專利名稱：用于檢測Ⅰ型新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶基因的組合物和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測β-內(nèi)酰胺酶基因的組合物和試劑盒，具體地，本發(fā)明涉及用于檢測I型新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶基因的組合物和試劑盒。
背景技術(shù)：
β -內(nèi)酰胺酶可以水解β -內(nèi)酰胺類抗菌藥物，根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)可以分為A、B、C和D四個大類。其中，B類內(nèi)酰胺酶又稱金屬內(nèi)酰胺酶，其能夠水解的底物包括青霉 素、頭孢霉素和碳青霉烯類等抗生素。已發(fā)現(xiàn)的金屬0-內(nèi)酰胺酶包括頂 、￥頂、6頂、5頂、SPM等型別。新德里金屬-β-內(nèi)酸胺酶(NewDelthi Metallo-β -Lactamase I, NDM-1)基因是一種新的金屬β內(nèi)酰胺酶基因；攜帶該基因的細菌(多為革蘭氏陰性菌)可對幾乎所有抗生素產(chǎn)生抗性，俗稱“超級細菌”。所述NDM-I基因還可以橫向傳遞給其他致病菌，并呈現(xiàn)同樣的耐藥性，大大增加治療的困難。所述NDM-I基因始發(fā)于印度次大陸，該地區(qū)抗生素的濫用現(xiàn)象異常嚴重。目前攜帶該基因的致病菌已傳播至多個國家，已發(fā)現(xiàn)200多個感染病例，并有多例死亡。我國香港地區(qū)于2009年發(fā)現(xiàn)首宗個例。目前，我國大陸已發(fā)現(xiàn)NDM-I基因的存在，已發(fā)現(xiàn)病例并無可考的流行病史，考慮到我國也存在嚴重的抗生素濫用的現(xiàn)象，產(chǎn)NDM-I泛耐藥細菌可能已經(jīng)在我國一定范圍內(nèi)存在。然而因為研發(fā)針對NDM-I基因的新藥，尤其是針對攜帶有NDM-I基因的革蘭氏陰性菌抗生素仍然存在滯后；因此一旦發(fā)生由攜帶有NDM-I基因的致病菌所引起的疾病的大規(guī)模傳播，將會面臨幾乎無藥可治的局面。因此，NDM-I基因是人類健康的重大威脅。綜上亟需能夠?qū)崿F(xiàn)快速、有效且準確檢測I型新德里金屬β -內(nèi)酰胺酶基因的產(chǎn)品以用于病例診治，病原學(xué)調(diào)查及防控政策的制定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)缺乏檢測I型新德里金屬β -內(nèi)酰胺酶基因的產(chǎn)品的問題，提供一種用于檢測I型新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶基因的組合物，使用該組合物可以實現(xiàn)對I型新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶基因的快速、有效且準確的檢測，來保證及時的病例診治、準確的病原學(xué)調(diào)查以及科學(xué)的防控政策的制定。本發(fā)明的第二個目的是提供包括所述組合物的用于檢測I型新德里金屬β -內(nèi)酰胺酶基因的試劑盒。本發(fā)明提供了一種用于檢測I型新德里金屬β -內(nèi)酰胺酶基因的組合物，其中，所述組合物包括以下序列I)長度為10-19個核苷酸的用于PCR擴增I型新德里金屬β -內(nèi)酰胺酶基因的第一引物，該引物的序列包括a) SEQ ID No 1 所示的序列，
b)SEQ ID No :1所示的序列的至少10個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列；2)長度為10-18個核苷酸的用于PCR擴增I型新德里金屬β -內(nèi)酰胺酶基因的第二引物，該引物的序列包括a) SEQ ID No: 2 所示的序列，b)SEQ ID No 2所示的序列的至少10個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列；3)長度為10-24個核苷酸的與I)和2)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的序列包括
a) SEQ ID No :3所示的序列或其互補序列，或者b) SEQ ID No 3所示的序列的至少10個核苷酸連續(xù)的片段，c) SEQ ID No 3所示序列的互補序列的至少10個核苷酸連續(xù)的片段，或者d)與a)或b)或c)具有至多5個核苷酸差異的序列；其中，3)所述的探針在5’端帶有互不相同的熒光報告基團，并且在除5'端外的任意一個位置上帶有熒光淬滅基團。本發(fā)明還提供了一種用于檢測I型新德里金屬β -內(nèi)酰胺酶基因的試劑盒，該試 劑盒含有聚合酶鏈式反應(yīng)液及耐熱DNA聚合酶，其中，所述試劑盒還含有本發(fā)明所述的組合物。本發(fā)明的用于檢測I型新德里金屬β -內(nèi)酰胺酶基因的組合物和試劑盒，敏感性高、特異性好、反應(yīng)快速、假陽性少且成本低，適合大規(guī)模的檢測及篩查；可以實現(xiàn)對I型新德里金屬內(nèi)酰胺酶基因的快速、有效且準確的檢測，因而能保證及時的病例診治、準確的病原學(xué)調(diào)查以及科學(xué)的防控政策的制定。


