一種治療Ebola病毒的藥物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種治療Ebola病毒的藥物及其制備方法，旨在提供一種制備方法簡單，用于治療埃博拉病毒的藥物；其技術(shù)要點(diǎn)：所述的藥物為特異切割Ebola病毒RNA的融合蛋白PIN-VP30-DD，基因序列如SEQ ID NO：1所示；制備方法為：1)PIN-VP30-DD原核表達(dá)載體的構(gòu)建；2)PIN-VP30-DD蛋白的原核表達(dá)純化；屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。
【專利說明】_種治療Ebola病毒的藥物及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開了一種生物藥物，具體地說，是一種治療Ebola病毒的藥物，本發(fā)明該 公開了該藥物的制備方法，屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 埃博拉病毒（EBOV)是引起人類和靈長類動物發(fā)生埃博拉出血熱（EBHF)的烈 性病毒，由此引起的出血熱是當(dāng)今世界上最致命的病毒性出血熱，已造成10次具有規(guī)模 的爆發(fā)流行。目前沒有針對Ebola病毒的特效藥物。Emily P等人用納米級的脂包被的 siRNA(nucleoprotein為革El基因）治療Ebola病毒，目前這個實(shí)驗(yàn)還在進(jìn)行之中，由于它只 是抑制轉(zhuǎn)錄，所以很難根治。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對上述不足，本發(fā)明的目的在于提供一種制備方法簡單，用于治療埃博拉病毒 的藥物及其制備方法。
[0004] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的第一個技術(shù)方案是這樣的：該治療Ebola病 毒的藥物，所述的藥物為特異切割Ebola病毒RNA的融合蛋白PIN-VP30_ DD，基因序列如SEQ ID NO :1 所示。
[0005] 進(jìn)一步的，上述的治療Ebola病毒的藥物，所述的藥物通過下述步驟制備：
[0006] I) PIN-VP30_DD原核表達(dá)載體的構(gòu)建
[0007] 以Ebola病毒RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR，然后擴(kuò)增VP30片段，并進(jìn)行點(diǎn)突變，即突 變成 VP30_dd;
[0008] PCR擴(kuò)增PIN，然后兩個PCR片段融合，克隆到PET-16b的BamHI和NdeI位點(diǎn)；
[0009] 2) PIN-VP30_DD蛋白的原核表達(dá)純化
[0010] 將帶有重組質(zhì)粒PIN-VP30_DD的大腸桿菌BL21菌種擴(kuò)大培養(yǎng)，在12-18°C經(jīng)IPTG 過夜誘導(dǎo)，收集所得到的PIN-VP30_DD蛋白菌體，經(jīng)過高壓破碎后離心獲得可溶性的上清， 進(jìn)行Ni柱親和層析；待目的蛋白與Ni柱結(jié)合之后，先用漂洗液洗滌，在用洗脫緩沖液洗 滌，在用脫鹽柱將洗脫組分中的高鹽緩沖液置換成含有20%甘油的PBS溶液，之后進(jìn)行 SDS-PAGE的檢測，所得即為純化的PIN-VP30_DD蛋白；
[0011] 為制備該藥物，本發(fā)明的另外一個技術(shù)方案是提供該治療Ebola病毒藥物的方 法，該方法依次包括下述步驟：
[0012] 1)PIN-VP30_DD原核表達(dá)載體的構(gòu)建
[0013] 序列合成PIN-VP30_DD,然后以PIN-VP30_DD為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后克隆到 PET-16b 的 BamHI 和 NdeI 位點(diǎn)；
[0014] 2) PIN-VP30_DD蛋白的原核表達(dá)純化
[0015] 將帶有重組質(zhì)粒PIN-VP30_DD的大腸桿菌BL21菌種擴(kuò)大培養(yǎng)，在12-18°C經(jīng)IPTG 過夜誘導(dǎo)，收集所得到的PIN-VP30_DD蛋白菌體，經(jīng)過高壓破碎后離心獲得可溶性的上清， 進(jìn)行Ni柱親和層析；待目的蛋白與Ni柱結(jié)合之后，先用漂洗液洗滌，在用洗脫緩沖液洗 滌，在用脫鹽柱將洗脫組分中的高鹽緩沖液置換成含有20%甘油的PBS溶液，之后進(jìn)行 SDS-PAGE的檢測，所得即為純化的PIN-VP30_DD蛋白。
[0016] 上述的治療Ebola病毒藥物的制備方法，所述的漂洗液由下述組分構(gòu)成：20mM Tri s-HCl，500mM NaCl，5 % 甘油，60mM 咪唑。
