專利名稱：特異性沉默雞馬立克氏病病毒gI、gE基因的siRNA序列及其載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)，涉及分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及針對雞馬立克氏病病毒US7 (gl)和US8 (gE)基因的siRNA序列設(shè)計、篩選及其在體外抑制MDV gl和 gE的應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及序列為SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 4的siRNA序列，其可以特異性干擾雞馬立克氏病病毒gl基因。
背景技術(shù)：
1. MDV的研究現(xiàn)狀雞馬立克氏病(MD)是雞的一種淋巴增生性病，在養(yǎng)殖業(yè)受到廣泛關(guān)注。如果缺乏控制手段，MD將產(chǎn)生巨大的損失。MD在1907年被發(fā)現(xiàn)，1968年首次分離到雞馬立克氏病病毒(MDV)。MDV屬皰疹病毒科雙鏈DNA病毒，基因組接近1801Λ，MDV具有Y -皰疹病毒的生物學(xué)特性，但是根據(jù)其基因組結(jié)構(gòu)被歸類為α-皰疹病毒。其基因組龐大，由長獨(dú)特區(qū) (UL)及其兩側(cè)的反向長重復(fù)序列(TRL和IRL)、短獨(dú)特區(qū)(US)及其兩側(cè)的反向短重復(fù)序列 (TRS和頂幻組成。MDV包括三種血清型，凡能引起腫瘤的MDV均屬于血清1型(MDV-I)，而天然不致瘤的MDV和火雞皰疹病毒(HVT)分別屬于血清2型和血清3型。相比其他α -皰疹病毒，MDV具有如下特點(diǎn)嚴(yán)格的細(xì)胞結(jié)合特性，在淋巴細(xì)胞中建立潛伏感染，基因組中包含的致癌基因能夠產(chǎn)生淋巴瘤。從1969年開始，MD就通過疫苗免疫得到了很好的控制。 然而，伴隨著MDV毒力不斷增強(qiáng)，疫苗的免疫效果逐步降低，病毒不斷演化迫使我們必須加快MD新疫苗的研發(fā)進(jìn)度以應(yīng)對毒力不斷增強(qiáng)所帶來的疾病控制壓力。然而，新疫苗研發(fā)速度還遠(yuǎn)跟不上病毒進(jìn)化速度，這對家禽業(yè)無疑一個潛在的最大威脅。另外，，強(qiáng)化商品雞的生產(chǎn)管理、使雞早期接觸病毒或接種低劑量病毒也是控制該病的一個好方法。現(xiàn)有的結(jié)果證明，MD疫苗能有效地控制該病，但是并不能阻止病毒的進(jìn)化。CVI988病毒株仍然是當(dāng)前控制MD的最好的疫苗，應(yīng)對(或者適應(yīng))將來不斷進(jìn)化的MDV毒力增強(qiáng)的趨勢，開發(fā)免疫效果更好的新型MD疫苗是控制該病的一種戰(zhàn)略需要。在MD的控制環(huán)節(jié)上有三個關(guān)鍵控制點(diǎn)，即呼吸道、細(xì)胞間播散、病毒門戶(羽毛毛囊上皮細(xì)胞)，這三個環(huán)節(jié)任何一點(diǎn)的突破都會對MD的控制產(chǎn)生跨越性的影響。
_4] 2. MDV Rl和迚基因及其表汰蛋白的研究現(xiàn)狀。gl和gE是MDV基因編碼很重要的病毒糖蛋白，位于MDV的基因組的US區(qū)，在所有的α -皰疹病毒中均存在編碼gE的同源基因，gE中都具有2個保守的半胱氨酸簇，并且 gE蛋白C端的半胱氨酸簇在所有的α -皰疹病毒中都有5個半胱氨酸殘基，說明皰疹病毒屬各成員的gE具有相似的功能很保守。與I型單純皰疹病毒(HSV-1、VZV、PRV等)有很高的同源性，影響體外病毒的生長。gE是一個重要的毒力基因，gl也與毒力有關(guān)，且對誘導(dǎo)完全保護(hù)是必須的。gE和gl基因是以非共價鍵形式結(jié)合成復(fù)合體gl/gE，它們與MDV在淋巴組中的侵襲和擴(kuò)散作用密切相關(guān)，是影響病毒生長的功能成分。有文獻(xiàn)報道gl/gE是病毒復(fù)制、增殖必需基因，gE是gG Fc受體，利用細(xì)胞的銜接機(jī)制來幫助病毒在細(xì)胞間擴(kuò)散。且gl-gE復(fù)合物有助于介導(dǎo)病毒侵入細(xì)胞，在細(xì)胞間傳播起到重要的作用(Schumacher et al. ,2001 ；shamblin et al. ,2004 ；Tischer et al.