專利名稱：一種檢測dna主動去甲基化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種檢測DNA主動去甲基化的方法，該方法通過構(gòu)建人工CpG島報告基因載體并在體外進行甲基化，通過轉(zhuǎn)染細胞并利用細胞的抗藥性篩選出單克隆穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，進一步檢測基因誘導(dǎo)DNA去甲基化。
背景技術(shù)：
表觀遺傳學(xué)指DNA序列不發(fā)生變化但基因表達卻發(fā)生了可遺傳的改變。本世紀初數(shù)例大規(guī)模單卵雙生雙胞胎的前瞻性流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，遺傳學(xué)變異只在一些少見的遺傳性腫瘤發(fā)生上發(fā)揮關(guān)鍵作用，而占全部腫瘤95%以上的散發(fā)性腫瘤的發(fā)生則主要由環(huán)境因素決定。目前，表觀遺傳學(xué)的研究范疇主要包括DNA甲基化，組蛋白修飾，染色質(zhì)重組等，其目的是揭示與DNA序列變異無關(guān)的基因表達可遺傳性現(xiàn)象的本質(zhì)、功能、形成機制及其在 疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。DNA甲基化是指基因組DNA 5_胞嘧啶甲基化(5_mC)，它是一種在哺乳動物中穩(wěn)定而且廣泛存在的表觀遺傳修飾方式。研究報道，哺乳動物中，CpG 二核苷酸序列在基因組中出現(xiàn)的頻率(僅1%)遠低于基因組中的其它雙核苷酸序列，但在基因組的某些區(qū)域，CpG序列密度很高，形成CpG島，它們通常位于基因的啟動子或第一個外顯子區(qū)，據(jù)統(tǒng)計哺乳動物基因組中共約有4萬個CpG島。哺乳動物中，5-胞嘧啶甲基化(5-mC)僅發(fā)生在CpG 二核苷酸序列內(nèi)，而且這種修飾方式能夠在細胞分裂的過程中穩(wěn)定的保留下來。脊椎動物基因的甲基化狀態(tài)有三種低甲基化狀態(tài)，如管家基因；非甲基化狀態(tài)；高度甲基化狀態(tài)，如女性的一條失活的X染色體和印記基因。DNA甲基化在維持正常細胞功能、遺傳印記、細胞分化和胚胎發(fā)育過程中起著極其重要的作用。胚胎發(fā)育過程中DNA甲基化的異常將導(dǎo)致基因的異常表達，可引發(fā)多種人類疾病。例如，臍巨舌-巨大發(fā)育綜合征(Beckwith-WiedemannSyndrome, BWS)和 Prader-Willi/Angelman 綜合征，Albright 遺傳性骨發(fā)育不全癥(AHO)，假性副甲狀腺功能減退癥Ia型/Ib型等。另外，DNA甲基化酶的突變也會導(dǎo)致一系列遺傳性疾病，例如DNMTl表達的降低可導(dǎo)致系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，DNMT3b的突變可導(dǎo)致免疫缺陷性著絲粒不穩(wěn)定性面部異常綜合征(ICF)。腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中也伴隨著基因組DNA整體甲基化水平的降低和CpG島局部甲基化水平的異常升高，從而導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定(如染色體的不穩(wěn)定、可移動遺傳因子的激活、原癌基因的表達)和抑癌基因的不表達?；贒NA甲基化的重要性，本領(lǐng)域的研究者關(guān)注于研究檢測DNA甲基化的方法。隨著技術(shù)的進步，檢測甲基化的手段逐漸豐富。目前，現(xiàn)有技術(shù)不僅可以探測某段DNA序列的甲基化分布，而且還能大通量地了解整個基因組甲基化的程度。通常DNA去甲基化有兩種形式，主動去除和被動去除。研究DNA被動去除甲基化通?？梢允褂?-Aza，TSA, RNAi,甚至通過miRNA下調(diào)DNMT來實現(xiàn)。