專利名稱：一種基于主效qtl連鎖標(biāo)記的大白菜低硝酸鹽含量檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體說就是一種基于主效QTL連鎖標(biāo)記的大白菜低硝酸鹽含量檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
大白菜是世界上主要蔬菜種類之一，我國栽培面積最大，每年大白菜播種面積900 萬畝左右，特別是中國加入WTO后，蔬菜的出口有極大的優(yōu)勢(shì)。大白菜有喜歡N03_的特性， 是一種硝酸鹽含量高的作物種類，這對(duì)人們的身體健康構(gòu)成了潛在的威脅。為了降低大白菜產(chǎn)品中的硝酸鹽含量，人們采取了各種措施如合理施用氮肥、改善大白菜生長的生態(tài)條件，適時(shí)采收等，但隨著氮肥施用量的逐年增加，大白菜硝酸鹽污染日益嚴(yán)重。常規(guī)方法雖然降低了大白菜中硝酸鹽含量，但是很難使大白菜中硝酸鹽含量降到安全范圍。培育推廣低硝酸鹽含量的大白菜品種是環(huán)保、高效的控制策略。大量前人工作(沈明珠，園藝學(xué)報(bào)， 1982,9(4) 41-47 ；Cheneby, Micorbial Ecology, 2003,46 (1) :113_121 ；Reinink, Annal s of Applied Biology, 1989,115 (3) :553_561 ；楊樹秀，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40 (12) 24-28)已表明大白菜的硝酸鹽含量性狀是可遺傳的，但常規(guī)育種實(shí)踐中，對(duì)低硝酸鹽含量大白菜育種材料選育困難，周期長、效率低，硝酸鹽含量受多種因素影響，這些導(dǎo)致了大白菜大白菜低硝酸鹽育種進(jìn)展緩慢。近幾年發(fā)展起來的分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，有效解決了這一問題，通過構(gòu)建硝酸鹽含量的遺傳圖譜和數(shù)量性狀位點(diǎn)(Quantitative Trait Locus, QTL)分析可以找到與大白菜硝酸鹽含量主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記。使用與某一特定大白菜品種硝酸鹽含量主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記可以對(duì)特定的低硝酸鹽大白菜品種的后代及其衍生品種或品系進(jìn)行早期基因型檢測(cè)，淘汰硝酸鹽含量高的植株，節(jié)約生產(chǎn)成本， 提高育種效率。大白菜品種A62-2-2-1是東北農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的低硝酸鹽大白菜育種材料， 是由日本引進(jìn)的品種耐病60天與哈白二號(hào)配制雜交一代，對(duì)雜交一代進(jìn)行五代自交選擇而成，經(jīng)硝酸鹽含量檢測(cè)為低硝酸鹽含量的材料，目前已應(yīng)用于低硝酸鹽育種中(楊樹秀， 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40 (12) :24-28)。目前尚未有與硝酸鹽含量主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用方法報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種通過檢測(cè)分子標(biāo)記預(yù)測(cè)大白菜硝酸鹽含量、應(yīng)用分子標(biāo)記進(jìn)行硝酸鹽含量鑒定、不受環(huán)境條件影響、減少育種工作量、提高選擇準(zhǔn)確性和育種效率的基于主效QTL連鎖標(biāo)記的大白菜低硝酸鹽含量檢測(cè)方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的步驟如下步驟一對(duì)A62-2-1大白菜植株的葉片分離提取獲得DNA，用大白菜品種A62-2-1 的 DNA，采用 PCR 弓丨物 TGGGAATCTCCTTTAGCAC 和 ACAAATCCAGGTCTCATCG 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得大小為300bp的分子標(biāo)記E18-300 ；所述6%聚丙烯酰胺凝膠，是指IOOml聚丙烯酰胺凝膠溶液中含有5. 7克丙烯酰胺和0. 