專利名稱：一種血管緊張素Ⅱ1型受體自身抗體的形態(tài)學(xué)檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及自身抗體的檢測方法，具體是一種血管緊張素II ι型受體自身抗體 (ATl-AA)的形態(tài)學(xué)檢測方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的免疫組織化學(xué)法是用特異性抗體來顯示目標(biāo)蛋白在組織細(xì)胞中的分布及 表達(dá)情況，而用形態(tài)學(xué)手段來確定一種特異性抗體在機(jī)體組織中分布特征的報(bào)道甚少。子癇前期是妊娠期特發(fā)的母嬰皆受累的嚴(yán)重病癥，病因復(fù)雜難明。近年來，患者血 清中ATl-AA的發(fā)現(xiàn)為該病病因及發(fā)病機(jī)制的闡明提供了一條新思路。該自身抗體具有ATl 受體類激動劑樣效應(yīng)，可引發(fā)多種與疾病密切相關(guān)的病理改變，并且證明ATl-AA屬于IgG3 類免疫球蛋白，提示其可能會通過胎盤/乳汁等途徑由母體進(jìn)入后代體內(nèi)。盡管如此，由于 技術(shù)問題，目前對于ATl-AA的檢測主要采用生物學(xué)鑒定法，比如酶聯(lián)免疫吸附法、激光共 聚焦共定位、免疫共沉淀等，這些方法或可檢測自身抗體的水平，或是通過觀察ATl-AA與 ATl受體的特異結(jié)合，間接證明該自身抗體的存在，但均不能定位自身抗體的分布。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種血管緊張素II 1型受體自身抗體的形態(tài)學(xué)檢測方 法，該方法能夠定位自身抗體的分布。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，利用免疫組織化學(xué)法原理，先合成特異性識別ATl-AA的抗 原決定簇一ATl受體細(xì)胞外第二環(huán)(ATlR-EC11)肽段；將合成的ATlR-EC11肽段標(biāo)記上辣 根過氧化物酶(HRP)；待組織取出后，迅速浸入4%多聚甲醛液中固定，24小時(shí)后石蠟包埋， 切片；組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化、高壓抗原修復(fù)后，滴加HRP標(biāo)記的ATlR-EC11肽段，4°C過 夜；最后采用DAB顯色。所述的ATlR-EC11肽段，起止位置為I165-T191,其氨基酸序列為SEQ ID NO :1。所述的組織切片厚度為3-50 μ m。與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明利用免疫組織化學(xué)法原理，采用合成的抗 原定位組織中的自身抗體，不僅能檢測到該自身抗體的存在，還能顯示自身抗體在組織中 的分布特征，為臨床相關(guān)疾病病理檢測提供了新的方法。


圖IATl-AA在大鼠胎盤絨毛組織中的分布圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 檢測大鼠胎盤組織中ATl-AA 委托上海吉爾生化有限公司合成ATlR-EC11肽段；
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采用濟(jì)南泰天和生物科技有限公司生產(chǎn)的Glue活化辣根過氧化物酶A型試劑盒， 將合成的ATlR-EC11肽段標(biāo)記上HRP ；大鼠懷孕20天時(shí)(臨產(chǎn)前)，腹腔注射10%水合氯醛(0.3ml/100g)進(jìn)行麻醉。 剖宮取出胎盤，用磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01M，pH 7. 2)經(jīng)臍靜脈充分灌流，待沖洗液徹底清 亮后將胎盤組織浸入4%多聚甲醛液中固定，石蠟包埋。8 μ m切片，脫蠟水化，3% H2O2孵育 10min，PBS沖洗5minX3次。高壓抗原修復(fù)(0. OlM枸櫞酸鈉緩沖液，pH 6. 0, 270°C, IOmin)， PBS 沖洗 5minX 3 次，滴加 HRP 標(biāo)記的 ATlR-EC11 肽段[5% PMT (0. OlM PBS+5% BSA), 1 100 稀釋]后4°C過夜。PBS沖洗5minX3次。DAB顯色。脫水、透明、封片。常規(guī)免疫組化法檢 測胎盤中總IgGs作為陽性對照。結(jié)果見圖1，在含有大量ATl-AA的免疫組Wistar孕鼠胎盤絨毛的滋養(yǎng)層細(xì)胞及血 管內(nèi)皮細(xì)胞處均有明顯黃染，證明有ATl-AA表達(dá)(短箭頭)，其分布與總IgGs —致(長箭 頭)；而不含ATl-AA的陰性組大鼠胎盤組織中有一般IgGs通過，卻無特異性ATl-AA存在。 直接證明母體中的ATl-AA可以通過胎盤轉(zhuǎn)給其后代。
權(quán)利要求
一種血管緊張素II 1型受體自身抗體的形態(tài)學(xué)檢測方法，其特征在于，包括如下步驟先合成AT1R ECII肽段；將合成的AT1R ECII肽段標(biāo)記上辣根過氧化物酶(HRP)；待組織取出后，迅速浸入4％多聚甲醛液中固定，24小時(shí)后石蠟包埋，切片；組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化、高壓抗原修復(fù)后，滴加HRP標(biāo)記的AT1R ECII肽段，4℃過夜；最后采用DAB顯色；所述的AT1R ECII肽段，其氨基酸序列為SEQ ID NO1。
2.如權(quán)利要求1所述的一種血管緊張素II1型受體自身抗體的形態(tài)學(xué)檢測方法，其特 征在于，所述的組織切片厚度為3-50 μ m。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種血管緊張素II 1型受體自身抗體(AT1-AA)的形態(tài)學(xué)檢測方法，步驟包括先合成AT1R-ECII肽段；再將合成的AT1R-ECII肽段標(biāo)記上辣根過氧化物酶(HRP)；待組織取出后，迅速浸入4％多聚甲醛液中固定，24小時(shí)后石蠟包埋，切片；組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化、高壓抗原修復(fù)后，滴加HRP標(biāo)記的AT1R-ECII肽段，4℃過夜；最后采用DAB顯色。本發(fā)明利用免疫組織化學(xué)法原理，采用合成的抗原定位組織中的自身抗體，不僅能檢測到該自身抗體的存在，還能顯示自身抗體在組織中的分布特征，為臨床相關(guān)疾病病理檢測提供了新的方法。
文檔編號G01N33/53GK101968482SQ201010259270
公開日2011年2月9日 申請日期2010年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月18日
發(fā)明者劉慧榮, 張?zhí)K麗, 楊麗紅, 楊曉麗, 燕子, 王瑾, 田玨, 鄭榮華 申請人:山西醫(yī)科大學(xué)