專利名稱：一種調(diào)控小鼠孤兒核受體的啟動子及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體的涉及一種啟動子及其用途。本發(fā)明特別涉及調(diào)控小鼠基因mLRH-1胚胎發(fā)育過程中高表達(dá)的啟動子P2及其在轉(zhuǎn)基因動物研究中的用途和其選擇性調(diào)節(jié)外源基因在胚胎發(fā)育早期高表達(dá)的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小鼠孤兒核受體mLRH-1(mouse liver receptor homolog 1)在成體中主要的表達(dá)器官是胰腺、肝臟、小腸和卵巢。mLRH-1在上述組織中對多個(gè)基因的表達(dá)有重要的調(diào)控作用，廣泛地參與了體內(nèi)膽汁酸循環(huán)和膽固醇平衡的調(diào)節(jié)。另一方面，mLRH-1剔除(knock-out)的小鼠在胚胎發(fā)育的早期就致死，早于胰腺、肝臟等組織的分化，表明mLRH-1在胚胎發(fā)育的早期起了非常重要的作用。
已有的研究顯示mLRH-1基因由9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子組成。mLRH-1在成體肝臟中的表達(dá)受到第一外顯子上游的啟動子P1(發(fā)明人以P1命名該啟動子以區(qū)別于P2)的調(diào)控。P1具有較強(qiáng)的肝特異的活性。尚無明確的實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示P1是否也調(diào)控mLRH-1在胚胎發(fā)育過程和其它組織中的表達(dá)。
小鼠胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cell，ES Cell)普遍應(yīng)用于基因的功能研究?？赏ㄟ^同源重組產(chǎn)生目的基因剔除的小鼠，觀察由于目的基因的缺失而引起的小鼠表型變化，推測該基因在體內(nèi)的生理功能。另一方面，ES細(xì)胞具有全能性，能根據(jù)環(huán)境因子的變化而定向分化，是體外研究早期發(fā)育和分化的優(yōu)良模型。
因此，本領(lǐng)域迫切需要確立新的能發(fā)揮調(diào)控mLRH-1表達(dá)的啟動子，而且該啟動子在胚胎期和成體中有不同的表達(dá)調(diào)控作用。然后利用該啟動子、或其表達(dá)載體在轉(zhuǎn)基因動物中既可以生產(chǎn)有用物質(zhì)，又可以進(jìn)一步研究目的基因在體內(nèi)特別是胚胎發(fā)育階段的生理功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種新的調(diào)控小鼠基因mLRH-1在胚胎發(fā)育過程中高表達(dá)的啟動子的序列。
本發(fā)明的另一目的就是提供含有所述啟動子序列的構(gòu)建物，載體，以及它們的用途。
本發(fā)明的另一目的就是提供一種利用所述啟動子在胚胎發(fā)育過程中高表達(dá)外源基因的方法。
本發(fā)明的第一方面提供了一種啟動子，其特征在于，它包括調(diào)控小鼠孤兒核受體(mLRH-1)在胚胎發(fā)育過程中高表達(dá)的啟動子的核苷酸序列。
在一優(yōu)選例中，所述的啟動子包括選自下述的核苷酸序列或具有功能活性的下述核苷酸序列的變體、同源物、片斷或衍生物1)SEQ ID NO1中975-1419位核苷酸；2)SEQ ID NO1中1-1419位核苷酸；在另一優(yōu)選例中，所述啟動子包括選自下述的核苷酸序列，且所述序列具有調(diào)控小鼠孤兒核受體(mLRH-1)在胚胎發(fā)育過程中高表達(dá)的啟動子活性1)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列有75％同源性的序列；2)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列有85％同源性的序列；3)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列有95％同源性的序列；在另一優(yōu)選例中，所述的啟動子具有選自下述的核苷酸序列或具有功能活性的下述核苷酸序列的變體、同源物、片斷或衍生物1) SEQ ID NO1中975-1419位核苷酸；2) SEQ ID NO1中1-1419位核苷酸；在另一優(yōu)選例中，所述的啟動子具有選自下述的核苷酸序列，且所述序列具有調(diào)控小鼠孤兒核受體(mLRH-1)在胚胎發(fā)育過程中高表達(dá)的啟動子活性1)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列有75％同源性的序列；2)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列有85％同源性的序列；3)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列有95％同源性的序列；本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于調(diào)控外源基因在胚胎發(fā)育過程中高表達(dá)的構(gòu)建物，所述構(gòu)建物含有外源基因以及該外源基因可操作地連接與本發(fā)明上述的啟動子。優(yōu)選的，所述的啟動子為包括選自下述的核苷酸序列或具有功能活性的下述核苷酸序列的變體、同源物、片斷或衍生物1)SEQ ID NO1中975-1419位核苷酸；2)SEQ ID NO1中1-1419位核苷酸；3)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列有75％同源性的序列；4)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列有85％同源性的序列；5)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列有95％同源性的序列；本發(fā)明的第三方面，提供了一種含有本發(fā)明上述核苷酸序列的載體。
