專利名稱：變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶過(guò)度表達(dá)株及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于口腔預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶過(guò)度表達(dá)株，還涉及一種變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶過(guò)度表達(dá)株的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
齲病是危害人類健康的第三大疾病，目前已公認(rèn)變形鏈球菌(Streptococcus mutans，以下稱變鏈菌)是最重要的致齲菌。在變鏈菌致齲毒力因子中，葡糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyltransferase，GTase)倍受關(guān)注。
變鏈菌含有三種GTase①葡糖基轉(zhuǎn)移酶-I(GTase-I)，又稱為細(xì)胞吸附型GTase(CAGTase)，主要以細(xì)胞結(jié)合的形式存在于細(xì)菌表面，僅合成非水溶性葡聚糖；②葡糖基轉(zhuǎn)移酶-SI(GTase-SI)，既能合成非水溶性葡聚糖又能合成水溶性葡聚糖；③葡糖基轉(zhuǎn)移酶-S(GTase-S)，僅能合成水溶性葡聚糖。變鏈菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶通過(guò)合成葡聚糖，特別是非水溶性葡聚糖，在以下幾方面發(fā)揮致齲作用1.介導(dǎo)變鏈菌緊密地粘附于牙面；2.葡聚糖作為基質(zhì)形成致密的菌斑，使細(xì)菌所產(chǎn)生的酸不易擴(kuò)散而較長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)留于牙面；3.菌斑“饑餓”時(shí)，為細(xì)菌的生存提供能量來(lái)源。
編碼葡糖基轉(zhuǎn)移酶-I(GTase-I)、葡糖基轉(zhuǎn)移酶-SI(GTase-SI)、葡糖基轉(zhuǎn)移酶-S(GTase-S)的基因分別是gtfB、gtfC、gtfD，已被克隆及測(cè)序。葡糖基轉(zhuǎn)移酶-I(GTase-I)與葡糖基轉(zhuǎn)移酶-SI(GTase-SI)的氨基酸序列高度同源，且抗葡糖基轉(zhuǎn)移酶-I(GTase-I)的多克隆抗體不能區(qū)分gtfB和gtfC的基因產(chǎn)物。
齲病被認(rèn)為是人類最普遍的感染性疾病。關(guān)于免疫防齲的研究已有近30年歷史。近來(lái)的研究表明，利用致齲菌毒力因子制備疫苗是預(yù)防齲病的有效手段。用提純的細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶(CAGTase)免疫雞，將所獲得的抗細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶(CAGTase)抗體用于被動(dòng)免疫獲得了明顯的抗齲效果。但由于變形鏈球菌所含細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶(CAGTase)量少，提取十分困難，成為妨礙細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶(CAGTase)疫苗實(shí)際應(yīng)用的主要原因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶過(guò)度表達(dá)株，通過(guò)構(gòu)建變鏈菌細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶(CAGTase)過(guò)度表達(dá)株，解決了變鏈菌細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶(CAGTase)量少、提取困難的問(wèn)題。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種制備細(xì)胞吸附型變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移過(guò)度表達(dá)株的方法，用該方法構(gòu)建的表達(dá)株對(duì)于研制細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶抗齲疫苗有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明技術(shù)方案如下首先，構(gòu)建攜帶細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶(CAGTase)基因的大腸桿菌——鏈球菌穿梭質(zhì)粒pZB1，并將變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶過(guò)度表達(dá)株B29-33(pZB1)，CCTCCNOM201045轉(zhuǎn)化至變鏈菌細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶(CAGTase)缺陷突變株B29中(變鏈菌B29由邊專等人于日本大阪大學(xué)構(gòu)建)，然后對(duì)變鏈菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶(CAGTase)過(guò)度表達(dá)株進(jìn)行篩選及對(duì)其特征的研究，其步驟如下(1)根據(jù)菌落形態(tài)篩選變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶過(guò)度表達(dá)株B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)表現(xiàn)為菌落體積較小，較堅(jiān)硬，菌落中間凹陷，深入嵌入瓊脂中。
