專(zhuān)利名稱(chēng)：水稻耐逆性相關(guān)受體類(lèi)蛋白OsSIK2及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物耐逆性相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別涉及一種水稻耐逆性相關(guān)受體類(lèi)蛋白0SSIK2及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
環(huán)境中物理化學(xué)因素的變化，如干旱、鹽堿、冷害、凍害、水澇等脅迫因素以及病蟲(chóng)害等生物因素對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要影響，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成農(nóng)作物大規(guī)模減產(chǎn)，培育耐逆性作物是種植業(yè)的主要目標(biāo)之一。提高作物的耐逆性，可以利用傳統(tǒng)的育種方法和分子遺傳育種方法。目前，分子遺傳育種已經(jīng)成為科技工作者所關(guān)注的領(lǐng)域之一。在非生物或生物逆境的脅迫下，高等植物細(xì)胞有多種途徑感受和應(yīng)答外界環(huán)境中物化參數(shù)的變化，將胞外信號(hào)變?yōu)榘麅?nèi)信號(hào)，經(jīng)過(guò)一系列磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)將信號(hào)傳遞到細(xì)胞核，經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控相關(guān)的功能基因，可以啟動(dòng)逆境應(yīng)答基因的表達(dá)，提高植物的耐逆性。植物耐非生物脅迫相關(guān)的基因已有很多報(bào)道，包括效應(yīng)分子基因和調(diào)控基因。水稻中與耐非生物脅迫相關(guān)的調(diào)控基因方面，包括轉(zhuǎn)錄因子如本實(shí)驗(yàn)室克隆的0sbHLH(專(zhuān)利號(hào) ZL 03 I 23913. 7)、0sDREBL(專(zhuān)利號(hào) ZL 02 I 29517.4)等和受體類(lèi)激酶，如 OsSIKl (專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?00710176995.7)及其它調(diào)控蛋白。上述基因轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥或水稻后，其聞表達(dá)均提聞了轉(zhuǎn)基因植株耐非生物脅迫的能力。水稻作為最重要的糧食作物之一，改善其耐逆性，具有重要的理論及現(xiàn)實(shí)意義。轉(zhuǎn)基因水稻植株的成功和水稻基因組測(cè)序工作的完成為研究發(fā)現(xiàn)新的耐逆境基因提供了有利條件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種植物耐逆性相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供一種植物耐逆性相關(guān)的蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的蛋白，名稱(chēng)為0sSIK2(Stress Inducible kinase 2),來(lái)源于水稻 (Oryza sativa),是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的序列2由837個(gè)氨基酸殘基組成。所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述(b)中的0sSIK2可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。 上述(b)中的0sSIK2的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列I自5'端第I至2514位堿基所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變得到。
編碼所述蛋白的基因(0sSIK2)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述基因是如下⑴或⑵或(3)的DNA分子(I)序列表中序列I所示的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA 分子;(3)與⑴限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。所述嚴(yán)格條件可為如下50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2XSSC，0. I % SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS、0. 5M NaPOJP ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，I X SSC，O. I % SDS中漂洗；還可為50°C，在 7% SDS,O. 5M NaPO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，O. 5X SSC, O. 1% SDS 中漂洗； 還可為50°C，在7% SDS、0. 5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，O. I X SSC，
