專利名稱：無精癥相關(guān)基因Fish檢測方法和相關(guān)檢測探針及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疾病相關(guān)基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及無精癥相關(guān)融合基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種無精癥相關(guān)基因FiSh檢測方法和相關(guān)檢測探針及試劑盒。
背景技術(shù)：
嚴(yán)重少精癥和無精癥是男性不育的主要原因之一。導(dǎo)致嚴(yán)重少精癥和無精癥的因素包括染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常，微生物感染、藥物影響等。近年發(fā)現(xiàn)Y染色體長臂AZF區(qū) (精子發(fā)生區(qū))存在微缺失現(xiàn)象，該現(xiàn)象與嚴(yán)重少精癥和無精癥相關(guān)。AZF區(qū)上存在三個(gè)亞區(qū)(AZFa，AZFb, AZFc)，各亞區(qū)包含的位點(diǎn)在男性生殖細(xì)胞發(fā)育的不同時(shí)期起著不同的作用，位點(diǎn)的缺失可致患者表現(xiàn)為少、弱精癥或無精癥從而引發(fā)不育。一般認(rèn)為，Y染色體的近端缺失(涉及AZFa和AZFb)，表現(xiàn)嚴(yán)重生精障礙，Y染色體的遠(yuǎn)端缺失(涉及AZFb遠(yuǎn)段和AZFc)，則殘留島狀的生精正常區(qū)域。臨床表現(xiàn)為少，弱精癥。目前多用PCR法擴(kuò)增AZF特征位點(diǎn)來檢測AZF區(qū)缺失。但來自不同實(shí)驗(yàn)室中的 AZF缺失發(fā)生率差異很大，從2%到10%不等，并常發(fā)現(xiàn)有假陽性和假陰性。表明PCR法的診斷標(biāo)準(zhǔn)尚待完善。FISH為分子生物學(xué)(探針)與細(xì)胞遺傳學(xué)(染色體)相結(jié)合，檢測染色體異常的新技術(shù)，已作為一種快速、準(zhǔn)確、直觀的分子遺傳學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于膀胱癌、乳腺癌、血液系統(tǒng)疾病診斷及預(yù)后判斷中，但對于應(yīng)用FISH技術(shù)進(jìn)行無精癥相關(guān)基因檢測的臨床研究，國內(nèi)外尚不多見。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的就是針對以上存在的問題與不足，提供一種無精癥相關(guān)基因 Fish檢測方法和相關(guān)檢測探針及試劑盒，該檢測方法設(shè)計(jì)巧妙，操作簡單，特異性和敏感性均能大幅提高，可以快速、準(zhǔn)確、直觀檢測出無精癥相關(guān)基因，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，從而可作為醫(yī)師診斷無精癥的參考依據(jù)，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種無精癥相關(guān)基因Fish檢測方法，其特點(diǎn)是，對人染色體展片進(jìn)行常規(guī)預(yù)處理，然后采用檢測探針進(jìn)行原位雜交，根據(jù)檢測到的熒光信號判斷是否存在所述無精癥相關(guān)基因。人染色體展片可以是人的任何部位的染色體展片，例如人外周血染色體展片。所述檢測探針可以是根據(jù)Y染色體長臂AZF區(qū)設(shè)計(jì)的任何探針，較佳地，所述檢測探針是DAZ檢測探針，其中DAZ為NCBI中GeneBank編號為AC053490. 2的核苷酸序列。所述DAZ可以采用任何合適的標(biāo)記。更佳地，所述DAZ采用Cy3標(biāo)記。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于上述的無精癥相關(guān)基因Fish檢測方法的檢測探針，其特點(diǎn)是，所述檢測探針是DAZ檢測探針，其中DAZ為NCBI中GeneBank編號為 AC053490. 