(2)免疫印跡鑒定變鏈菌細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶CAGTase過(guò)表達(dá)株野生株MT8148含兩種能與葡糖基轉(zhuǎn)移酶-I(GTase-I)多克隆抗體反應(yīng)的蛋白帶，分別代表葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase-I 156KDa)和GTase-SI(148KDa)，B29因缺乏葡糖基轉(zhuǎn)移酶-I(GTase-I)故僅有葡糖基轉(zhuǎn)移酶-SI(GTase-SI)。29(pZB1)-4，B29(pZB1)-33(CCTCCNo.M201045)均表達(dá)出葡糖基轉(zhuǎn)移酶-I(GTase-I)，但B29(pZB1)-4的表達(dá)水平接近野生型變鏈株MT8148，而B(niǎo)29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)和B29(pZB1)-11過(guò)度表達(dá)葡糖基轉(zhuǎn)移酶-I(GTase-I)。
(3)測(cè)定細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶CAGTase酶活力變鏈菌B29轉(zhuǎn)化株葡糖基轉(zhuǎn)移酶-I(GTase-I)酶活力測(cè)定表明轉(zhuǎn)化株B29(pZB1)-4葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase)酶活力與野生型MT8148相似，但B29(pZB1)-11和B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase)酶活力顯著高于MT8148。
(4)蔗糖依賴性粘附試驗(yàn) 結(jié)果表明變鏈菌野生型MT8148及變鏈菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶-IGTase-I缺陷株B29的粘附水平、非水溶性葡聚糖合成量與接種量無(wú)關(guān)，但B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)隨接種量的增加非水溶性葡聚糖合成增加但粘附水平下降。
(5)對(duì)陽(yáng)性蛋白帶行薄層掃描以確定細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶(CAGTase)的高表達(dá)水平。
最后，進(jìn)行變形鏈球菌細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶高表達(dá)株GTase-I基因上游DNA序列分析。發(fā)明優(yōu)點(diǎn)和效果
迄今為止，本項(xiàng)研究所獲得的細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶(CAGTase)過(guò)度表達(dá)株在國(guó)內(nèi)、外尚未見(jiàn)報(bào)告。通過(guò)這些細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶(CAGTase)過(guò)度表達(dá)株，進(jìn)一步探索了細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶(CAGTase)在變鏈菌致齲機(jī)制中的作用。同時(shí)，由于變鏈菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶的量少，難以提取，曾阻礙了利用細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶(CAGTase)作為抗齲疫苗的研究。運(yùn)用基因工程技術(shù)構(gòu)建了變鏈菌細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶(CAGTase)過(guò)度表達(dá)株后，將其免疫奶牛，測(cè)得牛乳中含高水平的抗變鏈菌抗體。將該免疫牛奶用于自愿受試人群含漱，結(jié)果顯示，牙舌面變鏈菌水平顯著下降。因此，構(gòu)建的這些細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶(CAGTase)過(guò)度表達(dá)株，對(duì)于研制細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶(CAGTase)抗齲疫苗可能有潛在的應(yīng)用價(jià)值。