但是使用DNA去甲基化試劑往往會引起細胞毒性，并且DNA甲基化去除之后很難恢復(fù)。有文獻報道，可以通過DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異的引入DNMT來實現(xiàn)DNA定點的甲基化，但是該方法存在的缺陷是瞬時轉(zhuǎn)染細胞很難長期觀察細胞DNA的自然狀態(tài)。因此，目前研究DNA主動去除的機制目前還沒有一種通用方法能夠?qū)崿F(xiàn)。綜上，迄今尚無一個實驗細胞模型能夠提供對于相關(guān)基因DNA甲基化或DNA去甲基化的功能研究；而研究DNA甲基化或者DNA去甲基化的機制對于解決由DNA甲基化異常而引起的疾病有著非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是和克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種新的DNA去甲基化的檢測方法，具體涉及一種檢測DNA主動去甲基化的方法，該方法通過構(gòu)建人工CpG島報告基因載體并在體外進行甲基化，通過轉(zhuǎn)染細胞并利用細胞的抗藥性篩選出單克隆穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，進一步檢測基因誘導(dǎo)DNA去甲基化。具體而言，本發(fā)明的檢測DNA主動去甲基化的方法，其特征在于，該方法利用篩選的已確定甲基化狀態(tài)的細胞株為基礎(chǔ)，收集基因與細胞株的混合克隆并測定其DNA甲基化的狀態(tài)，對比未轉(zhuǎn)基因的細胞株甲基化狀態(tài)，得到檢測結(jié)果；其包括以下步驟 1)構(gòu)建人工CpG島報告基因載體PCBS-luc并體外甲基化處理；
2)篩選單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株；
3)鑒定步驟2)獲得的單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。4 )檢測DNA主動去甲基化。本發(fā)明中，所述的鑒定后的細胞株分別為，穩(wěn)定整合了體外完全甲基化、部分甲基化和非甲基化的人工CpG島報告基因載體。本發(fā)明中，所述的人工CpG島報告基因載體是以TCDNA3. I作為骨架，依次插入Iuciferase報告基因、SV40啟動子、BD結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點和一段高CpG片段制得(本發(fā)明將所述的載體命名為PCBS-luc)；
其中，
所述的一段高CpG片段，來源于天藍鏈霉菌，作為一段CpG島，在人類基因組中沒有同源序列，可排除基因組序列干擾，方便檢測；
所述的人工CpG島報告基因載體插入Iuciferase報告基因，檢測基因轉(zhuǎn)錄活性；插入SV40啟動子，提供一個活性適中的啟動子；插入BD結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點，為在該位點特異引入蛋白提供位點。本發(fā)明還提供上述三種已知甲基化數(shù)量及位點的單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株；所述的單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株只要按常規(guī)細胞篩選方法就可以得到。本發(fā)明進一步提供了一種新的研究DNA甲基化及DNA去甲基化功能的方法。本發(fā)明中，通過構(gòu)建人工CpG島報告基因載體PCBS-luc，體外使用甲基轉(zhuǎn)移酶M. SssI對載體進行甲基化處理，并與anti-hygromycin基因表達載體共轉(zhuǎn)HEK293細胞，使用潮酶素B篩選出完全甲基化、部分甲基化和非甲基化的PCBS穩(wěn)定整合細胞株。所述的細胞株通過下述方法篩選得出首先運用大腸桿菌重組質(zhì)粒構(gòu)建的方法，以P⑶NA3. I為骨架，依次插入Iuciferase報告基因，SV40啟動子，BD結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點，和一段來源天藍鏈霉菌的高CpG片段，構(gòu)建載體(本發(fā)明將此載體命名為PCBS-luc);之后在體外對該載體(質(zhì)粒)進行人工甲基化處理，與anti-hygromycin基因表達載體共轉(zhuǎn)HEK293細胞，最后加潮酶素B篩選出單克隆細胞株。