O.1% SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS,O. 5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交， 在65°C，0. I XSSC,O. 1% SDS中漂洗；也可為在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用 2 X SSC, O. I % SDS 和 I X SSC, O. I % SDS 各洗膜一次。序列表中的序列I由2514個(gè)脫氧核糖核苷酸組成，自5’末端的第I至2514位脫氧核糖核苷酸為0sSIK2的開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame7ORF),自5’端的第I至3位脫氧核糖核苷酸為0sSIK2的起始密碼子ATG，自5’端的第2512至2514位脫氧核糖核苷酸為0sSIK2的終止密碼子TAG。含有所述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pR0KII、pBin438、 PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391_Xa 或 pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類(lèi)似功能。使用所述基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子(如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動(dòng)子、玉米的泛素啟動(dòng)子(Ubiquitin))、組成型啟動(dòng)子或組織特異表達(dá)啟動(dòng)子(如種子特異表達(dá)的啟動(dòng)子)，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因)。如賦予對(duì)卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptll基因，賦予對(duì)除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對(duì)抗生素潮霉素抗性的 hph基因,和賦予對(duì)methatrexate抗性的dhfr基因,賦予對(duì)草甘磷抗性的EPSPS基因)提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。所述重組載體具體為將所述基因插入pCambial302載體的BglI和SalI識(shí)別位點(diǎn)間得到的重組載體pCambial302-0sSIK2。擴(kuò)增所述基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述引物對(duì)具體可為如下(I)或(II)(I)由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對(duì)；(II)由序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA組成的引物對(duì)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的方法是將所述基因?qū)肽康闹参镏?，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于所述目的植物。所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述基因轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。將所述基因?qū)肽康闹参铮?會(huì)使所述蛋白質(zhì)目的植物中合成，進(jìn)而是目的植物的耐逆性性狀得到改良。所述基因可先進(jìn)行進(jìn)行如下修飾，再導(dǎo)入宿主中，以達(dá)到更好的表達(dá)效果I)根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達(dá)；例如，可根據(jù)受體植物所偏愛(ài)的密碼子，在保持本發(fā)明所述核苷酸序列編碼的氨基酸的同時(shí)改變其密碼子以符合植物偏愛(ài)性；優(yōu)化過(guò)程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地實(shí)現(xiàn)植物中導(dǎo)入基因的高水平表達(dá)，其中GC含量可為35 %,優(yōu)選為多于45 %,更優(yōu)選為多于 50%，最優(yōu)選多于約60% ；2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列進(jìn)行修飾；3)與各種植物表達(dá)的啟動(dòng)子連接，以利于其在植物中的表達(dá)；所述啟動(dòng)子可包括組成型、誘導(dǎo)型、時(shí)序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動(dòng)子；啟動(dòng)子的選擇將隨著表達(dá)時(shí)間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性表達(dá)啟動(dòng)子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時(shí)期而定；盡管證明了來(lái)源于雙子葉植物的許多啟動(dòng)子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動(dòng)子用于雙子葉植物中的表達(dá)，單子葉植物的啟動(dòng)子用于單子葉植物中的表達(dá)；4)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達(dá)效率；例如來(lái)源于 CaMV的tml，來(lái)源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明基因進(jìn)行連接。5)引入增強(qiáng)子序列，如內(nèi)含子序列(例如來(lái)源于Adhl和bronzel)和病毒前導(dǎo)序列(例如來(lái)源于TMV，MCMV和AMV)。在實(shí)際操作中，也可以將本發(fā)明基因進(jìn)行細(xì)胞靶向定位?？衫帽绢I(lǐng)域現(xiàn)有的技術(shù)實(shí)現(xiàn)。例如，將來(lái)源于靶向細(xì)胞器的靶基因序列與本發(fā)明基因序列融合，再導(dǎo)入植物細(xì)胞中，就可定位了。
