一種提取狗毛皮屑變應原的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種提取狗毛皮屑變應原的方法，包括如下步驟：1)狗毛皮屑脫脂；2)使用緩沖有效量的pH7.5～10.0的浸提緩沖液進行浸提，收集粗浸提液；3)使用酸性化合物調節(jié)步驟2)所得到的粗浸提液的pH至pH3.0～5.0，沉淀部分非變應原的雜蛋白，并且過濾除去雜蛋白。采用本發(fā)明方法獲得的狗毛皮屑變應原浸提液中主要變應原占總蛋白的比例明顯提高。
【專利說明】-種提取狗毛皮屑變應原的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物藥物【技術領域】，具體涉及一種提取狗毛皮屑變應原的方法。

【背景技術】
[0002] 過敏性疾病是當今世界上最常見的疾病之一。過敏性疾病的發(fā)病率約占人口的 20%。過敏性疾病從新生兒到老年人的各年齡段均可能發(fā)生，且有明顯的遺傳性傾向。過 敏性疾病包括過敏性哮喘、過敏性鼻炎、特應性皮炎、過敏性結膜炎等，嚴重的甚至會威脅 到人的生命（過敏性休克）。
[0003] 當變應原通過食入或吸入等方式進入體內后，會誘導B細胞產生特異性的抗體 I班(si班）。si班會牢固地結合在服大細胞、瞻堿粒細胞表面。當變應原再次進入體內時， 會與該些si班相結合。該種結合會誘導與si班結合的服大細胞和瞻堿粒細胞釋放生物活 性介質。釋放的生物活性介質除了組織胺W外，還可W是前列腺素D2、白H帰、血小板活化 因子等，它們的作用都相似，都可引起平滑肌收縮，毛細血管擴張和通透性增強，腺體分泌 物增多，即導致過敏性疾病的發(fā)生。
[0004] 引起過敏的主要變應原之一是動物皮屑。其中狗毛皮屑是最重要的動物變應原之 一，可能誘發(fā)過敏性哮喘、過敏性鼻炎或特應性皮炎等疾病。國內外狗致敏性疾病都比較普 遍，受累人群眾多。在我國，據(jù)王瑞埼等報道，2008年至2010年在北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應科 就診的患者共計204968例次，狗變應原陽性率38. 1%。在美國，Ingram等發(fā)現(xiàn)Los Alamos 地區(qū)約67%的哮喘患兒血清中可檢測到針對狗變應原的特異性I班抗體。
[0005] 由于導致過敏性疾病的變應原種類繁多，因此，進行診斷導致患者過敏的變應原 種類的檢測顯得尤為重要，其中，皮膚點刺試驗是目前臨床上最常見的變應原體內診斷方 法。當變應原進入過敏性疾病患者皮膚后，與服大細胞上的特異性I班抗體結合，導致服大 細胞脫顆粒釋放組胺等炎癥介質，使局部血管擴張，滲出增加，引起皮膚表面的風團和紅暈 反應?；颊邫C體對變應原刺激的敏感程度與體內組胺的釋放量、皮膚表面的風團反應呈正 相關。
[0006] 過敏性疾病的治療方法主要有對癥藥物治療與特異性免疫治療?，F(xiàn)有的對癥藥物 主要包括抗組胺藥物、過敏反應介質阻滯劑、巧劑、免疫抑制劑等。但對癥藥物常伴有不同 的副作用，且長期或大劑量服用易產生耐藥性，因此并不能達到根治的效果。特異性免疫治 療是在皮膚點刺試驗或其他方法驗證導致過敏的主要變應原物質后，將主要變應原制成不 同濃度的藥物制劑，通過梯度遞增的給藥方式連續(xù)給患者W變應原制劑，從而使患者對變 應原脫敏。特異性免疫治療是一種對因治療，世界衛(wèi)生組織WK)在其關于免疫脫敏的指導 性文件中明確指出："脫敏治療是唯一可W改變過敏性疾病自然進程的治療方法"。
[0007] 過敏性疾病的診斷和治療上，變應原藥物制劑都起到了至關重要的作用，因此，開 發(fā)穩(wěn)定而有效的變應原藥物制劑具有重要的意義。
[0008] 目前，對于狗毛皮屑變應原的獲取方法主要是收集狗毛皮屑直接進行提取，獲得 狗毛皮屑變應原浸提液。由于狗毛皮屑中含有較多的雜質，現(xiàn)有的方法不能很好地去除非 變應原的雜蛋白，導致狗毛皮屑變應原浸提液中變應原蛋白占總蛋白的比例較低。