， 2002)。Knapp等的研究證明，缺失gl/gE的PrV對大鼠的毒力大幅度降低，但將BHV-I的 gl/gE克隆到該P(yáng)rV突變株后，重組病毒又恢復(fù)了對大鼠的毒力。BHV-I的同源區(qū)段能夠彌補(bǔ)gE和gl缺失株對小鼠的毒力缺損，這也進(jìn)一步證明皰疹病毒同源gE蛋白具有相互互補(bǔ)的功能。通過對BHV-IgE缺失突變病毒體外表現(xiàn)型的分析揭示，gE對病毒分泌和蝕斑的縮小都有利。3. RNA干擾的研究現(xiàn)狀RNA干擾(RNA interference，RNAi)是序列特異的雙鏈RNA (dsRNA)使細(xì)胞內(nèi)同源mRNA降解，從而產(chǎn)生特異性基因表達(dá)沉默的過程。它是機(jī)體的一種小分子RNA介導(dǎo)的序列特異性免疫保護(hù)機(jī)制，可以對抗侵入性遺傳因子的作用。自1998年首次被報道以來，RNAi技術(shù)以其特有的優(yōu)越性而被迅速應(yīng)用于抗病毒及其相關(guān)方面的研究中，目前已在 HBV, HCV、流感病毒等的抗病毒研究中取得重要進(jìn)展。已有成功的可抗丙型肝炎表達(dá)小干擾RNA的轉(zhuǎn)基因鼠。MicroRNAs (miRNAs)是眾多生物體內(nèi)的主要基因表達(dá)調(diào)節(jié)因子，包括病毒。當(dāng)前，已報道MDV基因組的MEQ和LAT區(qū)域編碼6個miRNAs。另外，識別了 17個新的血清特性型miRNAs。這些miRNAs在致病過程和疫苗免疫應(yīng)答中的作用功能分析工作正在開展。RNAi的作用主要由長約19_21nt的dsRNA介導(dǎo)，其中一類稱為小干擾RNA(small interfering RNA, si RNA)，它和目的mRNA序列具有嚴(yán)格的配對，能引起相應(yīng)mRNA降解。由于RNAi是SiRNA靶向作用mRNA引起的特異性降解，因此要產(chǎn)生有效RNAi的關(guān)鍵是選擇合適的SiRNA作用靶點(diǎn)。目前RNAi靶點(diǎn)的選擇原則可以概括為以下幾點(diǎn)①選擇GC含量在50%左右的mRNA區(qū)域；②避免選擇啟動子起始部位下游50-100nt以內(nèi)或終止子上游 50-100nt內(nèi)的區(qū)域；③避免超過三個G或三個C的重疊，因為多聚G或多聚C能形成類聚物而干擾RNAi的沉默機(jī)制；④選擇以兩個AA開始的序列，這將使合成siRNA更加容易；⑤ 保證靶序列與其他基因沒有同源性。目前，制備siRNA的方法主要包括化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法、長片段dsRNA經(jīng)RNaseIII降解法、siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄法及PCR制備的siRNA表達(dá)框法等5種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)siRNA設(shè)計原則，選擇的siRNA其序列的GC含量分別為47. 5%和 52%,對應(yīng)的起始位點(diǎn)在gl和gE基因mRNA序列上的位置，分別命名為sigI735和sigE936。 構(gòu)建針對MDV gl和gE基因的siRNA真核表達(dá)載體，提取純化質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞可有效地抑制MDV gl和gE基因的表達(dá)，再通過DFl、Vero、MDCK穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn)一步檢測干擾序列抑制MDV gl和gE基因的表達(dá)效果。在一個方面中，本發(fā)明提供一種針對MDV gl和gE基因的siRNA序列，其核苷酸序列是sigI7!35 正義鏈 5 ‘ CAATTCCCATGTCGATGCA 3 ‘ (SEQ ID NO :1)，反義鏈 5' TGCATCGACATGGGAATTG 3' (SEQ ID NO :3) ;sigE936 正義鏈 5‘ AGATGTCCAGGTAGACGAT 3' (SEQ ID NO 2)；反義鏈 5' ATCGTCTACCTGGACATCT 3' (SEQ ID NO 4)。在第二個方面中，本發(fā)明提供包含上述第一個方面所述的siRNA序列的載體。