2的核苷酸序列。所述DAZ可以采用任何合適的標(biāo)記。較佳地，所述DAZ采用Cy3標(biāo)記。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種無精癥相關(guān)基因Fish檢測試劑盒，其特點(diǎn)是， 包括檢測探針容器，所述檢測探針容器內(nèi)具有DAZ檢測探針，其中DAZ為NCBI中GeneBank 編號為AC053490. 2的核苷酸序列。所述DAZ可以采用任何合適的標(biāo)記。較佳地，所述DAZ采用Cy3標(biāo)記。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明的無精癥相關(guān)基因Fish檢測方法通過對人染色體展片進(jìn)行常規(guī)預(yù)處理，然后采用檢測探針進(jìn)行原位雜交，根據(jù)檢測到的熒光信號判斷是否存在所述無精癥相關(guān)基因，設(shè)計(jì)巧妙，操作簡單，特異性和敏感性均能大幅提高，可以快速、準(zhǔn)確、直觀檢測出無精癥相關(guān)基因，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，從而可作為醫(yī)師診斷無精癥的參考依據(jù)，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式為更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步說明。下列具體實(shí)施例采用的試劑、儀器、耗材和步驟具體如下I 試劑I. IDNA 探針:采用無精癥相關(guān)基因DAZ紅色探針，探針用Cy3標(biāo)記，產(chǎn)生紅色信號。在_20°C下避光保存。溶解在含有硫酸葡聚糖、去離子甲酰胺和SSC的緩沖液中。DAZ序列相關(guān)信息見下表，其在NCBI (美國國立生物技術(shù)信息中心)中的GeneBank編號為AC053490. 2。
GeneChromosomeRefSeqBACDAZYqll. 223NM—004081. 5RP11-140H231.2DAPI 復(fù)染液-20°C避光保存。125ng/mL。溶解在含有1，4_苯二胺、甘油的緩沖液中。I. 3NP-40 室溫保存。非離子去垢劑。I. 420 X SSC 檸檬酸鈉和氯化鈉。用濃鹽酸調(diào)pH 5. 3后過濾滅菌，室溫保存半年。I. 5胃蛋白酶2000-3000U/mg。溶解在 IOmM HCl 中。I. 61 XPBS:磷酸緩沖液I. 7100XMgCl2 :2M MgCl2。I. 8 二甲苯。I. 9 濃鹽酸12N HCl。I. IONaOH IN NaOH。
I. 11 純凈水。I. 12 封片膠。I. 13 甲酰胺。分裝4 °C保存。I. 14 變性液35mL甲酰胺，5mL 20XSSC，補(bǔ)水到50mL。調(diào)pH到7. 0-8. O。4°C下可保存I周，使用前測pH。I. 15梯度乙醇:75%，85 %和 95% 乙醇。I. 16 洗脫液 I O. 4XSSC,O. 3% NP-40o 20mL 20XSSC，3mL NP-40，補(bǔ)水到 I 升。用 IN NaOH 調(diào) pH到7. 5。過濾滅菌。室溫下可保存半年。I. 17 洗脫液 2 2 X SSC, O. 1% NP-40o IOOmL 20 X SSC, ImL NP-40，補(bǔ)水到 I 升。用 IN NaOH 調(diào) pH 到7. 5。過濾滅菌。室溫下可保存半年。2儀器與耗材2. I 載玻片。2. 2 蓋玻片。2. 3移液管，槍頭:1-200 μ L02. 4 離心管I. 5_50mL2. 5 計(jì)時(shí)器。2. 6磁力攪拌器。2. 7渦旋振蕩器。2. 8手持離心機(jī)2. 9臺式離心機(jī)。2. 10 量筒。5OmL2. 11 水浴鍋。2. 12 濕盒。2. 13空氣培養(yǎng)箱。2. 14 鑷子。2. 15 染色缸。50mL2. 16突光顯微鏡。藍(lán)綠通道2. 17pH 計(jì)，pH 試紙。