利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的水稻受體類(lèi)蛋白0sSIK2的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得對(duì)干旱和鹽等非生物逆境脅迫耐受力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。所述基因具體可通過(guò)所述重組載體導(dǎo)入所述目的植物中。攜帶有所述基因的表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA 轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。所述耐逆性為耐鹽性和/或耐旱性。所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物具體為水稻。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，將0sSIK2基因?qū)胨?，獲得了過(guò)量表達(dá)0sSIK2基因的轉(zhuǎn)基因植株，在鹽脅迫后，轉(zhuǎn)0sSIK2基因植株的存活率和生長(zhǎng)狀態(tài)都要明顯好于對(duì)照植株，而 0sSIK2的突變體水稻表現(xiàn)出對(duì)鹽和旱脅迫的超敏感，說(shuō)明0sSIK2基因能夠顯著提高植物的耐鹽、耐旱性。本發(fā)明對(duì)于培育耐逆植物品種，特別是培育耐非生物脅迫(耐鹽)的作物、 林草等新品種具有重要價(jià)值，可用于農(nóng)牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境治理所需的耐逆性植物品種的培育和鑒定，對(duì)提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。


圖I為0sSIK2在4°C、NaCl、干旱和ABA處理下的表達(dá)特征圖2為植物表達(dá)載體pCambial302-0sSIK2的物理圖譜圖3為轉(zhuǎn)0sSIK2基因植株的Real time PCR檢測(cè)圖4為0sSIK2過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因、突變體及對(duì)照耐植株鹽性比較圖5為0sSIK2過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株在O. 5%鹽田中的表型及存活率圖6為0sSIK2突變體植株與其對(duì)照NIP的耐旱性比較圖7為0sSIK2過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照的耐旱性比較
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例I、水稻耐逆性相關(guān)蛋白0sSIK2編碼基因0sSIK2的篩選及其cDNA的克隆l、0sSIK2 的克隆對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的水稻全基因組序列進(jìn)行BLAST檢索，得到受體類(lèi)激酶(RLK)相關(guān)序列片段，經(jīng)過(guò)拼接，得到了 267個(gè)受體類(lèi)蛋白基因，經(jīng)RT-PCR測(cè)定，其中一些基因受非生物脅迫誘導(dǎo)，從中選取一個(gè)基因作進(jìn)一步研究。水稻(Oryzasativa var. TP309,記載在 Shou-Qiang Ouyang, Yun-Feng Liu, Peng Liu, Gang Lei，Si-Jie He，Biao Ma, Wan-Ke Zhang, Jin-Song Zhang and Shou-Yi Chen,Receptor-like kinase OsSIKl improves drought and salt stress tolerance in rice (Oryza sativa)plants, The Plant Journal，2010，62 (2) :316_29，公眾可從中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。)幼苗培養(yǎng)至兩周，釆用異硫氰酸胍-酚-氯仿抽提方法從冷凍的水稻苗中提取RNA。取5 μ g總RNA用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA —鏈。
以上述cDNA作為模板，所用引物如下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增正向5’ -ATGCCACCTCCTCTCTATGT-3’(序列 3)反向5’ -TTATATTGAAGCCACGTCAG-3’(序列 4)PCR反應(yīng)體系為25 μ 1，包含PCR緩沖液、O. 2mmol/L dNTPs、兩個(gè)引物各O. 8mmol/ L、5 μ I稀釋的cDNA混合液及I單位LA Taq DNA聚合酶(Takara)，PCR的條件為94°C， 30s ；58°C, Imin ；72°C,3min ；35 個(gè)循環(huán)。