【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明所要解決的技術問題即克服狗毛皮屑變應原浸提液變應原得率較低的缺 陷，提供一種提取較高變應原比率的狗毛皮屑變應原的方法。
[0010] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種提取狗毛皮屑變應原的方法，其特征在于，所 述方法包含W下步驟：
[0011] 1)狗毛皮屑脫脂；
[0012] 2)使用緩沖有效量的抑7. 5?10. 0的浸提緩沖液進行浸提，收集粗浸提液；
[0013] 3)使用酸性化合物調節(jié)所述步驟2)得到的粗浸提液的抑至抑3. 0?5. 0,沉淀 部分非變應原的雜蛋白；并且過濾除去雜蛋白。
[0014] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述提取狗毛皮屑變應原的方法包含W下步驟：
[0015] 1)狗毛皮屑脫脂；
[0016] 2)使用緩沖有效量的抑7. 5?10. 0的浸提緩沖液進行浸提，收集粗浸提液；
[0017] 3)使用酸性化合物調節(jié)所述步驟2)得到的粗浸提液的抑至抑3. 0?5. 0,沉淀 部分非變應原的雜蛋白，并且過濾除去雜蛋白；
[0018] 4)將步驟3)得到的濾液濃縮至原體積的1/10?1/150 ;
[0019] 5)將步驟4)得到的濃縮液中加入藥學上可接受的載體；
[0020] 6)過濾除菌。
[0021] 在一個優(yōu)選的實施方案中，在所述步驟1)前還可W將狗毛皮屑材料進行粉碎（更 優(yōu)選的使用液氮粉碎）。
[0022] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的提取方法步驟2)浸提還可W加入0. 1 %?5% 化C1。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述化C1濃度為0.5%?2%。在一個還要優(yōu)選的實 施方案中，所加入的化C1濃度為1%。
[0023] 在一個優(yōu)選的實施方案中，狗毛皮屑的來源選自：中華田園犬、邊境牧羊犬、德國 牧羊犬、中國沙皮犬、阿拉斯加雪橋犬、薩摩耶、拉布拉多尋回犬。
[0024] 在一個優(yōu)選的實施方案中，在所述步驟1)中，使用有機溶劑脫脂，并且脫脂后干 燥。在一個更優(yōu)選的實施方案中，脫脂所使用的有機溶劑選自丙麗、己離、無水己醇、甲 苯。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述步驟1)中所述有機溶劑加入量與狗毛皮屑質量比為 1 : 5 ?1 : 50w/v。
[00巧]在一個優(yōu)選的實施方案中，所述步驟2)的浸提緩沖液的抑為抑8.0?9.0。在另 一個優(yōu)選的實施方案中，所述步驟2)的浸提緩沖液選自pH7. 6的磯酸鹽緩沖液、P服.0的 測酸鹽緩沖液、P服.2的磯酸鹽緩沖液、P服.5的測酸鹽緩沖液。
[0026] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述步驟3)的酸性化合物選自巧樣酸、鹽酸、硫酸、磯 酸、己酸。
[0027] 在一個優(yōu)選的實施方案中，在所述步驟3)中使用酸性化合物調節(jié)粗浸提液的抑 至pH3. 0?4. 5。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述步驟3)使用酸性化合物調節(jié)粗浸提液 的抑至抑3.5?4.5。在一個最優(yōu)選的實施方案中，所述步驟3)使用酸性化合物調節(jié)粗浸 提液的抑至抑4.0。
[0028] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述步驟3)的過濾方法選自離也過濾、濾膜過濾。
[0029] 在一個優(yōu)選的實施方案中，在所述步驟4)中的濃縮方法選自超濾、透析。
