專利名稱：基于綠色熒光蛋白檢測乳酸菌在胃腸道中定植特性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及微生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于綠色熒光蛋白檢測乳酸菌在胃腸道中定植特性的方法，屬于基礎(chǔ)生命科學(xué)領(lǐng)域的前沿科學(xué)。
背景技術(shù)：
乳酸菌(LAB)是一類能利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸的革蘭陽性菌的通稱，是乳品工業(yè)發(fā)酵的重要菌類，被公認(rèn)安全的食品級微生物(generally regard as safe, GRAS),它包括乳酸乳球菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌等至少23個屬，是人類一大益生菌，可促進營養(yǎng)成分在動物體內(nèi)的分解和吸收、緩解乳糖不耐癥、改善腸道環(huán)境、拮抗病原微生物、控制血清膽固醇水平、緩解高血壓以及抗腫瘤作用等，在食品發(fā)酵、醫(yī)藥等與人類生活密切相關(guān)的領(lǐng)域有著極其重要的作用。綠色突光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是海洋中無脊椎動物體內(nèi)(如水母)的一種天然蛋白，相對分子質(zhì)量為27000，由238個氨基酸組成。GFP標(biāo)記系統(tǒng)具有標(biāo)記基因小(約Ikb)，直接肉眼檢測熒光、對細(xì)胞安全、穩(wěn)定等優(yōu)點，已被成功用于微生物定殖、對宿主組織侵染、微生物動態(tài)監(jiān)測、基因表達調(diào)控等研究。腸道微生態(tài)系統(tǒng)是動物體內(nèi)最大、最復(fù)雜的一個微生態(tài)系統(tǒng)，其中存在著大量的細(xì)菌，它們之間相互拮抗、互利共生，共同維持腸道微生態(tài)系統(tǒng)的平衡。近年來，隨著腸道微生態(tài)學(xué)的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)益生乳酸菌的適當(dāng)使用不僅可以維持動物體及人體的腸道微生態(tài)平衡，達到益生防病的效果，還可以避免濫用抗生素引起的副作用。顯然，對腸道的粘附是乳酸菌發(fā)揮其眾多生理功能的必要前提，乳酸菌可通過脂磷壁酸以及菌體分泌的表面蛋白對腸道粘膜細(xì)胞產(chǎn)生強大的粘附作用，與腸道厭氧菌共同形成生物屏障，阻止致病菌的入侵。腸道乳酸菌對機體免疫有多方面的調(diào)節(jié)作用，能顯著提高機體的免疫功能，尤其是在對病原菌的定植拮抗方面，這使得對乳酸菌等益生菌的研究成為當(dāng)今生物技術(shù)的熱門課題之一。然而，其在體內(nèi)生物效應(yīng)的準(zhǔn)確機制方面的研究甚少， 這樣對開發(fā)新型乳酸菌制品造成巨大障礙，故深入研究乳酸菌粘附特性很有必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述問題，提供一種基于綠色熒光蛋白檢測乳酸菌在胃腸道中定植特性的方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種表達綠色熒光蛋白的乳酸菌LAB-GFP，其特征在于由下述方法構(gòu)建(I)設(shè)計引物NI和N2，以pLEB590為模板，擴增出編碼nisin抗性基因nisi片斷， 其中NI序列為NI 5’ -AGATCTAGACAGGAGGGAAGAGGAAATGAG-3’ 并附有內(nèi)切酶位點(比如下劃線為 XbaI酶切位點)；N2序列為