圖1質(zhì)粒(pTF37)的構(gòu)建質(zhì)粒(pSP73)用NdeI和HpaI消化，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后分離出221bp多克隆區(qū)(multiclonal site)。質(zhì)粒(pMW119)經(jīng)PuvII消化，瓊脂糖凝膠電泳并分離出3.9Kb(千堿)的DNA片段后與221bp DNA片段混勻，末端平齊后連接，所產(chǎn)生的重組質(zhì)粒多克隆區(qū)有2個(gè)方向，如圖方向者為質(zhì)粒(pTF37)。
圖2 質(zhì)粒(pTF41)，質(zhì)粒(pTF42)的構(gòu)建質(zhì)粒(pSK6)經(jīng)KpnI和BglII消化后，分離純化GTase基因(5.0Kb)。將gtfB基因與經(jīng)KpnI和BglII消化后的質(zhì)粒(pTF37)連接。質(zhì)粒(pSK16)經(jīng)KpnI消化，分離提純gtfC基因(4.7b)。將gtfC基因與經(jīng)KpnI和SphI消化后的pTF37連接，重組質(zhì)粒為pTF42。
圖3 質(zhì)粒(pZB1)和質(zhì)粒(pZB2)的構(gòu)建質(zhì)粒(pVA838)經(jīng)XbaI和SalI消化后分離出6.2Kb DNA片段，將該DNA片段與經(jīng)XbaI和SalI消化后的pTF41連接，所產(chǎn)生的重組質(zhì)粒為質(zhì)粒(pZB1)。質(zhì)粒(pVA838)經(jīng)EcoRI和BamHI消化后，提取7.0Kb DNA片段與經(jīng)EcoRI和BglII消化后的質(zhì)粒(pTF42)連接，所產(chǎn)生的重組質(zhì)粒為質(zhì)粒(pZB2)。
圖4 變鏈菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase-I)高表達(dá)株在輕唾培養(yǎng)基上菌落形態(tài)采用質(zhì)粒(pZB1)轉(zhuǎn)化變鏈菌B29后分離到大量轉(zhuǎn)化株，其中多數(shù)在MS瓊脂上表現(xiàn)為粗糙菌落。根據(jù)轉(zhuǎn)化株特征分別命名為B29(pZB1)-4、B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)、B29(pZB1)-11。變鏈菌MT8148、B29及葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase-I)高表達(dá)株在MS瓊脂上呈現(xiàn)出各不相同的菌落形態(tài)。變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶過(guò)度表達(dá)株B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)表現(xiàn)為菌落體積較小，較堅(jiān)硬，菌落中間凹陷，深入嵌入瓊脂中。
圖5變鏈菌細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶GTase-I過(guò)度表達(dá)株免疫印跡分析一抗兔抗GTase-1多克隆抗體二抗堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗免IgG免疫印跡清楚地顯示野生株MT8148含兩種能與葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase-I)多克隆抗體反應(yīng)的蛋白帶，分別代表葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase-I 156KDa)和葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase-SI148Kda)、B29因缺乏葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase-I)故僅有葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase-SI)。29(pZB1)-4、B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)均表達(dá)出GTase-I，但B29(pZB1)-4的表達(dá)水平接近野生型變鏈株MT8148，而B(niǎo)29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)和B29(pZB1)-11過(guò)度表達(dá)GTase-I。B29(pZB1)-4上清樣本中還存在一條100KD的過(guò)度表達(dá)帶。
具體實(shí)施例方式