在一個實(shí)施方案中，所述載體為PGEM-T fesy載體。在一個實(shí)施方案中，所述載體特征在于按下述方法構(gòu)建而成一步法PCR擴(kuò)增含有禽源TO啟動子的特異性干擾 gl和gE基因的CU6-3-SiRNA的表達(dá)盒，將其定向克隆到pGEM_T fesy載體，構(gòu)建得到 pGEM-T-cU6-3-shgI735 和 pGEM-T-cU6-3_shgE9;35 表達(dá)載體；所述 cU6-3_siRNA 序列包含 394bp的cU6-3啟動子、19nt的siRNA正義鏈、7bp loop環(huán)、19nt的siRNA反義鏈、6個連續(xù) T為終止信號序列，5'和3'端均為HindIII酶切位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，所述載體為真核表達(dá)載體。在一個實(shí)施方案中，所述真核表達(dá)載體為帶有EGFP標(biāo)記的真核表達(dá)載體。在一個實(shí)施方案中，所述載體為基于PGEM-T Easy載體構(gòu)建的載體。在第三個方面中，本發(fā)明提供第一個方面所述的SiRNA序列和第二個方面所述的載體在針對MDV的基因研究中的應(yīng)用。在第四個方面中，本發(fā)明提供第一個方面所述的SiRNA序列和第二個方面所述的載體在制備用于針對MDV基因工程疫苗中的應(yīng)用。在第五個方面中，本發(fā)明提供第一個方面所述的SiRNA序列和第二個方面所述的載體在制備用于預(yù)防或治療由雞馬立克氏病病毒導(dǎo)致的疾病的藥物中的應(yīng)用。在一個實(shí)施方案中，所述由雞馬立克氏病病毒導(dǎo)致的疾病是雞馬立克氏病。在第六個方面中，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防或治療由雞馬立克氏病病毒導(dǎo)致的疾病的藥物，所述藥物包含第一個方面所述的siRNA序列和第二個方面所述的載體作為活性成分。在一個實(shí)施方案中，所述由雞馬立克氏病病毒導(dǎo)致的疾病是雞馬立克氏病。本發(fā)明的另一個目的是提供了一種初步鑒定雞馬立克氏病病毒復(fù)制特異性干擾靶位點(diǎn)的方法，及其在制備治療MDV病毒感染的基因治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益之處是提供的siRNA序列針對MDV的增殖必需基因gl和gE，目前，國內(nèi)外尚無以此基因作為RNAi靶點(diǎn)的報道。以此序列為基礎(chǔ)的真核表達(dá)載體在細(xì)胞中能有效抑制gl和gE基因mRNA水平和蛋白表達(dá)水平，因此可作為MDV基因治療的一個新靶點(diǎn)ο


圖1為一步法PCR快速擴(kuò)增CU6-3-表達(dá)盒上下游設(shè)計。M :DL2000DNA ；1 :cU6-3_shgI97 ；2 cU6-3_shgI328 ；3 cU6-3_shgI487 ； 4 :cU6-3-shgI735 ；5 cU6-3_shgI922 ；6 :cU6-3_shgE172 ；7 cU6-3_shgE328 ；8 cU6-3-shgE461 ；9 :cU6-3_shgE936 ；10 :cU6-3_shgE1261 ；11 :cU6-3_conshRNA ；12 Negative control. 圖 2 為擴(kuò)增 cU6-3-shRNAgI 和 cU6-3_shRNAgE 表達(dá)盒 PCR 鑒定。圖3 為 pEGFP-gl 和 pEGFP-gE 酶切鑒定。圖4為轉(zhuǎn)染4 后熒光顯微鏡觀察cU6-3_shRNA對gE_EGFP、gI-EGFP融合蛋白的表達(dá)抑制觀察結(jié)果。A :transfection of pEGFP-C 1 ；B co tr an sf e c t i on of pEGFP-gE andpcU6-3-conshRNA ；C :co_transfection of pEGFP-gl and cU6-3_conshRNA ；D transfection reagent-only control (no-plasmid DNA) ；E :no_fluorescencemicroscopy image cU6-3_conshRNA ；F-J :Co_transfected with pEGFP-gE andvarious cU6-3_shRNAgE expression Plasmids ；K-O :Co_transfected withpEGFP-gl and various cU6_3_shRNAgI expression plasmids.