專利名稱：表達(dá)人類血管緊張素ii受體i反義基因的重組腺相關(guān)病毒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物材料領(lǐng)域。具體地說是一種將人類血管緊張素II受體I反義基因(AT1-AS)與重組腺相關(guān)病毒載體重組構(gòu)建，并獲得可以滿足治療要求的滴度。
背景技術(shù)：
高血壓是一種多因素影響，多基因起源的慢性疾病。應(yīng)用傳統(tǒng)藥物能夠有效控制，但也存在一些缺點(diǎn)。首先，高血壓病人在就診時(shí)許多已有靶器官損害，臨床上所用的有些藥物不能逆轉(zhuǎn)高血壓的合并癥。其次，由于藥物的副作用，病人長期服藥的依從性受到很大的影響，而且輕至中度的高血壓病人多無癥狀，病人往往認(rèn)為服藥是非必須的，很不方便，影響疾病的治療。由于該病是病人每天需用藥1-3次，而且可能是聯(lián)合使用多種藥物，并且終身服用才能達(dá)到效果，更影響病人依從性，而且藥物價(jià)格昂貴使許多病人難以堅(jiān)持治療。而從基因水平上對(duì)高血壓的致病基因進(jìn)行校正，將為最終治愈高血壓帶來希望。由于人類RAS在高血壓發(fā)病中的作用比較明確，在人體中分布廣泛，而且臨床上作用于RAS的藥物能從多種水平發(fā)揮抗高血壓的作用，因此反義抑制RAS能產(chǎn)生降血壓的效應(yīng)，這已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。以病毒為載體介導(dǎo)的血管緊張素II受體I反義基因注入自發(fā)性高血壓大鼠體內(nèi)，能夠長期使血壓下降，同時(shí)能夠逆轉(zhuǎn)高血壓引起的病理生理改變。在幼年自發(fā)性高血壓大鼠應(yīng)用血管緊張素II受體I反義基因后，還能阻止高血壓的進(jìn)展。應(yīng)用于其它動(dòng)物模型，也充分證明血管緊張素II受體I反義基因治療的可靠性，有效性。同時(shí)基因治療也具有藥物所不具備的優(yōu)越性。但以往的病毒載體，由于存在免疫源性，與基因組的非特異性整合，轉(zhuǎn)基因范圍窄等原因，限制了基因治療的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所使用的重組腺相關(guān)病毒載體它可以攜帶基因轉(zhuǎn)染分裂期和非分裂期細(xì)胞(即具有廣泛的轉(zhuǎn)基因范圍)、無副作用(無免疫源性)、感染效率高、能驅(qū)動(dòng)基因在體內(nèi)長期表達(dá)，而且成功地解決了無腺病毒污染的體外大量復(fù)制問題。為了能使高血壓的基因治療真正實(shí)現(xiàn)，發(fā)明人將人類血管緊張素II受體I反義基因(AT1-AS)與重組腺相關(guān)病毒載體重組構(gòu)建，利用有效的包裝系統(tǒng)進(jìn)行包裝成為含AT1-AS基因的重組腺相關(guān)病毒，并獲得可以滿足治療要求的滴度，以滿足臨床治療的需要。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)方法是該表達(dá)人類血管緊張素II受體I反義基因的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)，其該載體系統(tǒng)該載體系統(tǒng)包括包裝質(zhì)粒pXX2，輔助質(zhì)粒pXX6，真核表達(dá)載體pXXUF1，并在真核表達(dá)載體pXXUF1內(nèi)插入了人類血管緊張素II受體I反義基因編碼序列。該重組腺相關(guān)病毒由天然狀態(tài)的腺相關(guān)病毒經(jīng)分子生物學(xué)方法人工剪切、修飾和加工而成。其中pXX2為包裝質(zhì)粒，含有編碼腺相關(guān)病毒Rep蛋白和Cap蛋白的編碼序列，并在上游和下游各插入一個(gè)p5啟動(dòng)子。pXX6為輔助質(zhì)粒，刪除了腺病毒的致病基因序列，保留了腺病毒E1A、E2A和VA1RNA基因，它們表達(dá)的蛋白質(zhì)可發(fā)揮輔助作用以刺激rAAV基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。