本發(fā)明的第四方面，提供了含有本發(fā)明上述載體的宿主或宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的第五方面，提供了上述啟動子在轉(zhuǎn)基因動物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的第六方面，提供了上述啟動子選擇性調(diào)節(jié)外源基因在胚胎發(fā)育早期高表達(dá)的應(yīng)用。
本發(fā)明的第七方面，提供了一種在胚胎發(fā)育過程中高表達(dá)外源基因的方法，它包括以下步驟1)提供一構(gòu)建物，所述構(gòu)建物含有外源基因以及與該外源基因可操作地連接的權(quán)利要求1所述的啟動子；2)將步驟1)中的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主或宿主細(xì)胞，使其表達(dá)外源基因。
優(yōu)選的，所述啟動子為包括選自下述的核苷酸序列或具有功能活性的下述核苷酸序列的變體、同源物、片斷或衍生物1)SEQ ID NO1中975-1419位核苷酸；
2)SEQ ID NO1中1-1419位核苷酸；3)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列有75％同源性的序列；4)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列有85％同源性的序列；5)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列有95％同源性的序列；本發(fā)明還包括具有與SEQ ID NO1所示核苷酸序列75％、85％、90％、95％同源性的且具有相同調(diào)控功能活性的序列，可使用歐洲生物信息學(xué)研究所(EBI)提供的Clustal計(jì)算機(jī)程序測定序列同源性。還包括將SEQ ID NO1核苷酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)(如1-10個(gè))核苷酸的保守性取代、缺失、插入或添加而形成的，且具有相同調(diào)控活性功能的序列。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
在以下說明中所提到的“本發(fā)明的核苷酸序列”包括“本發(fā)明的啟動子”的含義，反之亦然。另外，術(shù)語“本發(fā)明的核苷酸序列”與“本發(fā)明的多核苷酸序列”“P2啟動子”“本發(fā)明啟動子”是同義詞，指具有P2啟動子序列(SEQ NO1)或其活性片段的多核苷酸序列。
本發(fā)明的功能活性是指本發(fā)明核苷酸序列的變體、同源物、片斷或衍生物具有調(diào)控小鼠基因mLRH-1在胚胎發(fā)育過程中高表達(dá)的啟動子活性。
有關(guān)本發(fā)明啟動子和/或核苷酸序列的其他方面包括含有本發(fā)明序列的結(jié)構(gòu)；含有本發(fā)明序列的載體；含有本發(fā)明序列的質(zhì)粒；含有本發(fā)明序列的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；含有本發(fā)明序列的轉(zhuǎn)化組織；含有本發(fā)明序列的轉(zhuǎn)化過的器官；含有本發(fā)明序列的轉(zhuǎn)化過的宿主；含有本發(fā)明序列的轉(zhuǎn)化過的動物。本發(fā)明還包括用所述啟動子表達(dá)產(chǎn)物的方法，如在宿主動物細(xì)胞中表達(dá)；包括轉(zhuǎn)移所述啟動子的方法。
“可操作連接”是指DNA序列上游的啟動子的連接，使得該啟動子介導(dǎo)該DNA序列的轉(zhuǎn)錄?？梢岳斫?，啟動子序列包括轉(zhuǎn)錄起始和翻譯起始、翻譯起始密碼子之間的轉(zhuǎn)錄序列。
“構(gòu)建物”是指能夠影響與核苷酸序列相容的宿主中結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的核苷酸序列。該構(gòu)建物至少包括啟動子，并任選地包括轉(zhuǎn)錄終止信號。正如本文所述，還可使用其它實(shí)現(xiàn)表達(dá)所必需的或有幫助的因子。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)(較佳的小于10個(gè))核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實(shí)質(zhì)上改變該啟動子的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上至P2啟動子全長。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離上述多聚核苷酸。