本發(fā)明中所述的細胞模型是整合人工CpG島報告基因載體PCBS-luc的單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株；可通過轉(zhuǎn)染該細胞株，收集轉(zhuǎn)染后細胞并進行BSP分析，觀察DNA甲基化數(shù)量及位點的改變，最終通過有效的輔助實驗進行判斷目的基因或者蛋白是否具有DNA甲基化或者去甲基化的功能。本發(fā)明結(jié)合BSP分析可精確、有效、方便的應(yīng)用于DNA甲基化或DNA去甲基化的功能研究；其中，所述的BSP是指DNA經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后，非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而甲基化的胞嘧啶保持不變，PCR擴增克隆，然后進行DNA的測序；根據(jù)核苷酸序列中C一T轉(zhuǎn)化的情況來判斷樣本中的甲基化狀態(tài)如果與原序列比較，發(fā)生了 C一T的轉(zhuǎn)變則表示該處未發(fā)生甲基化，如果沒有這一轉(zhuǎn)變，則該處發(fā)生甲基化。所述的測序法可獲得樣本DNA序列中全部的甲基化信息。本檢測方法綜合應(yīng)用表觀遺傳學(xué)、細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)，提供了一種具可有效應(yīng)用于DNA甲基化或DNA去甲基化的單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，基于該細胞株，可進一步檢 測基因誘導(dǎo)DNA去甲基化，在表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。本發(fā)明方法可用于觀察目標蛋白去甲基化的功能，尋找去甲基化酶；檢測相關(guān)基因是否有DNA甲基化或去甲基化的功能，輔助研究基因功能；通過控制細胞株甲基化程度，靈活觀察組蛋白修飾與DNA甲基化之間的關(guān)系；還可研究環(huán)境因子對于細胞DNA甲基化的影響，是新的研究DNA主動去甲基化或DNA甲基化的方法。


圖I是重組質(zhì)?！斯pG島報告基因載體PCBS-Iuc的質(zhì)粒圖。圖2是通過軟件分析的該質(zhì)粒中各部分CpG島分布及CG位點的含量情況，其中，深色橫線表示CpG島，深色豎線表示每一個CG位點。圖3是用于檢測該細胞株轉(zhuǎn)錄活性的四種載體質(zhì)粒，其中，A為質(zhì)粒PM，作為陰性對照，其中沒有可與圖I重組質(zhì)粒中的BD結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的位點，從而不能激活啟動子而激發(fā)轉(zhuǎn)錄活性；B為質(zhì)粒PMVP16，其中的VP16是一個很強的激活結(jié)構(gòu)域，可與圖I重組質(zhì)粒中的BD結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的位點，從而激活啟動子而激發(fā)轉(zhuǎn)錄活性；C為質(zhì)粒PMIP，是PM添加IP(嘌呤酶素抗性標簽)的質(zhì)粒；D為質(zhì)粒PMIPVP16，是PMVP16添加IP (嘌呤酶素抗性標簽)的質(zhì)粒，IP標簽用于持續(xù)加壓篩選。圖4中A為HpaII酶切鑒定質(zhì)粒甲基化程度；B為熒光素酶報告基因活性檢測甲基化質(zhì)粒及非甲基化質(zhì)?；钚?