專利名稱：血管緊張素ii 2型受體基因與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地涉及人血管緊張素II2型受體基因(Angiotensin II type 2 receptor gene，AT2R)的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotide polymorphism，SNP)及其與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性。本發(fā)明還涉及檢測(cè)這些SNP的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EH)是最常見的心血管疾病，其發(fā)病率逐年上升，并可引起嚴(yán)重的心、腦、腎并發(fā)癥，是腦卒中和冠心病的主要危險(xiǎn)因素。EH是一種由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用而發(fā)病的多基因病，尋找EH相關(guān)基因進(jìn)而闡明高血壓發(fā)病的遺傳機(jī)制已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)(HarrapSB.Hypertensiongenes versus environment.Lancet，1994，344169-171)。
腎素-血管緊張素(RAS)系統(tǒng)是體內(nèi)調(diào)節(jié)血壓和水鹽代謝的重要系統(tǒng)。血管緊張素II(AngII)作為系統(tǒng)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，主要通過兩種受體，即1型受體(AT1R)和2型受體(AT2R)來發(fā)揮作用(Clin AT，Herblin WF，McCall DE etal.Identification of angiotensin II receptor subtypes.Biochem BiophysRes Commun.1989；165196-203)。研究表明AT1R能介導(dǎo)AngII的血管收縮、醛固酮分泌、鈉吸收和血管細(xì)胞增生等功能。(Timmermans PB，Wong PC，ChiuAT et al.Angiotensin II receptors and angiotensin II receptorantagonists.Pharmacol Rev 1993；45205-51)，而AT2R能拮抗這些功能發(fā)揮保護(hù)作用(Carey RM，Wang ZQ，Siragy HM.Role of the Angiotensin type2 receptor in the regulation of blood pressure and renal function.Hypertension 2000；35[part2]155-163；Carey RM，Howell NL，Jin XH，Siragy HM. Angiotensin type 2 receptor-mediated hypotension inangiotensin type-1 receptor-blocked rats.Hypertension 2002；39(5)E27-28)。雖然已有許多關(guān)于RAS系統(tǒng)基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的研究，但沒有證實(shí)AT2R基因與原發(fā)性高血壓相關(guān)性的報(bào)道，更沒有證實(shí)AT2R基因的SNP與原發(fā)性高血壓相關(guān)性的報(bào)道。
綜上所述，為了最終實(shí)現(xiàn)治療高血壓，本領(lǐng)域迫切需要尋找原發(fā)性高血壓易感基因，并開發(fā)檢測(cè)原發(fā)性高血壓的方法、試劑盒，以及相關(guān)的治療藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種診斷(尤其是早期診斷)高血壓等高血壓的方法及檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明的另一目的是提供一種新的治療高血壓的方法。
本發(fā)明的再一目的是提供一種治療高血壓等高血壓的藥物組合物。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種對(duì)個(gè)體的高血壓易感性進(jìn)行診斷的方法，它包括步驟檢測(cè)該個(gè)體的AT2R基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的AT2R基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個(gè)體患高血壓的可能性高于正常人群。
在另一優(yōu)選例中，所述的方法中檢測(cè)的是AT2R的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常AT2R核苷酸序列比較差異。
在另一優(yōu)選例中，所述的差異是選自下組的單核苷酸多態(tài)性362位G→A；438位T→C；1334位T→C；1675位A→G；3066位C→T；3697位T→C；4297位G→T；4303位G→A；4599位C→A；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO17。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測(cè)樣品是否存在AT2R基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，包括步驟(a)用AT2R基因特異性引物擴(kuò)增樣品的AT2R基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；和(b)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在選自下組的單核苷酸多態(tài)性362位G→A；
438位T→C；1334位T→C；3066位C→T；4599位C→A；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO17。
