專利名稱：：雙控雙調(diào)節(jié)原核表達(dá)載體系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種雙控雙調(diào)節(jié)原核表達(dá)載體系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和用途。
背景技術(shù)：
：原核細(xì)胞中基因表達(dá)(蛋白質(zhì)合成)載體一股都是單載體，即一個感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)入一種質(zhì)粒，完成目的基因的表達(dá)，實現(xiàn)目的蛋白質(zhì)的合成。這種形式的表達(dá)載體在把表達(dá)載體往感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化時操作程序簡單，轉(zhuǎn)化效率高。但是，該種表達(dá)載體在基因表達(dá)(蛋白質(zhì)合成)過程中，載體上的控制調(diào)節(jié)系統(tǒng)對基因表達(dá)的控制不嚴(yán)格，經(jīng)常有漏表達(dá)，造成一些表達(dá)產(chǎn)物對大腸桿菌宿主細(xì)胞有毒性的一些基因難已表達(dá)，從而限制了現(xiàn)有的一些表達(dá)載體的廣泛應(yīng)用。該種形式的表達(dá)載體可參考以下文獻(xiàn)Yanisch-Perron,C.,Vieira,J.andjamesW.Warren,JenniferR.Walker,JohnR.Roth,etal.ConstructionandCharacterizationofaHighlyRegulableExpressionVector,pLACll,andItsMultipurposeDerivatives,pLAC22andpLAC33.Plasmid(2000)44,138-151；Studier,F.W.(1991).Useofbacteriophage-T71ysozymetoimproveaninducibleT7expressionsystem.J.Mol.Biol.219，37-44；Studier,F.W.，andMoffatt，B.A.(1986).UseofbacteriophageT7RNApolymerasetodirectselectivehigh-levelexpressionofclonedgenes.J.Mol.Biol.189，113—130；Studier，F(xiàn).W.，Rosenberg，A.H.，Dunn，J.J.，andDubendorff，J.W.(1990).UseofT7RNA-polymerasetodirectexpressionofclonedgenes.In"MethodsinEnzymology"(D.V.Goeddel,Ed.),AcademicPress，SanDiego.Vol.185，pp.60-89；Vieira，J.，andMessing，J.(1982).ThepUCplasmids,anM13mp7_derivedsystemforinsertionmutagenesisandsequencingwithsyntheticuniversalprimers.Gene19，259-268；Glass，R.E.(1982)."GeneFunctionE.coliandItsHeritableElements."Univ.CaliforniaPress，BerkeleyandLosAngeles；Godson，G.N.(1991).Anover-expressionplasmidforEscherichiacoliprimase.Gene100,59-64；Mu”Iler-Hill,B.(1975).Lacrepressorandlacoperator.Prog.Biophys.Mol.Biol.30，227-252;Mu..ller-Hill，B.(1996).“ThelacOperon:AShortHistoryofaGeneticParadigm.，，deGruyter,Berlin；Bolivar,F.，Rodriguez,R.L.，Greene，P.J.，Betlach，M.C.，Heyneker,H.L.，Boyer,H.W.，Crosa，J.H.，andFalkow，S.(1977).ConstructionandcharacterizationofnewcloningvehiclesII.Amultipurposecloningsystem.Gene2,95-113；Brosius，J.(1988).Expressionvectorsemployinglambda-,trp_，lac-,andlpp-derivedpromoters.Biotechnology10,205-225；Brosius,J.,andHoly,A.(1984).Regulationofribosomal150WARRENETALRNApromoterswithasyntheticlacoperator.Proc.Natl.Acad.Sci.USA81，6929-6933；Amann,Ε.，andBrosius，J.(1985).ATGvectorsforregulatedhigh-levelexpressionofclonedgenesinEscherichiacoli.Gene40，183—190；Amann,Ε.，Ochs，B.,andAbel,K-J.(1988).TightlyregulatedtacvectorsusefulfortheexpressionofunfusedandfusedproteinsinEscherichiacoli.Gene69,301-315；Balbars，P·，andBolivar,F.(1990).DesignandconstructionofexpressionplasmidvectorsinEscherichiacoli.In“MethodsinEnzymology，，(D.V.Goeddel,Ed.)