1.構(gòu)建攜帶葡糖基轉(zhuǎn)移酶(CAGTase)基因的大腸桿菌—鏈球菌穿梭質(zhì)粒(pZB1)本研究首先分離質(zhì)粒(pSP 73)上多克隆區(qū)(multiclonal site)并連接至低拷貝質(zhì)粒(pMW 119)，構(gòu)成新質(zhì)粒(pTF37)。將葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase-I)及葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase-SI)基因分別連接到質(zhì)粒(pTF37)分別構(gòu)成質(zhì)粒(pTF41)和質(zhì)粒(pTF42)。然后從源于鏈球菌質(zhì)粒(pVA838)中分離鏈球菌復(fù)制子片段并連接至質(zhì)粒(pTF41)和質(zhì)粒(pTF42)，分別構(gòu)成大腸桿菌-變形鏈球菌攜帶GTase基因穿梭質(zhì)粒(pZB1)和質(zhì)粒(pZB2)。具體步驟如下(1)構(gòu)建質(zhì)粒(pTF37) 質(zhì)粒(pSP73)用NdeI和HpaI消化，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后分離出221bp多克隆區(qū)(multiclonal site)。質(zhì)粒(pMW119)經(jīng)PuvII消化，瓊脂糖凝膠電泳并分離出3.9Kb(千堿)的DNA片段后與221bp DNA片段混勻，末端平齊后連接，所產(chǎn)生的重組質(zhì)粒多克隆區(qū)有兩個(gè)方向，如圖方向者為質(zhì)粒(pTF37)(圖1)。
(2)構(gòu)建質(zhì)粒(pTF41)、質(zhì)粒(pTF42) 質(zhì)粒(pSK6)經(jīng)KpnI和BglII消化后，分離純化GTase基因(5.0Kb)。將gtfB基因與經(jīng)KpnI和BglII消化后的質(zhì)粒(pTF37)連接(圖2)。質(zhì)粒(pSK16)經(jīng)KpnI消化，分離提純gtfC基因(4.7b)。將gtfC基因與經(jīng)KpnI和SphI消化后的pTF37連接，重組質(zhì)粒為pTF42。
(3)構(gòu)建質(zhì)粒(pZB1)和質(zhì)粒(pZB2) 質(zhì)粒(pVA838)經(jīng)XbaI和SalI消化后分離出6.2Kb DNA片段，將該DNA片段與經(jīng)XbaI和SalI消化后的質(zhì)粒(pTF41)連接，所產(chǎn)生的重組質(zhì)粒為質(zhì)粒(pZB1)(圖3)。質(zhì)粒(pVA838)經(jīng)EcoRI和BamHI消化后，提取7.0Kb DNA片段與經(jīng)EcoRI和BglII消化后的質(zhì)粒(pTF42)連接，所產(chǎn)生的重組質(zhì)粒為質(zhì)粒(pZB2)。
在選擇載體質(zhì)粒時(shí)其拷貝數(shù)是重要的考慮因素。含葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase)基因的高拷貝質(zhì)粒(pBR322)和pUC系列不能在大腸桿菌中生存。因?yàn)檫@類質(zhì)粒在大腸桿菌中大量繁殖，其攜帶的葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase)基因過(guò)度表達(dá)，在大腸桿菌細(xì)胞漿內(nèi)合成多量葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase)。葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase)可能對(duì)大腸桿菌具有毒性作用，因此，在克隆這一蛋白基因時(shí)常采用低拷貝質(zhì)粒。質(zhì)粒(pMW119)為低拷貝質(zhì)粒，攜帶了葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase-I)基因和葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase-SI)基因的質(zhì)粒(pMW119)，分別為質(zhì)粒(pSK6)和質(zhì)粒(pSK16)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，大腸桿菌能低水平表達(dá)葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase)并穩(wěn)定生長(zhǎng)。
質(zhì)粒(pSK6)和質(zhì)粒(pSK16)僅攜帶能在大腸桿菌中復(fù)制的復(fù)制子，為了構(gòu)建鏈球菌—大腸桿菌穿梭質(zhì)粒，必須在質(zhì)粒(pSK6)和質(zhì)粒(pSK16)上加上能在鏈球菌中復(fù)制的復(fù)制子。質(zhì)粒(pVA838)含這種鏈球菌復(fù)制子(圖3)。質(zhì)粒(pVA838)經(jīng)XbaI和SalI消化后可分離出完整的鏈球菌復(fù)制子，但質(zhì)粒(pSK6)上缺乏SalI酶切區(qū)，為了解決這一問(wèn)題，從質(zhì)粒(pSP73)上分離出221bp的多酶切區(qū)(其中含XbaI和SalI單一酶切點(diǎn))并將其整合至質(zhì)粒(pMW119)，形成質(zhì)粒(pTF37)。隨后將葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase-I)基因和葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase-SI)基因整合至質(zhì)粒(pTF37)分別構(gòu)建質(zhì)粒(pTF41)和質(zhì)粒(pTF42)。