圖5為轉(zhuǎn)染4 后流式細(xì)胞儀檢測cU6-3-shRNA對gE_EGFP、gI-EGFP融合蛋白的表達(dá)抑制分析結(jié)果。(圖注部分見圖4)圖 6 為 pGEMT-cU6-3-shRANgI7;35 質(zhì)粒載體中 shRNA 測序圖譜。圖 7 為 pGEMT-cU6-3-shRANgE936 質(zhì)粒載體中 shRNA 測序圖譜。圖8為特異性重組干擾質(zhì)粒在不同細(xì)胞系上的基因抑制效果。(a)特異性重組干擾質(zhì)粒和融合基因質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)染4 后不同細(xì)胞的熒光顯微鏡觀察(100X) ； (b)流式細(xì)胞儀定量檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組對gE-EGFP和gl-EGFP陽性細(xì)胞的抑制作用。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步說明。實(shí)施例一 siRNA真核表汰載體體外抑制gl-EGFP和gE_EGFP融合蛋白的表汰1. siRNA的設(shè)計根據(jù)siRNA設(shè)計原則，從gl和gE mRNA起始密碼子AUG下游 IOOnt處搜索AA序列，其3 ‘端相鄰19nt序列作為候選靶點(diǎn)，分別選擇GC含量在40 % -60 % 的5條siRNA序列，利用GenBank數(shù)據(jù)庫中Blast功能對雞體內(nèi)全基因組序列進(jìn)行比對， 確保無相似性。最終選擇的siRNA其cDNA序列為sigI735 5 ‘ CAATTCCCATGTCGATGCA 3 ‘ (SEQ ID NO 1) ；sigE936 5 ‘ AGATGTCCAGGTAGACGAT 3 ‘ (SEQ IDNO 2)，對應(yīng) gl和gE mRNA的735和936位核苷酸位點(diǎn)。所述sigI735和sigE936反義鏈分別為 5' TGCATCGACATGGGAATTG 3' (SEQ ID NO 3)或 5' ATCGTCTACCTGGACATCT 3' (SEQ ID NO 4)。2.表達(dá)siRNA所需shRNA的合成與制備通過一步法PCR擴(kuò)增含有禽源U6啟動子的siRNA表達(dá)盒特異性干擾gl和gE基因的cU6-3-shRNA序列。(gl基因開放閱讀框如下ATGTATCTACTACAATTATTATTTTGGATCCGCCTCTTTCGAGGCATCTGGTCTATAGTTTATACTGGAACATCTGTTACGTTATCAACGGACCAATCTGCTCTTGTTGCGTTCTGCGGATTAGATAAAATGGTGAATGTACGCGGCCAACTTTTATTCCTGGGCGACCAGACTCGGACCAGTTCTTATACAGGAACGACGGAAATCTTGAAATGGGATGAAGAATATAAATGCTATTCCGTTCTACATGCGACATCATATATGGATTGTCCTGCTATA
GACGCCACGGTATTCAGAGGCTGTAGAGACGCTGTGGTATATGCTCAACCTCATGATAGAGTACAACCTTTTCCCGAAAAGGGAACATTGTTGAGAATTGTCGAACCCAGAGTATCAGATACAGGCAGCTATTACATACGTGTAGCTCTCGCTGGAAGAAATATGAGCGATATATTTAGAATGGCTGTTATTATAAGGAGTAGCAAATCTTGGGCCTGTAATCACTCTGCTAGTTCATTTCAGGCCCATAAATGTATTCGCTATGTCGACCGTATGGCCTTTGAAAATTATCTGATTGGACATGTAGGCAATTTGCTGGACAGTGACTCGGAATTGCATGCAATTTATAATATTACTCCCCAATCCATTTCCACAGATATTAATATTATAACGACTCCATTTTACGATAATTCGGGAACAATTTATTCACCTACGGTTTTTAATTTGT