pXXUF1真核表達(dá)載體，所用的是CMV啟動(dòng)子，其含有一多克隆位點(diǎn)(pXXUF1為NotI位點(diǎn))，可以連接不同的目的基因。該重組腺相關(guān)病毒是表達(dá)人類血管緊張素II受體I反義基因的重組腺相關(guān)病毒rAAV-AT1-AS。發(fā)明人提出的人類血管緊張素II受體I反義基因由PCR法從人體白細(xì)胞基因組中克隆而得。它包括有效量的表達(dá)人類血管緊張素II受體I反義基因的重組腺相關(guān)病毒和藥學(xué)上所接受的載體或賦形劑。再則，該重組腺相關(guān)病毒由天然狀態(tài)的腺相關(guān)病毒和腺病毒經(jīng)分子生物學(xué)方法人工剪切、修飾和加工而成。該重組腺相關(guān)病毒是表達(dá)人類血管緊張素II受體I反義基因的重組腺相關(guān)病毒rAAV-AT1-AS。制備表達(dá)人類血管緊張素II受體I反義基因的重組腺相關(guān)病毒(a)、提供腺相關(guān)病毒包裝所必需的Rep蛋白和Cap蛋白的編碼序列——pXX2質(zhì)粒，和刺激腺相關(guān)病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄所必需的腺病毒E1A、E2A和VAIRNA基因——pXX6質(zhì)粒。(b)、提供含腺相關(guān)病毒基因組的真核表達(dá)載體pXXUF1，在該真核載體中腺相關(guān)病毒缺失cap蛋白和rep蛋白編碼區(qū)，并插入人類血管緊張素II受體I反義基因，形成重組質(zhì)粒pXXUF1-AT1-AS。(c)、將步驟α中的pXX2、pXX6和pXXUF1-AT1步驟(b)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，適時(shí)回收，并純化、檢測其病毒滴度。將步驟(c)中回收純化的病毒經(jīng)尾靜脈注射入自發(fā)性高血壓大鼠體內(nèi)，檢測其生物學(xué)活性。在步驟(c)共轉(zhuǎn)染的方法是鈣磷DNA共沉淀轉(zhuǎn)染法。真核載體pXXUF1所含啟動(dòng)子為CMV啟動(dòng)子。純化是用SSCP法，而檢測滴度是用斑點(diǎn)雜交法。在步驟4中預(yù)計(jì)檢測的結(jié)果將說明該種表達(dá)人類血管緊張素II受體I反義基因的重組腺相關(guān)病毒(rAAV-AT1-AS)在生物體內(nèi)可長期高效表達(dá)，發(fā)揮其降低血壓、改善腎臟功能、防止心臟及血管重構(gòu)等生理和病理生理作用，以期用于臨床，從而實(shí)現(xiàn)高血壓、心力衰竭，冠心病，腦血管疾病，腎臟疾病及其他相關(guān)疾病的基因治療。


圖1 本發(fā)明腺相關(guān)病毒的序列及具體分區(qū)圖2 本發(fā)明腺相關(guān)病毒的基因級(jí)構(gòu)造3 ITR的序列及二級(jí)結(jié)構(gòu)4 腺相關(guān)病毒的轉(zhuǎn)錄和翻譯中有增殖性和潛優(yōu)性的兩種表達(dá)方式圖5 在AAV的增殖性表達(dá)中可轉(zhuǎn)錄生成6種mRNA的表達(dá)方式圖6 PXXZZ、PXX6質(zhì)粒構(gòu)成圖7 PXXUF1質(zhì)粒構(gòu)成圖8 人類血管緊張素II受體I基因片段的序列圖9 PXXUF1-AT1-AS的質(zhì)粒構(gòu)成下面進(jìn)一步描述本發(fā)明重組腺相關(guān)病毒的各部組成特點(diǎn)及其制備方法一、天然腺相關(guān)病毒(AAV)及重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體的特征腺相關(guān)病毒是一種動(dòng)物單鏈DNA病毒，它屬于細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒亞科，依賴病毒屬，自然缺陷、無包被和無致病原性。
