專利名稱：一種克隆山羊tnnc2基因編碼區(qū)全序列的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種克隆山羊骨骼肌肌鈣蛋白C2(TNNU)基因 編碼區(qū)全序列的方法。
背景技術(shù)：
快肌肌鈣蛋白C2(TNNC2)是存在于骨骼肌細(xì)肌絲中的鈣離子結(jié)合蛋白復(fù)合物成 員之一。肌鈣蛋白C與肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白I 一起形成三元肌鈣蛋白復(fù)合物，在肌肉的 收縮和舒張中起著關(guān)鍵作用。肌鈣蛋白C2是快速骨骼肌收縮的鈣離子受體，并且是鈣離子 激活肌小節(jié)收縮的關(guān)鍵。鈣離子的結(jié)合啟動了細(xì)肌絲褶皺般的結(jié)構(gòu)的變化通過細(xì)肌絲組成 蛋白。導(dǎo)致肌球蛋白和肌動蛋白間的橫橋的變形，促使細(xì)肌絲向粗肌絲的滑動產(chǎn)生肌肉收 縮的效果。快肌肌鈣蛋白C2含有4個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，是肌鈣蛋白復(fù)合物中的一個(gè)重要成 員。每個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)均有一個(gè)由12個(gè)氨基酸殘基組成的鈣離子結(jié)合環(huán)，鈣離子結(jié)合環(huán) 存在于一對a-螺旋中。每個(gè)鈣離子結(jié)合環(huán)都富含酸性氨基酸(Asp and Glu)負(fù)責(zé)結(jié)合單 個(gè)鈣離子。TNNC2整體結(jié)構(gòu)包括一個(gè)N-末端和一個(gè)C-末端的球形區(qū)域，這兩個(gè)球形區(qū)域被 一個(gè)靈活的螺旋鏈接。從而形成啞鈴形。每個(gè)球形區(qū)域包含一對EF手性結(jié)構(gòu)域用于結(jié)合 金屬尚子。RT-PCR克隆是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)以及分子 克隆相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成 目的基因片段，將合成的目的基因片段克隆到載體細(xì)胞基因中，然后用質(zhì)粒PCR產(chǎn)物測序。 此技術(shù)利用PCR技術(shù)能在體外進(jìn)行有效的基因擴(kuò)增，而不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理， 可利用這一技術(shù)很快獲得其他依靠限制性內(nèi)切酶消化的方法難于得到的PCR產(chǎn)物；克隆載 體PCR測序能克服PCR產(chǎn)物測序引物近端的十幾個(gè)堿基無法測序獲得的缺點(diǎn)。與RACE (cNDA 末端快速擴(kuò)增)技術(shù)相比較而言，目的基因片段的長度明確，成本低，工作量小。該技術(shù)成 功的關(guān)鍵是PCR引物的設(shè)計(jì)，在起始密碼子的上游設(shè)計(jì)上游引物，在終止密碼子的下游設(shè) 計(jì)下游引物，使得PCR產(chǎn)物包含完整的基因編碼區(qū)全序列?，F(xiàn)有技術(shù)中采用RACE (cNDA末端快速擴(kuò)增)技術(shù)是基于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上由已知 的一段cDNA片段，通過往兩端延伸擴(kuò)增從而獲得完整的3’端和5’端的方法。1、目的PCR 產(chǎn)物的基因片段長度不明確。2、試驗(yàn)成本高。3、工作量大，實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求高。分段PCR克隆法將目的基因分成幾段來分別克隆，然后做亞克隆測序拼接。成本 高，工作量大，一個(gè)基因分成幾段就需要做幾次克隆。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種簡單、快捷的獲取山羊TNNC2基因的完整 編碼區(qū)序列的方法，填補(bǔ)了該基因在山羊上的空白，為進(jìn)一步研究山羊的該基因奠定了基 石出。
本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種克隆山羊TNNC2基因編碼區(qū)全序列的方法，包括以下步驟Al、提取山羊眼肌組織中的總RNA，然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；A2、引物的設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)設(shè)計(jì)一對簡并引物，上游引物在起始密碼子的上游區(qū) 域設(shè)計(jì)，下游引物在終止密碼子的下游區(qū)域設(shè)計(jì)；設(shè)計(jì)的引物為上游引物P1 5 ‘ -TGATGACGGACCAGCAGG-3 ‘下游引物P2 :5, -CTTCTTACTGCACGCCCTC-3 ‘用cDNA為模板進(jìn)行梯度PCR操作擴(kuò)增TNNC2基因，溫度為范圍在50°C到65°C之 間的8個(gè)溫度點(diǎn).PCR反應(yīng)體系為IOul體系(5 μ L的2XMaster Mix Tap,上下游引物各 0. 