質(zhì)粒(pTF41)既含葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase-I)基因又具有SalI和XbaI酶切點(diǎn)，因而含鏈球菌復(fù)制子的質(zhì)粒(pVA838)SalI和XbaI片段能整合至質(zhì)粒(PTF41)而形成質(zhì)粒(pZB1)。由于在質(zhì)粒(pTF42)構(gòu)建中已失去SalI和XbaI酶切點(diǎn)，因此質(zhì)粒(pVA838)經(jīng)BamHI和EcoRI消化、分離出鏈球菌復(fù)制子后將該片段連接于質(zhì)粒(pTF42)的EcoRI和BglII上。因?yàn)锽amHI和BglII為同裂酶(isoschizomer)產(chǎn)生相同的粘性末端，因而可以連接。通過(guò)紅霉素耐性挑選重組質(zhì)粒，本研究所構(gòu)建質(zhì)粒見(jiàn)表1。由于質(zhì)粒(pZB1)和質(zhì)粒(pZB2)分別含大腸桿菌低拷貝復(fù)制子和鏈球菌復(fù)制子，故既能在大腸桿菌中生存復(fù)制也能在鏈球菌中生存復(fù)制。
表1質(zhì)粒 特征pTF37 Ampr(L)源于pMW119含來(lái)源于pSP73的多克隆區(qū)[4.05Kb]*pTF41 Ampr(L)源于pFT37含gtfB基因[9.0Kb]pTF42 Ampr(L)源于pFT37含gtfC基因[9.0Kb]pZB1 EmrAmpr(M)鏈球菌—大腸桿菌穿梭質(zhì)粒含gtfB基因[15.2Kb]pZB2EmrAmpr(M)鏈球菌—大腸桿菌穿梭質(zhì)粒含gtfC基因[16Kb]*[ ]內(nèi)為質(zhì)粒分子量，Kb千堿基對(duì)，(L)低拷貝，(M)中等拷貝
2.質(zhì)粒(pZB1)對(duì)變鏈菌細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶(CAGTase)陷突變株B29的轉(zhuǎn)化變鏈菌細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶(CAGTase)缺陷突變株B29由邊專等人在日本大阪大學(xué)構(gòu)建。變鏈菌B29于變鏈菌轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(Todd-Hewitt培養(yǎng)基及5％失活馬血清)中37℃，18hr，以變鏈菌轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基1∶40稀釋(10ml)，37℃，1.5hr，加入質(zhì)粒(pZB1)至終濃度25ug/ml，37℃，2hr，離心；濃縮10倍，涂皿。
3.對(duì)變鏈菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶CAGTase過(guò)度表達(dá)株的篩選及對(duì)其特征的研究(1)采用質(zhì)粒(pZB1)轉(zhuǎn)化變鏈B29后分離到大量轉(zhuǎn)化株，其中多數(shù)在MS瓊脂上表現(xiàn)為粗糙菌落。根據(jù)轉(zhuǎn)化株特征分別命名為B29(pZB1)-4、B29(pZB1)-33(CCTCCNo.M201045)。B29(pZB1)-11。變鏈菌MT8148、B29及葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase-I)高表達(dá)株在MS瓊脂上呈現(xiàn)出各不相同的菌落形態(tài)。變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶過(guò)度表達(dá)株B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)表現(xiàn)為菌落體積較小，較堅(jiān)硬，菌落中間凹陷，深入嵌入瓊脂中(圖4)。
(2)免疫印跡清楚地顯示野生株MT8148含兩種能與葡糖基轉(zhuǎn)移酶GTase-I多克隆抗體反應(yīng)的蛋白帶，分別代表葡糖基轉(zhuǎn)移酶GTase-I(156KDa)和葡糖基轉(zhuǎn)移酶GTase-SI(148KDa)。B29因缺乏葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase-I)故僅有葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase-SI)。29(pZB1)-4、B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)均表達(dá)出葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase-I)，但B29(pZB1)-4的表達(dá)水平接近野生型變鏈株MT8148，而B(niǎo)29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)和B29(pZB1)-11過(guò)度表達(dá)GTase-I(圖5)。B29(pZB1)-4上清樣本中還存在一條100KD的過(guò)度表達(dá)帶。