P2啟動子全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開P2啟動子的核苷酸序列來設(shè)計(jì)引物，并用小鼠基因組DNA或含小鼠染色體的人工染色體克隆作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到本發(fā)明啟動子(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該啟動子序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki，etal.Science 1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的啟動子。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明啟動子的構(gòu)建物或載體，以及用所述構(gòu)建物或載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生外源蛋白或功能性核酸的方法。
“外源”基因是指可操作地連接與本發(fā)明啟動子且其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)受到本發(fā)明啟動子調(diào)控的任何基因、基因片斷或具一定功能的多聚核苷酸。
“目的”基因是指實(shí)驗(yàn)者或生產(chǎn)者有意識的引入到某種載體中的基因或基因片斷，其目的是為了在宿主或宿主細(xì)胞中表達(dá)該基因從而來研究該基因的生物學(xué)功能或獲得有實(shí)用價(jià)值的該基因產(chǎn)物。
適用于本發(fā)明的外源基因沒有特別限制，幾乎所有的功能基因、功能基因片斷或多聚核苷酸都可用于本發(fā)明。由于基因突變造成某蛋白在胚胎時(shí)期表達(dá)不足或不表達(dá)所導(dǎo)致的遺傳病，可以從正常人細(xì)胞中分離得到有關(guān)基因，然后將其與本發(fā)明的啟動子元件相連，形成含外源基因的構(gòu)建物，然后將所述構(gòu)建物用于基因治療。
一種構(gòu)建物的例子就是與P2啟動子相連的外源基因。啟動子一般應(yīng)位于外源基因的上游。
本發(fā)明中，含P2啟動子的核苷酸序列可優(yōu)選地插入到載體，例如表達(dá)載體中。術(shù)語“載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于表達(dá)載體、克隆載體，例如適用于原核(如大腸桿菌等細(xì)菌)、低等真核細(xì)胞(如酵母)、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞中的載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。在表達(dá)載體中，除了含有復(fù)制起點(diǎn)、P2啟動子之外，還可含有標(biāo)記基因和其他翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含P2啟動子和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambrook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效地與待表達(dá)的外源基因相連接，以指導(dǎo)所述外源基因mRNA合成。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)外源蛋白質(zhì)或功能性核酸。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動物細(xì)胞等。
用重組DNA轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。一些采用的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染方法包括但并不限于磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多核苷酸序列來表達(dá)或生產(chǎn)外源蛋白。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明所述多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基、培養(yǎng)液中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基、培養(yǎng)液或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
具體而言，本發(fā)明的啟動子可通過將相應(yīng)的編碼序列引入宿主細(xì)胞(直接引入或通過引入含外源基因編碼序列的載體)，并在合適的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞以表達(dá)外源蛋白，然后分離和純化出外源蛋白。
在上面的方法中的外源蛋白可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