N2 5，-CGTCTGCAGTTAGGATCCCTAGTTTCCTAC-3，并附有內(nèi)切酶位點(比如下劃線為 PstI酶切位點);(2)采用內(nèi)切酶酶切，比如將nisi片斷純化后，用XbaI和PstI進行雙酶切；(3)經(jīng)雙酶切后的nisi片斷與經(jīng)相同酶切處理的pMG36e在T4DNA連接酶的作用下進行連接，連接液電轉(zhuǎn)化至乳酸菌感受態(tài)；(4)取轉(zhuǎn)化菌液涂布在含紅霉素和nisin的GM17平板上，30°C培養(yǎng)48 72h后， 挑單克隆至含紅霉素和nisin的液體GM17培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行單酶切和PCR鑒定，將陽性重組子命名為pMG36e-nisI ；(5)設(shè)計引物Gl和G2，以pGFP為模板，擴增出編碼綠色熒光蛋白基因gfp片斷， 其中Gl序列為Gl :5’ -GCGAGCTCATGAGTAAAGGAGAAGAACT-3’ 并附有內(nèi)切酶位點(比如下劃線為 SacI酶切位點);G2序列為G2 5，-GCTCTAGACGCGGTACCTTTGTATAG-3，并附有內(nèi)切酶位點(比如下劃線為 XbaI 酶切位點)；(6)將gfp片斷純化后，用內(nèi)切酶進行雙酶切(如XbaI和SacI)；(7)經(jīng)雙酶切后的gfp片斷與經(jīng)相同酶切處理的pMG36e_nisI在T4DNA連接酶的作用下進行連接，連接液電轉(zhuǎn)化至乳酸菌感受態(tài)；(8)取轉(zhuǎn)化菌液涂布在含紅霉素和nisin的GM17平板上，30°C培養(yǎng)48 72h后， 挑單克隆至含紅霉素和nisin的液體GM17培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行單酶切和PCR鑒定，將陽性重組子載體命名為pMG36e-nisI-gfp，陽性菌株命名為LAB-GFP。其中，所述步驟(I)中，NI引入XbaI位點，N2引入PstI位點。所述步驟(5)中，Gl引入SacI位點，G2引入XbaI位點。應(yīng)用上述所構(gòu)建的能夠表達綠色熒光蛋白的乳酸菌LAB-GFP分析其在胃腸道中定植特性的方法，步驟如下(I)挑取GM17平板上構(gòu)建成功的表達綠色熒光蛋白的乳酸菌LAB-GFP單個菌落于 GMl7液體培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)48 72h，此時濃度約為109cfu/mL ；(2)小鼠口服免疫前，過夜禁食、禁水，每只小鼠飼喂ImLLAB-GFP乳酸菌菌液，為實驗組，同時對照組小鼠口服ImL O. 85%生理鹽水；(3)分別于接種后2、6、18、26、42和72h宰殺，分別取胃、空腸、回腸和盲腸內(nèi)容物O. 5g，用無菌生理鹽水倍比稀釋后分三個稀釋度接種于含抗生素平板上，30°C培養(yǎng)48 72h，計數(shù)菌落；(4)取胃、空腸、回腸、盲腸的內(nèi)容物和腸壁做成連續(xù)的冰凍切片(12μπι)，在熒光顯微鏡下觀察重組菌的分布。本發(fā)明所構(gòu)建的乳酸菌綠色突光蛋白表達載體pMG36e-nisI_gfp,其特征在于可應(yīng)用于多種乳酸菌，包括乳酸乳球菌、植物乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種等。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是本發(fā)明提供一種基于綠色熒光蛋白(GFP)檢測乳酸菌在胃腸道中定植特性的方法，將轉(zhuǎn)化乳酸菌株飼喂小鼠，通過跟蹤監(jiān)測熒光菌體在小鼠胃腸道各段的情況，以準(zhǔn)確地確定該乳酸菌在動物消化道各段的定植、黏附狀況。本發(fā)明可應(yīng)用于多種乳酸菌，不受細(xì)菌的型別和種類限制，大大擴展了其應(yīng)用領(lǐng)域，操作簡單、形象生動，便于掌握乳酸菌對腸道定植或機體清除病原菌的動態(tài)變化，有利于弄清乳酸菌誘導(dǎo)粘膜免疫反應(yīng)的機制。本發(fā)明提供的能夠表達綠色熒光蛋白的乳酸菌載體有望成為非常具有吸引力的口服基因工程疫苗傳送載體。


圖I是本發(fā)明PCR所擴增得到的nisin抗性基因nisi片斷電泳圖。圖2是本發(fā)明PCR所擴增得到的綠色熒光蛋白基因gfp片斷電泳圖。圖3是本發(fā)明所構(gòu)建能夠表達綠色熒光蛋白(GFP)的乳球菌菌體熒光顯微照片。圖4是熒光菌體在胃腸道各段組織中的菌數(shù)代謝情況。其中，( )代表胃；(■) 代表空腸；(▲)代表回腸；⑴代表盲腸。圖5 (A-F)是熒光菌體在胃腸道組織切片的定植照片。圖5 (G、H)是對照組小鼠胃腸道組織切片照片。