(3)變鏈菌B29轉(zhuǎn)化株葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase-I)酶活力測(cè)定表明轉(zhuǎn)化株B29(pZB1)-4葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase)酶活力與野生型MT8148相似，但B29(pZB1)-11和B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase)酶活力顯著高于MT8148。
(4)蔗糖依賴性粘附試驗(yàn)按Koga等描述的方法，測(cè)試菌于BHI肉湯中37℃生長(zhǎng)18hr，將25μl、50μl、100μl和200μl該生長(zhǎng)物分別接種至3ml含1％蔗糖的BHI肉湯中，30°水平角傾斜培養(yǎng)18小時(shí)。輕柔旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)試管，將脫落菌體傾至另一試驗(yàn)管中，粘附菌體量采用比色測(cè)量(OD550)并以占總生長(zhǎng)菌體數(shù)百分比表示。每份測(cè)試樣品一式三份。在另一次實(shí)驗(yàn)中，接種菌液量為25μl，分別于培養(yǎng)時(shí)間15、18、21、24hr，測(cè)定蔗糖依賴性粘附水平。
非水溶性葡聚糖合成的測(cè)定在蔗糖依賴性粘附試驗(yàn)后，菌體樣本合并，蒸餾水洗滌4次，懸混于3ml蒸餾水中，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)液，用蒽酮比色法測(cè)定總己糖量(代表非水溶性葡聚糖)。
結(jié)果表明變鏈菌野生型MT8148及變鏈菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶-I(GTase-I)缺陷株B29的粘附水平、非水溶性葡聚糖合成量與接種量無(wú)關(guān)，但B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)隨接種量的增加非水溶性葡聚糖合成增加但粘附水平下降。
4.變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶高表達(dá)株GTase-I基因上游DNA序列分析從變鏈菌B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)，B29(pZB1)-11中提取DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，于含氨芐青霉素(100ug/ml)和紅霉素(250ug/ml)的LB瓊脂中生長(zhǎng)，篩選合適轉(zhuǎn)化株。
DNA測(cè)序方法按Sanger雙脫氧鏈終止法進(jìn)行。
DNA測(cè)序引物為引物1 GAACGCGGCTACAATTAATAC 21mer引物2 GCCAGATGCTGTAAGCAGCG20merDNA測(cè)序反應(yīng)RM反應(yīng)液5×測(cè)序反應(yīng)緩沖液 2ul標(biāo)記緩沖液2ulDTT 1ulSequenase 2ulDATP-35S 0.5ulMn緩沖液 1ul混勻、靜置冰中備用2％ Soft agarose 3ml引物(OD280＝1)3ul待測(cè)DNA 7ul混勻后98℃，10min，37℃ 10min，加8.5ul RM反應(yīng)液，37℃ 5min，分別取4.5ul加至ddG，ddA，ddT，ddC(每種2.5ul)中，37℃ 10min，加終止反應(yīng)液4ul，70℃ 2min，立即上樣電泳。
電泳條件在恒壓1700V下預(yù)電泳30min，待電泳膠表面55℃時(shí)方上樣電泳。
電泳后膠處理凝膠取下，置于5％甲醇，5％乙酸中固定15min，在固定液加2000mlH2O漂洗5min，取出膠，吸干水份，置于干膠機(jī)中，80℃真空干膠1hr，置于X片盒中-80℃感光過(guò)夜。
測(cè)序結(jié)果表明質(zhì)粒pZB1與從B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)和B29(pZB1)-11中所提質(zhì)粒在GTase-I上游區(qū)無(wú)任何差別(圖5)，說(shuō)明pZB1在轉(zhuǎn)化進(jìn)入變鏈菌過(guò)程中未發(fā)生突變。雖然pZB1在大腸桿菌宿主中為低拷貝質(zhì)粒，但該質(zhì)粒在變鏈菌中的復(fù)制數(shù)量尚不清楚，因此推測(cè)可能是由于pZB1在變鏈菌中的大量復(fù)制導(dǎo)致GTase-I基因數(shù)量增加而引起B(yǎng)29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)的GTase-I高表達(dá)。另外一種可能的機(jī)制是變鏈菌GTase-I基因的調(diào)控基因僅對(duì)染色體上的GTase-I基因有調(diào)控作用，因此，位于質(zhì)粒上的GTase-I基因得以大量表達(dá)。
變鏈菌MT8148 GTase-I基因與變鏈菌GS-5株gtfB上游比較存在著廣泛的一致性，這一結(jié)果與Fujiwara等的Southern雜交結(jié)果一致。因?yàn)樽冩溇鶰T8148與GS-5在遺傳型分類上為同一型，因此推測(cè)變鏈菌GTase基因可能在遺傳型同型菌株間高度保守。
權(quán)利要求
1.一種變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶過(guò)度表達(dá)株，其特征在于變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶過(guò)度表達(dá)株B29-33，CCTCC NOM201045。