將獲得的PCR產(chǎn)物與pGEM-T-easy載體(購(gòu)自Promega)連接，得到的連接產(chǎn)物命名為PT_M1，測(cè)序，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列I所示的核苷酸，該P(yáng)CR產(chǎn)物的基因命名為 0sSIK2，該基因的編碼區(qū)為序列表中序列I自5’末端第1-2514位核苷酸，該基因編碼的蛋白命名為0sSIK2，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2所示。序列表中序列I由2514 個(gè)核苷酸組成，序列表中序列2由837個(gè)氨基酸殘基組成。2、非生物脅迫和激素處理下水稻0sSIK2基因的表達(dá)模式由于0sSIK2基因在水稻幼苗中的豐度很低，因此選用RT-PCR的方法研究了 0sSIK2在各種處理時(shí)的轉(zhuǎn)錄特征。水稻(Oryza sativa TP309)種子種在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)室中生長(zhǎng)至兩葉一心期時(shí) (2周)進(jìn)行如下脅迫處理1)低溫處理水稻苗置于4°C中；2)鹽處理水稻苗移入O. 6% NaCl水溶液中；3)干旱處理將水稻苗從MS培養(yǎng)基(購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。) 中取出，吸干水分,置于空氣中；4)ABA處理將水稻苗移入100 μ m脫落酸(ABA)水溶液中； 分別在上述各種處理后0、0. 5、1、5、12和24小時(shí)分別收集新鮮葉片Ig提取總RNA，將每個(gè)樣品的總RNA(5 μ g)用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco)在42°C下逆轉(zhuǎn)錄50min，取1/20的cDNA混合物用于Northern分析，探針為0sSIK2 cDNA,以檢測(cè)0sSIK2的表達(dá)豐度。以18srRNA為內(nèi)標(biāo)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，得到相似的結(jié)果。結(jié)果具體如圖I所示，0sSIK2基因的表達(dá)明顯受低溫、鹽、干旱和ABA誘導(dǎo)。實(shí)施例2、培育耐鹽和耐干旱脅迫的水稻一、0sSIK2超表達(dá)水稻植株的獲得和鑒定I、0sSIK2超表達(dá)水稻植株的獲得I) 0sSIK2 超表達(dá)載體 pCambial302_0sSIK2 的構(gòu)建以水稻品種TP309的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，以正向BglII :5’_AGATCTA TGCCACCTCCTCTCTATGT-3’，反向 SalI :5’ -GTCGAC TTATATTGAAGCCACGTCAG-3’ 為引物，得到 PCR產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)測(cè)序，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列I的自5'末端第1-2514位脫氧核糖核苷酸，即為 0sSIK2全長(zhǎng)cDNA ;將該P(yáng)CR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)BglI和SalI雙酶切，回收酶切后片段與經(jīng)過(guò)同樣酶
切的 pCambial302 ( H0f ig KP, Moyle RL, Putterill J, Walter C. , Expression analysis
of four Pinus radiata male cone promoters in the heterologous host Arabidopsis, Planta，2003，217(6) :858_67，公眾可從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。)載體片段連接，得到連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，送去測(cè)序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列表中序列I的自5'末端第1-2514位脫氧核糖核苷酸插入到載體的 BglI和SalI酶切位點(diǎn)間得到的載體，該質(zhì)粒命名為pCambial302-0sSIK2，即為重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示。2) 0sSIK2超表達(dá)載體pCambial302_0sSIK2的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)0sSIK2基因的水稻植株的獲得〈1>轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌a、感受態(tài)細(xì)胞的制備參照 Sambrook 等(A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press)的方法挑取根癌農(nóng)桿菌 AGLl (He Y, Jones HD，Chen S，Chen XM，Wang Dff, Li KX, Wang DS, Xia LQ, Agrobacterium-mediated transformation of durum wheat(Triticum turgidum L. var. durum cv Stewart)with improved efficiency, J ExpBot. 2010,61(6) 1567-81，公眾可從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。)單菌落于10mlLB(10g/ L NaCl，5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨)中，28°C振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)晚期；取0. 