[0030] 在一個優(yōu)選的實施方案中，在所述步驟4)中，所述濃縮時使用抑5. 0?7. 0的緩 沖液更換緩沖體系。在一個更加優(yōu)選的實施方案中，在所述步驟4)中，濃縮時使用P冊.5? 6. 5的緩沖液更換緩沖體系。
[0031] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述步驟4)濃縮時使用的代替原浸提液的抑5. 0? 7. 0的緩沖液選自：甘氨酸-鹽酸緩沖液、磯酸氨二軸-巧樣酸緩沖液、巧樣酸-氨氧化 軸-鹽酸緩沖液、巧樣酸-巧樣酸軸緩沖液、己酸-己酸軸緩沖液、己酸-邸TA緩沖液、磯酸 氨二軸-磯酸二氨軸緩沖液、磯酸氨二軸-磯酸二氨鐘緩沖液、磯酸二氨鐘-氨氧化軸緩沖 液、Tris-鹽酸緩沖液、測砂-鹽酸緩沖液、測酸-測砂緩沖液、甘氨酸-氨氧化軸緩沖液、測 砂-氨氧化軸緩沖液、碳酸軸-碳酸氨軸緩沖液、碳酸軸-氨氧化軸緩沖液、磯酸氨二軸-氨 氧化軸緩沖液、氯化鐘-鹽酸緩沖液、氯化鐘-氨氧化軸緩沖液。
[0032] 在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述步驟4)濃縮時替代浸提液所使用的抑5. 0? 7. 0的緩沖液選自；P冊.0的己酸-己酸軸緩沖液、P冊.5的己酸-EDTA緩沖液、P冊.0的磯 酸氨二軸-巧樣酸緩沖液、P冊.5的Tris-鹽酸緩沖液、pH7. 0的磯酸氨二軸-磯酸二氨軸 緩沖液。
[0033] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述步驟4)將所述步驟3)得到的濾液濃縮至原體積 的 1/40 ?1/100。
[0034] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述步驟5)的藥學上可接受的載體選自多元醇、藥用 防腐劑、氨基己酸或其組合。其中，所述的多元醇選自；丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、 聚己二醇，濃度范圍在40%?60% v/v，更優(yōu)選的為45%?55% v/v的甘油。所述的藥用 防腐劑選自苯酷、硫柳隸、苯甲酸、山梨酸、山梨酸鹽類、對輕基苯甲酸醋類、苯甲醇、苯己醇 或其組合，濃度范圍在0. 1 %?3% w/v。更優(yōu)選的為藥用防腐劑為0. 1 %?0.5% w/v的苯 酷。所述的氨基己酸的濃度范圍在0. 1%?2. 0%w/v，優(yōu)選的氨基己酸濃度范圍在0.3%? 1. 0% w/v，更優(yōu)選的氨基己酸濃度為0. 65% w/v。
[0035] 利用本發(fā)明所述的提取方法提取的狗毛皮屑變應原，主要變應原占總蛋白的比例 明顯提高。所提取的狗毛皮屑變應原可W用于制備含有狗毛皮屑變應原的藥物組合物，W 用于診斷或治療由狗毛皮屑變應原引起的免疫性疫病。

【具體實施方式】
[0036] 本發(fā)明提供了一種提取狗毛皮屑變應原的方法，其特征在于，所述方法包含W下 步驟：
[0037] 1)狗毛皮屑脫脂；
[0038] 2)使用緩沖有效量的抑7. 5?10. 0的浸提緩沖液進行浸提，收集粗浸提液；
[0039] 3)使用酸性化合物調節(jié)所述步驟2)得到的粗浸提液的抑至抑3. 0?5. 0,沉淀 部分非變應原的雜蛋白，并且過濾除去雜蛋白。
[0040] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述提取狗毛皮屑變應原的方法包含W下步驟：
[0041] 1)狗毛皮屑脫脂；
[0042] 2)使用緩沖有效量的抑7. 5?10. 0的浸提緩沖液進行浸提，收集粗浸提液；
[0043] 3)使用酸性化合物調節(jié)所述步驟2)得到的粗浸提液的抑至抑3. 0?5. 0,沉淀 部分非變應原的雜蛋白，并且過濾除去雜蛋白；
[0044] 4)將步驟3)得到的濾液濃縮至原體積的1/10?1/150 ;
[0045] 5)將步驟4)得到的濃縮液中加入藥學上可接受的載體；
[004引 6)過濾除菌。
[0047] 本發(fā)明中的"包含W下步驟"是指該方法除了所列出的必要步驟外，還可W有任何 其它有幫助或促進該項實施方案完成的操作步驟。