3克甲叉雙丙烯酰胺；步驟二 將E18-300用于大白菜品種A62_2_l及其衍生品種或品系的基因型檢測(cè)，以判斷該品種或品系硝酸鹽含量；所述大白菜品種A62-2-1衍生品種或品系是指以 A62-2-1為親本，通過常規(guī)雜交、或采用組織培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)、花粉培養(yǎng)、游離小孢子培養(yǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化、物理誘變和化學(xué)化學(xué)誘變方法獲得的大白菜品種或品系，或采用花藥培養(yǎng)、花粉培養(yǎng)、游離小孢子培養(yǎng)獲得單倍體，再用秋水仙素處理獲得雙單倍體；步驟三判斷如步驟二所述的大白菜品種A62-2-1衍生品種或品系的硝酸鹽含量的方法是將大白菜品種A62-2-1及其衍生品種或品系為母本或父本與其他大白菜品種雜交并繁衍至F2以上，對(duì)大白菜植株的葉片分離提取獲得DNA，然后用E18-300的PCR引物 TGGGAATCTCCTTTAGCAC 和 ACAAATCCAGGTCTCATCG 對(duì)這些 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，判斷是否具有大白菜品種A62-2-1的低硝酸鹽含量主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記E18-300，來預(yù)測(cè)該品種或品系硝酸鹽含量；只有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)唯一一條300bp的E18-300時(shí)，則預(yù)測(cè)該品種或品系具有低硝酸鹽含量；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)唯一一條290bp的E18-290時(shí)，則預(yù)測(cè)該品種或品系具有高硝酸鹽含量；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)出現(xiàn)300bp和290bp的E18-300和E18-290 時(shí)，則預(yù)測(cè)該品種或品系具有中等硝酸鹽含量；所述的低硝酸鹽含量是指大白菜硝酸鹽含量低于300mg/kg鮮樣，所述的中等硝酸鹽含量是指大白菜硝酸鹽含量介于300mg/kg鮮樣到400mg/kg鮮樣之間，所述的高硝酸鹽含量是指大白菜硝酸鹽含量在400mg/kg鮮樣以上。本發(fā)明用于界定與大白菜品種A62-2-1低硝酸鹽含量主效QTL緊密連鎖分子標(biāo)記，通過檢測(cè)分子標(biāo)記可以預(yù)測(cè)大白菜硝酸鹽含量，應(yīng)用分子標(biāo)記進(jìn)行硝酸鹽含量鑒定， 不受環(huán)境條件的影響，大大減少育種家的工作量，提高選擇的準(zhǔn)確性和育種效率。本發(fā)明克服常規(guī)育種大白菜硝酸鹽含量檢測(cè)易受環(huán)境影響，在苗期就可以通過分子標(biāo)記對(duì)大白菜植株的硝酸鹽含量進(jìn)行鑒定，淘汰高硝酸鹽含量的植株，減少常規(guī)育種中的人力和物力的浪費(fèi)，顯著加快育種進(jìn)程，提高育種效率和準(zhǔn)確率。本發(fā)明對(duì)大白菜低硝酸鹽含量品種 A62-2-1 (早)與大白菜高硝酸鹽含量品種A33-2( $ )雜交，獲得F2單株進(jìn)行基因型與葉球硝酸鹽含量表型數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳連鎖和QTL分析，獲得與A62-2-1低硝酸鹽含量主效QTL 緊密連鎖分子E18-300。通過檢測(cè)A62-2-1及其衍生品種或品系的DNA，是否有分子標(biāo)記 E18-300，可以預(yù)測(cè)其硝酸鹽含量，從而加快低硝酸鹽大白菜的選擇進(jìn)度。本發(fā)明是一種多基因控制的大白菜硝酸鹽含量的分子標(biāo)記輔助選擇鑒定技術(shù)，使用的A62-2-1是東北農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的低硝酸鹽大白菜育種材料，是由日本引進(jìn)的品種耐病60天與哈白二號(hào)配制雜交一代，對(duì)雜交一代進(jìn)行五代自交選擇而成，經(jīng)硝酸鹽含量檢測(cè)為低硝酸鹽含量的材料，目前已應(yīng)用于低硝酸鹽育種中(楊樹秀，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40 (12) :24-28)。目前尚未有硝酸鹽含量主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用方法報(bào)道，利用與A62-2-1低硝酸鹽含量主效QTL緊密連鎖分子E18-300，可以不受環(huán)境的影響，對(duì)特定的的低硝酸鹽材料的后代及衍生品種或品系在早代苗期進(jìn)行篩選，節(jié)約成本，提高育種和選擇效率。