具體實施例方式I. nisin抗性基因nisi片段的獲得根據(jù)Genbank中報道的nisi的堿基序列(登錄號X76884),結(jié)合質(zhì)粒pMG36e的酶切位點，設(shè)計特異性引物NI和N2，并分別弓I入XbaI和PstI酶切位點，以質(zhì)粒pLEB590為模板，進行PCR擴增，引物序列如下NI 5’ -AGATCTAGACAGGAGGGAAGAGGAAATGAG-3’ 并附有內(nèi)切酶位點(比如下劃線為 XbaI酶切位點)；N2 5，-CGTCTGCAGTTAGGATCCCTAGTTTCCTAC-3，并附有內(nèi)切酶位點(比如下劃線為 PstI酶切位點)。PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 lmin， 30個循環(huán)；最后，72°C延伸IOmin0PCR結(jié)果得到一條單一條帶，大小為780bp，與預(yù)期結(jié)果一致(圖I)。2.重組質(zhì)粒pMG36e_nisI的構(gòu)建將PCR產(chǎn)物純化后，使用XbaI和PstI對其進行雙酶切，然后與經(jīng)相同酶切的 pMG36e在T4DNA連接酶的作用下進行連接。將連接液電轉(zhuǎn)化至乳酸菌感受態(tài)細(xì)胞中，然后涂布在含有紅霉素(終濃度為2. 5 μ g/ml)和nisin (終濃度為40IU/ml)的GM17平板培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)72h左右，挑取單克隆到含有紅霉素(終濃度為2. 5 μ g/ml)和nisin (終濃度為40IU/ml)的GM17液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)48 72h。提取質(zhì)粒進行單酶切和PCR鑒定，將陽性重組子命名為pMG36e-nisI。3.綠色熒光蛋白基因gfp片段的獲得根據(jù)Genbank中報道的gfp的堿基序列(登錄號AF049064. I)，結(jié)合質(zhì)粒 pMG36e-nisI的酶切位點，設(shè)計特異性引物Gl和G2，并分別引入SacI和XbaI酶切位點，以質(zhì)粒pGFP為模板，進行PCR擴增，引物序列如下Gl :5’ -GCGAGCTCATGAGTAAAGGAGAAGAACT-3’ 并附有內(nèi)切酶位點(比如下劃線為SacI酶切位點)；G2 5，-GCTCTAGACGCGGTACCTTTGTATAG-3，并附有內(nèi)切酶位點(比如下劃線為 XbaI 酶切位點)。PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 lmin， 30個循環(huán)；最后，72°C延伸IOmin0PCR結(jié)果得到一條單一條帶，大小為750bp，與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)。4.重組質(zhì)粒 pMG36e_nisI_gfp 的構(gòu)建將PCR產(chǎn)物純化后，使用SacI和XbaI對其進行雙酶切，然后與經(jīng)相同酶切的 pMG36e-nisI在T4DNA連接酶的作用下進行連接。將連接液電轉(zhuǎn)化至乳球菌感受態(tài)細(xì)胞中， 然后涂布在含有紅霉素(終濃度為2. 5 μ g/ml)和nisin (終濃度為40IU/ml)的GM17平板培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)48 72h左右，挑取單克隆到含有紅霉素(終濃度為2. 5 μ g/ml)和 nisin (終濃度為40IU/ml)的GM17液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)48 72h。提取質(zhì)粒進行單酶切和PCR鑒定，將陽性重組子命名為pMG36e-nisI-gfp，陽性菌株命名為LAB-GFP。5.綠色熒光蛋白表達的觀察液體培養(yǎng)基中的乳酸菌離心后收集沉淀，用鹽溶液(O. 85% NaCl)潤洗，然后涂抹在載波片上，使用Nikon ECLIPSE 90i熒光顯微鏡進行熒光觀察結(jié)合MOTDX 35進行拍照， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在熒光顯微鏡下可清晰看到乳球菌的形態(tài)，并且有綠色熒光蛋白的表達(圖3)。6.表達綠色熒光蛋白重組菌LAB-GFP在胃腸道中定植的動物實驗挑取GM17平板上構(gòu)建成功的表達綠色熒光蛋白的乳酸菌LAB-GFP單個菌落于 GM17液體培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)48 72h，此時濃度約為109cfu/mL ;小鼠口服免疫前，過夜禁食、禁水，每只小鼠飼喂ImL LAB-GFP乳酸菌菌液，作為實驗組；同時對照組小鼠口服 ImL O. 85%生理鹽水。分別于接種后2、6、18、26、42和72h宰殺，分別取胃、空腸、回腸和盲腸內(nèi)容物