2. 18 溫度計(jì)。0072]3實(shí)驗(yàn)步驟0073]3. I洗片和烤片0074]3. I. I將人染色體展片用95%乙醇室溫水化5min，2次。0075]3. I. 275%乙醇室溫水化5min，2次。0076]3. I. 3在60°C烘箱中烤片lhi*。0077]3. 2預(yù)處理0078]3. 2. IlXPBS 室溫洗滌 5min，2 次。0079]3. 2. 2蛋白酶消化用25uL胃蛋白酶蓋片，37°C消化5-15min。0080]3. 2. 31 XPBS 室溫洗滌 5min。0081]3. 2. 475%，85%，95%梯度乙醇脫水5min各I次。0082]3. 2. 5室溫晾干。0083]3. 3人染色體展片變性0084]3. 3. I在濕盒中鋪滿濕潤的紙巾，在37°C培養(yǎng)箱中預(yù)熱。0085]3. 3. 2將變性液從4°C中取出復(fù)溫到室溫，轉(zhuǎn)移到水浴鍋中70°C預(yù)熱。0086]3. 3. 3變性前測量變性液溫度。將人染色體展片浸沒于變性液中，70°C變性5min，每個(gè)染色缸中最多放入4張展片。0087]3. 3. 4立即將展片轉(zhuǎn)移到室溫75%，85%，95%梯度乙醇中，脫水5min各I次。0088]3. 3. 5吸干展片上的液體，晾干。0089]3. 4檢測探針預(yù)處理0090]3. 4. I將檢測探針從_20°C中取出復(fù)溫到室溫，略微振蕩離心。0091]3. 4. 2檢測探針70°C水浴5min。0092]3. 4. 3立即冰浴檢測探針待用。0093]3. 5探針雜交0094]3. 5. I取20 μ L檢測探針覆蓋在展片上，取蓋片覆蓋，小心排除氣泡。0095]3. 5. 2用封片膠封片。0096]3. 5. 3將封好的片子在80°C預(yù)熱的鐵板上共變性5min。0097]3. 5. 4將展片轉(zhuǎn)移到37°C預(yù)熱的濕盒中，雜交過夜(約16hi0。0098]3. 6洗脫0099]3. 6. 170°C預(yù)熱洗脫液1，室溫復(fù)溫洗脫液2。0100]3. 6. 2用鑷子小心去掉封片膠，揭開蓋片。0101]3. 6. 3將展片立即轉(zhuǎn)移到70°C預(yù)熱的洗脫液I中，洗脫2min。0102]3. 6. 4將展片轉(zhuǎn)移到洗脫液2中，洗脫5min。0103]3. 6. 5將展片轉(zhuǎn)移到梯度乙醇中，脫水5min各I次。0104]3. 6. 6避光日京干。0105]3. 7復(fù)染0106]3. 7. I取15 μ L DAPI蓋片，鏡檢或4°C保存至I周。0107]3. 8鏡檢0108]3. 8. I在熒光顯微鏡下觀察，利用UV激發(fā)波長觀察藍(lán)色染色體信號，利用綠色激
發(fā)觀察雜交在染色體上的檢測探針發(fā)出的紅色信號。
3. 8. 2選擇背景干凈，雜交信號清晰，細(xì)胞核大小一致，無重疊，核邊界完整，DAPI 染色均一的區(qū)域攝像。3. 8. 3判讀標(biāo)準(zhǔn)。23對染色體中最小的染色體為Y染色體，其中正常細(xì)胞為Y染色體上能夠看到橙紅色信號，表明檢測探針雜交在Y染色體上， 無精癥相關(guān)基因存在，為無精癥陰性細(xì)胞。異常細(xì)胞為Υ染色體上不能看到橙紅色信號，表明檢測探針無法雜交在Y染色體上，無精癥相關(guān)基因不存在，為無精癥陽性細(xì)胞。實(shí)施例II、樣本材料來源從醫(yī)院取得無精癥病患的外周血染色體展片樣本和正常人的外周血染色體展片樣本。2、樣本檢測采用上述方法處理和檢測樣本。3、檢測結(jié)果使用DAZ檢測探針雜交中，如果橙紅色信號點(diǎn)為正常，沒有出現(xiàn)橙紅色信號點(diǎn)為無精癥陽性。統(tǒng)計(jì)無精癥病患的外周血染色體展片樣本的100個(gè)細(xì)胞，能觀察到90個(gè)以上的細(xì)胞的Y染色體上不能看到橙紅色信號，表明檢測探針無法雜交在Y染色體上，無精癥相關(guān)基因不存在，為無精癥陽性細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)正常人的外周血染色體展片樣本的100個(gè)細(xì)胞，能觀察到90個(gè)以上的細(xì)胞的Y染色體上能看到橙紅色信號，表明檢測探針能雜交在Y染色體上， 無精癥相關(guān)基因存在，為無精癥陰性細(xì)胞。