圖1為本發(fā)明的A62-2-1低硝酸鹽含量QTL掃描的LOD圖；其中包含QTL的連鎖群區(qū)段和LOD值分布被顯示，縱軸為LOD值，橫軸為QTL連鎖群遺傳距離；圖2為本發(fā)明的A62-2-1低硝酸鹽含量QTL連鎖群定位分析示意圖。其中包含QTL的連鎖群區(qū)段被顯示，左側(cè)為標(biāo)記見的距離，右側(cè)為標(biāo)記的名稱。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖舉例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1 結(jié)合圖1、圖2，本發(fā)明一種基于主效QTL連鎖標(biāo)記的大白菜低硝酸鹽含量檢測(cè)方法，步驟如下步驟一對(duì)A62-2-1大白菜植株的葉片分離提取獲得DNA，用大白菜品種A62-2-1 的 DNA，采用 PCR 弓丨物 TGGGAATCTCCTTTAGCAC 和 ACAAATCCAGGTCTCATCG 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得大小為300bp的分子標(biāo)記E18-300 ；所述6% 聚丙烯酰胺凝膠，是指IOOml聚丙烯酰胺凝膠溶液中含有5. 7克丙烯酰胺和0. 3克甲叉雙丙烯酰胺；步驟二 將E18-300用于大白菜品種A62_2_l及其衍生品種或品系的基因型檢測(cè)，以判斷該品種或品系硝酸鹽含量；所述大白菜品種A62-2-1衍生品種或品系是指以 A62-2-1為親本，通過常規(guī)雜交、或采用組織培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)、花粉培養(yǎng)、游離小孢子培養(yǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化、物理誘變和化學(xué)化學(xué)誘變方法獲得的大白菜品種或品系，或采用花藥培養(yǎng)、花粉培養(yǎng)、游離小孢子培養(yǎng)獲得單倍體，再用秋水仙素處理獲得雙單倍體；步驟三判斷如步驟二所述的大白菜品種A62-2-1衍生品種或品系硝酸鹽含量的方法是將大白菜品種A62-2-1及其衍生品種或品系為母本或父本與其他大白菜品種雜交并繁衍至F2以上，對(duì)大白菜植株的葉片分離提取獲得DNA，然后用E18-300的PCR引物 TGGGAATCTCCTTTAGCAC 和 ACAAATCCAGGTCTCATCG 對(duì)這些 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，判斷是否具有大白菜品種A62-2-1的低硝酸鹽含量主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記E18-300，來預(yù)測(cè)該品種或品系硝酸鹽含量；只有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)唯一一條300bp的E18-300時(shí)，則預(yù)測(cè)該品種或品系具有低硝酸鹽含量；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)唯一一條290bp的E18-290時(shí)，則預(yù)測(cè)該品種或品系具有高硝酸鹽含量；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)出現(xiàn)300bp和290bp的E18-300和E18-290 時(shí)，則預(yù)測(cè)該品種或品系具有中等硝酸鹽含量；所述的低硝酸鹽含量是指大白菜硝酸鹽含量低于300mg/kg鮮樣，所述的中等硝酸鹽含量是指大白菜硝酸鹽含量介于300mg/kg鮮樣到400mg/kg鮮樣之間，所述的高硝酸鹽含量是指大白菜硝酸鹽含量在400mg/kg鮮樣以上。