發(fā)明人采用RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)和5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)的方法確定了R1 ES細(xì)胞株中mLRH-1的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄子起始位點(diǎn)。利用PCR獲得了此轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1.4kb的序列(以P2命名，見圖6)。通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染和報(bào)告基因分析驗(yàn)證P2是否具有啟動子活性，結(jié)果顯示P2在R1 ES細(xì)胞株中具有很強(qiáng)的活性，而在成體細(xì)胞株中只有較弱的活性。對小鼠胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期的胚胎作RT-PCR檢測表明P2是調(diào)控mLRH-1在胚胎發(fā)育早期表達(dá)的啟動子。對此1.4kb的P2啟動子進(jìn)行缺失和細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分析確定了調(diào)控mLRH-1基因在胚胎發(fā)育早期高表達(dá)所必需的核心啟動子序列(見圖7)。


圖1.RT-PCR擴(kuò)增R1 ES細(xì)胞中mLRH-1瓊脂糖電泳結(jié)果。
1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2為Primer-a與Primer-5r引物配對；3為Primer-1與Primer-5r引物配對；2與3的模板為R1 ES細(xì)胞總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶處理后的產(chǎn)物；4為Primer-a與Primer-5r引物配對；5為Primer-1與Primer-5r引物配對；4與5的模板為R1 ES細(xì)胞總RNA未經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶處理。
圖2. 5’RACE inverse PCR的方法確定V2異構(gòu)體的5’末端。
1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2為5’RACE inverse PCR結(jié)果，經(jīng)測序，大分子量的條帶為小分子量條帶所代表的DNA的雙體。V2異構(gòu)體的5’末端位于mLRH-1基因內(nèi)含子1的6408A。
圖3.P2啟動子活性的細(xì)胞轉(zhuǎn)染和報(bào)告基因分析。
數(shù)據(jù)來自三次不同轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的平均值。負(fù)對照pGL3basic的值為1，其它轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中的報(bào)告基因激活活性以相對負(fù)對照的激活倍數(shù)表示。
圖4.RT-PCR檢測小鼠胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期的mLRH-1表達(dá)情況。
M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-8為Primer-1與Primer-5r配對檢測V1異構(gòu)體；9-16為Primer-a與Primer-5r配對檢測V2異構(gòu)體；17-24為HPRT對照；1，9，17分別為水對照；2，10，18為胚胎發(fā)育5.5天；3，11，19為胚胎發(fā)育6.5天；4，12，20為胚胎發(fā)育7.5天；5，13，21為胚胎發(fā)育8.5天；6，14，22為胚胎發(fā)育9.5天；7，15，23為胚胎發(fā)育10.5天；8，16，24為胚胎發(fā)育11.5天。
圖5調(diào)控mLRH-1基因在胚胎發(fā)育早期高表達(dá)所必需的P2核心啟動子的確定。
將不同長度的P2啟動子構(gòu)建物分別轉(zhuǎn)染R1 ES細(xì)胞株和Y1細(xì)胞株。數(shù)據(jù)來自至少三次不同轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的平均值。負(fù)對照的值為1，其它轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中的報(bào)告基因活性以相對負(fù)對照的激活倍數(shù)表示。
圖6 P2的完整序列(1419bp)圖7 調(diào)控mLRH-1基因在胚胎發(fā)育早期高表達(dá)所必需的P2核心啟動子序列(445bp)具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1確定R1 ES細(xì)胞株中mLRH-1的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄子起始位點(diǎn)以已知的mLRH-1 cDNA(簡稱V1)檢索EST(expressed sequence tag)數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)一條EST(GI16486133)與V1在5’末端不相同。在該EST中，V1中的第一外顯子被一段未知序列所取代。