5 μ L，2 μ L 的 cDNA, 2 μ L 的 ddH20.)，反應(yīng)條件為 95°C預(yù)變性 5min, 35 個(gè)循環(huán)(94°C，40s ； 50°C 60°C,40s ；72°C，50s)，最后 72°C IOmin。A3、PCR產(chǎn)物的回收和純化；A4、克隆。所述的方法，所述步驟Al包括以下步驟用液氮將眼肌磨成粉末裝入1. 5ml的EP 管，放入零下80的超低溫冰箱中備用；取新的1. 5ml的EP管，加入1. 3ml的Trizol液，然后 加入約80mg的眼肌組織粉末，用手搖晃混勻后，用震蕩儀震蕩約30秒后室溫放置5分鐘； 4°C下13000rpm離心3分鐘將液體用移液槍轉(zhuǎn)運(yùn)到另一個(gè)新的1. 5ml的EP管，加入0. 2ml 的氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒；取上層水相0. 4ml于一新的離心管，加入 0. 4ml的異丙醇，室溫放置10分鐘，4°C下12000rpm離心10分鐘；棄去上清液，加入Iml的 75%乙醇混勻，4°C下7500g離心5分鐘；小心棄去上清液，然后用移液槍吸干管壁上多余的 乙醇，加入30到100UL的DEPC水；將效果好的RNA立即反轉(zhuǎn)錄成cDNA。


圖1是TNNC2基因的8個(gè)溫度點(diǎn)的梯度PCR產(chǎn)物電泳圖。圖2是山羊TNNC2基因編碼區(qū)的核苷酸序列和預(yù)測的氨基酸序列。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。步驟一提取山羊眼肌組織中的總RNA(核糖核酸)，然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；1.組織的采集選取周歲的天府肉羊頸動脈放血后立即取約Ig眼肌放入液氮罐中用于提取總 RNA2. RNA的制備及cDNA的合成在實(shí)驗(yàn)室用液氮將眼肌磨成粉末裝入1. 5ml的EP管。放入零下80的超低溫冰箱 中備用。取新的1. 5ml的EP管，加入1. 3ml的Trizol液，然后加入約80mg的眼肌組織粉
末。用手搖晃混勻后，用震蕩儀震蕩約30秒后室溫放置5分鐘。4°C下13000rpm離心3分鐘將液體用移液槍轉(zhuǎn)運(yùn)到另一個(gè)新的1. 5ml的EP管，并 往這個(gè)新EP管中加入0. 2ml的氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒，然后4°C下13000rpm離心8分鐘。離心結(jié)束以后用移液槍將這個(gè)EP管中的上層水相約0. 4ml移入一 新的離心管，加入0. 4ml的異丙醇，室溫放置10分鐘，4°C下12000rpm離心10分鐘。棄去 上清液，加入Iml的75%乙醇混勻，4°C下7500g離心5分鐘。小心棄去上清液，然后用移液槍吸干管壁上多余的乙醇，注意不要把RNA吸掉，然 后根據(jù)RNA量的多少。加入30到100UL的DEPC水。用1. 5%瓊脂糖電泳法檢測RNA的質(zhì) 量。將效果好的RNA立即反轉(zhuǎn)錄成cDNA。步驟二引物的設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)；依據(jù)已發(fā)表的牛的TNNC2基因的序列(登錄號為BC118491. 1)設(shè)計(jì)一對簡并引 物，上游引物在起始密碼子的上游區(qū)域設(shè)計(jì)，下游引物在終止密碼子的下游區(qū)域設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì) 的引物為上游引物 P 1:5' -TGATGACGGACCAGCAGG-3 ‘下游引物P2 5 ‘ -CTTCTTACTGCACGCCCTC-3 ‘用cDNA為模板進(jìn)行梯度PCR操作擴(kuò)增TNNC2基因，溫度為范圍在50°C到65°C之 間的8個(gè)溫度點(diǎn).PCR反應(yīng)體系為IOul體系(5 μ L的2XMaster Mix Tap,上下游引物各
0.5 μ L，2 μ L 的 cDNA, 2 μ L 的 ddH20.)，反應(yīng)條件為 95°C預(yù)變性 5min, 35 個(gè)循環(huán)(94°C，40s ； 50°〇 601，408;721，508)，最后721 IOmin。反應(yīng)結(jié)束后將約有500bp的PCR產(chǎn)物收集 到一個(gè)EP管中并切膠回收(圖1)，將回收的基因片段克隆到質(zhì)粒載體中，然后挑取陽性菌 進(jìn)行PCR反映，產(chǎn)物送測序公司測序。步驟三PCR產(chǎn)物的回收和純化；PCR產(chǎn)物用寶生物膠回收試劑盒純化回收，具體操作步驟為a. PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖IlOV電泳分離后，在紫外光下用消毒刀片切下與預(yù)期 片段大小一致的DNA條帶，裝入1. 5mL的EP管中，將膠輕柔切碎。b.在離心管中加入600ul的溶膠液A，放置于55°C水浴鍋中水浴IOmin溶膠，中間