；C為甲基化細胞株轉(zhuǎn)染應(yīng)答PMVP16熒光素酶報告基因活性檢測結(jié)果；D為非甲基化細胞株轉(zhuǎn)染應(yīng)答PMVP16熒光素酶報告基因活性檢測結(jié)果。圖5是甲基化細胞株7#BSP結(jié)果圖，其中，黑色方框表示甲基化位點，白色方框表示非甲基化位點，灰色方框表示未測出的位點。圖6是非甲基化細胞株8#BSP結(jié)果圖，其中，黑色方框表示甲基化位點，白色方框表示非甲基化位點，灰色方框表示未測出的位點。圖7是甲基化細胞株9#BSP結(jié)果圖，其中，黑色方框表示甲基化位點，白色方框表示非甲基化位點，灰色方框表示未測出的位點。圖8是甲基化細胞株7#傳至15代后BSP結(jié)果圖，其中，黑色方框表示甲基化位點，白色方框表不非甲基化位點，灰色方框表不未測出的位點。
圖9是非甲基化細胞株8#傳至15代后BSP結(jié)果圖，其中，黑色方框表示甲基化位點，白色方框表不非甲基化位點，灰色方框表不未測出的位點。圖10表明應(yīng)用本發(fā)明的細胞模型首次發(fā)現(xiàn)的VP16激活結(jié)構(gòu)域在哺乳動物細胞中具有DNA去甲基化的功能，其中，A為PMIP加壓篩選72小時后的細胞甲基化情況，B為PMIPVP16加壓篩選72小時后的細胞甲基化情況，C為PMIP加壓篩選7天后的細胞甲基化情況，D為PMIPVP16加壓篩選7天后的細胞甲基化情況，黑色方框表示甲基化位點，白色方框表不非甲基化位點，灰色方框表不未測出的位點。
具體實施例方式下面通過實施例更具體的說明本發(fā)明。實施例I.人工CpG島報告基因載體PCBS-luc的構(gòu)建及體外甲基化 I. PCBS-Iuc 的設(shè)計
運用大腸桿菌重組質(zhì)粒構(gòu)建的方法，以POTNA3. I為骨架,依次插入了 Iuciferase報告基因，SV40啟動子，BD結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點，一段來源天藍鏈霉菌的高CpG片段，制得(命名為PCBS-luc)。2. PCBS-luc的體外甲基化
將PCBS-luc用限制性內(nèi)切酶進行單酶切線性化，37度溫育，2小時。之后對產(chǎn)物進行純化(使用Axygen凝膠回收試劑盒)，將回收后的產(chǎn)物一半用于甲基化處理，一半不處理作為非甲基化的對照。體外甲基化處理使用I (NEB公司)。甲基化處理后產(chǎn)物再次進行純化，方法與前相同。最后用限制型內(nèi)切酶雄all驗證甲基化的程度，見圖4中的A。Hpall識別位點CCGG，當其中的C被甲基化修飾之后功73II將不能將其切開。如圖4A所示，甲基化質(zhì)粒為彌散條帶，未被雄all切開，而對照非甲基化質(zhì)粒明顯被切開。所有酶切反應(yīng)均按照其說明書嚴格操作。3.構(gòu)建 PMVP16
片段VP16來源于質(zhì)粒PVP16，設(shè)計引物VP16F，VP16T (見引物表)擴增出片段，插入載體PM。實施例2 :單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的篩選 I、確定篩選的最佳藥物濃度
最佳藥物濃度是指可以使細胞全部死亡的最低濃度。所選藥物為潮霉素B(HygromycinB)，其濃度為50mg/ml。所用細胞為HEK293。具體步驟如下
(I)復(fù)蘇HEK293細胞入6cm dish，待長滿時傳代，3ml中按照每孔18_20ul傳入96孔板中，補足IOOul/孔。(2)文獻中有關(guān)此種藥物對于HEK293細胞的最佳使用濃度為200ug/ml，也有推薦為100ug/ml。因此選擇預(yù)實驗藥物濃度分別為80 ug/ml, 100 ug/ml, 150 ug/ml, 200ug/ml,以確定本實驗最終適合的藥物濃度。(3)待96孔板中細胞傳好，加壓篩選，經(jīng)過6天時間，觀察到lOOug/ml為最佳濃度。