圖I為本發(fā)明實施例I在PCR引物擴增I型新德里金屬β -內(nèi)酰胺酶基因靶核酸序列后所得PCR擴增產(chǎn)物的電泳照片；圖2為IO2拷貝/毫升、IO3拷貝/毫升、IO4拷貝/毫升、IO5拷貝/毫升、IO6拷貝/毫升、IO7拷貝/毫升、IO8拷貝/毫升、IO9拷貝/毫升和101°拷貝/毫升的I型新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶基因陽性對照品的熒光定量PCR圖；圖3為本發(fā)明實施例I檢測制備例I模擬待測樣本中I型新德里金屬β -內(nèi)酰胺酶基因的熒光定量PCR圖；圖4為本發(fā)明實施例I檢測小鼠腸道排泄物樣本中I型新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶基因的熒光定量PCR圖；圖5為本發(fā)明實施例2檢測小鼠腸道排泄物樣本中I型新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶基因的熒光定量PCR圖；圖6為本發(fā)明實施例3檢測小鼠腸道排泄物樣本中I型新德里金屬β -內(nèi)酰胺酶基因的熒光定量PCR圖；圖7為本發(fā)明實施例4檢測小鼠腸道排泄物樣本中I型新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶基因的熒光定量PCR圖8為本發(fā)明實施例5檢測小鼠腸道排泄物樣本中I型新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶基因的熒光定量PCR圖；圖9為本發(fā)明實施例6檢測小鼠腸道排泄物樣本中I型新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶基因的熒光定量PCR圖；圖10為本發(fā)明實施例7檢測小鼠腸道排泄物樣本中I型新德里金屬β -內(nèi)酰胺酶基因的熒光定量PCR圖。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種用于檢測I型新德里金屬β -內(nèi)酰胺酶基因的組合物，其中，所述組合物包括以下序列I)長度為10-19個核苷酸的用于PCR擴增I型新德里金屬β -內(nèi)酰胺酶基因的第一引物，該引物的序列包括a) SEQ ID No :1 所示的序列，b) SEQ ID No : I所示的序列的至少10個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列；2)長度為10-18個核苷酸的用于PCR擴增I型新德里金屬β -內(nèi)酰胺酶基因的第二引物，該引物的序列包括a) SEQ ID No: 2 所示的序列，b) SEQ ID No 2所示的序列的至少10個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列；3)長度為10-24個核苷酸的與I)和2)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的序列包括a) SEQ ID No :3所示的序列或其互補序列，或者b) SEQ ID No 3所示的序列的至少10個核苷酸連續(xù)的片段，c) SEQ ID No 3所示序列的互補序列的至少10個核苷酸連續(xù)的片段，或者d)與a)或b)或c)具有至多5個核苷酸差異的序列；其中，3)所述的探針在5’端帶有互不相同的熒光報告基團，并且在除5'端外的任意一個位置上帶有熒光淬滅基團。在本發(fā)明中，“引物”可以是天然的、合成的或者是二者嵌合的寡核苷酸。引物可以作為在一定條件下誘發(fā)DNA復(fù)制的起始點。在上述條件下可以誘發(fā)與靶核酸鏈互補的引物擴增產(chǎn)物，即在四種不同的三磷酸脫氧核糖核苷及一種聚合試劑(DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)存在下，在一種合適的緩沖液中，在合適的溫度下進行上述擴增。優(yōu)選的引物是單鏈寡脫氧核糖核苷酸。引物的合適長度取決于該引物的設(shè)計用途，但一般在10-20個(優(yōu)選10-19個或10-18個)核苷酸之間，較短的引物分子通常需要較低的溫度，從而與模板形成充分穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。引物不必反映模板的準確序列，但必須充分互補，以與模板雜交并引發(fā)DNA合成。 在本發(fā)明中，術(shù)語“探針”是指能識別特異核苷酸序列的帶標記的一段單鏈DNA或RNA分子，它只與被檢測的特定核苷酸序列結(jié)合。探針位置盡可能地靠近上游引物。為保證結(jié)合特異性，探針的合適長度一般在10-25個(優(yōu)選10-24個)核苷酸之間。