TTAATAACAATTCCCATGTCGATGCAATGAATTCGACTGGTATGTGGAATACCGTTTTAAAATATACCCTTCCAAGGCTTATTTACTTTTCTACGATGATTGTACTATGTATAATAGCATTGGCAATTTATTTGGTCTGTGAAAGGTGCCGCTCTCCCCATCGTAGGATATACATCGGTGAACCAAGATCTGATGAGGCCCCACTCATCACTTCTGCAGTTAACGAATCATTTCAATATGATTATAATGTAAAGGAAACTCCTTCAGATGTTATTGAAAAGGAGTTGATGGAAAAACTGAAGAAGAAAGTCGAATTGTTGGAAAGAGAAGAATGTGTATAG(SEQ ID NO 5)；gE基因開放閱讀框如下ATGTGTGTTTTCCAAATCCTGATAATAGTGACGACGATCAAAGTAGCTGGAACGGCCAACATAAATCATATAGACGTTCCTGCAGGACATTCTGCTACAACGACGATCCCGCGATATCCACCAGTTGTCGATGGGACCCTTTACACCGAGACGTGGACATGGATTCCCAATCACTGCAACGAAACGGCAACAGGCTATGTATGTCTGGAAAGTGCTCACTGTTTTACCGATTTGATATTAGGAGTATCCTGCATGAGGTATGCGGATGAAATCGTCTTACGAACTGATAAATTTATTGTCGATGCGGGATCCATTAAACAAATAGAATCGCTAAGTCTGAATGGAGTTCCGAATATATTCCTATCTACGAAAGCAAGTAACAAGTTGGAGATACTAAATGCTAGCCTACAAAATGCGGGTATCTACATTCGGTATTCTAGAAATGGGACGAGGACTGCAAAGCTGGATGTTGTTGTGGTTGGCGTTTTGGGTCAAGCAAGGGATCGCCTACCCCAAATGTCCAGTCCTATGATCTCATCCCACGCCGATATCAAGTTGTCATTAAAAAACTTTAAAGCATTAGTATATCACGTGGGAGATACTATCAATGTCTCGACGGCGGTTATACTAGGACCTTCTCCGGAGATATTCACATTGGAATTTAGGGTGTTGTTCCTCCGTTATAATCCAACGTGCAAGTTCGTCACGATTTATGAACCTTGTATATTTCACCCCAAAGAACCAGAGTGTATTACTACTGCAGAACAATCGGTATGTCATTTCGCATCCAACATTGACATTCTGCAGATAGCCGCCGCACGTTCTGAAAATTGTAGCACAGGGTATCGTAGATGTATTTATGACACGGCTATCGATGAATCTGTGCAGGCCAGATTAACATTCATAGAACCAGGAATTCCTTCCTTTAAAATGAAAGATGTCCAGGTAGACGATGCTGGATTGTATGTGGTTGTGGCTTTATACAATGGACGTCCAAGTGCATGGACTTACATTTATTTGTCAACGGTGGAAACATATCTTAATGTATATGAAAACTACCACAAGCCGGGATTTGGGTATAAATCATTTCTACAGAACAGTAGTATCGTCGACGAAAATGAGGCTAGCGATTGGTCCAGCTCGTCCATTAAACGGAGAAATAATGGTACTATCATTTATGATATTTTACTCACATCGCTATCAATTGGGGCGATTATTATCGTCATAGTAGGGGGTGTTTGTATTGCCATATTAATTAGGCGTAGGAGACGACGTCGCACGAGGGGGTTATTCGATGAATATCCCAAATATATGACGCTACCAGGAAACGATCTGGGGGGCATGAATGTACCGTATGATAATACATGCTCTGGTAACCAAGTTGAATATTATCAAGAAAAGTCGGCTAAAATGAAAAGAATGGGTTCGGGTTATACCGCTTGGCTAAAAAATGATATGCCGAAAATTAGGAAACGCTTAGATTTATACCACTGA(SEQ IDNO 6))設(shè)計原則如圖1所示，以含禽源啟動子(cTO-3)的雞全基因組DNA(登錄號 DQ531569)為模板，上游引物與cTO啟動子5‘端序列(GACTAAGAGCATCGAGACTG)互補(bǔ)，其引物序列為5' AAGCTTCAGACAGACGTCAGGCTTTC 3'；下游引物如表1所示包含與cU6_3啟動子3'端(GACTAAGAGCATCGAGACTG)互補(bǔ)的序列、編碼siRNA正義鏈序列(斜體)、7nt的 loop序列(CTCTTGA)、siRNA反義鏈序列(下劃線)和6個連續(xù)T為終止信號的序列，此外還加入酶切位點(diǎn)(HindIII)。表IMDV gl和gE基因的siRNA下游引物Table. 1 The MDV gl and gE of siRNAs reverse primers