，AcademicPress，SanDiego.Vol.185，pp.14-37；Balba's，P.，Sobero'n，X.，Merino，E.，Zurita，M.，Hilda,M.，Valle,F.，F(xiàn)lores,N.，andBolivar,F.(1986).PlasmidvectorpBR322anditsspecial-purposederivatives-Areview.Gene50,3-40.Beckwith,J.R.,andZipser,D.(Eds.)(1970)."TheLactoseOperon.”ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，NY；TimothyS.Ham,SungKukLee,JayD.Keasling,etal.ATightlyRegulatedInducibleExpressionSystemUtilizingthefimInversionRecombinationSwitch.BiotechnologyandBioengineering，2006，Vol.94,No.1，pl_4；IanΤ.D.Petty.AplasmidvectorforcloningdirectIyatthetranscriptioninitiationsiteofabacteriophageT7promoter.NucleicAcidsResearch.1988，Volume16Number17，p8738；ChristineCagnon,VlvianeValverdeandJean-MichelMassonlAnewfamilyofsugar—inducibleexpressionvectorsforEscherichiacoli.ProteinEngineering.1991，vol.4no.7pp.843-847.W.TomStumpandKathleenB.Hall.SP6RNApolymeraseefficientlysynthesizesRNAfromshortdouble-strandedDNAtemplates.NucleicAcidsResearch,1993,21(23)5480-5484.EllenD.Jorgensen$,RussellK.Durbin,StevenS.Risman,etal.SpecificContactsbetweentheBacteriophageT3，T7，andSP6RNAPolymerasesandTheirPromoters,THEJOURNOAFLBIOLOGICACLHEMISTRY.Val.1991,266(1),645-651.HirokazuKotani，YukuoIshizaki，NobutsuguHiraoka，etal.NucleicAcidsResearch.1987，15(6)2653-2664.現(xiàn)有的大腸桿菌表達(dá)載體經(jīng)常有目的基因不表達(dá)的情況發(fā)生，原因是在單控單調(diào)節(jié)的情況下由啟動子、操縱子、調(diào)節(jié)基因組成的控制調(diào)節(jié)系統(tǒng)不嚴(yán)格，即目的基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄和翻譯)控制調(diào)節(jié)不嚴(yán)格，在非誘導(dǎo)表達(dá)時也能夠(漏表達(dá))進(jìn)行少量的目的基因表達(dá)，合成出蛋白質(zhì)。有些目的基因的表達(dá)產(chǎn)物還會對宿主細(xì)胞有毒性作用，造成宿主細(xì)胞的死亡，不能獲得要表達(dá)的目的蛋白。
發(fā)明內(nèi)容為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種雙控雙調(diào)節(jié)原核表達(dá)載體系統(tǒng)，用雙載體控制調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)，即SP6啟動子(promoter)+乳糖(Iac)調(diào)節(jié)基因表達(dá)系統(tǒng)和araB啟動子(promoter)+araC調(diào)節(jié)基因表達(dá)系統(tǒng)，分別由乳糖類似物IPTG和阿拉伯糖(L-arabinose)誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。在該雙控雙調(diào)節(jié)原核表達(dá)載體系統(tǒng)中，由兩個表達(dá)載體共同完成目的基因的表達(dá)。其中一個為主表達(dá)載體，即目的基因克隆到此表達(dá)載體上，另一個為輔助表達(dá)載體，該輔助表達(dá)載體控制調(diào)節(jié)主表達(dá)載體的啟動子(SP6)。若實現(xiàn)主表達(dá)載體表達(dá)目的基因，必須經(jīng)過輔助表達(dá)載體的控制調(diào)節(jié)系統(tǒng)和自身載體上的控制調(diào)節(jié)系統(tǒng)雙調(diào)控實現(xiàn)目的基因的表達(dá)。雙控雙調(diào)節(jié)原核表達(dá)載體系統(tǒng)實現(xiàn)雙控雙調(diào)節(jié)基因表達(dá)的原理如圖1所示。為了實現(xiàn)上述的發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案一種雙控雙調(diào)節(jié)原核表達(dá)載體系統(tǒng)，由兩個表達(dá)載體共同完成目的基因的表達(dá)；其中一個表達(dá)載體為主表達(dá)載體，目的基因克隆到此表達(dá)載體上，另一個表達(dá)載體為輔助表達(dá)載體，該輔助表達(dá)載體控制調(diào)節(jié)主表達(dá)載體啟動子的開關(guān)；主表達(dá)載體含有SP6啟動子和乳糖調(diào)節(jié)基因，輔助表達(dá)載體含有araB啟動子、araC調(diào)節(jié)基因和SP6RNA聚合酶基因；主表達(dá)載體和輔助表達(dá)載體的表達(dá)目的基因受誘導(dǎo)物控制和/或調(diào)節(jié)。