進(jìn)一步將此未知序列檢索小鼠基因組數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)該序列位于mLRH-1基因的第一內(nèi)含子中。因此，該EST所代表的產(chǎn)物是mLRH-1的一個(gè)異構(gòu)體(簡稱V2)。根據(jù)V2 5’末端序列合成正向引物Primer-a(表1)，與第五外顯子內(nèi)的反向引物Primer-5r(表1)配對，以R1 ES細(xì)胞總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，可擴(kuò)增出491bp的明顯條帶，而根據(jù)V1異構(gòu)體中包含的第一外顯子序列合成的正向引物Primer-1(表1)，與Primer-5r配對，卻不能獲得擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。顯示R1 ES細(xì)胞中只存在這種新的異構(gòu)體V2，而不存在V1形式。
根據(jù)V2異構(gòu)體的5’端序列設(shè)計(jì)反向引物Primer-br和Primer-cr(表1)，與位于第二、三外顯子的正向引物Primer-2和Primer-3(表1)分別配對，利用5’RACE inverse PCR和測序確定了V2異構(gòu)體的5’末端(圖2)。

表1實(shí)施例2擴(kuò)增和克隆轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1.4kb的P2序列根據(jù)mLRH-1的全基因組序列和實(shí)施例1中所確定的V2異構(gòu)體的5’末端，設(shè)計(jì)正向引物Primer-d，與反向引物Primer-cr配對(表1)，以小鼠的基因組DNA為模板，擴(kuò)增得到V2異構(gòu)體5’末端上游約1.6kb的基因組序列。此片斷經(jīng)KpnI和XhoI酶解后，約1.4kb的片斷(簡稱P2)插入熒光素報(bào)告基因載體pGL3basic(Promega)的KpnI和XhoI位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pV2Pro1.4k。pV2Pro1.4k經(jīng)HindIII酶切后得到約325bp的片斷，插入pGL3basic的HindIII位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pV2Pro0.3k。
實(shí)施例3P2啟動子活性的細(xì)胞轉(zhuǎn)染和報(bào)告基因分析將pV2Pro1.4k、pV2Pro0.3k和負(fù)對照pGL3basic分別轉(zhuǎn)染R1 ES細(xì)胞株、Y1小鼠腎上腺細(xì)胞株和Huh7人肝細(xì)胞株，以檢驗(yàn)不同長度的V2異構(gòu)體5’端上游序列的啟動子活性。在Y1和Huh7細(xì)胞中，pV2Pro1.4k和pV2Pro0.3k的報(bào)告基因活性相近，相對于負(fù)對照都有約6-12倍的激活。而在R1 ES細(xì)胞中，pV2Pro0.3k的報(bào)告基因活性與在Y1和Huh7細(xì)胞中類似，但pV2Pro1.4k卻有很強(qiáng)的報(bào)告基因活性，相對于負(fù)對照有約150倍的激活(圖3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，P2啟動子在作為早期發(fā)育體外模型的小鼠胚胎干細(xì)胞中具有很強(qiáng)的活性，而在成體細(xì)胞株中只具有相對較弱的活性，它可能是調(diào)控mLRH-1基因在胚胎發(fā)育早期表達(dá)的啟動子。
實(shí)施例4P2是調(diào)控mLRH-1基因在胚胎發(fā)育早期表達(dá)的啟動子對小鼠胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期的胚胎作RT-PCR檢測表明胚胎發(fā)育早期只存在V2形式的異構(gòu)體，而V1異構(gòu)體最早出現(xiàn)在胚胎發(fā)育的10.5天(圖4)。結(jié)合實(shí)施例3的結(jié)果進(jìn)一步顯示P2啟動子是調(diào)控mLRH-1基因在胚胎發(fā)育早期表達(dá)的啟動子。
實(shí)施例5調(diào)控mLRH-1基因在胚胎發(fā)育早期高表達(dá)所必需的P2核心啟動子的確定為了確定調(diào)控mLRH-1基因在胚胎發(fā)育早期高表達(dá)所必需的P2核心啟動子，將1.4kb的P2啟動子做了5’端缺失分析。將不同長度的P2啟動子構(gòu)建物分別轉(zhuǎn)染R1 ES細(xì)胞株和Y1細(xì)胞株，在Y1細(xì)胞中，不同長度的P2缺失構(gòu)建物活性非常相近，而在R1 ES細(xì)胞中，0.7k和0.4k的P2啟動子與1.4k的P2啟動子的活性接近，都明顯高于0.3k的P2啟動子活性(圖5)。由此可以確定調(diào)控mLRH-1基因在胚胎發(fā)育早期高表達(dá)所必需的P2核心啟動子為3’端0.4k的序列。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>調(diào)控小鼠孤兒核受體的啟動子及其用途<130>031107<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1419<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>啟動子核心區(qū)域<222>(975)..(1319)<223>