此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，引物和探針上少數(shù)核苷酸殘基的變化，尤其是引物和探針在5’端出現(xiàn)的少數(shù)核苷酸的改變，只能造成該核苷酸的錯配，但不會造成整個DNA復(fù)制合成過程無法進行，進而不會引起PCR產(chǎn)物產(chǎn)量的明顯波動。因此由上述“與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列”以及“與a)或b)或c)具有至多5個核苷酸差異的序列”也可以得到正確的足夠的PCR熒光信號，因此所述序列也應(yīng)該包括在本發(fā)明中。另外，對本發(fā)明的引物/探針可以實施本領(lǐng)域常規(guī)的修飾以提高其穩(wěn)定性，例如，硫化(磷酸骨架上的非橋氧原子被硫原子代替)、甲基化、形成肽核酸、以及在核糖的2'位置引入如甲基和/或氟等的取代基等。優(yōu)選地，本發(fā)明所述組合物包括以下序列 I)長度為15-19個核苷酸的用于PCR擴增I型新德里金屬β -內(nèi)酰胺酶基因的第一引物，該引物的序列包括a) SEQ ID No : I 所示的序列，b)SEQ ID No 1所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多2個核苷酸差異的序列；2)長度為15-18個核苷酸的用于PCR擴增I型新德里金屬β -內(nèi)酰胺酶基因的第二引物，該引物的序列包括a) SEQ ID No: 2 所示的序列，b) SEQ ID No 2所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者c)與a)或b)具有至多2個核苷酸差異的序列；3)長度為15-24個核苷酸的與I)和2)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的序列包括a) SEQ ID No :3所示的序列或其互補序列，或者b) SEQ ID No 3所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，c) SEQ ID No 3所示序列的互補序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者d)與a)或b)或c)具有至多2個核苷酸差異的序列；其中，3)所述的探針在5’端帶有互不相同的熒光報告基團，并且在除5'端外的任意一個位置上帶有熒光淬滅基團。進一步優(yōu)選地，本發(fā)明所述組合物由以下序列組成I)用于PCR擴增I型新德里金屬內(nèi)酰胺酶基因第一引物，該引物的序列為如SEQ ID No 1所示的序列；2)用于PCR擴增I型新德里金屬內(nèi)酰胺酶基因第二引物，該引物的序列為如SEQ ID No 2所示的序列；3)與I)和2)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的序列為如SEQ ID No 3所不的序列或其互補序列；其中，3)所述的探針在5’端帶有互不相同的熒光報告基團，并且在除5'端外的任意一個位置上帶有熒光淬滅基團。本發(fā)明的組合物中探針上所帶有的所述熒光報告基團和所述熒光淬滅基團可以為本領(lǐng)域常用的用作熒光報告基團和熒光淬滅基團的物質(zhì)。只要滿足所述熒光報告基因在所述熒光淬滅基團的上游，且所述熒光報告基團的發(fā)射波長小于所述熒光淬滅基團的吸收波長。所述熒光報告基團和所述熒光淬滅基團按照上述原則可以選自由6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein, FAM)、四氯-6-羧基突光素(tetrachloro-6-carboxyfIuorescein, TET)、六氣 _6_ 甲基突光素(Hexachloro-6-methylfluorescein, HEX)、6_ 竣基四甲基羅丹明(6-carboxytetramethy lrhodamine, TAMRA)、橫酸羅丹明(Sulforhodamine 101,Texas Red)、羧基-X-羅丹明(Carboxy-x-rhodamine, ROX)、花菁 3 (cyanine3, Cy3)、花菁3. 5 (cyanine3. 5, Cy3. 5)、花菁 5 (cyanine5，Cy5)、花菁 5· 5 (cyanine5. 5, Cy5. 5)、生物搜索技術(shù)公司(Biosearch Technologies, Inc)的黑洞萍滅劑 I (Black Hole Quencher 1，BHQ1)、黑洞淬滅劑 2 (Black Hole Quencher 2, BHQ2)、黑洞淬滅劑 3 (Black Hole Quencher3，BHQ3)、4_(4_ 二甲基氛基苯偶氣基)苯甲酸(4-(4，-dimethylaminophenylazo)benzoic acid, DABCYL)、6_羧基-4’，5’ -二氯-2’，7’ -二甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酯(6_Carboxy-4’，5’ -dichloro_2’，7’ -dimethoxyf luorescein, JOE)和美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的VIC熒光染料所組成的組中。