1、AAV基因組是一個(gè)線性、單鏈(ssDNA)分子，含4680個(gè)核苷酸(序列如圖1)，其特征在于1)其基因組由4個(gè)開放閱讀寬讀框(ORF)組成，分稱rep區(qū)、lip區(qū)、inf區(qū)和cap區(qū)(見圖1、圖2)。位于基因組DNA左端的一個(gè)大ORF由于移碼突變或缺失會(huì)阻止DNA復(fù)制，因而被稱為rep區(qū)。右端的一個(gè)大ORF(cap)編碼合成3種外殼蛋白。另有兩個(gè)小ORF位于基因組DNA的中央?yún)^(qū)，即inf區(qū)和lip區(qū)。
2)在分子單鏈每個(gè)末端含有一個(gè)145個(gè)堿基末端重復(fù)序列(ITR)(見圖1)。ITR序列折疊成發(fā)卡結(jié)構(gòu)作為DNA復(fù)制起始和包裝重組AAV基因組為感染性的病毒顆粒所需的唯一已知順式作用元件(見圖3)。 3)腺相關(guān)病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相當(dāng)復(fù)雜，按有無輔助病毒的共轉(zhuǎn)染分，有增殖性和潛伏性兩種表達(dá)方式(如圖4)。
在AAV的增殖性表達(dá)中，可轉(zhuǎn)錄生成6種mRNA，分別由啟動(dòng)子P5、P19、P40啟動(dòng)合成(如圖5)。在腺病毒(Ad)的共轉(zhuǎn)染的情況下，Ad的E1A基因負(fù)責(zé)AAV基因表達(dá)的反式激活；Ad E2A基因編碼單鏈DNA結(jié)合蛋白，可刺激AAV啟動(dòng)子所啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄，還可促進(jìn)AAV轉(zhuǎn)錄本從胞核向胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)；另外Ad VA1 RNA可能也有利于AAV蛋白合成的起始。而AAV也能夠正調(diào)節(jié)和負(fù)調(diào)節(jié)自身基因和輔助病毒基因表達(dá)。AAV的rep基因能夠正調(diào)節(jié)和負(fù)調(diào)節(jié)P5、P19、P40啟動(dòng)子所啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄，在有Ad的情況下，rep基因產(chǎn)物行使正調(diào)節(jié)功能，這是AAV基因大量合成所必須的；而在無輔助病毒共轉(zhuǎn)染的情況下，rep基因產(chǎn)物則起負(fù)調(diào)節(jié)作用。
在無輔助病毒或者的情況下，AAV DNA以雙鏈形式整合到宿主細(xì)胞基因組中，在那里以潛伏狀態(tài)持續(xù)存在，形成AAV的潛伏感染。AAV整合的特異位點(diǎn)是在人染色體的19q13.3-19q ter上。Rep基因產(chǎn)物除了負(fù)調(diào)節(jié)作用外，還可識(shí)別和結(jié)合特異的整合位點(diǎn)，即GGTC序列，并介導(dǎo)了ITR與整合位點(diǎn)的重組。而腺病毒的感染可使其進(jìn)入增殖感染狀態(tài)。
2、AAV作為基因克隆的載體。
AAV是目前已知的唯一能夠在宿主基因組特異染色體位點(diǎn)整合的真核細(xì)胞病毒。這個(gè)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了基因治療的新希望，AAV基因治療載體不僅僅能夠和非整合載體(如腺病毒為基礎(chǔ)的載體)相比更持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)轉(zhuǎn)基因，而且能夠減少理論上的由于轉(zhuǎn)基因的隨機(jī)整合導(dǎo)致的插入突變幾率。我們使用的這一套載體系統(tǒng)是將天然腺相關(guān)病毒和腺病毒用分子生物學(xué)方法經(jīng)一系列剪切和修飾而成，它們保留了腺相關(guān)病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄所必需的部分，也保留了腺病毒的晚期基因輔助成份，其他多余的部分均已刪除，既能實(shí)現(xiàn)病毒長期穩(wěn)定的潛伏感染，又能避免腺病毒的致病危險(xiǎn)，而且腺病毒晚期基因的表達(dá)可以保證被克隆基因的表達(dá)效率。