<400>1ggtacccatg ctcagggctg tcactactat aagccataag cctagggttc cacattgcct 60ttttacagac agaggattca attaccttta caagagcatc gacattattg cctataagcc 120aatcactgat ttacctgaag tgtaaggtaa tctcaaagta gagtctcttc tgagaaaggt 180tctcagatct tagcagcgga atttttaaaa accttataag gacccggcag tggcagcata 240cacctttaat cccagggctc tggtggcaga ggcaggtgga tctctgtaaa ttctaggcca 300gcctggtcta cagagcaatc tctaggacag ccaaggctgc acagtgaaag caagaaaaga 360aaaagaaaaa gacaccccgc ccccacacac agaagaagtc ttagctcaat tacttctcat 420tgaagtttag ccctaaagga ccatttctag cctagattaa aaccaggtgg gtttatagag 480gagagagata ttaggtgttg cctagtttgt tttaccacag acctcttggc caactggctc 540ctggactgtc ttgggcctgt cagtgctttg tggtgtttgg tctggtctac taagcccagg 600taactttcca actccgaggc tttgtagacc agatctcctt tgaagatccc aggctcccaa 660
ggcagggcga gcttgaactc ggtattgaag aaagttccca atgatgtaat tttaaagata 720aagagcctta aattccaaaa acagaggtcc aaaactccct cctttctttc agggtgaggg 780tggaggactc cagcagtata gagagggaag tggggattgc cctggcatat tttccccagg 840cataaagccc aggatggggt atttattagg acactctttt agggtattga aaatctgcag 900gtttgcccca attcgggatt ggcagcccgc cctctcacgg aagcggagga tgtccccacc 960cccaccccct gcagctgcct acagtgctta tttgaaacaa tcaatacaaa gagaattttt 1020tttaagtttt tttttttttt tttttttttt aaccagggaa gatcactggc tttaagttcg 1080tgttttgttt tgcaaagctt ggtctacaag gtgcgctgaa gttttgtctt tagaaaccgg 1140gctgttcttt ttaaaacaaa gcgctccggg tgagggcgtg gagcccagga aggaggtggg 1200ggggagggcc agaacccacc cagtaggcaa aacgcattat tggctcaact gagttttgca 1260gcttcacctg atggaatgtt caagtgggag gggtggaaaa attagggaag tcagagcttc 1320agagttgata aattcgtttc tcttttccct tgggctgtca cttcccttca ggggaagaat 1380actttaaaac agagatctag gactcttccc gggcttcag 1419<210>2<211>24<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(24)<223>引物-a<400>2tctaggactc ttcccgggct tcag 24<210>3
<211>25<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(25)<223>引物-5r<400>3agtagggaca tcgttttctc tgcgt 25<210>4<211>24<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(24)<223>引物-1<400>4atgtctgcta gtttggatac tgga 24<210>5<211>24<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(24)<223>引物-br<400>5gatactacgt tctgaagccc ggga 24
<210>6<211>29<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(29)<223>引物-cr<400>6accactcgag ctgaagcccg ggaagagtc29<210>7<211>19<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(19)<223>引物-2<400>7gcgtctgcac cagggtcag 19<210>8<211>19<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(19)<223>引物-3<400>8gctgggcttc cggaccgac19