主表達(dá)載體的誘導(dǎo)物是乳糖類似物IPTG，輔助表達(dá)載體的誘導(dǎo)物是阿拉伯糖。上述雙控雙調(diào)節(jié)原核表達(dá)載體系統(tǒng)的構(gòu)建方法，包括以下步驟1)WSEQIDNO:1和2所示序列為引物，以質(zhì)粒pETlla為模板，進(jìn)行PCR擴增，用BglII酶切PCR產(chǎn)物，回收目的片段后直接進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建pESP-Ι載體；將目的基因片段插入PESP-I載體中，構(gòu)建含有目的基因的主表達(dá)載體；2)將質(zhì)粒pARA13用I3StI和HindIII雙酶切，回收目的片段，與SP6RNA聚合酶基因連接，構(gòu)建質(zhì)粒PARA-SP6作為輔助表達(dá)載體；3)將主表達(dá)載體和輔助表達(dá)載體同時轉(zhuǎn)化大腸桿菌，同時使用主表達(dá)載體誘導(dǎo)物和輔助表達(dá)載體誘導(dǎo)物控制和/或調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)。本發(fā)明還提供了上述雙控雙調(diào)節(jié)原核表達(dá)載體系統(tǒng)用于表達(dá)目的基因的用途。本發(fā)明具有以下技術(shù)效果1)本發(fā)明提供的基因表達(dá)載體系統(tǒng)，在目的基因表達(dá)過程中，表達(dá)控制高度嚴(yán)格而且可調(diào)。2、本發(fā)明提供的表達(dá)載體系統(tǒng)解決了目的基因表達(dá)過程中的漏表達(dá)問題，從而能表達(dá)一些難以表達(dá)的基因，即載體表達(dá)目的基因(蛋白質(zhì)合成)的廣譜性增強?；帽景l(fā)明的基因表達(dá)載體系統(tǒng)廣譜性強。圖1雙控雙調(diào)節(jié)原核表達(dá)載體系統(tǒng)表達(dá)原理示意2:pESP-l載體結(jié)構(gòu)示意圖SP6啟動子在質(zhì)粒pESP-Ι中432-448的位置，Lac操縱基因(operator)在405-429的位置，LacI編碼序列在835-1914的位置。pESP-Ι載體克隆表達(dá)區(qū)域(cloning/expressionregion)為權(quán)利要求1.一種雙控雙調(diào)節(jié)原核表達(dá)載體系統(tǒng)，其特征在于由兩個表達(dá)載體共同完成目的基因的表達(dá)；其中一個表達(dá)載體為主表達(dá)載體，目的基因克隆到此表達(dá)載體上，另一個表達(dá)載體為輔助表達(dá)載體，該輔助表達(dá)載體控制調(diào)節(jié)主表達(dá)載體啟動子的開關(guān)；主表達(dá)載體含有SP6啟動子和乳糖調(diào)節(jié)基因，輔助表達(dá)載體含有araB啟動子、araC調(diào)節(jié)基因和SP6RNA聚合酶基因；主表達(dá)載體和輔助表達(dá)載體的表達(dá)目的基因受誘導(dǎo)物控制和/或調(diào)節(jié)。2.如權(quán)利要求1所述的載體系統(tǒng)，其特征在于所述的誘導(dǎo)物是乳糖類似物IPT6，輔助表達(dá)載體的誘導(dǎo)物是阿拉伯糖。3.如權(quán)利要求1或2所述雙控雙調(diào)節(jié)原核表達(dá)載體系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟1)以SEQIDNO:1和2所示序列為引物，以質(zhì)粒pETlla為模板，進(jìn)行PCR擴增，用BglII酶切PCR產(chǎn)物，回收目的片段后直接進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建pESP-Ι載體；將目的基因片段插入pESP-Ι載體中，構(gòu)建含有目的基因的主表達(dá)載體；2)將質(zhì)粒pARA13用I^stI和HindIII雙酶切，回收目的片段，與SP6RNA聚合酶基因連接，構(gòu)建質(zhì)粒PARA-SP6作為輔助表達(dá)載體；3)將主表達(dá)載體和輔助表達(dá)載體同時轉(zhuǎn)化大腸桿菌，同時使用主表達(dá)載體誘導(dǎo)物和輔助表達(dá)載體誘導(dǎo)物控制和/或調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)。4.如權(quán)利要求1或2所述雙控雙調(diào)節(jié)原核表達(dá)載體系統(tǒng)的用途。全文摘要本發(fā)明屬于分子生物學(xué)基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種雙控雙調(diào)節(jié)原核表達(dá)載體系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和用途。該載體系統(tǒng)由兩個表達(dá)載體共同完成目的基因的表達(dá)，其中一個表達(dá)載體為主表達(dá)載體，目的基因克隆到此表達(dá)載體上，另一個表達(dá)載體為輔助表達(dá)載體，該輔助表達(dá)載體控制調(diào)節(jié)主表達(dá)載體啟動子的開關(guān)，主表達(dá)載體含有SP6啟動子和乳糖調(diào)節(jié)基因，輔助表達(dá)載體含有arab啟動子、araC調(diào)節(jié)基因和SP6RNA聚合酶基因，主表達(dá)載體和輔助表達(dá)載體的表達(dá)目的基因受誘導(dǎo)物控制和/或調(diào)節(jié)。文檔編號C12N15/70GK102174554SQ20111002503公開日2011年9月7日申請日期2011年1月24日優(yōu)先權(quán)日2011年1月24日發(fā)明者李國瑞,翟景波,陳永勝申請人:內(nèi)蒙古民族大學(xué)