[0048] 在一個優(yōu)選的實施方案中，狗毛皮屑的來源包括；中華田園犬、邊境牧羊犬、德國 牧羊犬、中國沙皮犬、阿拉斯加雪橋犬、薩摩耶、拉布拉多尋回犬等。狗毛皮屑可W通過商業(yè) 途徑購買，也可W通過其他途徑獲得。
[0049] 在一個優(yōu)選的實施方案中，狗毛皮屑材料獲得后首先通過研磨使其粉碎。在一個 更優(yōu)選的實施方案中，研磨在低溫條件下進行。低溫環(huán)境下進行研磨，有利于保持狗毛皮屑 變應原蛋白的活性。研磨方法可W是但不限于；液氮研磨。
[0050] 在一個優(yōu)選的實施方案中，在所述步驟1)中，使用有機溶劑脫脂，并且脫脂后干 燥。在一個更加優(yōu)選的實施方案中，所使用的有機溶劑選自但不限于己離、丙麗、無水己醇、 甲苯。將脫脂有機溶劑與狗毛皮屑材料W-定比例（較佳1 : 5?1 : 50w/v，更佳1 : 5? 1 ; 25w/v,還要佳1 ; 10?1 ; 20w/v)混合，攬拌1?24小時（較佳1?12小時，更佳 1?6小時，還要佳1?3小時，最佳2小時），棄上層脫脂有機溶劑。脫脂2?6次，至脫 脂后的有機溶劑為無色，將脫脂后的固體物自然干燥后稱重。實驗室操作應在通風樞內完 成，中試采用真空濃縮提取罐。
[0051] 在一個具體的實施方案中，所述步驟1)使用丙麗作為脫脂溶劑。將丙麗與狗毛皮 屑材料W-定比例（較佳1 : 5?1 : 50w/v，更佳1 : 5?1 : 25w/v，還要佳1 : 10? 1 ; 20w/v)混合，攬拌1?24小時（較佳1?12小時，更佳1?6小時，還要佳1?3小 時，最佳2小時），棄上層丙麗。脫脂2?6次，至脫脂后的丙麗為無色，將脫脂后的固體物 自然干燥后稱重。
[0052] 動物來源原料中的蛋白質多為酸性蛋白。在本發(fā)明所述步驟2)中，選擇偏堿性抑 值的浸提液，可增大蛋白質的溶解度，提高提取效果。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述步驟 2)的浸提緩沖液的抑范圍為抑8.0?9.0。在另一個優(yōu)選的實施方案中，浸提緩沖液選自 pH7. 6的磯酸鹽緩沖液、P服.0的測酸鹽緩沖液、P服.2的磯酸鹽緩沖液、P服.5的測酸鹽緩 沖液。
[0053] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述步驟2)的浸提緩沖液中還可W加入0. 1 %?5% 化C1。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述化C1濃度為0.5%?2%。在一個還要優(yōu)選的實 施方案中，所加入的化C1濃度為1%。
[0054] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的浸提過程可在低溫下（優(yōu)選2?8C)進行。低 溫下進行浸提可W保護蛋白的活性，減少蛋白失活的比例，同時避免浸提過程中微生物繁 殖、減少狗自身酶系的作用。
[00巧]在一個具體的實施方案中，在2?8C條件下，所述步驟2) W-定的比例（優(yōu)選 1 : 5?1 : 50w/v,更優(yōu)選1 : 10?1 : 40w/v,還要優(yōu)選1 : 20?1 : 30w/v)加入 pH7. 5?10. 0的磯酸鹽緩沖液（優(yōu)選抑8. 2的磯酸鹽緩沖液）和0. 1 %?5 %化C1 (優(yōu)選 0. 5%?2%化Cl,更優(yōu)選1 %化Cl)，充分接觸攬拌1?72小時（優(yōu)選進行10?70小時， 更優(yōu)選48?60小時），離也或/并過濾，獲得粗浸提液。
[0056] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述步驟3)的酸性化合物選自但不限于巧樣酸、鹽 酸、硫酸、磯酸、己酸。使用所述酸性化合物調節(jié)所述步驟2)得到的粗浸提液的抑至 P冊.0?5. 0，更佳至抑3. 0?4. 5，再佳至抑3. 5?4. 5，最佳至抑4. 0。