<210>9<211>23<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(23)<223>引物-d<400>9tgttttgcct gcttgtctgc ctg 2權(quán)利要求
1.一種啟動子，其特征在于，它包括調(diào)控小鼠孤兒核受體(mLRH-1)在胚胎發(fā)育過程中高表達(dá)的啟動子的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的啟動子，其特征在于，包括選自下述的核苷酸序列或具有功能活性的下述核苷酸序列的變體、同源物、片斷或衍生物1)SEQ ID NO1中975-1419位核苷酸；2)SEQ ID NO1中1-1419位核苷酸。
3.如權(quán)利要求1所述的啟動子，其特征在于，包括選自下述的核苷酸序列，且所述序列具有調(diào)控小鼠孤兒核受體(mLRH-1)在胚胎發(fā)育過程中高表達(dá)的啟動子活性1)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列有75％同源性的序列；2)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列有85％同源性的序列；3)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列有95％同源性的序列。
4.如權(quán)利要求2所述的啟動子，其特征在于，具有選自下述的核苷酸序列或具有功能活性的下述核苷酸序列的變體、同源物、片斷或衍生物1)SEQ ID NO1中975-1419位核苷酸；2)SEQ ID NO1中1-1419位核苷酸。
5.如權(quán)利要求2所述的啟動子，其特征在于，具有選自下述的核苷酸序列，且所述序列具有調(diào)控小鼠孤兒核受體(mLRH-1)在胚胎發(fā)育過程中高表達(dá)的啟動子活性1)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列有75％同源性的序列；2)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列有85％同源性的序列；3)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列有95％同源性的序列。
6.一種用于調(diào)控外源基因在胚胎發(fā)育過程中高表達(dá)的構(gòu)建物，其特征在于，所述構(gòu)建物含有外源基因以及該外源基因可操作地連接與權(quán)利要求1所述的啟動子。
7.權(quán)利要求6所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述的啟動子為包括選自下述的核苷酸序列或具有功能活性的下述核苷酸序列的變體、同源物、片斷或衍生物1)SEQ ID NO1中975-1419位核苷酸；2)SEQ ID NO1中1-1419位核苷酸。
8.一種含有權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的核苷酸序列的載體。
9.一種含有權(quán)利要求8所述載體的宿主或宿主細(xì)胞。
10.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述啟動子在轉(zhuǎn)基因動物中的應(yīng)用。
11.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述啟動子選擇性調(diào)節(jié)外源基因在胚胎發(fā)育早期高表達(dá)的應(yīng)用。
12.一種在胚胎發(fā)育過程中高表達(dá)外源基因的方法，它包括以下步驟1)提供一構(gòu)建物，所述構(gòu)建物含有外源基因以及與該外源基因可操作地連接的權(quán)利要求1所述的啟動子；2)將步驟1)中的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主或宿主細(xì)胞，使其表達(dá)外源基因。
13.權(quán)利要求12所述的啟動子為包括選自下述的核苷酸序列或具有功能活性的下述核苷酸序列的變體、同源物、片斷或衍生物1)SEQ ID NO1中975-1419位核苷酸；2)SEQ ID NO1中1-1419位核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個(gè)調(diào)控小鼠基因mLRH－1(mouse liver receptor homolog 1)在胚胎發(fā)育過程中高表達(dá)的啟動子P2的核苷酸序列及其用途。此啟動子在作為早期發(fā)育體外模型的小鼠胚胎干細(xì)胞中具有很強(qiáng)的活性，而在成體細(xì)胞株中只具有相對較弱的活性。P2啟動子的發(fā)現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因動物研究和應(yīng)用領(lǐng)域中選擇性地調(diào)節(jié)異源基因或目的基因在胚胎發(fā)育早期高表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/63GK1616660SQ20031010863
公開日2005年5月18日 申請日期2003年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月14日
發(fā)明者謝幼華, 汪垣, 高大明, 孔玉英 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院