2、確認甲基化PCBS-Iuc質(zhì)粒及非甲基化PCBS-Iuc質(zhì)粒的活性 (I)將293細胞傳入96孔板內(nèi)，12-16小時內(nèi)進行轉(zhuǎn)染；(2)共轉(zhuǎn)甲基化 PCBS-luc (40ng)與 PM (160ng);甲基化 PCBS-luc (40ng)與 PMVP16(160ng),看甲基化質(zhì)粒的結(jié)合情況；共轉(zhuǎn)非甲基化PCBS-luc (40ng)與PM (160ng);非甲基化PCBS-luc (40ng)與PMVP16 (160ng)，看非甲基化質(zhì)粒的結(jié)合情況。由于PCBS-Iuc質(zhì)粒上含有BD結(jié)合位點，PM中沒有可以結(jié)合BD的部分，但是PMVP16含有可結(jié)合BD的VP16激活結(jié)構(gòu)域，因此可激活啟動子獲得較高的轉(zhuǎn)錄活性，轉(zhuǎn)錄后72小時測螢光素酶活性，見圖4B。PM未對細胞產(chǎn)生激活效應(yīng)，而PMVP16可以對細胞產(chǎn)生激活作用，說明構(gòu)建的質(zhì)粒是具有活性的，可用于后續(xù)的實驗轉(zhuǎn)染細胞并篩選單克??；而明顯可見非甲基化質(zhì)粒的活性遠高于甲基化質(zhì)粒的活性，推測甲基化會影響VP16與BD結(jié)構(gòu)域的結(jié)和從而影響基因的轉(zhuǎn)錄激活。3.轉(zhuǎn)染細胞并篩選單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株
anti-hygromycin 基因表達載體 PMSCV-Hyg (200ng)與甲基化 PCBS-luc (900ng),非甲基化PCBS-luc (900ng)分別共同轉(zhuǎn)染入HEK293細胞中(24孔板)，用終濃度為100ug/ml的潮酶素B對細胞進行加壓并傳代篩選(10cm dish)。觀察細胞。 (I)加壓5天后control細胞全死。(2)加藥后第7天，用終濃度lOOug/ml潮酶素B的DMEM對甲基化細胞株及非甲基化細胞株換液。(3)再過10天，單克隆長成，肉眼可看到白色小點。挑細胞單克隆步驟
吸出培養(yǎng)基；
加胰酶洗一遍，2ml,吸出；
再加一次胰酶，2ml，吸出；
取Iml胰酶于EP管中；
每次IOul胰酶小心滴加入圈出的克隆中，反復(fù)吹吸，吸入加好培養(yǎng)基的48孔板中(每孔300ul培養(yǎng)基)，再吸孔內(nèi)培養(yǎng)基IOul入圈內(nèi)，反復(fù)吹吸，放入48孔內(nèi)；
吹勻孔內(nèi)細胞；
觀察后放入培養(yǎng)箱，最終挑到甲基化細胞單克隆15個，非甲基化細胞單克隆13個。(4)觀察48孔板內(nèi)的細胞生長狀況。(5)48孔內(nèi)長滿的和約90%的細胞傳入12孔板，用帶藥培養(yǎng)基(潮酶素B 50ug/ml)培養(yǎng)。(6)繼續(xù)觀察細胞，如同上步驟，長滿的傳入12孔板，12孔板內(nèi)長滿的細胞傳入6孔板，此時均用50ug/ml的潮酶素B培養(yǎng)基進行維持培養(yǎng)。(7)待6孔板內(nèi)細胞長滿后，分批凍存細胞，保存-80度。最后獲得甲基化細胞株1#，2#，4#，5#，6#，7#，8#，9#，10#，11#，12#，13#，14# ;非甲基化細胞株 1#, 2#, 3#, 5#, 6#, 7#,8#,9#。實施例3 甲基化單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的鑒定
I.鑒定甲基化及非甲基化單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的熒光素酶活性
(I)分別將所篩穩(wěn)轉(zhuǎn)單克隆細胞株傳入96孔板，12-16小時進行轉(zhuǎn)染，PM為空載對照。(2) 72小時后測定Iuciferase值,進行計算。(3)結(jié)果如圖4C，D所示，C為甲基化各單克隆細胞對于PMVP16的轉(zhuǎn)染應(yīng)答螢光素酶活性情況，D為非甲基化各單克隆細胞對于PMVP16的轉(zhuǎn)染應(yīng)答螢光素酶活性情況；選擇熒光素酶活性較高的甲基化細胞克隆7#,熒光素酶活性較低的甲基化細胞克隆9#，及非甲基化細胞8#進行下一步的鑒定。2.鑒定甲基化細胞株及非甲基化細胞株的甲基化程度