這一載體系統(tǒng)的構(gòu)成如下pXX2(如圖6)保留了AAV的cap基因和rep基因(此時(shí)得到pACG-2)，并在下游區(qū)域又插入了一個(gè)p5啟動(dòng)子(在原來區(qū)域用XbaI和PstI切下，再連接到pACG-2的適當(dāng)位置)。另外我們對(duì)照組所使用的報(bào)告基因(lacZ)也連在pXX2的下游。方法是先在pXX2下游造一個(gè)ClaI的切口，再在其切口上加一個(gè)Sse8387I的接頭(5’-CGCCTGCAGG-3’)，把兩端為Pst I切口的lacZ片段連接于其上。
PXX6(如圖6)在腺病毒改造質(zhì)粒pBH10(已切掉了E1、E3基因和包裝信號(hào))上用PmeI和SgfI切下一個(gè)8kb的片段(得到pXX5)，而pXX6則是由pXX5上用ClaI和SalI切下一段克隆入pBS中得到的，僅僅留下E2A、E4和VA編碼區(qū)。
pXXUF1(如圖7)rAAV包裝所用的質(zhì)粒pXXUF1含有CMV啟動(dòng)子(箭頭)所驅(qū)動(dòng)的人gfp基因，它是將腺相關(guān)病毒的編碼基因全部刪除后再由Not I位點(diǎn)導(dǎo)入的。為了便于基因克隆和表達(dá)，又將其加工成環(huán)狀。
二、人類血管緊張素II受體I基因(human angiotension II type Ireceptor gene，AT1)的基本特點(diǎn)及其與rAAV的重組構(gòu)建。
1、人類血管緊張素II受體I(AT1受體)及其基因的基本特點(diǎn)1)人類血管緊張素II受體I(AT1受體)屬于G蛋白偶聯(lián)受體，與血管緊張素II結(jié)合后，使細(xì)胞發(fā)生一系列變化，主要是細(xì)胞內(nèi)的若干因子如磷脂酶C，磷脂酶D，磷脂酶A2，腺苷酸環(huán)化酶，酪氨酸激酶等的轉(zhuǎn)錄后修飾，以及引起細(xì)胞內(nèi)第二信使和一些離子的累積，另外促進(jìn)與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的早期基因，生長因子以及其他激素的表達(dá)。在生理狀態(tài)下主要發(fā)揮調(diào)節(jié)血壓，血容量的作用。在病理狀態(tài)下，參與高血壓，充血性心力衰竭，動(dòng)脈粥樣硬化，心血管重構(gòu)等病理過程。AT1基因?yàn)閱我换?，位?號(hào)染色體q22，長約60Kb，有個(gè)4外顯子，全部編碼區(qū)位于外顯子4上，長約1Kb，編碼359個(gè)氨基酸。其3′-非編碼區(qū)5′端的A1166C具有多態(tài)性，與高血壓相關(guān)聯(lián)。反義AT1受體基因片段是指與真核表達(dá)載體反向連接的AT1受體基因片段，能夠與AT1受體的mRNA互補(bǔ)結(jié)合，激活RNA酶H，使AT1受體的mRNA水解，拷貝數(shù)降低，而反義AT1受體基因片段釋出后，仍能繼續(xù)結(jié)合mRNA，使mRNA進(jìn)一步減少。因此，在病理狀態(tài)下，反義AT1受體基因片段從基因水平阻斷AT1受體基因的表達(dá)，從而封閉AT1受體，達(dá)到治療疾病的目的。
2)人類血管緊張素II受體I基因cDNA片段的序列(圖8)AT1-cDNA 5’CACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCAAAATGATTCTCAACTCTTCTACTGAAGATGGTATTAAAAGAATCCAAGATGATTGTCCCAAAGCTGGAAGGCATAATTACATATTTGTCATGATTCCTACTTTATACAGTATCATCTTTGTGGTGGGAATATTTGGAAACAGCTTGGTGGTGATAGTCATTTACTTTTATATGAAGCTGAAGACTGTGGCCAGTGTTTTTCTTTTGAATTTAGCACTGGCTGACTTATGCTTTTTACTGACTTTGCCACTATGGGCTGTCTACACAGCTATGGAATACCGCTGGCCCTTTGGCAATTACCTATGTAAGATTGCTTCAGCCAGCGTCAGTTTCAACCTGTACGCTAGTGTGTTTCTACTCACGTGTCTCAGCATTGATCGATACCTGGCTATTGTTCACCCAATGAAGTCCCGCCTTCGACGCACAATGCTTGTAGCCAAAGTCACCTGCATCATCATTTGGCTGCTGGCAGGCTTGGCCAGTTTGC