2.一種實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述的變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶過(guò)度表達(dá)株的構(gòu)建方法，包括下列步驟A、構(gòu)建攜帶葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因的大腸桿菌—鏈球菌穿梭質(zhì)粒，首先構(gòu)建質(zhì)粒pTF37，質(zhì)粒pSP73用NdeI和HpaI消化，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后分離出221bp多克隆區(qū)，質(zhì)粒pMW119經(jīng)PuvII消化，瓊脂糖凝膠電泳并分離出3.9Kb的DNA片段后與221bp DNA片段混勻，末端平齊后連接；其次是構(gòu)建質(zhì)粒pTF41、質(zhì)粒pTF42，質(zhì)粒pSK6經(jīng)KpnI和BglII消化后，分離純化GTase基因5.0Kb，將gtfB基因與經(jīng)KpnI和BglII消化后的質(zhì)粒pTF37，質(zhì)粒pSK16經(jīng)KpnI消化，分離提純gtfC基因4.7b，將gtfC基因與經(jīng)KpnI和SphI消化后的pTF37連接，重組質(zhì)粒為pTF42；最后構(gòu)建質(zhì)粒pZB1和質(zhì)粒pZB2，質(zhì)粒pVA838經(jīng)XbaI和SalI消化后分離出6.2Kb DNA片段，將該DNA片段與經(jīng)XbaI和SalI消化后的質(zhì)粒pTF41連接，所產(chǎn)生的重組質(zhì)粒為質(zhì)粒pZB1，質(zhì)粒pVA838經(jīng)EcoRI和BamHI消化后，提取7.0KbDNA片段與經(jīng)EcoRI和BglII消化后的質(zhì)粒pTF42連接，所產(chǎn)生的重組質(zhì)粒為質(zhì)粒pZB2；B、質(zhì)粒pZB1對(duì)變鏈菌細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶CAGTase陷突變株B29的轉(zhuǎn)化，變鏈菌B29于變鏈菌轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中37℃，18hr，以變鏈菌轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基1∶40稀釋，37℃，1.5hr，加入質(zhì)粒pZB1至終濃度25ug/ml，37℃，2hr，離心，濃縮10倍，涂皿；C、對(duì)變鏈菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶CAGTase過(guò)度表達(dá)株的篩選，首先采用質(zhì)粒pZB1轉(zhuǎn)化變鏈B29后分離到轉(zhuǎn)化株，其中在MS瓊脂上表現(xiàn)為粗糙菌落；D、變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶高表達(dá)株GTase-I基因上游DNA序列分析，從變鏈菌B29(pZB1)-33 CCTCC No.M201045，變鏈菌B29(pZB1)-11中提取DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，于含氨芐青霉素和紅霉素的LB瓊脂中生長(zhǎng)，篩選轉(zhuǎn)化株。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種變形鏈球葡糖基轉(zhuǎn)移酶過(guò)度表達(dá)株方法及構(gòu)建方法,采用變列鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶過(guò)度表達(dá)株B29－33 pZB1,CCTCC NO:M201045,構(gòu)建攜帶葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因的大腸桿菌－鏈球菌穿梭質(zhì)粒;質(zhì)粒pZB1對(duì)變鏈菌細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶陷突變株B29的轉(zhuǎn)化;對(duì)變鏈菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶過(guò)度表達(dá)株的篩選。本發(fā)明解決了變形鏈菌細(xì)胞吸附型葡糖基轉(zhuǎn)移酶量少,提取困難的問(wèn)題,對(duì)抗齲疫苗有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1369554SQ0211552
公開(kāi)日2002年9月18日 申請(qǐng)日期2002年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月5日
發(fā)明者邊專 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)