(I)提取甲基化7#、9#，非甲基化8#細胞全基因組DNA (TIANGEN BIOTECH BeijingCO. , LTD),并進行亞硫酸氫鈉處理(Zymo Research, Orange, CA, USA)。(2)用兩對引物進行BSP測序(兩對BSP引物CBSBwF/wT，CBSBF/T見引物表)，檢測具體的甲基化狀態(tài)。如圖5，圖6，圖7所示，分別為甲基化細胞株7#的甲基化狀態(tài)，非甲基化細胞株8#的甲基化狀態(tài)及甲基化細胞株9#的甲基化狀態(tài)，非甲基化8#為完全非甲基化狀態(tài)，而甲基化7#為部分甲基化狀態(tài)，甲基化9#為全甲基化狀態(tài)。結(jié)合細胞株對PMVP16轉(zhuǎn)染應(yīng)答的熒光素酶活性及細胞株的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)甲基化程度與熒光素酶活性呈負相 關(guān)，所以推論甲基化位點可能會影響VP16與BD結(jié)構(gòu)域的結(jié)合從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄活性的降低；因此，甲基化細胞株7#既具有較好的熒光素酶活性，又具有甲基化位點，適用于研究能夠與BD結(jié)合的基因的DNA甲基化或去甲基化的功能，而甲基化9#細胞株可能會影響基因與BD結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，所以不適合用于基因功能的研究，但是可用作環(huán)境因素對于DNA甲基化影響的細胞模型；而非甲基化細胞株8#可很好的用于研究相關(guān)基因或環(huán)境因素對DNA甲基化功能影響的研究。3.鑒定細胞株的甲基化狀態(tài)穩(wěn)定性
對甲基化7#及非甲基化8#細胞株進行傳代培養(yǎng)，收取傳至第15代的細胞，方法同上，進行BSP測序(引物與之前相同)，如圖8、9所示，結(jié)果表明所述的兩株細胞甲基化或非甲基化狀態(tài)穩(wěn)定，其甲基化或非甲基化狀態(tài)不會隨著傳代培養(yǎng)而改變。實施例4 甲基化細胞模型的應(yīng)用
I.構(gòu)建實驗所需質(zhì)粒PMIP及PMIPVP16
在原有的PM質(zhì)粒上插入嘌呤酶素抗性的片段IP，在PMIP的基礎(chǔ)上插入片段VP16，這兩個質(zhì)粒由于含有嘌呤酶素抗性因此可以用來持續(xù)刺激甲基化細胞，加壓篩選出混合細胞株(如圖3中的C，D)。2.轉(zhuǎn)染
將PMIP，PMIPVP16分別轉(zhuǎn)染入甲基化細胞株7# (6孔板)，轉(zhuǎn)染后24小時加嘌呤酶素并傳代，72小時后收部分細胞，其余細胞持續(xù)加藥篩選至7天收集細胞。-80度凍存。3.將轉(zhuǎn)染 PMIP 72 小時，PMIPVP16 72 小時，PMIP 7 天，PMIPVP16 7 天的細胞提取全基因組DNA，亞硫酸氫鈉處理后，用與之前相同的BSP引物進行PCR擴增，并測序觀察結(jié)果。如圖10所示，A為PMIP篩選72小時，B為PMIPVP16篩選72小時，C為PMIP篩選7天，D為PMIPVP16篩選7天，結(jié)果表明，陰性對照PMIP無論是瞬時轉(zhuǎn)染還是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染都含有穩(wěn)定的甲基化狀態(tài)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株甲基化程度更為規(guī)則，而PMIPVP16篩選到的細胞株則明顯幾乎不存在甲基化位點，說明VP16可誘導(dǎo)促進DNA去甲基化。以上實施例的結(jié)果表明，利用本發(fā)明的測試方法首次發(fā)現(xiàn)VP16在哺乳細胞中的DNA去甲基化功能，同時也表明所述的細胞株具有預(yù)期的功能；本測試方法利用細胞株測試基因?qū)NA去甲基化，與現(xiàn)有技術(shù)相比更加容易、明確和方便。
權(quán)利要求