5ml菌液加入50ml新鮮LB液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl 0. 5 ;轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，冰浴20分鐘；4°C，4000rpm離心10分鐘，收集菌體；沉淀用20ml預(yù)冷的10%甘油重懸；4°C， 4000rpm離心10分鐘，迅速倒出上清液；用甘油重懸，即為感受細(xì)胞，按每管50 μ I體積分裝至1.5ml的離心管中，分裝后于_70°C保存待用。b、根癌農(nóng)桿菌電擊轉(zhuǎn)化取50 μ I感受態(tài)細(xì)胞，加入0. 5 μ g質(zhì)粒pCambial302-0sSIK2，輕輕混勻，冰上放置；2500V電擊5秒，立刻加入800 μ I LB培養(yǎng)基；28°C，150rpm,恢復(fù)培養(yǎng)45分鐘；涂布細(xì)胞于篩選培養(yǎng)基平板上，超凈臺(tái)吹干表層液體；28°C培養(yǎng)兩天。從轉(zhuǎn)化后的平板挑取單菌落接種至2ml LB YEB液體培養(yǎng)基(含抗生素終濃度為50 μ g/ml的卡那霉素和25 μ g/ml的利福平)中，28°C振蕩過(guò)夜，堿裂解法抽提質(zhì)粒，分別進(jìn)行PCR和酶切鑒定。PCR 鑒定的引物為正向 BglII :5，-AGATCT ATGCCACCTCCTCTCTATGT-3’ (序列 5)， 反向 SalI :5’ -GTCGACTTATATTGAAGCCACGTCAG-3’ (序列 6)，得到 2514bp 的片段為陽(yáng)性質(zhì)粒。酶切采用BglI和SalI雙酶切，得到2514bp的片段為陽(yáng)性質(zhì)粒。將上述PCR鑒定和酶切鑒定的陽(yáng)性質(zhì)粒送去測(cè)序，結(jié)果為該質(zhì)粒為 pCambial302-0sSIK2，含有該質(zhì)粒的菌株命名為 AGLl/pCambial302_0sSIK2?！?>農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化A、幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)取水稻品種TP309 (以下簡(jiǎn)稱(chēng)野生型水稻。)種子，70%乙醇水溶液消毒I分鐘， 無(wú)菌水沖洗2-3遍；再用2%有效氯的次氯酸鈉溶液振蕩消毒60分鐘以上，無(wú)菌水沖洗4-5 遍，然后在無(wú)菌條件下分離出幼胚，接在N6D2 (N6鹽分和維生素,500g/L水解酪蛋白，30g/L 蔗糖，2mg/L 2，4-D，2. 5g/L固化劑(gelrite)，ρΗ5· 8)培養(yǎng)基上，于28°C暗培養(yǎng)4天，得到水稻TP309幼胚的愈傷組織。B、農(nóng)桿菌的培養(yǎng)從LB固體培養(yǎng)基上挑取AGLl/pCambial302_0sSIK2接種至20ml含終濃度為 50 μ g/ml的卡那霉素和25 μ g/ml的利福平的LB液體培養(yǎng)基中，28°C搖菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期；再?gòu)闹腥?. 5ml轉(zhuǎn)接至50ml同樣的LB培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)至0D_為0. 5左右。C、共培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化、篩選、分化將OD6qq 為 0. 5 的 AGLl/pCambial302-0sSIK2 于 4000g 離心 10 分鐘后，沉淀用等體積的AAM-AS (AA鹽分和氨基酸,MS維生素，IOOmM乙酰丁香酮(Acetosyringone, AS), pH5. 2) 培養(yǎng)基重懸，得到AAM-AS菌液；將預(yù)培養(yǎng)4天的來(lái)源于水稻TP309幼胚的愈傷組織浸入此 AAM-AS菌液中侵染20分鐘，用無(wú)菌濾紙吸干后轉(zhuǎn)移到N6D2C (N6D2,10g/L葡萄糖，IOOmM乙酰丁香酮，PH5. 2)培養(yǎng)基上(在培養(yǎng)基表面鋪一張無(wú)菌濾紙)，25°C暗培養(yǎng)3天。將愈傷組織用含300mg/L的頭孢霉素(cef)的無(wú)菌水洗滌4_5遍，無(wú)菌濾紙吸干后轉(zhuǎn)至 N6D2S1 (N6D2, 25mg/L潮霉素(Hygromycine)，600mg/L 頭孢霉素(cefotaxime), pH5. 8) 培養(yǎng)基上，篩選一代；兩周后，轉(zhuǎn)移至N6D2S2 (N6D2, 50mg/L潮霉素，300mg/L頭孢霉素，pH5. 8) 培養(yǎng)基上篩第二代(2周/代)。取出經(jīng)過(guò)兩次篩選生長(zhǎng)旺盛的抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基(MS鹽分和維生素，300g/L水解酪蛋白，50mg/L潮霉素，3g/L 6-BA，2. 5mg/L KT, O. 2mg/L ZT, 2. 5g/L 固化劑 (gelrite)，ρΗ5· 8)上，在分化培養(yǎng)箱(12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗，白天28°C，夜晚25°C )中培養(yǎng)7天；然后移至分化培養(yǎng)基上，在分化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至產(chǎn)生再生苗；再生的植株在生根壯苗培養(yǎng)基(1/4MS鹽分，MS維生素，lmg/L多效唑，O. 5mg/LNAA,6. 5g/L瓊脂粉，pH5. 