在另一優(yōu)選例中，所述的單核苷酸多態(tài)性是1334位T→C。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的AT2R蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種檢測(cè)高血壓的試劑盒，它包括特異性擴(kuò)增AT2R基因或轉(zhuǎn)錄本的引物。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有選自下組的試劑(a)與突變部位結(jié)合的探針；(b)識(shí)別突變位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶。
在另一優(yōu)選例中，所述的突變選自以下單核苷酸多態(tài)性362位G→A；438位T→C；1334位T→C；1675位A→G；3066位C→T；3697位T→C；4297位G→T；4303位G→A；4599位C→A；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO17。
在另一優(yōu)選例中，所述的單核苷酸多態(tài)性是1334位T→C。


圖1顯示了AT2R的一種SNP圖像(以SNP03為例)的測(cè)序結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過多年研究，首次發(fā)現(xiàn)和證明了AT2R基因與高血壓密切相關(guān)，而且發(fā)現(xiàn)了它的新功能AT2R的改變將導(dǎo)致高血壓，其中關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，在AT2R第1334位的SNP03(T/C)在病例和對(duì)照組中的分布存在顯著性差異(P＜0.05)，該SNP多態(tài)可改變轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
AT2R基因的詳細(xì)序列可參見登錄號(hào)為U208605的核苷酸序列(可參見網(wǎng)址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，全長是5293bp(SEQ ID NO17)。
本發(fā)明人對(duì)AT2R基因中的2938bp區(qū)域進(jìn)行了測(cè)序，包括其中啟動(dòng)子區(qū)為1501bp，5’UTR為160bp，編碼區(qū)為1092bp，內(nèi)含子為152bp，3’UTR為33bp。
基于本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，AT2R蛋白或多肽有多方面的新用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療AT2R蛋白功能低下或喪失所致的疾病(如高血壓)，和用于篩選促進(jìn)AT2R蛋白功能的物質(zhì)，如抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組人AT2R蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價(jià)值的能刺激人AT2R蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)人AT2R DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人AT2R基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人AT2R基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人AT2R蛋白的分子，也包括那些并不影響人AT2R蛋白功能的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人AT2R基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人AT2R蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人AT2R蛋白功能的抗體以及不影響人AT2R蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人AT2R基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人AT2R基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
抗人AT2R蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測(cè)活檢標(biāo)本中的人AT2R蛋白。一種優(yōu)選的抗AT2R抗體是不識(shí)別正常AT2R但識(shí)別突變AT2R的抗體，或者識(shí)別正常AT2R但不識(shí)別突變AT2R的抗體。利用該抗體對(duì)正常和異常AT2R蛋白的特異性差異，可以方便地進(jìn)行蛋白質(zhì)水平的高血壓易感性檢測(cè)。
利用本發(fā)明AT2R蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與AT2R蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如抑制劑、激動(dòng)劑或拮抗劑等。
本發(fā)明AT2R蛋白及其抗體、抑制劑、激動(dòng)劑、拮抗劑等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、或皮下給藥。
正常的AT2R多肽可直接用于疾病治療，例如，用于高血壓治療。在使用本發(fā)明AT2R蛋白時(shí)，還可同時(shí)使用其他治療高血壓的藥劑。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明AT2R蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約0.1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的AT2R蛋白或其拮抗劑、激動(dòng)劑施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約0.1微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0.1微克/千克體重-約100微克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