優(yōu)選地，所述熒光報告基團選自由6-羧基熒光素、六氯-6-甲基熒光素、VIC熒光染料、四氯-6-羧基熒光素、羧基-X-羅丹明、6-羧基四甲基羅 丹明、磺酰羅丹明、6-羧基_4’，5’ - 二氯-2’，7’ - 二甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酯、花菁3、花菁5和花菁5. 5所組成的組中；所述熒光淬滅基團選自由6-羧基四甲基羅丹明、4- (4- 二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、BHQ1、BHQ2和BHQ3所組成的組中。更優(yōu)選地，按照下表I所示來選擇熒光報告基團和熒光淬滅基團。表I
權(quán)利要求
1.用于檢測I型新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶基因的組合物，其特征在于，所述組合物包括以下序列 1)長度為10-19個核苷酸的用于PCR擴增I型新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶基因的第一引物，該引物的序列包括 a)SEQ ID No 1所示的序列， b)SEQID No 1所示的序列的至少10個核苷酸連續(xù)的片段，或者 c)與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列； 2)長度為10-18個核苷酸的用于PCR擴增I型新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶基因的第二引物，該引物的序列包括 a)SEQ ID No :2所示的序列， b)SEQID No :2所示的序列的至少10個核苷酸連續(xù)的片段，或者 c)與a)或b)具有至多5個核苷酸差異的序列； 3)長度為10-24個核苷酸的與I)和2)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的序列包括 a)SEQ ID No :3所示的序列或其互補序列，或者 b)SEQID No :3所示的序列的至少10個核苷酸連續(xù)的片段， c)SEQID No :3所示序列的互補序列的至少10個核苷酸連續(xù)的片段， 或者d)與a)或b)或c)具有至多5個核苷酸差異的序列； 其中，3)所述的探針在5’端帶有互不相同的熒光報告基團，并且在除5,端外的任意一個位置上帶有熒光淬滅基團。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其特征在于，所述組合物包括以下序列 1)長度為15-19個核苷酸的用于PCR擴增I型新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶基因的第一引 物，該引物的序列包括 a)SEQ ID No 1所示的序列， b)SEQID No :1所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者 c)與a)或b)具有至多2個核苷酸差異的序列； 2)長度為15-18個核苷酸的用于PCR擴增I型新德里金屬β_內(nèi)酰胺酶基因的第二引物，該引物的序列包括 a)SEQ ID No :2所示的序列， b)SEQID No :2所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段，或者 c)與a)或b)具有至多2個核苷酸差異的序列； 3)長度為15-24個核苷酸的與I)和2)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的序列包括 a)SEQ ID No :3所示的序列或其互補序列，或者 b)SEQID No :3所示的序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段， c)SEQID No :3所示序列的互補序列的至少15個核苷酸連續(xù)的片段， 或者d)與a)或b)或c)具有至多2個核苷酸差異的序列； 其中，3)所述的探針在5’端帶有互不相同的熒光報告基團，并且在除5,端外的任意一個位置上帶有熒光淬滅基團。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中，所述組合物由以下序列組成 1)用于PCR擴增I型新德里金屬內(nèi)酰胺酶基因第一引物，該引物的序列為如SEQID No I所不的序列； 2)用于PCR擴增I型新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶基因第二引物，該引物的序列為如SEQID No 2所不的序列； 3)與I)和2)所述引物的PCR擴增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的序列為如SEQID No : 3所示的序列或其互補序列； 其中，3)所述的探針在5’端帶有互不相同的熒光報告基團，并且在除5,端外的任意一個位置上帶有熒光淬滅基團。