1.一種檢測DNA主動去甲基化的方法，其特征在于，利用篩選的已確定甲基化狀態(tài)的細胞株為基礎(chǔ)，收集基因與細胞株的混合克隆并測定其DNA甲基化的狀態(tài)，對比未轉(zhuǎn)基因的細胞株甲基化狀態(tài)，得到檢測結(jié)果；其包括以下步驟 1)構(gòu)建人工CpG島報告基因載體PCBS-Iuc并體外甲基化處理； 2)篩選單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株； 3)鑒定步驟2)獲得的單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株； 4)檢測DNA主動去甲基化。
2.按權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的已確定甲基化狀態(tài)的細胞株為，穩(wěn)定整合了體外完全甲基化、部分甲基化或非甲基化的人工CpG島報告基因載體。
3.按權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述的人工CpG島報告基因載體是以P⑶NA3. I作為骨架，依次插入Iuciferase報告基因、SV40啟動子、BD結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點和一段高CpG片段制得，命名為PCBS-luc。
4.按權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的一段高CpG片段源自天藍鏈霉菌。
5.按權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的人工CpG島報告基因載體插入Iuciferase報告基因檢測基因轉(zhuǎn)錄活性；插入BD結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點特異引入蛋白提供位點。
6.按權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的步驟2)的單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，通過下述方法篩選 以P⑶NA3. I為骨架，依次插入Iuciferase報告基因，SV40啟動子，BD結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點，和一段源自天藍鏈霉菌的高CpG片段，構(gòu)建載體PCBS-luc后；在體外對該載體進行人工甲基化處理，與anti-hygromycin基因表達載體共轉(zhuǎn)HEK293細胞,最后加潮酶素B篩選出單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基因誘導(dǎo)DNA去甲基化的檢測方法。本發(fā)明利用篩選的已確定甲基化狀態(tài)的細胞株為基礎(chǔ)，收集基因與細胞株的混合克隆并測定其DNA甲基化的狀態(tài)，對比未轉(zhuǎn)基因的細胞株甲基化狀態(tài)，得到檢測結(jié)果。本發(fā)明還通過構(gòu)建人工CpG島報告基因載體PCBS-luc，體外使用甲基轉(zhuǎn)移酶M.SssI對載體進行甲基化處理，并與anti-hygromycin基因表達載體共轉(zhuǎn)HEK293細胞，使用潮酶素B篩選出完全甲基化、部分甲基化和非甲基化的PCBS穩(wěn)定整合細胞株。本發(fā)明可用于觀察目標蛋白去甲基化的功能、檢測DNA甲基化或去甲基化的功能、觀察組蛋白修飾與DNA甲基化之間的關(guān)系，還可用于研究環(huán)境因子對于細胞DNA甲基化的影響。
文檔編號C12N5/10GK102719518SQ20111007700
公開日2012年10月10日 申請日期2011年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月29日
發(fā)明者張進, 楊璐, 王慧君, 馬端 申請人:復(fù)旦大學(xué)