CAGCTATAATCCATCGAAATGTATTTTTCATTGAGAACACCAATATTACAGTTTGTGCTTTCCATTATGAGTCCCAAAATTCAACCCTTCCGATAGGGCTGGGCCTGACCAAAAATATACTGGGTTTCCTGTTTCCTTTTCTGATCATTCTTACAA2、人類血管緊張素II受體I基因(AT1)cDNA片段的克隆及其與rAAV的重組和構(gòu)建。
1)人類血管緊張素II受體I基因(AT1)cDNA片段的克隆設(shè)計(jì)引物P1，5’-GCCCGGAATTCAAAATGATTCTCAAC-3’；P2，5’-GGCGCACAAGCTTTCAAATAAGAGTATAAC-3′。由武漢生物合成公司合成。用酚-氯仿抽提的方法從人白細(xì)胞中提取基因組DNA并以其為模板進(jìn)行PCR(試劑盒購自日本TAKARA公司)。PCR儀購自英國TECONE公司。并將產(chǎn)物與pXXUF3反向相連。質(zhì)粒圖如圖9。
將AT1cDNA測序，所得結(jié)果與從GeneBank中的結(jié)果相同。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明表達(dá)人類血管緊張素II受體I反義基因的重組腺相關(guān)病毒的制備方法1、rAAV-AT1-AS與rAAV-LacZ重組病毒的包裝與回收pXX2、pXX6、pXXUF1-AT1-AS、pdx-LacZ的質(zhì)粒的大量提取，所用大提試劑盒購自Promega公司。方法依說明書所述。
將293細(xì)胞(人腎母胚胎腫瘤細(xì)胞系)傳入數(shù)個(gè)150mm培養(yǎng)板中，傳代培養(yǎng)需要0.25％胰蛋白酶、高糖DMEM培養(yǎng)基、新生小牛血清(購自Gibco公司)。待細(xì)胞生長到60％到70％聚集度時(shí)，按摩爾比1∶1∶1將pXX2、pXX6、pXXUF1-AT1(pdx-lacZ)用鈣磷轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)吸棄所有培養(yǎng)基，加入少量PBS緩沖液，刮取盤中293細(xì)胞，后-80℃凍存。
2、rAAV-AT1-AS與rAAV-LacZ回收病毒的純化為祛除細(xì)胞中的異型蛋白，病毒的純化應(yīng)用SSCP法[13](純化裝置購自MILLIPORE公司)。具體如下將所轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞按每15cm盤應(yīng)用2.5mL的DMEM的比例進(jìn)行重懸。凍融2次后用各0.1mg的Dnase I和RnaseA 37℃溫育30min。然后4℃，3000rpm離心15min。取上清與脫氧膽酸(終濃度0.5％)37℃溫育30min。先后應(yīng)用5μm孔濾器和0.8μm孔濾器過濾。將過濾物應(yīng)用肝素柱純化(肝素柱的制備方法詳見說明書)。肝素柱用25mL的PBS(PH7.4)+0.1M NacL洗2次。再以15mL的PBS(PH7.4)+0.4M NacL洗脫，洗脫液在NMWL過濾裝置中離心濃縮至1mL。收集濃縮液后再灌注PBS(PH7.4)濃縮至1mL，移去含病毒的溶液后再用100μL的PBS溶液洗3次，將洗脫液加入總的病毒純化液中。取病毒純化液用斑點(diǎn)雜交法測定滴度。
3、rAAV-AT1-AS與rAAV-LacZ滴度的測定—斑點(diǎn)雜交a)AT1cDNA探針的標(biāo)記和純化同位素標(biāo)記的核苷酸α-P32購自北京雅輝公司。用HindIII切下UF3-AT1-AS中的AT1片段做為已知序列的探針。隨機(jī)引物法標(biāo)記AT1片段并純化(試劑盒購自QIAGEN公司，方法如說明書)。