[0017] 進(jìn)一步的，上述的治療Ebola病毒藥物的制備方法，所述的漂洗液pH8. 0。
[0018] 上述的治療Ebola病毒藥物的制備方法，所述的洗脫緩沖液由下述組分構(gòu)成： 20mM Tris-HCl，500mM NaCl，5%甘油，500mM 咪唑。
[0019] 進(jìn)一步的，上述的治療Ebola病毒藥物的制備方法，所述的pH8. 0。
[0020] 進(jìn)一步的，上述的治療Ebola病毒藥物的制備方法，所述的脫鹽柱為ro-10脫鹽 柱。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案，將一個RNA非序列特異性的切割 Domain PIN與VP30_DD進(jìn)行融合，構(gòu)建成PIN-VP30 _DD融合蛋白，該蛋白可以特異性切割 Ebola病毒RNA，從而可以用來Ebola病毒感染的病毒治療。
[0022] VP30是Ebola病毒的一個特異性RNA結(jié)合蛋白，有288個氨基酸組成，它參與這 個病毒的轉(zhuǎn)錄開始。VP30的磷酸化，調(diào)節(jié)它與NP的結(jié)合，從而影響轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。VP30在氨 基酸（aa 29 31 and 42 46)有兩個和三個磷酸化位點(diǎn)，把這幾個絲氨酸突變成天冬氨酸， 即VP30_DD。該蛋白降低Ebola病毒mRNA的合成，但是該蛋白仍然保留了特異的RNA結(jié)合特 性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1是本發(fā)明提供的PIN-VP30-DD蛋白特異的切割Ebola virus病毒RNA。檢測 圖譜。

【具體實(shí)施方式】 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明的權(quán)利要求做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明 的任何限制，任何人在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的權(quán)利要 求保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0024] 實(shí)施例1
[0025] 本發(fā)明提供的一種治療Ebola病毒的藥物，該藥物為特異切割Ebola病毒RNA的 融合蛋白PIN-VP30_ DD，基因序列如SEQ ID N0:1所示。
[0026] 該藥物由下述步驟依次制備：
[0027] I. PIN_VP30_DD原核表達(dá)載體的構(gòu)建。
[0028] 序列合成PIN-VP30_ddDNA融合序列，克隆到PET-16b的BamHI和NdeI位點(diǎn)。具 體序列如SEQ ID NO :1所示：
[0029] 以 PIN-VP30, DNA 融合序列為模板，用引物 PET-16b_F:TTGTTAGCAGCCGGATCCATG GAAGCTTCATATGAGAGAGGAC(SEQ ID N0:2)和引物 PET-16b_R:ATCGAAGGTCGTCATATGTTATAGC CGGATTGGCTCCTCTT(SEQ ID NO :3)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，然后 Infusion 克隆到 PET-16b 的 BamHI 和NdeI位點(diǎn)。即為原核表達(dá)載體PET-16b-PIN-VP30_DD
[0030] 2. PIN-VP30_DD蛋白的原核表達(dá)純化。
[0031] 將帶有重組質(zhì)粒PIN-VP30_DD的大腸桿菌BL21菌種擴(kuò)大培養(yǎng)，在16°C經(jīng)IPTG過 夜誘導(dǎo)，分別收集所得到的PIN-VP30_ DD蛋白菌體，經(jīng)過高壓破碎后離心獲得可溶性的上清， 進(jìn)行Ni柱親和層析。待目的蛋白與Ni柱結(jié)合之后，先用漂洗液（20mM Tris-HCl，500mM NaCl，5% (v/v)甘油，60mM 咪唑，pH8. 0)洗滌，之后用洗脫緩沖液（20mM Tris-HCl，500mM NaCl，5% (v/v)甘油，500mM咪唑，pH8.0)。利用PD-10脫鹽柱將洗脫組分中的高鹽緩沖液 置換成含有20 %甘油的PBS溶液，之后進(jìn)行SDS-PAGE的檢測。所得即為純化的PIN-VP30_dd 蛋白具體序列如SEQ ID NO :4所不。
[0032] 為了更好的說明本發(fā)明的效果，下面給出PIN_VP30_DD蛋白活性的驗(yàn)證方法：
[0033] PIN-VP30_DD蛋白與Ebola virus病毒RNA進(jìn)行孵育，經(jīng)過RT-PCR檢查。發(fā)現(xiàn) PIN-VP30_DD能夠特異的切割Ebola virus病毒RNA。