權(quán)利要求
1.一種特異性干擾雞馬立克氏病病毒gl基因的SiRNA序列，其特征在于所述SiRNA序列為sigI735 正義鏈 5' CAATTCCCATGTCGATGCA 3' (SEQ ID NO 1) 反義鏈 5' TGCATCGACATGGGAATTG 3' (SEQ ID NO :3)。
2.一種特異性干擾雞馬立克氏病病毒gE基因的siRNA序列，其特征在于所述siRNA序列為:sigE936 正義鏈 5' AGATGTCCAGGTAGACGAT 3' ； (SEQ ID NO 2) 反義鏈 5' ATCGTCTACCTGGACATCT 3'。(SEQ ID NO :4)。
3.一種包含權(quán)利要求1或2所述的siRNA序列的載體。
4.權(quán)利要求3所述的載體，其為真核表達(dá)載體。
5.權(quán)利要求3的載體，其特征在于所述載體為基于pGEM-Tfesy載體構(gòu)建的載體。
6.權(quán)利要求1或2所述的siRNA序列，權(quán)利要求3-5中任一項所述的載體在針對雞馬立克氏病病毒的基因研究中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1或2所述的siRNA序列，權(quán)利要求3-5中任一項所述的載體在制備用于雞馬立克氏病病毒的基因工程疫苗中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1或2所述的siRNA序列，權(quán)利要求3-5中任一項所述的載體在制備用于預(yù)防或治療由雞馬立克氏病病毒導(dǎo)致的疾病的藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述由雞馬立克氏病病毒導(dǎo)致的疾病是雞馬立克氏病。
10.一種藥物，其用于預(yù)防或治療由雞馬立克氏病病毒導(dǎo)致的疾病，包含權(quán)利要求1或 2所述的siRNA序列，權(quán)利要求3-5中任一項所述的載體作為活性成分。
11.權(quán)利要求10所述的藥物，其中所述由雞馬立克氏病病毒導(dǎo)致的疾病是雞馬立克氏病。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種能有效地特異性沉默雞馬立克氏病病毒(MDV)gI和gE的siRNA序列及其載體和在MDV基因治療和制備基因工程疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明使用http//www.ambion.com的靶位點(diǎn)篩選和設(shè)計工具，通過一步法PCR擴(kuò)增含有禽源U6啟動子的siRNA表達(dá)盒用于快速篩選出MDV gI和gE基因的干擾序列。根據(jù)siRNA對應(yīng)的起始位點(diǎn)在gI和gE基因mRNA序列上的位置，分別命名為sigI735和sigE936。構(gòu)建分別含有干擾序列的siRNA真核表達(dá)載體，提取純化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞，可有效抑制MDV gI和gE基因的表達(dá)，并利用DF1、Vero、MDCK穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn)一步檢測干擾序列抑制MDV gI和gE基因表達(dá)的效果。
文檔編號C12N15/79GK102212520SQ20111007731
公開日2011年10月12日 申請日期2011年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月23日
發(fā)明者劉長軍, 崔紅玉, 王云峰, 王玫, 石星明, 趙妍 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所