取出離心管緩慢搖動一到兩次。c.膠溶解后放至室溫，加入加20uL溶液B，混勻，轉(zhuǎn)入離心柱，8000rpm離心40s。d.棄離心液，將柱子放入新的1. 5M1 EP管中，加500uL洗脫液C，8000rpm離心 Imin重復(fù)此步驟3次。e.將離心柱放入新離心管，加20ul滅菌蒸餾水，浸潤lOmin，IOOOOrpm離心
1.5min。f.離心管中的溶液即為回收的DNA片段的水溶液。g.取2uL回收產(chǎn)物于1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測回收效率和純度。步驟四克?。?1)目的片段與載體連接將回收、檢測后的目的片段與PMD-18T載體連接，根據(jù)TaKaRa的pMD_18T載體試 劑盒使用說明書，操作連接體系為PMD-18T Vector1. OuL純化回后的PCR片段4. OuL連接液 Ligase buffer5. OuLTotal10. OuL
以上操作在冰上進(jìn)行，稍離心混勻，16°C在PCR儀中連接過夜，-20°C保存?zhèn)溆谩?2)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl2法)a.挑取大腸桿菌Dffia菌種，在LB瓊脂板上畫線，37°C培養(yǎng)過夜(12_16h)。b.挑取單菌落，接種到IOOmL LB液體培養(yǎng)基中。37°C 190rpm振蕩培養(yǎng)12h，當(dāng) ODD600值達(dá)到0. 4-0. 5時(shí)(輕搖培養(yǎng)基肉眼可見云霧狀)，停止培養(yǎng)。c.將菌液以50mL/份分裝至預(yù)冷的IOOmL滅菌離心管中，冰浴10-15min， 4000rpm4°C離心 lOmin。d.棄上清，每管用50mL的預(yù)冷的0. IMol的CaCl2 (液體中有冰粒效果最好)重懸 菌體沉淀，冰浴30min后，4000rpm 4°C離心3min。e.棄上清，每管用IOmL預(yù)冷的0. IM的CaCl2重懸菌體沉淀，冰浴10-15min，即為 感受態(tài)細(xì)胞。f.現(xiàn)制現(xiàn)用。或?qū)⒅苽浜玫母惺軕B(tài)細(xì)胞加入30%甘油至終濃度為15-20%，混勻， 分裝成200uL/份，投入液氮快速冷凍后，-80°C保存(3)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化a.從_80°C冰箱取出保存的感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍。b.將2. 5ul連接產(chǎn)物緩慢打入200ul的感受態(tài)細(xì)胞中，動作要輕柔，冰浴20min。c. 42°C水浴熱激90s(中間不能搖晃離心管)，迅速取出置于冰上，冰浴5-lOmin。d.加入800uL LB液體培養(yǎng)基(不加Amp)，于37°C、小于150rpm振蕩培養(yǎng)50min 以復(fù)蘇細(xì)胞。e.3000rpm離心5min，吸去部分上清，輕柔懸浮細(xì)菌，涂布于選擇性平板上。待液 體完全滲入瓊脂后，倒扣平板，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9_16h。(4)陽性菌落的篩選隨機(jī)挑選菌落接種于LB氨節(jié)培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至中等濃度后以菌液為模板，用于相 應(yīng)基因PCR擴(kuò)增相同的引物及反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測， 將擴(kuò)增產(chǎn)物與目的片段大小一致的菌液0.5mL裝入1.5ml EP離心管中，加入30%甘油。交 送寶生物工程技術(shù)有限公司完成測序。步驟五檢驗(yàn)試驗(yàn)的正確性；將測序結(jié)果在NCBI上運(yùn)用blast在線比對軟件以驗(yàn)證序列的正確性和該方法的 可靠性。結(jié)果表明該方法獲得的山羊TNNC2基因完整編碼區(qū)序列的核苷酸序列與其他已知 的16種哺乳動物的同源性為92. 18% 99. 38%。表明該方法能達(dá)到獲得山羊TNNC2基因 的完整編碼區(qū)序列的目的。獲得的山羊TNNC2基因序列為ATGTGTGTGCAGGAGAACGGAGGTGAGGCAGGAATGTACTCCCCTCTGTCCCTTTGACTCTTTGATGGC CCGTGTTTTTGATGACGGACCAGCAGGCTGAGGCCCGGTCCTACCTCAGCGAGGAGATGATCGCTGAGTTCAAGGCC GCCTTCGACATGTTTGACGCGGACGGCGGCGGGGACATCAGCGTCAAGGAGCTGGGCACCGTGATGAGGATGCTGGG TCAGACACCCACCAAAGAGGAGCTGGACGCCATCATCGAAGAGGTGGATGAGGATGGCAGCGGCACCATCGACTTCG AGGAGTTCTTGGTCATGATGGTGCGCCAGATGAAAGAGGACGCCAAGGGCAAGAGCGAAGAGGAGCTGGCTGAGTGT TTCCGCATCTTCGACAGGAACGCGGACGGCTACATCGACGCCGAGGAGCTGGCGGAGATTTTCCGAGCCTCCGGGGAGCACGTGACAGACGAGGAGCTCGAATCCCTGATGAAGGACGGGGACAAGAACAACGACGGCCGCATTGACTTCGACG AGTTCCTGAAGATGATGGAGGGCGTGCAGTAA。