b)回收物的和定量標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)備回收物經(jīng)適量DnaseI和RNAse消化，消化細(xì)胞基因組的DNA、RNA。反應(yīng)終止后再加ProteinseK，消化病毒的蛋白質(zhì)外殼(以上試劑均購自日本TAKARA公司)。酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提，祛除沉淀，上清中為病毒中的DNA。將上清按體積比對(duì)倍稀釋。標(biāo)準(zhǔn)物采用目的基因片段，即AT1 cDNA片段，測定濃度后按分子數(shù)對(duì)倍稀釋(具體計(jì)算方法略)。并作加熱和堿變性處理。
c)雜交與放射自顯影配好斑點(diǎn)雜交裝置，并按裝置大小安置一塊0.45μm的尼龍膜，將待測病毒樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品按體積梯度和分子梯度分別上樣，上樣后將膜80℃干烤2小時(shí)，后42℃預(yù)雜交1小時(shí)(預(yù)雜交液購自INTERGEN公司)。再加加熱處理的標(biāo)記探針，45℃雜交12-16小時(shí)。洗膜后-80℃放射自顯影2-3天。結(jié)果顯示我們制備的rAAV具備足夠的滴度(1-2×1011p.f.u.)，可以用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床治療。
在多種動(dòng)物模型及臨床應(yīng)用中顯示，AT1受體阻滯劑具有降低血壓，改善心功能，逆轉(zhuǎn)心臟和血管重構(gòu)，腎臟保護(hù)，預(yù)防PTCA術(shù)后再狹窄與動(dòng)脈粥樣硬化，預(yù)防腦中風(fēng)等作用。反義AT1受體基因從基因水平上阻斷AT1受體基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯，使AT1受體表達(dá)減少，較AT1受體阻滯劑的作用更為徹底，作用更強(qiáng)。重組腺相關(guān)病毒載體這一優(yōu)異的基因治療載體的開發(fā)成功，使人類基因治療具備了可能性和可行性。表達(dá)人類血管緊張素II受體I反義基因的重組腺相關(guān)病毒(rAAV-AT1-AS)的構(gòu)建成功，為基因治療走向臨床邁出了可喜的一步。相信，表達(dá)人類血管緊張素II受體I反義基因的重組腺相關(guān)病毒(rAAV-AT1-AS)用于臨床后，必將在高血壓，心力衰竭，冠心病，糖尿病，腎功能衰竭，中風(fēng)等嚴(yán)重危害人類健康的疾病的治療中，發(fā)揮極其主要的作用。
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)人類血管緊張素II受體I反義基因的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)，它適用于高血壓、腎臟疾病及其他相關(guān)疾病的基因治療，其特征在于該載體系統(tǒng)包括包裝質(zhì)粒pXX2，輔助質(zhì)粒pXX6，真核表達(dá)載體pXXUF1，并在真核表達(dá)載體pXXUF1內(nèi)插入了人類血管緊張素II受體I反義基因編碼序列。
2.如權(quán)利要求1所述的一種重組腺相關(guān)病毒，其特征在于該重組腺相關(guān)病毒由天然狀態(tài)的腺相關(guān)病毒經(jīng)分子生物學(xué)方法人工剪切、修飾和加工而成。
3.如權(quán)利要求1所述的一種重組腺相關(guān)病毒，其特征在于(a)、pXX2為包裝質(zhì)粒，含有編碼腺相關(guān)病毒Rep蛋白和Cap蛋白的編碼序列，并在上游和下游各插入一個(gè)p5啟動(dòng)子。(b)、pXX6為輔助質(zhì)粒，刪除了腺病毒的致病基因序列，保留了腺病毒E1A、E2A和VA1RNA基因，它們表達(dá)的蛋白質(zhì)可發(fā)揮輔助作用以刺激rAAV基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。(c)、pXXUF1真核表達(dá)載體，所用的是CMV啟動(dòng)子，其含有一多克隆位點(diǎn)(pXXUF1為NotI位點(diǎn))，可以連接不同的目的基因。