O.5g，用無菌生理鹽水倍比稀釋后接種于含紅霉素(終濃度為2.5yg/ml)和nisin(終濃度為40IU/ml)的GM17平板培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)48 72h，計數(shù)菌落。結(jié)果表明，在口服菌液6h后，在所有取樣的腸段內(nèi)容物中均清晰地發(fā)現(xiàn)熒光乳酸菌，并在42h達到最大濃度，表明此時乳酸菌已能在胃腸道中定植、繁殖，之后雖有所下降， 但口服三天后菌量仍然保持在104cfu/g左右，結(jié)果如表I、圖4所示。表I不同胃腸段中表達綠色熒光蛋白乳酸菌LAB-GFP的數(shù)量單位Log(cfu/g)
2h6h18h26h42h72h胃O3.6±0.213.6±0.344.5 ±0.284.9±0.424.5±0.26空腸O4.6±0.324.1 ±0.524.6 + 0.465.9±0.544.4±0.36回腸O3.5 士 0.263.5±0·354·7±0·345.9±0.464·7±0·24盲腸O5·5±0.275.8±0.386.2 土 0.286.4±0.526.1 ±0.34取胃、空腸、回腸、盲腸的內(nèi)容物和腸壁做成連續(xù)的冰凍切片(12 μ m)，在熒光顯微鏡下觀察重組菌的分布。結(jié)果表明，在熒光顯微鏡下，可清晰看到LAB-GFP主要存在于腸道的內(nèi)容物中，少數(shù)細(xì)菌黏附在各腸段的黏膜上，個別細(xì)菌存在于上皮細(xì)胞間，如圖5(A-F)。而對照組中無任何熒光菌體存在，如圖5 (G、H)。7.結(jié)論借助于綠色熒光蛋白GFP的高效表達，我們首次清晰觀察到乳酸菌在小鼠胃腸道中的準(zhǔn)確分布。研究乳酸菌在胃腸道中的定植特性以及GFP在乳酸菌中的表達并成功運用于動物實驗，將有助于我們更好地理解乳酸菌在機體中的定植，與腸上皮細(xì)胞間的相互關(guān)系以及如何引起免疫應(yīng)答等一系列問題，更將促進有關(guān)在細(xì)胞水平上的微生物與宿主細(xì)胞間的相互作用，微生物對腸道固有菌群的影響等一系列實驗。本發(fā)明所提供的基于綠色熒光蛋白檢測乳酸菌在胃腸道中定植特性的方法，操作簡單，清晰直觀，在科研、生產(chǎn)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。應(yīng)用本發(fā)明所構(gòu)建的乳酸菌綠色突光蛋白表達載體pMG36e-nisI_gfp可轉(zhuǎn)化多種乳酸菌，其中包括乳酸乳球菌、植物乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種等，轉(zhuǎn)化菌株在普通生長條件下均能夠表達綠色熒光蛋白。本發(fā)明所提供的方法可用于研究乳酸菌在胃腸道中的定植特性、代謝狀況以及與腸道相互作用機理等，操作簡單，清晰直觀，形象生動，可廣泛應(yīng)用于科研、生產(chǎn)等各種領(lǐng)域，為研究乳酸菌口服疫苗提供了很好的基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種表達綠色熒光蛋白的乳酸菌LAB-GFP，其特征在于由以下方法構(gòu)建(1)設(shè)計引物NI和N2，以pLEB590為模板，擴增出編碼nisin抗性基因nisi片斷，其中NI序列為NI 5，-AGATCTAGACAGGAGGGAAGAGGAAATGAG-3，并附有內(nèi)切酶位點(比如下劃線為 XbaI 酶切位點)；N2序列為N2 5，-CGTCTGCAGTTAGGATCCCTAGTTTCCTAC-3，并附有內(nèi)切酶位點(比如下劃線為 PstI 酶切位點)；(2)采用內(nèi)切酶酶切，比如將nisi片斷純化后，用XbaI和PstI進行雙酶切；(3)經(jīng)雙酶切后的nisi片斷與經(jīng)相同酶切處理的pMG36e在T4DNA連接酶的作用下進行連接，連接液電轉(zhuǎn)化至乳酸菌感受態(tài)；(4)取轉(zhuǎn)化菌液涂布在含紅霉素和nisin的GM17平板上，30°C培養(yǎng)48 