人AT2R蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于AT2R蛋白的無表達(dá)或異常/無活性的AT2R蛋白的表達(dá)所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。構(gòu)建攜帶AT2R基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(xiàn)(Sambrook，et al.)。另外重組人AT2R基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測(cè)人AT2R蛋白水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測(cè)定和放射免疫測(cè)定。
一種檢測(cè)檢測(cè)樣品中是否存在AT2R蛋白的方法是利用AT2R蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，它包括將樣品與AT2R蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在AT2R蛋白。
AT2R蛋白的多聚核苷酸可用于AT2R蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，AT2R蛋白的多聚核苷酸可用于檢測(cè)AT2R蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下AT2R蛋白的異常表達(dá)。如AT2R DNA序列可用于對(duì)活檢標(biāo)本的雜交以判斷AT2R蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用AT2R蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測(cè)AT2R蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測(cè)AT2R基因的突變也可用于診斷高血壓。檢測(cè)可以針對(duì)cDNA，也可針對(duì)基因組DNA。AT2R蛋白突變的形式包括與正常野生型AT2R DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。一類優(yōu)選的突變是表2所示的SNP?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測(cè)突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1
1對(duì)象與方法1.1研究對(duì)象1.1.1中國人SNP發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)樣本樣本為來自19個(gè)核心漢族高血壓家系、無親緣關(guān)系的19例原發(fā)性高血壓病人。
1.1.2 SNP分型和關(guān)聯(lián)分析初步研究樣本所有受試者均為漢族。原發(fā)性高血壓組(EH組)和正常血壓組(NT組)各96例，均來自中國上海地區(qū)，彼此無親緣關(guān)系。EH組是上海市瑞金醫(yī)院高血壓科門診確診或在上海地區(qū)普查中確診的高血壓病患者，其中男46例、女50例，平均年齡49.7±7.13歲，入選標(biāo)準(zhǔn)為(1)收縮壓＞150mmHg和/或舒張壓＞95mmHg(即除外臨界高血壓患者)，或正在接受抗高血壓藥物治療一年以上；(2)在20歲之前或60歲以后發(fā)病者除外；(3)臨床上除外繼發(fā)性高血壓。NT組為40歲以上居民，其中男47例、女49例，平均年齡49.4±5.30歲，收縮壓＜140mmHg，且舒張壓＜90mmHg。無高血壓家族史，排除肝、腎、甲狀腺、糖尿病史。EH組和NT組在年齡、性別構(gòu)成上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。
1.1.3 SNP分型和關(guān)聯(lián)分析擴(kuò)大研究樣本對(duì)于在上述初步研究中得到的陽性結(jié)果，擴(kuò)大樣本量后(EH組和NT組各250例)進(jìn)一步驗(yàn)證。EH組男137例、女113例，平均年齡57.03±12.09歲。NT組男126例，女124例，平均年齡49.94±5.47歲。EH組和NT組在性別構(gòu)成上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。
1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 DNA提取常規(guī)酚-氯仿法提取外周血白細(xì)胞DNA，并標(biāo)化DNA濃度值至20ng/μl。
1.2.2 PCR及測(cè)序引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中AT2R的基因組序列，應(yīng)用prime3軟件(美國麻省理工生物醫(yī)學(xué)白頭研究所，http//www-gonome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi)設(shè)計(jì)引物。具體引物如下表1所示。
表1引物序列表

1.2.3 AT2R基因的調(diào)控區(qū)和編碼區(qū)分段體外擴(kuò)增以提取的DNA為模板，用Taq酶，在GeneAmp 9700 PCR儀上以Touchdown程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2分鐘，94℃變性30秒，63℃退火40秒，72℃延伸40秒，共10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度遞減0.5℃；以后94℃變性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸40秒，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。