[0057] 本發(fā)明所述步驟3)主要是根據(jù)不同蛋白等電點不同的原理而設計的。等電點為 本領域技術人員所熟知的專業(yè)術語。在某一抑的溶液中，氨基酸或蛋白質解離成陽離子和 陰離子的趨勢或程度相等，成為兼性離子，呈電中性，此時溶液的抑成為該氨基酸或蛋白 質的等電點。當溶液抑為該蛋白等電點時，該蛋白在溶液中的溶解度最低。通過反復研究 發(fā)現(xiàn)，將狗毛皮屑的粗浸提液抑調節(jié)至抑3. 0?5. 0 (更佳至抑3. 0?4. 5，再佳至抑3. 5? 4.5,最佳至抑至抑4.0)時，各種雜蛋白因溶解度降低而沉淀，即主要變應原蛋白（例如狗 毛皮屑主要變應原蛋白Can fl)在浸提液中的比例提高。
[0058] 在一個優(yōu)選的實施方案中，在所述步驟3)中使用酸性化合物（選自但不限于巧樣 酸、鹽酸、硫酸、磯酸、己酸）將粗浸提液抑調節(jié)至抑3. 0?5. 0 (更佳至抑3. 0?4. 5,再 佳至抑3. 5?4. 5,最佳至抑4. 0)，靜置12?72小時（優(yōu)選24?60小時，更優(yōu)選的48? 60小時），靜置后使用離也過濾或濾膜過濾將沉淀去除。其中，若過濾步驟使用濾膜過濾， 則可W依次按孔徑從大到小的順序使用濾膜進行過濾，直至濾過順暢。優(yōu)選地，可W依次選 用孔徑為3]im、0. 8]im、0. 45]im、0. 22]im的濾膜進行過濾。若過濾步驟使用離也過濾，貝U W轉速10000?1300化pm離也（優(yōu)選在2?8°C條件下進行離也）5?30分鐘，棄沉淀，離 也可重復2?5次。
[0059] 在一個優(yōu)選的實施方案中，在低溫條件下（優(yōu)選2?8C )使用酸性化合物（選 自但不限于巧樣酸、鹽酸、硫酸、磯酸、己酸）將粗浸提液抑調節(jié)至抑3. 0?5. 0 (更佳至 P冊.0?4. 5,再佳至抑3. 5?4. 5,最佳至抑4. 0)。
[0060] 在一個具體的實施方案中，2?8C條件下，用巧樣酸將粗浸提液抑調節(jié)至 P冊.0?5. 0 (優(yōu)選抑3. 0?4. 5,進一步優(yōu)選抑3. 5?4. 5,最優(yōu)選抑4. 0)，靜置12?72 小時（優(yōu)選24?60小時，更優(yōu)選的48?60小時），然后依次按孔徑從大到小的順序使用 3]im、0. 8]im、0. 45]im、0. 22]im濾膜進行過濾，直至濾過順暢，去除沉淀。
[0061] 在另一個具體的實施方案中，用己酸將粗浸提液抑調節(jié)至抑3. 0?5. 0 (優(yōu)選 P冊.0?4. 5,進一步優(yōu)選抑3. 5?4. 5,最優(yōu)選抑4. 0)，靜置12?72小時（優(yōu)選24?60 小時，更優(yōu)選的48?60小時），然后在轉速10000?1300化pm離也（優(yōu)選在2?8°C條件 下進行離也）5?30分鐘，棄沉淀，離也可重復2?5次。
[0062] 本發(fā)明所述步驟4)的濃縮是為了將步驟3)得到的濾液濃縮至原體積的1/10? 1/150,進一步提高變應原蛋白的濃度。濃縮方法選自超濾或透析，可W選擇截留孔徑為 3?20kD (優(yōu)選的為3?lOkD，更優(yōu)選的為5kD)的超濾膜或透析膜進行濃縮。在一個優(yōu)選 的實施方案中，所述步驟4)將步驟3)得到的濾液濃縮至原體積的1/40?1/100。
[0063] 在一個優(yōu)選的實施方案中，在所述步驟4)的濃縮（超濾或透析）過程中可W進行 緩沖液的替換，即將浸提時的緩沖液替換成其他的緩沖體系。此處，更換緩沖體系可W使狗 毛皮屑變應原浸提液更加穩(wěn)定。同時，利用換液的過程，可W部分除去浸提液中可能存在的 色素等無變應原活性成分。