因此，本診斷方法能獲得90%以上的特異性和敏感性。綜上所述，本發(fā)明的無精癥相關(guān)基因Fish檢測方法設(shè)計(jì)巧妙，操作簡單，特異性和敏感性均能大幅提高，可以快速、準(zhǔn)確、直觀檢測出無精癥相關(guān)基因，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠， 從而可作為醫(yī)師診斷無精癥的參考依據(jù)，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。在此說明書中，本發(fā)明已參照其特定的實(shí)施例作了描述。但是，很顯然仍可以做出各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說明書和附圖
應(yīng)被認(rèn)為是說明性的而非限制性的。
權(quán)利要求
1.一種無精癥相關(guān)基因FiSh檢測方法，其特征在于，對人染色體展片進(jìn)行常規(guī)預(yù)處理，然后采用檢測探針進(jìn)行原位雜交，根據(jù)檢測到的熒光信號判斷是否存在所述無精癥相關(guān)基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的無精癥相關(guān)基因Fish檢測方法，其特征在于，所述檢測探針是DAZ檢測探針，其中DAZ為NCBI中GeneBank編號為AC053490. 2的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的無精癥相關(guān)基因Fish檢測方法，其特征在于，所述DAZ采用 Cy3標(biāo)記。
4.一種用于根據(jù)權(quán)利要求I所述的無精癥相關(guān)基因Fish檢測方法的檢測探針，其特征在于，所述檢測探針是DAZ檢測探針，其中DAZ為NCBI中GeneBank編號為AC053490. 2的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測探針，其特征在于，所述DAZ采用Cy3標(biāo)記。
6.一種無精癥相關(guān)基因Fish檢測試劑盒，其特征在于，包括檢測探針容器，所述檢測探針容器內(nèi)具有DAZ檢測探針，其中DAZ為NCBI中GeneBank編號為AC053490. 2的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的無精癥相關(guān)基因Fish檢測試劑盒，其特征在于，所述DAZ采用Cy3標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種無精癥相關(guān)基因Fish檢測方法，對人染色體展片進(jìn)行常規(guī)預(yù)處理，然后采用檢測探針進(jìn)行原位雜交，根據(jù)檢測到的熒光信號判斷是否存在無精癥相關(guān)基因，較佳地，檢測探針是DAZ檢測探針，其中DAZ為NCBI中GeneBank編號為AC053490.2的核苷酸序列，還涉及相關(guān)的檢測探針及試劑盒，本發(fā)明的無精癥相關(guān)基因Fish檢測方法和相關(guān)檢測探針設(shè)計(jì)巧妙，操作簡單，特異性和敏感性均能大幅提高，可以快速、準(zhǔn)確、直觀檢測出無精癥相關(guān)基因，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，從而可作為醫(yī)師診斷無精癥的參考依據(jù)，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK102605045SQ20111002462
公開日2012年7月25日 申請日期2011年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月21日
發(fā)明者白小萍, 譚睿, 趙翊均 申請人:江蘇百帝生物科技有限公司