8)上生根壯苗；待小苗長(zhǎng)至IOcm左右時(shí)打開(kāi)容器封口膜，煉苗2-3天，將陽(yáng)性小苗移至人工氣候室栽培，共得到了 541株篩選陽(yáng)性Ttl代轉(zhuǎn)0sSIK2水稻，篩選抗生素為終濃度為50 μ g/ml 的卡那酶素和25 μ g/ml的利福平。T1代表示Ttl代自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株。采用上述方法，將空載體pCambial302轉(zhuǎn)入水稻品種TP309中，得到Ttl代轉(zhuǎn)空載體水稻，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA為模板，引物為正向BglII :5’ -AGATCTATGCCACCTCCTCT CTATGT-3’，反向 SalI :5’ -GTCGACTTATATTGAAGCCACGTCAG-3’，結(jié)果沒(méi)有得到目的片段。2、轉(zhuǎn)0sSIK2水稻植株的鑒定分別提取水稻品種TP309植株(野生型水稻)Jtl代轉(zhuǎn)空載體水稻、Ttl代轉(zhuǎn)0sSIK2 水稻的總RNA進(jìn)行Real-time PCR鑒定分析，其中，Real-time PCR所用的引物如下正向5，-ATGCCACCTCCTCTCTATGT-3，反向5，-TTATATTGAAGCCACGTCAG-3，結(jié)果如圖3所示，可以看出，在41株Ttl代轉(zhuǎn)0sSIK2水稻中，有21株Ttl代轉(zhuǎn)0sSIK2 水稻的0sSIK2基因表達(dá)量高于野生型水稻，是野生型水稻的3-10倍。這些0sSIK2基因表達(dá)量高于野生型水稻的Ttl代轉(zhuǎn)0sSIK2水稻即為0sSIK2基因過(guò)表達(dá)植株。野生型水稻和轉(zhuǎn)空載體水稻結(jié)果無(wú)顯著差異。挑選出74-3、72-1、1-43和1-18四個(gè)株系的Ttl代轉(zhuǎn)0sSIK2水稻用同樣的方法進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，以野生型水稻TP309植株和Ttl代轉(zhuǎn)空載體水稻(42-1)為對(duì)照，進(jìn)行RT-PCR， 結(jié)果如圖3所示，從圖中可以看出，TP309植株和42-1的0sSIK2的相對(duì)轉(zhuǎn)錄數(shù)分別約為I. 5 和I. 0，74-3和72-1的0sSIK2的相對(duì)轉(zhuǎn)錄數(shù)分別約為3. 8和8. 5，1-43和1-18的0sSIK2 的相對(duì)轉(zhuǎn)錄數(shù)分別約為4. 5和6. O。收獲74-3株系Ttl代轉(zhuǎn)0sSIK2水稻、72_1株系的Ttl代轉(zhuǎn)0sSIK2水稻和Ttl代轉(zhuǎn)空載體水稻的種子，播種得到74-3株系T1代轉(zhuǎn)0sSIK2水稻、72_1株系的T1代轉(zhuǎn)0sSIK2水稻和T1代轉(zhuǎn)空載體水稻。三、轉(zhuǎn)0sSIK2基因水稻耐逆性檢測(cè)I、耐鹽性試驗(yàn)
1)0. 6% NaCl水溶液耐鹽性試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行如下兩組處理0.6% NaCl水溶液組將上述2個(gè)0sSIK2基因過(guò)表達(dá)株系(74_3株系T1代轉(zhuǎn) 0sSIK2水稻和72-1株系的T1代轉(zhuǎn)0sSIK2水稻)的2周齡苗移入O. 6 % (O. 6g/100ml) NaCl 水溶液中處理18天，室溫(25°C )，自然光照。以TP309水稻(野生型水稻)和T1代轉(zhuǎn)空載體水稻為對(duì)照。O. 5% NaCl水溶液組將0sSIK2的T-DNA插入突變體sik2 (購(gòu)于日本水稻基因組研究中心，Rice Genome Research Center (RGRC))及其對(duì)照 NIP (Shou-Qiang Ouyang, Yun-Feng Liu, Peng Liu, Gang Lei, Si-Jie He, Biao Ma, Wan-Ke Zhang, Jin-Song Zhang and Shou-Yi Chen,Receptor-1 ike kinase OsSIKl improves drought and salt stress tolerance in rice(Oryza sativa)plants, 2010, The Plant Journal,62(2) :316-29.公眾可從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。)的2周齡苗移入O. 5% (O. 5g/100ml) NaCl水溶液中處理18天，室溫(25°C )，自然光照。觀察兩組鹽脅迫處理植株的表型并照相。實(shí)驗(yàn)共設(shè)三次重復(fù)，每次重復(fù)中，所測(cè)試的各株系植株均為30株。結(jié)果如圖4所示，74-3株系T1代轉(zhuǎn)0sSIK2水稻和72_1株系的T1代轉(zhuǎn)0sSIK2水稻鹽脅迫后的長(zhǎng)勢(shì)均明顯優(yōu)于對(duì)照TP309水稻(野生型水稻)，在0. 6% NaCl處理18天后， 對(duì)照(TP309)和轉(zhuǎn)基因植株(74-3、72-1)均表現(xiàn)萎蔫，但是對(duì)照萎蔫程度較轉(zhuǎn)基因植株顯著，野生型水稻和T1代轉(zhuǎn)空載體水稻結(jié)果無(wú)顯著差異；當(dāng)用0. 5% NaCl處理0sSIK2突變體(sik2，該突變體為T(mén)-DNA插入突變體，其中 0sSIK2基因不表達(dá))和其對(duì)照NIP (sik2來(lái)自日本水稻基因組研究中心，突變的原始材料是日本晴NIP，NIP的0sSIK2基因是正常表達(dá)的)18天時(shí)，NIP略顯萎蔫，而sik2則明顯萎蔫。 表明0sSIK2的過(guò)量表達(dá)增加了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性，而在該基因的突變體中由于0sSIK2 其表達(dá)下降或不表達(dá)，則導(dǎo)致植株的耐鹽性下降。