[0064] 在一個優(yōu)選的實施方案中，在所述步驟4)中，濃縮時使用抑5. 0?7. 0的緩沖液 更換緩沖體系。所述P冊.0?7.0的緩沖液選自；甘氨酸-鹽酸緩沖液、磯酸氨二軸-巧樣 酸緩沖液、巧樣酸-氨氧化軸-鹽酸緩沖液、巧樣酸-巧樣酸軸緩沖液、己酸-己酸軸緩沖 液、己酸-邸TA緩沖液、磯酸氨二軸-磯酸二氨軸緩沖液、磯酸氨二軸-磯酸二氨鐘緩沖液、 磯酸二氨鐘-氨氧化軸緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液、測砂-鹽酸緩沖液、測酸-測砂緩沖液、 甘氨酸-氨氧化軸緩沖液、測砂-氨氧化軸緩沖液、碳酸軸-碳酸氨軸緩沖液、碳酸軸-氨 氧化軸緩沖液、磯酸氨二軸-氨氧化軸緩沖液、氯化鐘-鹽酸緩沖液、氯化鐘-氨氧化軸緩 沖液。
[0065] 在一個更加優(yōu)選的實施方案中，在所述步驟4)濃縮時，使用抑5. 5?6. 5的緩沖 液更換緩沖體系。在另一個更加優(yōu)選的實施方案中，在所述步驟4)濃縮時，使用的緩沖液 選自；P冊.0的己酸-己酸軸緩沖液、P冊.5的己酸-EDTA緩沖液、P冊.0的磯酸氨二軸-巧 樣酸緩沖液、P冊.5的Tris-鹽酸緩沖液、pH7. 0的磯酸氨二軸-磯酸二氨軸緩沖液。
[0066] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述步驟4)的超濾可重復進行多次（更優(yōu)選進行2? 5次）。多次進行超濾可W更好地去除雜質，更好地濃縮浸提液，并且更充分地替換緩沖體 系。
[0067] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述步驟5)加入的藥學上可接受的載體選自但不 限于；多元醇、藥用防腐劑、氨基己酸或其組合。其中，所述的多元醇選自但不限于；丙二 醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、聚己二醇，多元醇濃度范圍在40%?60% v/v，更優(yōu)選的為 45%?55% v/v的甘油。所述的藥用防腐劑選自但不限于：苯酷、硫柳隸、苯甲酸、山梨 酸、山梨酸鹽類、對輕基苯甲酸醋類、苯甲醇、苯己醇或其組合，所述藥用防腐劑濃度范圍在 0. 1 %?3% w/v，更優(yōu)選的為化1 %?0. 5% w/v的苯酷。所述的氨基己酸的濃度范圍在 0. 1%?2.0%w/v，優(yōu)選的氨基己酸濃度范圍在0.3%?1.0%w/v，更優(yōu)選的氨基己酸濃度 為0. 65% w/v。加入多元醇、藥用防腐劑、氨基己酸或其組合，有利于液體藥物組合物的穩(wěn) 定性。
[0068] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述步驟6)使用的濾膜選自孔徑為3 ym、0. 8 ym、 0. 45 y m、0. 22 y m的濾膜或其組合。若使用不同孔徑濾膜組合，則按照孔徑由大至小的順序 原則進行使用。過濾除菌可有效地去除液體藥物組合物中的細菌，有利于更長時間的保存。
[0069] 利用本發(fā)明所述的方法獲得的狗毛皮屑變應原，主要變應原蛋白（Can fl)占總蛋 白的比例較現(xiàn)有方法有顯著提高。所提取的狗毛皮屑變應原可W用于制備含有狗毛皮屑變 應原的藥物組合物，W用于診斷或治療由狗毛皮屑變應原引起的過敏性疾病。
[0070] 下面將結合實施例進一步詳細地描述本發(fā)明。然而應當理解，列舉該些實施例只 是為了起說明作用，而并不是用來限制本發(fā)明的范圍。
[0071] 實施例1不同pH值的酸性化合物沉淀狗毛皮屑變應原粗浸提液的效果比較
[0072] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用酸性化合物將狗毛皮屑變應原粗浸提液的抑調至抑3. 0? 5. 0 (優(yōu)選抑3. 5?4. 5,更優(yōu)選抑4. 0)時，各種雜蛋白的溶解度降低而沉淀，即主要變應原 蛋白（例如Can fl)的比例提高。本試驗分別選擇將狗毛皮屑的粗浸提液抑調節(jié)至抑3.0， P冊.5, pH4. 0, pH4. 5, P冊.0。
[0073] 狗毛皮屑變應原浸提的具體步驟如下：
[0074] 1、取中華田園犬毛皮屑原材料2?3kg，按質量體積比（w/v)l : 20加入丙麗，連 續(xù)攬拌脫脂2小時，過濾，回收固體物，棄丙麗溶液，重復該過程3次，將脫脂后的原材料轉 移到干凈巧盤中，平鋪成薄層，室溫（18?25C )干燥36?48小時。