實(shí)施例2 結(jié)合圖1、圖2，本發(fā)明一種基于主效QTL連鎖標(biāo)記的大白菜低硝酸鹽含量檢測(cè)方法(1)采用低硝酸鹽含量大白菜品種A62-2-1 (早)與高硝酸鹽含量品種A33-2 (古) 雜交，獲得雜種F1;(2)雜種F1自交得到的F2分離群體，共計(jì)160個(gè)&單株；(3)分離提取160個(gè)&單株的DNA，選取在兩個(gè)親本間具有多態(tài)性的E18-300/ E18-290 標(biāo)記的引物 TGGGAATCTCCTTTAGCAC 和 ACAAATCCAGGTCTCATCG 及其它多態(tài)性 EST-SSR、SSR和SRAP引物根據(jù)已有方法(忻雅，園藝學(xué)報(bào)，2006，33 (3) 549-554 ；Thiel T， Theor. Appl. Gene, 2003,106 411~422 ；馮輝，園藝學(xué)報(bào)，2009，36 (1) :103_108 ；陳鋒，江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，23 (4) 283-288)對(duì)160個(gè)F2單株的DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠(100ml聚丙烯酰胺凝膠溶液中含有5. 7克丙烯酰胺和0. 3克甲叉雙丙烯酰胺)上電泳分離后，獲得分子標(biāo)記多態(tài)性數(shù)據(jù)。(4)基于連鎖遺傳交換定律，對(duì)分子標(biāo)記分析資料構(gòu)建大白菜遺傳連鎖圖，將獲得的多態(tài)性數(shù)據(jù)采用MAPMAKER/EXP3. 0，設(shè)定LOD彡2. 5，使用Kosambi函數(shù)構(gòu)建A62-2-1的遺傳連鎖圖。(5) 160個(gè)F2單株的硝酸鹽含量于208年7月14日開始，將用于分子標(biāo)記的160個(gè) F2單株進(jìn)行盆栽，盆的大小為30mX 30Cm ；土質(zhì)為壤土，肥力中上等，土壤基礎(chǔ)性狀為全氮 0. 220%、全磷 0. 081%、緩效鉀 451. 4mg .kg人堿解氮 147. Omg ·kg入速效磷 128. 6mg .kg人速效鉀103. 6mg · kg—1、有機(jī)質(zhì)4. 616%、PH值7. 20 ；將大白菜種子于2009年7月14日播種育苗，8月8日移栽到盆內(nèi)，每個(gè)單株在后期的施肥量和灌水量相同，每株施尿素8克。大白菜結(jié)球緊實(shí)后收獲，把每株總剖成四等份，取相對(duì)的兩份測(cè)定硝酸鹽含量。硝酸鹽含量測(cè)定采用改進(jìn)試粉法(杜應(yīng)瓊，園藝學(xué)報(bào)，2005，32 (1) 49-53)。為遺傳分析和QTL定位需要，劃定硝酸鹽含量低于300mg/kg鮮樣為低硝酸鹽含量，硝酸鹽含量介于300mg/kg鮮樣到400mg/kg鮮樣為中等硝酸鹽含量，硝酸鹽含量高于 400mg/kg鮮樣以為高硝酸鹽含量。(6)綜合遺傳圖譜資料和硝酸鹽含量數(shù)據(jù)，QTL分析采用Windows QTL Cartographer V2. 5軟件，采用復(fù)合區(qū)間作圖法對(duì)大白菜硝酸鹽含量的QTL進(jìn)行掃描，在 IOcM的窗口內(nèi)，以2cM的步行速度對(duì)連鎖群進(jìn)行掃描，以LOD大于2. 5作為QTL存在的閾值。即若某一區(qū)間內(nèi)LOD > 2. 5，則認(rèn)為該區(qū)間LOD值最高處存在一個(gè)QTL，復(fù)合區(qū)間作圖法分析發(fā)現(xiàn)在連鎖群1的E18-300/E18-290兩側(cè)存在與大白菜硝酸鹽含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)，LOD值分別為23. 3,27. 4。連鎖分析表明，標(biāo)記E18-300/E18-290與兩個(gè)QTL遺傳距離分別為1.3cM和3.6cM，表明E18-300與A62-2-1的低硝酸鹽含量QTL緊密連鎖。兩個(gè)QTL 分別解釋遺傳變異為24%、23% (見圖1、圖2、表一)。這兩個(gè)QTL位點(diǎn)加性效應(yīng)的掃描結(jié)果表明其加性效應(yīng)均為降低硝酸鹽位點(diǎn)，這對(duì)降低硝酸鹽含量的效應(yīng)來說表現(xiàn)為增效加性效應(yīng)，說明降低硝酸鹽含量的增效基因均來自母本A62-2-1。表明E18-300與A62-2-1的低硝酸鹽含量主效QTL緊密連鎖，可用于低硝酸鹽品種A62-2-1的后代及衍生品種或品系的硝酸鹽含量預(yù)測(cè)。表1 A62-2-1/A33-2低硝酸鹽含量主效QTL分析
權(quán)利要求