1.2.4 SNP的發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)PCR產(chǎn)物經(jīng)Resin樹脂純化后，用ABI-PRISMTM377 DNA測(cè)序儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司appliedbiosystems(ABI))進(jìn)行熒光標(biāo)記末端終止法雙向測(cè)序，用Polyphred軟件(美國華盛頓大學(xué)http//droog.mbt.washington.edu/Polyphred.html)進(jìn)行序列的判讀和SNP確認(rèn)。
1.2.5 SNP基因分型和關(guān)聯(lián)分析用直接單向測(cè)序法進(jìn)行SNP基因分型。選擇啟動(dòng)子區(qū)、第1內(nèi)含子區(qū)和外顯子區(qū)的高頻SNP進(jìn)行初步分型，即在96個(gè)高血壓病人和96正常血壓對(duì)照組中進(jìn)行分型和關(guān)聯(lián)分析，有陽性意義的位點(diǎn)再在250個(gè)高血壓病人和250個(gè)正常血壓對(duì)照組中進(jìn)行分型和關(guān)聯(lián)分析。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SNPs各基因型在病人和正常血壓對(duì)照中分布的比較采用R×C表x2檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。
2.結(jié)果2.1 AT2R基因SNP的發(fā)現(xiàn)和分布AT2R的基因共有3個(gè)外顯子，測(cè)序總長度是2938bp，共發(fā)現(xiàn)9個(gè)SNP，包括啟動(dòng)子區(qū)3個(gè)，編碼區(qū)2個(gè)，3′非編碼區(qū)3個(gè)，內(nèi)含子1個(gè)，其中5個(gè)是新發(fā)現(xiàn)的SNP。AT2R基因SNP分布情況見表2。測(cè)序確認(rèn)雜合子圖像見圖1。
表2中國人AT2R基因SNP的種類及其分布

說明(1)表中第一列為SNP的名稱；第二列為SNP在AT2R基因序列中的位置；第三列為SNP所屬基因區(qū)域，Promoter為啟動(dòng)子區(qū)，Exon為外顯子區(qū)，Intron為內(nèi)含子區(qū)，3′UTR為3′末端非翻譯序列；第四列為在等位基因中SNP的兩個(gè)堿基；第五列為測(cè)序所用引物。
(2)SNP01，SNP02，SNP03(圖1)，SNP05，SNP09為新發(fā)現(xiàn)的SNP。
(3)在基因序列中的位置以SEQ ID NO17的序列為標(biāo)準(zhǔn)序列。
2.2 SNP位點(diǎn)的基因分型在各為96例的EH組和NT組中，對(duì)3個(gè)SNP(SNP03、SNP04、SNP05)進(jìn)行初步基因分型和關(guān)聯(lián)分析。
結(jié)果提示，SNP03等位基因分布在兩組中有顯著差異(P＜0.05)(表3)，即擴(kuò)大樣本，在250例原發(fā)性高血壓病人和250例正常血壓對(duì)照中對(duì)該SNP進(jìn)行分型和關(guān)聯(lián)研究。結(jié)果表明該SNP與高血壓顯著相關(guān)(P＜0.05)(表4)。
表33個(gè)SNPs基因分型和關(guān)聯(lián)分析結(jié)果男性 女性頻率 頻率SNP等位基因1 等位基因2 x2P 等位基因1 等位基因2 x2PEHCON EHCONEHCON EHCONSNP03 0.80 0.95 0.20 0.05 12.72 0.0004 0.84 0.97 0.16 0.03 7.05 0.0079SNP04 0.48 0.67 0.52 0.33 8.000.0047 0.67 0.74 0.33 0.26 0.863 0.353SNP05 0.96 0.98 0.04 0.02 2.560.2620.96 0.98 0.04 0.02 1.006 0.316表4 SNP03基因分型和關(guān)聯(lián)分析結(jié)果基因型等位基因頻率TTTCCC T C x2p男性EH137113 0 24 0.825 0.175 5.63 ＜0.05NT126113 0 13 0.897 0.103女性EH11372392 0.810 0.190 1.732 0.188NT12493265 0.854 0.145EH，原發(fā)性高血壓NT，正常血壓對(duì)照
3.討論高血壓是遺傳因素與多種環(huán)境因素相互作用而導(dǎo)致的多基因疾病，其遺傳機(jī)制的研究已經(jīng)成為目前的研究熱點(diǎn)。迄今研究者已經(jīng)成功地確定了幾種單基因遺傳性高血壓的候選基因，但占高血壓約95％的原發(fā)性高血壓的遺傳方式和易感基因仍未確認(rèn)。研究候選基因是原發(fā)性高血壓遺傳研究的主要策略之一。RAS系統(tǒng)是體內(nèi)調(diào)節(jié)血壓和水鹽代謝的重要系統(tǒng)，該系統(tǒng)中的AGT、ACE、AT1R、AT2R、REN、RENBP等均為原發(fā)性高血壓的候選基因。
AT2R基因位于X染色體上，約5kb長，包括3個(gè)外顯子，其啟動(dòng)子區(qū)和第一個(gè)內(nèi)含子與基因的調(diào)控有關(guān)(Martin MM，Elton TS.The sequence andgenetic organization of the human type 2 angiotensin II receptor.Biophys Res Commun 1995；209554-562；Warnecke C，Willich T，HolzmeisterJ，Bottari S，F(xiàn)leck E，Regitz-Zagrosek V.Efficient transcription ofthe human angiotensin II type 2 receptor gene requires intronic sequenceelements.Biochem J 1999；34017-24)。研究發(fā)現(xiàn)AT2R能拮抗AT1R而發(fā)揮保護(hù)性作用如舒張血管、利鈉、抗血管增生等，并在動(dòng)物中對(duì)血壓調(diào)節(jié)起重要作用(Carey RM，Wang ZQ，Siragy HM.Role of the Angiotensin type 2receptor in the regulation of blood pressure and renal function.Hypertension 2000；35[part2]155-163；Carey RM，Wang ZQ，Siragy HM.Updaterole of the angiotensin type-2(AT(2))receptor in bloodpressure regulation.Curr Hypertens Rep 2000；2(2)198-201)。