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項所述的組合物，其中，所述熒光報告基團的發(fā)射波長 小于所述熒光淬滅基團的吸收波長；并且所述熒光報告基團和所述熒光淬滅基團選自由6-羧基熒光素、四氯-6-羧基熒光素、六氯-6-甲基熒光素、6-羧基四甲基羅丹明、磺酰羅丹明、羧基-X-羅丹明、花菁3、花菁3. 5、花菁5、花菁5. 5、BHQ1、BHQ2、BHQ3、4_(4- 二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、6-羧基-4’，5’ - 二氯-2’，7’ - 二甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酯和VIC熒光染料所組成的組中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物,其中，所述突光報告基團選自由6-羧基突光素、六氯-6-甲基熒光素、VIC熒光染料、四氯-6-羧基熒光素、羧基-X-羅丹明、6-羧基四甲基羅丹明、磺酰羅丹明、6-羧基_4’，5’ - 二氯_2’，7’ - 二甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酯、花菁3、花菁5和花菁5. 5所組成的組中；所述熒光淬滅基團選自由6-羧基四甲基羅丹明、4- (4- 二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、BHQ1、BHQ2和BHQ3所組成的組中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中，所述熒光報告基團為6-羧基熒光素；所述熒光淬滅基團為BHQl。
7.用于檢測I型新德里金屬β_內(nèi)酰胺酶基因的試劑盒，該試劑盒含有聚合酶鏈式反應(yīng)液及耐熱DNA聚合酶，其特征在于，所述試劑盒還含有權(quán)利要求1-6中任意一項所述的組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其中，所述試劑盒還包括陽性對照品，所述陽性標準品為IO3-IO8拷貝/毫升的I型新德里金屬內(nèi)酰胺酶基因質(zhì)粒DNA溶液，其中，所述I型新德里金屬β -內(nèi)酰胺酶基因質(zhì)粒DNA由I型新德里金屬β -內(nèi)酰胺酶基因DNA片段和質(zhì)粒載體組成，所述I型新德里金屬內(nèi)酰胺酶基因DNA片段選自由如SEQ ID No :4所示的I型新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶的完整基因和I型新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶基因擴增產(chǎn)物所組成的組中；所述試劑盒還包括陰性對照品，所述陰性對照品為水。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其中，所述陽性標準品為IO5-IO8拷貝/毫升的I型新德里金屬β -內(nèi)酰胺酶基因質(zhì)粒DNA溶液；所述I型新德里金屬β -內(nèi)酰胺酶基因DNA片段為如SEQ ID No 5所示的I型新德里金屬β -內(nèi)酰胺酶基因擴增產(chǎn)物；所述陰性對照品選自由蒸餾水、去離子水、注射用水、重蒸水和超純水所組成的組中。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其中，所述試劑盒檢測的樣本選自由腸道排泄物、血液、唾液和鼻腔洗出液所組成的組中。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于檢測I型新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶基因的組合物和試劑盒，它們均包括有關(guān)SEQ ID No1-2所示序列或其至少10個核苷酸連續(xù)的片段、或與它們存在具有至多5個核苷酸差異的序列的特異性引物；以及SEQ IDNo3所示的序列或其互補序或它們的至少10個核苷酸連續(xù)的片段、或與它們存在具有至多5個核苷酸差異的序列的特異性探針。本發(fā)明的組合物和試劑盒，敏感性高、特異性好、反應(yīng)快速、假陽性少且成本低，適合大規(guī)模的檢測及篩查；可以實現(xiàn)對I型新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶基因的快速、有效且準確的檢測，因而能保證及時的病例診治、準確的病原學(xué)調(diào)查以及科學(xué)的防控政策的制定。
文檔編號C12Q1/68GK102719519SQ20111007702
公開日2012年10月10日 申請日期2011年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月30日
發(fā)明者葉鋒, 宋玉亮 申請人:北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司