72h后，挑單克隆至含紅霉素和nisin的液體GM17培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行單酶切和PCR鑒定，將陽性重組子命名為pMG36e-nisI ；(5)設(shè)計引物Gl和G2，以pGFP為模板，擴增出編碼綠色熒光蛋白基因gfp片斷，其中 Gl序列為Gl :5’ -GCGAGCTCATGAGTAAAGGAGAAGAACT-3，并附有內(nèi)切酶位點(比如下劃線為SacI 酶切位點)；G2序列為G2 :5’ -GCTCTAGACGCGGTACCTTTGTATAG-3，并附有內(nèi)切酶位點(比如下劃線為XbaI酶切位點)；(6)將gfp片斷純化后，用內(nèi)切酶進行雙酶切(如XbaI和SacI)；(7)經(jīng)雙酶切后的gfp片斷與經(jīng)相同酶切處理的pMG36e-nisI在T4DNA連接酶的作用下進行連接，連接液電轉(zhuǎn)化至乳酸菌感受態(tài)；(8)取轉(zhuǎn)化菌液涂布在含紅霉素和nisin的GM17平板上，30°C培養(yǎng)48 72h后，挑單克隆至含紅霉素和nisin的液體GM17培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行單酶切和PCR鑒定，將陽性重組子載體命名為pMG36e-nisI-gfp，陽性菌株命名為LAB-GFP。
2.如權(quán)利要求I所述表達綠色熒光蛋白的乳酸菌的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中，NI引入XbaI位點，N2引入PstI位點。
3.如權(quán)利要求I所述表達綠色熒光蛋白的乳酸菌的制備方法，其特征在于所述步驟(5)中，Gl引入SacI位點，G2引入XbaI位點。
4.應(yīng)用權(quán)利要求I所構(gòu)建的能夠表達綠色熒光蛋白的乳酸菌LAB-GFP分析其在胃腸道中定植特性的方法，其特征在于步驟如下(1)挑取GM17平板上構(gòu)建成功的表達綠色熒光蛋白的乳酸菌LAB-GFP單個菌落于 GMl7液體培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)48 72h，此時濃度約為109cfu/mL ；(2)小鼠口服免疫前，過夜禁食、禁水，每只小鼠飼喂ImLLAB-GFP乳酸菌菌液，為實驗組，同時對照組小鼠口服ImL O. 85%生理鹽水；(3)分別于接種后2、6、18、26、42和72h宰殺，分別取胃、空腸、回腸和盲腸內(nèi)容物O.5g，用無菌生理鹽水倍比稀釋后分三個稀釋度接種于含抗生素平板上，30°C培養(yǎng)48 72h，計數(shù)菌落；(4)取胃、空腸、回腸、盲腸的內(nèi)容物和腸壁做成連續(xù)的冰凍切片(12μπι)，在熒光顯微鏡下觀察重組菌的分布。
5.應(yīng)用權(quán)利要求I所構(gòu)建的乳酸菌綠色熒光蛋白表達載體pMG36e-nisI-gfp，其特征在于可應(yīng)用于多種乳酸菌，包括乳酸乳球菌、植物乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種等。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于綠色熒光蛋白檢測乳酸菌在胃腸道中定植特性的方法。提供帶有熒光蛋白的乳酸菌表達載體(比如pMG36e-nisI-gfp)用于使乳酸菌自身表達綠色熒光蛋白，該載體含有nisin抗性基因nisI和綠色熒光蛋白基因gfp。將該載體轉(zhuǎn)化乳酸菌，轉(zhuǎn)化子自身能夠表達綠色熒光蛋白。將轉(zhuǎn)化菌株飼喂昆明小鼠，通過跟蹤監(jiān)測熒光菌體在小鼠消化道各段的情況來準(zhǔn)確分析乳酸菌在動物消化道各段中的定植、黏附狀況。本發(fā)明提供的方法可應(yīng)用于多種乳酸菌，不受細(xì)菌型別和種類的限制，也不受細(xì)菌生長環(huán)境的限制，可廣泛應(yīng)用于科研、生產(chǎn)等各種領(lǐng)域，有望成為乳酸菌口服疫苗的表達載體。
文檔編號C12R1/225GK102604877SQ201110024958
公開日2012年7月25日 申請日期2011年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月24日
發(fā)明者王艷萍, 王菁蕊, 王金菊 申請人:天津科技大學(xué)