[0034] 具體實(shí)驗(yàn)如下：
[0035] PIN-VP30_DD蛋白與 Ebola virus 病毒 RNA 的切割實(shí)驗(yàn)。
[0036] 取Ebola virus病毒感染的細(xì)胞。然后把PIN_VP30_DD克隆到真核表達(dá)載體上（慢 病毒），然后用這個病毒感染這株細(xì)胞。24小時后，用熒光RT-PCR檢查Ebola virus病毒 RNA，與對照相比，實(shí)驗(yàn)組的Ebola virus病毒RNA明顯減少，甚至消失。這個實(shí)驗(yàn)說明， PIN-VP30_DD蛋白可以特異的切割Ebola virus病毒RNA。檢測圖譜如圖1所示。
【權(quán)利要求】
1. 一種治療Ebola病毒的藥物，其特征在于，所述的藥物為特異切割Ebola病毒RNA的 融合蛋白PIN-VP30_DD，基因序列如SEQ ID N0:1所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療Ebola病毒的藥物，其特征在于，所述的藥物通過下述步 驟制備： 1. PIN-VP30_DD原核表達(dá)載體的構(gòu)建 序列合成PIN-VP30_DD，然后以PIN-VP30_DD為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后克隆到PET-16b 的BamHI和Ndel位點(diǎn)； 2. PIN-VP30_DD蛋白的原核表達(dá)純化 將帶有重組質(zhì)粒PIN-VP30_DD的大腸桿菌BL21菌種擴(kuò)大培養(yǎng)，在12-18°C經(jīng)IPTG過夜 誘導(dǎo)，收集所得到的PIN-VP30_DD蛋白菌體，經(jīng)過高壓破碎后離心獲得可溶性的上清，進(jìn)行 Ni柱親和層析；待目的蛋白與Ni柱結(jié)合之后，先用漂洗液洗滌，在用洗脫緩沖液洗滌，在 用脫鹽柱將洗脫組分中的高鹽緩沖液置換成含有20 %甘油的PBS溶液，之后進(jìn)行SDS-PAGE 的檢測，所得即為純化的PIN-VP30_DD蛋白。
3. 制備權(quán)利要求1所述的治療Ebola病毒藥物的方法，其特征在于，該方法依次包括下 述步驟： 1. PIN-VP30_DD原核表達(dá)載體的構(gòu)建 序列合成PIN-VP30_DD，然后以PIN-VP30_DD為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后克隆到PET-16b 的BamHI和Ndel位點(diǎn)； 2. PIN-VP30_DD蛋白的原核表達(dá)純化 將帶有重組質(zhì)粒PIN-VP30_DD的大腸桿菌BL21菌種擴(kuò)大培養(yǎng)，在12-18°C經(jīng)IPTG過夜 誘導(dǎo)，收集所得到的PIN-VP30_DD蛋白菌體，經(jīng)過高壓破碎后離心獲得可溶性的上清，進(jìn)行 Ni柱親和層析；待目的蛋白與Ni柱結(jié)合之后，先用漂洗液洗滌，在用洗脫緩沖液洗滌，在 用脫鹽柱將洗脫組分中的高鹽緩沖液置換成含有20 %甘油的PBS溶液，之后進(jìn)行SDS-PAGE 的檢測，所得即為純化的PIN-VP30_DD蛋白。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的治療Ebola病毒藥物的制備方法，其特征在于，所述的漂洗液 由下述組分構(gòu)成：20mM Tris-HCl，500mM NaCl，5%甘油，60mM咪唑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或者4所述的治療Ebola病毒藥物的制備方法，其特征在于，所述的 漂洗液PH8. 0。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的治療Ebola病毒藥物的制備方法，其特征在于，所述的洗脫緩 沖液由下述組分構(gòu)成：20mM Tris-HCl，500mM NaCl，5%甘油，500mM咪唑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3或者6所述的治療Ebola病毒藥物的制備方法，其特征在于，所述的 pH8. 0〇
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的治療Ebola病毒藥物的制備方法，其特征在于，所述的脫鹽柱 為ro-io脫鹽柱。
【文檔編號】A61K38/00GK104491833SQ201410719533
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月1日
【發(fā)明者】霍依然, 李紅梅, 覃啟紅, 黃龍 申請人:覃啟紅