但因其表達(dá)在胚胎早期較高，而出生后迅速下降；在成體中的表達(dá)也僅局限于腎上腺、心臟、大腦等少數(shù)組織(Shanmugam S，Llorens-Cortes C，Clauser E，CorvolP，Gase JM.Expression of angiotensin II AT2receptor mRNA duringdevelopment of the rat kidney and adrenal gland.Am J Physiol 1995；268F922-F930；Sechi LA，Griffin CA，Grady EF，Kalinyak JE，SchambelanM.Characterization of angiotensin II receptor subtypes in rat heart.Circ Res 1992；111482-1489)，故對(duì)其的研究特別是多態(tài)性方面的研究很少。
本發(fā)明人首次在中國人群中對(duì)該基因啟動(dòng)子區(qū)、3個(gè)外顯子及其連接區(qū)內(nèi)含子共2938bp進(jìn)行了SNP檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)9個(gè)SNP，包括啟動(dòng)子區(qū)3個(gè)，編碼區(qū)2個(gè)，3′非編碼區(qū)3個(gè)，內(nèi)含子1個(gè)。與NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)中的數(shù)據(jù)相比較，本發(fā)明在中國人群中發(fā)現(xiàn)的9個(gè)SNP，該庫收錄的僅4個(gè)，它們分別是SNP04、SNP06、SNP07和SNP08，其余5個(gè)SNP(SNP01、SNP02、SNP03、SNP05和SNP09)均為未被該庫收錄的新SNP。這反映了SNP的分布存在種族差異性。
由于多基因疾病表現(xiàn)型的復(fù)雜性、相關(guān)基因的微效性和人群的遺傳異質(zhì)性，其相關(guān)基因定位克隆研究一直是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。在原發(fā)性高血壓候選基因中篩選多態(tài)性標(biāo)記，然后在病例-對(duì)照中進(jìn)行相關(guān)分析是目前尋找疾病相關(guān)基因的重要方法之一。SNP數(shù)量多、分布廣、密度高，是進(jìn)行遺傳連鎖分析和關(guān)聯(lián)研究最理想的遺傳標(biāo)記。本研究從AT2R基因的9個(gè)SNP中選出啟動(dòng)子區(qū)、第一個(gè)內(nèi)含子和第一個(gè)外顯子區(qū)內(nèi)各1個(gè)SNP(SNP03、SNP04、SNP05)，在上海地區(qū)漢族中，通過病例-對(duì)照分析，進(jìn)行它們與高血壓間的相關(guān)性研究。結(jié)果表明這3個(gè)SNP在上海地區(qū)漢族中都存在，并在一項(xiàng)病例-對(duì)照組各為250例的研究中發(fā)現(xiàn)SNP03(1334T/C)的2種等位基因頻率分布，在男性EH組和NT組之間有顯著性差異(P＜0.05)。
AT2R基因的這個(gè)位于啟動(dòng)子區(qū)的SNP是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的SNP，該位點(diǎn)涉及3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)(V$COMP1.01、V$RBPJK.01和V$HMGIY.01)，T到C的改變將失去其中1個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)V$RBPJK.01，且不能增加新的結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)想該位點(diǎn)能夠影響AT2R基因的表達(dá)，從而影響AT2R的功能。而該SNP等位基因頻率分布的差異在男性中存在，可能與該基因位于X染色體而對(duì)男性與女性的影響不同有關(guān)。本發(fā)明的結(jié)果提示，AT2R基因變異與上海漢族人群EH發(fā)病相關(guān)，尤其是男性的EH發(fā)病相關(guān)。
實(shí)施例2原發(fā)性高血壓易感性檢測(cè)試劑盒制備一試劑盒，它含有名稱序列(5’→3’) 編號(hào) 濃度正向引物gcacatttgtggaaacttcattt SEQ ID NO7 干粉2OD反向引物ctggttgttgaagtttaaagcag SEQ ID NO8 干粉2ODPCR反應(yīng)液 含Taq酶dNTP鎂離子PCR反應(yīng)緩沖液抽取待檢測(cè)男性病人的血液3ml，使用常規(guī)方法(或使用特定的試劑盒)從血液中提取DNA。將高血壓檢測(cè)試劑盒中的PCR引物稀釋到1μmol/μl，以所提取的DNA為模板與所提供的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物純化后，用ABI-PRISMTM377 DNA測(cè)序儀進(jìn)行熒光標(biāo)記末端終止法雙向測(cè)序，用Polyphred軟件進(jìn)行序列的判讀和SNP確認(rèn)。
檢測(cè)結(jié)果圖1所示，其中，含C表示高血壓易感性高于正常人群。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海市高血壓研究所國家人類基因組南方研究中心<120>血管緊張素II 2型受體基因與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性<130>036164<160>17<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1gtgccttcct cttgctggta t21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2tatgtgccga acactgtgat g21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3aggtggtaga gctgggtttg t21<210>4