因此0sSIK2參與植物對(duì)鹽脅迫的應(yīng)答反應(yīng)(上述實(shí)驗(yàn)的目的是要說(shuō)明0sSIK2基因過(guò)量表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐逆性，而其不表達(dá)的突變體則與其對(duì)照比較，鹽敏感。進(jìn)一步說(shuō)明0sSIK2與植物耐逆性相關(guān))。2)0. 5% NaCl水溶液的鹽池中耐鹽性鑒定在0. 5% NaCl水溶液的鹽池中進(jìn)行了耐鹽性鑒定。所有鹽池實(shí)驗(yàn)均在自然溫度和光照下進(jìn)行，在抽穗前完成，具體如下將65棵74-3株系T1代轉(zhuǎn)0sSIK2水稻和65棵72_1株系的T1代轉(zhuǎn)0sSIK2水稻在北京6月的自然溫度和光照育秧一個(gè)月，后移至清水池中。在北京7月自然條件下緩秧 7天之后灌鹽水至0. 5% (質(zhì)量百分含量)NaCl，67天后復(fù)水42天，以91棵對(duì)照TP309水稻(野生型水稻)和91棵T1代轉(zhuǎn)空載體水稻為對(duì)照。在鹽池中受鹽脅迫后所有的水稻植株生長(zhǎng)均受到嚴(yán)重抑制。在鹽脅迫(灌鹽水) 后的第23天、30天、37天、50天和70天時(shí)分別統(tǒng)計(jì)對(duì)照和轉(zhuǎn)基因植株的存活率，結(jié)果見(jiàn)表 I所示，在鹽脅迫23、30和37天時(shí)，轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)系(74-3株系T1代轉(zhuǎn)0sSIK2水稻和72_1株系的T1代轉(zhuǎn)0sSIK2水稻)的成活率均為100%，而對(duì)照(TP309水稻)23、30和37天時(shí)成活率分別下降至76%、64%和36% ;當(dāng)鹽脅迫至50天和70天時(shí)，轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)系72_1和74_3 分別下降至81 %、75 %和76 %、73 %，而對(duì)照分別急劇下降至20 %和4 %。野生型水稻和T1代轉(zhuǎn)空載體水稻結(jié)果無(wú)顯著差異。拍照如圖5所示，可以看出，鹽脅迫67天和復(fù)水42天后對(duì)照(TP309水稻)和轉(zhuǎn)基因植株(72-1和74-3)的生長(zhǎng)情況，在復(fù)水前對(duì)照和轉(zhuǎn)基因植株均嚴(yán)重萎蔫，但是轉(zhuǎn)基因植株明顯好于對(duì)照，復(fù)水后，大部分轉(zhuǎn)基因植株開(kāi)始反綠，而對(duì)照繼續(xù)萎蔫，僅極少數(shù)對(duì)照苗有綠色。上述結(jié)果與盆栽的耐鹽性(上述I) O. 6% NaCl水溶液耐鹽性試驗(yàn))鑒定結(jié)果一致表明，0sSIK2的過(guò)量表達(dá)植株有較強(qiáng)的耐鹽性。表I 0sSIK2轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)系與對(duì)照在O. 5% NaCl鹽池中的存活率比較
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求I所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下⑴或(2)或(3)的DNA分子(1)序列表中序列I所不的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子；(3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體是將權(quán)利要求2或3所述基因插入pCambial302載體的多克隆位點(diǎn)得到的重組載體。
6.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)。
7.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)肽康闹参镏?，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2或3所述基因通過(guò)權(quán)利要求4或 5所述重組載體導(dǎo)入所述目的植物中。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述耐逆性為耐鹽性和/或耐旱性。
10.如權(quán)利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物具體為水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種水稻耐逆性相關(guān)受體類(lèi)蛋白OsSIK2及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明對(duì)于培育耐逆植物品種，特別是培育耐非生物脅迫(耐鹽)的作物、林草等新品種具有重要價(jià)值，可用于農(nóng)牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境治理所需的耐逆性植物品種的培育和鑒定，對(duì)提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N9/12GK102604907SQ201110025188
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2011年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月24日
發(fā)明者何鍶潔, 張萬(wàn)科, 張勁松, 林晴, 陳麗娟, 陳受宜, 馬彪 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所