1. 一種基于主效QTL連鎖標(biāo)記的大白菜低硝酸鹽含量檢測(cè)方法， 其特征在于步驟如下步驟一對(duì)A62-2-1大白菜植株的葉片分離提取獲得DNA，用大白菜品種A62-2-1的 DNA,采用 PCR 引物 TGGGAATCTCCTTTAGCAC 和 ACAAATCCAGGTCTCATCG 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得大小為300bp的分子標(biāo)記E18-300 ；所述6% 聚丙烯酰胺凝膠，是指IOOml聚丙烯酰胺凝膠溶液中含有5. 7克丙烯酰胺和0. 3克甲叉雙丙烯酰胺；步驟二 將E18-300用于大白菜品種A62-2-1及其衍生品種或品系的基因型檢測(cè)，以判斷該品種或品系硝酸鹽含量；所述大白菜品種A62-2-1衍生品種或品系是指以A62-2-1為親本，通過常規(guī)雜交、或采用組織培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)、花粉培養(yǎng)、游離小孢子培養(yǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化、物理誘變和化學(xué)化學(xué)誘變方法獲得的大白菜品種或品系，或采用花藥培養(yǎng)、花粉培養(yǎng)、游離小孢子培養(yǎng)獲得單倍體，再用秋水仙素處理獲得雙單倍體；步驟三判斷如步驟二所述的大白菜品種A62-2-1衍生品種或品系的硝酸鹽含量的方法是將大白菜品種A62-2-1及其衍生品種或品系為母本或父本與其他大白菜品種雜交并繁衍至F2以上，對(duì)大白菜植株的葉片分離提取獲得DNA，然后用E18-300的PCR引物 TGGGAATCTCCTTTAGCAC 和 ACAAATCCAGGTCTCATCG 對(duì)這些 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，判斷是否具有大白菜品種A62-2-1的低硝酸鹽含量主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記E18-300，來預(yù)測(cè)該品種或品系硝酸鹽含量；只有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)唯一一條300bp的E18-300時(shí)，則預(yù)測(cè)該品種或品系具有低硝酸鹽含量；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)唯一一條290bp的E18-290時(shí)，則預(yù)測(cè)該品種或品系具有高硝酸鹽含量；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)出現(xiàn)300bp和290bp的E18-300和E18-290 時(shí)，則預(yù)測(cè)該品種或品系具有中等硝酸鹽含量；所述的低硝酸鹽含量是指大白菜硝酸鹽含量低于300mg/kg鮮樣，所述的中等硝酸鹽含量是指大白菜硝酸鹽含量介于300mg/kg鮮樣到400mg/kg鮮樣之間，所述的高硝酸鹽含量是指大白菜硝酸鹽含量在400mg/kg鮮樣以上。
全文摘要
本發(fā)明提供一種應(yīng)用分子標(biāo)記進(jìn)行硝酸鹽含量鑒定、不受環(huán)境條件影響、減少育種工作量、提高選擇準(zhǔn)確性和育種效率的基于主效QTL連鎖標(biāo)記的大白菜低硝酸鹽含量檢測(cè)方法，步驟包括對(duì)大白菜植株的葉片分離提取獲得DNA，采用PCR引物TCTGCCTCTGCTCAAAGT和GCTGAAACATCCCACGACT進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小為300bp的分子標(biāo)記E18-300；將E18-300用于大白菜品種A62-2-1及其衍生品種或品系的基因型檢測(cè)。本發(fā)明利用與A62-2-1低硝酸鹽含量主效QTL緊密連鎖分子E18-300，可以不受環(huán)境的影響，對(duì)特定的的低硝酸鹽材料的后代及衍生品種或品系在早代苗期進(jìn)行篩選，節(jié)約成本，提高育種和選擇效率。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102181546SQ20111009050
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月12日
發(fā)明者張耀偉, 楊樹秀, 王麗麗 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)