本技術(shù)簡單、快捷的獲取了山羊TNNC2基因的完整編碼區(qū)序列，填補(bǔ)了該基因在 山羊上的空白，為進(jìn)一步研究山羊的該基因奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明設(shè)計(jì)的簡并引物不會出現(xiàn)影響PCR反應(yīng)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物二聚體，上下游 引物交聯(lián)。適宜的PCR反應(yīng)溫度范圍跨度大。該技術(shù)相比較分段克隆和RACE技術(shù)而言，目的PCR片段的長短大致明確，工作量 小(只需克隆一次)，具有成本低，效率高的優(yōu)勢。應(yīng)當(dāng)理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換， 而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種克隆山羊TNNC2基因編碼區(qū)全序列的方法，其特征在于，包括以下步驟 Al、提取山羊眼肌組織中的總RNA，然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；A2、引物的設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)設(shè)計(jì)一對簡并引物，上游引物在起始密碼子的上游區(qū)域設(shè) 計(jì)，下游引物在終止密碼子的下游區(qū)域設(shè)計(jì)；設(shè)計(jì)的引物為 上游引物 P 1:5' -TGATGACGGACCAGCAGG-3 ‘ 下游引物 P2 5 ‘ -CTTCTTACTGCACGCCCTC-3 ‘用cDNA為模板進(jìn)行梯度PCR操作擴(kuò)增TNNC2基因，溫度為范圍在50°C到65°C之間的8 個(gè)溫度點(diǎn).PCR反應(yīng)體系為IOul體系(5yL的2XMaster Mix Tap，上下游引物各0. 5 μ L， 2 μ L 的 cDNA，2 μ L 的 ddH20.)，反應(yīng)條件為 95°C預(yù)變性 5min，35 個(gè)循環(huán)(94°C，40s ；50°C 600C，40s ；72°C，50s)，最后 72°C IOmin。 A3、PCR產(chǎn)物的回收和純化； A4、克隆。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟Al包括以下步驟用液氮將眼 肌磨成粉末裝入1. 5ml的EP管，放入零下80的超低溫冰箱中備用；取新的1. 5ml的EP管， 加入1. 3ml的Trizol液，然后加入約80mg的眼肌組織粉末，用手搖晃混勻后，用震蕩儀震 蕩約30秒后室溫放置5分鐘；4°C下13000rpm離心3分鐘將液體用移液槍轉(zhuǎn)運(yùn)到另一個(gè)新 的1. 5ml的EP管，加入0. 2ml的氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒；取上層水相 0. 4ml于一新的離心管，加入0. 4ml的異丙醇，室溫放置10分鐘，4°C下12000rpm離心10分 鐘；棄去上清液，加入Iml的75%乙醇混勻，4°C下7500g離心5分鐘；小心棄去上清液，然 后用移液槍吸干管壁上多余的乙醇，加入30UL到100UL的DEPC水；將效果好的RNA立即反 轉(zhuǎn)錄成cDNA。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種克隆山羊TNNC2基因編碼區(qū)全序列的方法，包括以下步驟A1、提取山羊眼肌組織中的總RNA，然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；A2、引物的設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)設(shè)計(jì)一對簡并引物，上游引物在起始密碼子的上游區(qū)域設(shè)計(jì)，下游引物在終止密碼子的下游區(qū)域設(shè)計(jì)；設(shè)計(jì)的引物為上游引物P15′-TGATGACGGACCAGCAGG-3′下游引物P25′-CTTCTTACTGCACGCCCTC-3′。A3、PCR產(chǎn)物的回收和純化；A4、克隆。提供一種簡單、快捷的獲取山羊TNNC2基因的完整編碼區(qū)序列的方法，填補(bǔ)了該基因在山羊上的空白，為進(jìn)一步研究山羊的該基因奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/10GK102146372SQ20111002489
公開日2011年8月10日 申請日期2011年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月24日
發(fā)明者徐剛毅, 徐洪剛, 汪代華, 陳浩林 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)