4.如權(quán)利要求3所述的一種重組腺相關(guān)病毒，其特征在于該重組腺相關(guān)病毒是表達(dá)人類血管緊張素II受體I反義基因的重組腺相關(guān)病毒rAAV-AT1-AS。
5.如權(quán)利要求1所述的一種人類血管緊張素II受體I基因的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)，其特征在于緊張素II受體I反義基因由PCR法從人體白細(xì)胞基因組(genomic DNA)中克隆而得。
6.該發(fā)明為一種藥物組合物，其特征在于，它包括有效量的如權(quán)利要求(1)所述的表達(dá)人類血管緊張素II受體I反義基因的重組腺相關(guān)病毒和藥學(xué)上所接受的載體或賦形劑。
7.如權(quán)利要求(6)所述的藥物組合物，其特征在于，該重組腺相關(guān)病毒由天然狀態(tài)的腺相關(guān)病毒和腺病毒經(jīng)分子生物學(xué)方法人工剪切、修飾和加工而成。
8.如權(quán)利要求(6)所述的藥物組合物，其特征在于該重組腺相關(guān)病毒是表達(dá)人類血管緊張素II受體I反義基因的重組腺相關(guān)病毒rAAV-AT1-AS。
9.一種制備表達(dá)人類血管緊張素II受體I反義基因的重組腺相關(guān)病毒的方法；其特征在于a)、提供腺相關(guān)病毒包裝所必需的Rep蛋白和Cap蛋白的編碼序列——pXX2質(zhì)粒，和刺激腺相關(guān)病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄所必需的腺病毒E1A、E2A和VAI RNA基因——pXX6質(zhì)粒。b)、提供含腺相關(guān)病毒基因組的真核表達(dá)載體pXXUF1，在該真核載體中腺相關(guān)病毒缺失cap蛋白和rep蛋白編碼區(qū)，并插入人類血管緊張素II受體I反義基因，形成重組質(zhì)粒pXXUF1-AT1-AS。c)、將步驟α中的pXX2、pXX6和pXXUF1-AT1步驟2)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，適時(shí)回收，并純化、檢測其病毒滴度。d)、將步驟c中回收純化的病毒經(jīng)尾靜脈注射入自發(fā)性高血壓大鼠體內(nèi)，檢測其生物學(xué)活性。
10.根據(jù)權(quán)利要求書9所述的一種制備方法，其特征在于，在步驟(c)中共轉(zhuǎn)染的方法是鈣磷DNA共沉淀轉(zhuǎn)染法。真核載體pXXUF1所含啟動(dòng)子為CMV啟動(dòng)子。純化是用SSCP法，而檢測滴度是用斑點(diǎn)雜交法。
11.根據(jù)權(quán)利要求書9所述的一種制備方法，其特征在于，在步驟(d)中預(yù)計(jì)檢測的結(jié)果將說明該種表達(dá)人類血管緊張素II受體I反義基因的重組腺相關(guān)病毒(rAAV-AT1-AS)在生物體內(nèi)可長期高效表達(dá)，發(fā)揮其降低血壓，改善腎臟功能，防止心臟，血管重構(gòu)等生理和病理生理作用。
全文摘要
一種表達(dá)人類血管緊張素II受體I反義基因的重組腺相關(guān)病毒(rAAV),它適用于高血壓、心力衰竭、腎臟疾病及其他相關(guān)疾病的基因治療,該載體系統(tǒng)包括包裝質(zhì)粒pXX
文檔編號(hào)C12N7/01GK1422950SQ0211577
公開日2003年6月11日 申請(qǐng)日期2002年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月28日
發(fā)明者汪道文, 肖嘯, 孔強(qiáng), 王濤 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院