<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4cttctaaaat ttcggccttg c 21<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5tgacagagac ctatgaaagg aga23<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6gccagctttc cagagaggtt20<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>7gcacatttgt ggaaacttca ttt23<210>8<211>23<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>8ctggttgttg aagtttaaag cag 23<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>9caaggatgtc ctcagctctg t 21<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>10actttgcaca tcacaggtcc a 21<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>11tccttttggc tactcttcct c 21<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>12ggtcacgggt tatcctgttc t21<210>13<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>引物<400>14tggtgagcct caaagcaagt a21<210>15<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>15aactatgtta tatcgtccag tga 23<210>16<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<223>引物<400>16tagattaact ataaacctcc actc 24<210>17<211>5293<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>17aactatagaa acccatctag tcacaagttt ctccttcctg tggtctccat ttgggcaata 60caattaagaa aaatacgttt ccccacataa caattcttcc aattcttttc cccttctttg 120atgcttttat gatagattat gaatggtcat cagtgatttt ctgtaaatgc cacgtttcct 180ttttgccaag acaaagagtg agactaaggg accatctagt gccttcctct tgctggtata 240gaggctaaac agcgtgagtt ctgatattag tttcctttga tttaaatgca agtgtcttca 300tttaatagct gtatgatctc agaaaagtta ttaaactcta tgagtcctag tttcctgatt 360tgtaaagtgg gggctaatat gaatagcttg taatagcacc taccatatgc taggcatgat 420tttaggcact ttaaacatat tagctcattt aaatttccat tagcttattt aaaattccta 480ctctacgatg taggtaattt atatcattct cctttctcag atgagaaact gagacatgaa 540gaagtaaagt aacttggcca aggtcagaat tagtaggtgg tagagctggg tttgtaaagc 600caggtagttg gatcccagag gctatttact aaccagtgtg ctatattgcc tctctattaa 660attattgatg ataaataact catcacagtg ttcggcacat aacatttatt gtcagctagt 720attatcacta ccatcacctg ttcttatctt tcttcatttt gtcactcttg cttctgctgg 780attggttgtg tagtttattg cccccactgc cacaagagac agcagcaaca gtgatctagg 840ttgaaatagc tagctaatcc ctcttcactt tatgtgcttt gtatttaaac cacaaatatg 900acagagacct atgaaaggag actaaacctc tttttggtcg tgtaaaaatt atattcctgc 960aatctccaac cctccagcaa caagccaaca aaaactgcgc aaagcaaggc cgaaatttta1020gaagtggtag acttcaagta aaattcctac cattctttaa taaacagggg taaaaatttc1080agaaagtaat gaaggttgtg aaagctgatg aagcaaagac tttgctacta taataaattt1140cctagtctct actcactaat ttctattaga atgccaatat caggaaaaaa ggaagagaaa1200attctgtaaa taacttacta tatttttctc ctacgaagta agccactgac ttcaaaattc1260tctagcacat ttgtggaaac ttcatttttt ttgtttgaga tttatttgaa tgagctgtta1320tgattggaga cagtgagaat ttcagattaa tgttttgcag tcaaaaaaaa acctctctgg1380aaagctggca agggttcata agtcagccct agaattatgt aggttgaagg ctcccagtgg1440acagaccaaa catataagaa ggaaaccaga gatctggtgc tattacgtcc