΙ. I-GUS plus載體用Hind III/EcoR I切出含GUS基因的片段，連入用相同酶切的PCAMBIA1300載體中,所得的載體稱為pCAMBIA1300_GUSplus。實施例2、水稻成熟種子經(jīng)脫殼和消毒處理后放置在成熟胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3周。挑取自然分裂的胚性愈傷組織(淡黃色，致密呈球狀)，置入繼代培養(yǎng)基中， 在光照培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)，獲得水稻愈傷。水稻愈傷經(jīng)過0sRTS2P-GUSplUs質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌侵染、共培養(yǎng)、在含有G418抗生素的培養(yǎng)基上篩選。能夠正常生長的愈傷經(jīng)分化、 生根、練苗移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌(EHA1(^)介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系主要應(yīng)用Hiei等人(1994)報道的方法基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化。獲得的轉(zhuǎn)基因苗后代用GUS染液染色后見圖3所示。表明0sRTS2基因啟動子驅(qū)動的⑶S在根尖生長點附近的原始表皮細(xì)胞以及雄蕊中特異表達(dá)。對比例1、花椰菜花葉病毒35S啟動子為植物轉(zhuǎn)基因常用的啟動子。實施例2中使用的 0sRTS2P-GUSplus質(zhì)粒即含有35S啟動子，用于啟動G418抗性基因。35S啟動子可保證G418 抗性基因在包括愈傷組織在內(nèi)的所有組織中表達(dá)，從而保證轉(zhuǎn)入0sRTS2P-GUSplUs質(zhì)粒的愈傷及其分化后的植株能夠在含G418的培養(yǎng)條件下存活。若使用35S啟動子替代0sRTS2 啟動子，同樣會導(dǎo)致外源基因(如GUQ在幾乎所有組織中表達(dá)，從而失去組織特異性。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.水稻根尖特異表達(dá)基因《sTtTM的啟動子，其特征在于該啟動子為SEQID N0:1所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻根尖特異表達(dá)基因OsRTS2的啟動子，其特征是所述啟動子還包括在SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一個或多個核苷酸生成的突變體、等位基因和衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻根尖特異表達(dá)基因OsRTS2的啟動子，其特征是所述啟動子還包括是在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列雜交、且具有相同功能的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的水稻根尖特異表達(dá)基因OsRTS2的啟動子的用途用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因水稻，為建立水稻組織特異表達(dá)標(biāo)記品系。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻根尖特異表達(dá)基因OsRTS2的啟動子，該啟動子為SEQIDNO1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還同時公開了上述水稻根尖特異表達(dá)基因OsRTS2的啟動子的用途用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因水稻，為建立水稻組織特異表達(dá)標(biāo)記品系。該啟動子的功能在于能啟動下游編碼基因在水稻根冠表層細(xì)胞中的特異表達(dá)，以及能啟動下游編碼基因在水稻花藥中的特異表達(dá)。
文檔編號C12N15/113GK102206643SQ20111009050
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月12日
發(fā)明者吳平, 張麝龍, 莫肖蓉 申請人:浙江大學(xué)