[00巧]2、取脫脂干燥后原材料2?3kg，按質量體積比（w/v) 1 : 20加入含1. 0%化C1的 50mM的磯酸氨二軸-磯酸二氨軸緩沖液（P服.2)，在2?8C下，連續(xù)浸提48?60小時，除 去固體顆粒后，即得狗毛皮屑變應原粗浸提液。
[0076] 3、使用巧樣酸分別調整粗浸提液至抑3. 0,抑3. 5, pH4. 0, pH4. 5, P冊.0, 2?8°C 下，靜置48小時，依次使用0. 45 y m、0. 22 y m濾孔濾膜過濾，去除沉淀物。
[0077] 使用化an壯ord蛋白濃度測定法測定總蛋白濃度，使用酶聯(lián)免疫吸附巧LISA)方 法測定狗毛皮屑主要變應原蛋白（Can fl)的濃度，其中，化an壯ord蛋白濃度測定法W及 ELISA法均是該領域技術人員所熟知的方法。具體結果見下表所示。
[0078]

【權利要求】
1. 一種提取狗毛皮屑變應原的方法，其特征在于，所述方法包含以下步驟： 1) 狗毛皮屑脫脂； 2) 使用緩沖有效量的pH7. 5?10. 0的浸提緩沖液進行浸提，收集粗浸提液； 3) 使用酸性化合物調節(jié)所述步驟2)得到的粗浸提液的pH至pH3. 0?5. 0,沉淀部分 非變應原的雜蛋白，并且過濾除去雜蛋白。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包含以下步驟： 1) 狗毛皮屑脫脂； 2) 使用緩沖有效量的pH7. 5?10. 0的浸提緩沖液進行浸提，收集粗浸提液； 3) 使用酸性化合物調節(jié)所述步驟2)得到的粗浸提液的pH至pH3. 0?5. 0,沉淀部分 非變應原的雜蛋白，并且過濾除去雜蛋白； 4) 將步驟3)得到的濾液濃縮至原體積的1/10?1/150 ; 5) 將步驟4)得到的濃縮液中加入藥學上可接受的載體； 6) 過濾除菌。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述狗毛皮屑的來源選自：中華田園 犬、邊境牧羊犬、德國牧羊犬、中國沙皮犬、阿拉斯加雪橇犬、薩摩耶、拉布拉多尋回犬。
4. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述步驟1)中，使用有機溶劑脫 月旨，并且脫脂后干燥。
5. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步驟2)的浸提緩沖液的pH為 pH8. 0 ?9. 0〇
6. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步驟3)的酸性化合物選自檸檬 酸、鹽酸、硫酸、磷酸、乙酸。
7. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述步驟3)中，使用酸性化合物調 節(jié)浸提液的pH至pH3. 0?4. 5。
8. 根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟5)的藥學上可接受的載體選自 多元醇、藥用防腐劑、氨基己酸或其組合。
9. 根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于，所述多元醇選自丙二醇、甘油、山梨糖醇、 甘露糖醇、聚乙二醇。
10. 根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于，所述藥用防腐劑選自苯酚、硫柳汞、苯甲 酸、山梨酸、山梨酸鹽類、對羥基苯甲酸酯類、苯甲醇、苯乙醇或其組合。
【文檔編號】A61K39/35GK104447943SQ201410719331
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月21日 優(yōu)先權日:2014年11月21日
【發(fā)明者】李勤 申請人:浙江我武生物科技股份有限公司