cagcgtctga1500gagaacgagt aagcacagaa ttcaaagcat tctgcagcct gaattttgaa ggtaagtatg1560aagcaattta tatataattt acttggaagg tagaacatac attaaatgaa aatatttttt1620atggatgaac ttctgttttt cctgtgtttt aacactgtat tttgcaaaac tcctaaatta1680tttagctgct gtttctctta caggagtgtg tttaggcact aagcaagctg atttatgata1740actgctttaa acttcaacaa ccagtaagtc ttcaagtgga atttattatt gattctttta1800tgttaatttg ttaggtcaaa agaaaaatct ttagagcaaa ataaaagttt tgctctttat1860taggaggttc tttagatatt acacttttaa ttgggtagct tatttgcatg tattttgaaa1920ctatctaaag taaatagtgt ttcctttgta tgcttatctt tagctaatgt gttttttttt1980tggtttaaat atgctctagt gaaaaaatca caaaactcac actgtaacgt ttgagagcaa2040cggctattca gttcggttaa accgaaaaga gagaaaaaga aaaatgataa gactatatca2100tgattaatca ttgatgttca tttctcattt cactgagcaa tctaaactac ttctacttga2160acctaacata ggtttggctg tttttttctt tatctgattt aattgaaaat ggattgttta2220gatattaaat agaccaaaat tagatatcta tatctaaaac taatattctc tattaaaagg2280agaagactta gaaatataaa tatatttcat aacttcttct taactatatt attattgtga2340
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1.一種對(duì)個(gè)體的高血壓易感性進(jìn)行診斷的方法，其特征在于，它包括步驟檢測(cè)該個(gè)體的AT2R基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的AT2R基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個(gè)體患高血壓的可能性高于正常人群。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，檢測(cè)的是AT2R的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常AT2R核苷酸序列比較差異。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的差異是選自下組的單核苷酸多態(tài)性362位G→A；438位T→C；1334位T→C；1675位A→G；3066位C→T；3697位T→C；4297位G→T；4303位G→A；4599位C→A；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO17。
4.一種檢測(cè)樣品是否存在AT2R基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，包括步驟(a)用AT2R基因特異性引物擴(kuò)增樣品的AT2R基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；和(b)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在選自下組的單核苷酸多態(tài)性362位G→A；438位T→C；1334位T→C；3066位C→T；4599位C→A；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO17。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的單核苷酸多態(tài)性是1334位T→C。
6.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的AT2R蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。
7.一種檢測(cè)高血壓的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴(kuò)增AT2R基因或轉(zhuǎn)錄本的引物。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，它還含有選自下組的試劑(a)與突變部位結(jié)合的探針；(b)識(shí)別突變位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的突變是選自下組的單核苷酸多態(tài)性362位G→A；438位T→C；1334位T→C；1675位A→G；3066位C→T；3697位T→C；4297位G→T；4303位G→A；4599位C→A；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO17。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述的單核苷酸多態(tài)性是1334位T→C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)原發(fā)性高血壓易感性的方法，它包括檢測(cè)個(gè)體的血管緊張素II 2型受體基因AT
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1614033SQ20031010842
公開日2005年5月11日 申請(qǐng)日期2003年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月5日
發(fā)明者張怡, 朱鼎良, 張奎星, 王谷亮, 黃薇 申請(qǐng)人:上海市高血壓研究所, 國家人類基因組南方研究中心