一組環(huán)狀糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一組環(huán)狀糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因和應(yīng)用。該環(huán)狀糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶，來自軟腐芽孢桿菌(Bacillus?macerans)。本發(fā)明將其基因序列進(jìn)行了突變，得到了四種突變蛋白質(zhì)。對上述突變蛋白質(zhì)降解淀粉和生產(chǎn)環(huán)狀糊精的進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明某些位點(diǎn)突變得到的環(huán)狀糊精葡萄糖轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)α-CD的專一性更高，生產(chǎn)效率更高，在工業(yè)生產(chǎn)上具有重大價值。
【專利說明】一組環(huán)狀糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一組環(huán)狀糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)狀糊精的英文為cyclodextrin，簡稱⑶。環(huán)糊精是環(huán)糊精轉(zhuǎn)葡萄糖基酶(CGTase)作用于淀粉的產(chǎn)物，是六個以上葡萄糖以α-1，4糖苷鍵連結(jié)的環(huán)狀寡聚糖，其中最常見、研究最多的是<1-環(huán)糊精((1-^)、0-環(huán)糊精(0_?)、Y _環(huán)糊精(Y -⑶)，分別由六個、七個和八個葡萄糖分子構(gòu)成，是相對大和相對柔性的分子。
[0003]α -環(huán)狀糊精為淀粉深加工的一類高值化產(chǎn)品，由六個葡萄糖基通過α _1，4葡萄糖苷鍵連接而成的環(huán)狀低聚糖。在結(jié)構(gòu)上，α-⑶呈現(xiàn)出圓筒形(一端大，一端小)的立體結(jié)構(gòu)，具有“外親水，內(nèi)疏水”的特殊性質(zhì)。憑借其特殊的立體結(jié)構(gòu)，在功能上，使其可與多種客體化合物采用適當(dāng)方法進(jìn)行包結(jié)，從而改變被包結(jié)物質(zhì)的溶解度、揮發(fā)性及化學(xué)反應(yīng)性能等理化性質(zhì)，再加之其安全無毒性，使其具有一些非常有用的功能。
[0004]α -⑶是一種有潛力的食品添加劑，特別是可以作為目前已經(jīng)生產(chǎn)的β -環(huán)狀糊精(β_⑶)的替代產(chǎn)品。β_⑶已有大規(guī)模生產(chǎn)，但在使用過程中發(fā)現(xiàn)它有臟器沉積的風(fēng)險，以及包結(jié)效率低下的問題。
[0005]概括起來，α -CD在食品工業(yè)有如下應(yīng)用前景:(I)將水不溶性或溶解度低的化合物制成水溶解度高的包封化合物；(2)使包封的化合物具有良好的穩(wěn)定性(如保色、保香，耐熱、耐酸、耐水解、抗氧化、防揮發(fā)等)；(3)屏蔽作用(掩蓋食品中不愉快氣味和苦味)；(4)除去食品中不需要的成分(如咖啡因、膽固醇等)；(5)具有乳化、發(fā)泡作用，可作乳化劑和發(fā)泡劑；(6)使液體狀、油狀、揮發(fā)性物料固化。
`[0006]目前，α-⑶開發(fā)和應(yīng)用的最大障礙是缺乏具有高α _環(huán)糊精轉(zhuǎn)化活力的酶制劑，使得該產(chǎn)品的成本和價格高出β -CD的三倍，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。
[0007]α -⑶的生成,主要是以淀粉為原料,經(jīng)過環(huán)狀糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶(cyclodextringlucano-transferase簡稱CGTases)的糖基轉(zhuǎn)化作用而來。CGTases的專一性較低，在大多數(shù)情況下同時產(chǎn)生Y-⑶三種產(chǎn)物。采用不同的CGTases產(chǎn)生的三種產(chǎn)物比例不同，現(xiàn)有的CGTases的主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是β _⑶，同時也產(chǎn)生一定量的α-和Υ-⑶?，F(xiàn)有的研究方向主要是兩個方面:其一是從自然資源中尋求催化效果更好或?qū)Ｒ恍愿叩拿?；其二是對現(xiàn)有的酶蛋白進(jìn)行定向改造從而獲得催化效果更好或?qū)Ｒ恍愿叩拿浮?br>
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一組環(huán)狀糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因和應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明提供的環(huán)狀糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶，來自軟腐芽孢桿菌(Bacillus macerans),是將序列表的序列I所示蛋白質(zhì)進(jìn)行如下(a)、(b)、(C)和(d)四個突變得到的蛋白質(zhì):
[0010](a)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槿齻€連續(xù)的組氨酸[0011] (b)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槿齻€連續(xù)的組氨酸，同時將第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楸奖彼幔?br> [0012](c)將序列表的序列I自N末端第89位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榫彼?，同時將第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槿齻€連續(xù)的組氨酸，并且將第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楸奖彼帷?br> [0013](d)將序列表的序列I自N末端第89位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榫彼?，同時將第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槿齻€連續(xù)的組氨酸，同時將第180位氨基酸殘基由甘氨酸突變?yōu)榱涟彼?，并且將?95位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楸奖彼帷?br> [0014]編碼所述蛋白質(zhì)的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0015]所述基因具體可為將序列表的序列2所示蛋白質(zhì)進(jìn)行如下(e)、(f)、(g)和(h)四個突變得到的DNA分子:
[0016](e)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃ACCACCAC
[0017](f)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃ACCACCAC，同時將第583-585位核苷酸由TAT突變?yōu)镃GA ；
[0018](g)將序列表的序列2自5’末端第265-267位核苷酸由TAT突變?yōu)镃GA，同時將第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃ACCACCAC，并且將第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)門TC。
[0019](h)將序列表的序列2自5’末端第265-267位核苷酸由TAT突變?yōu)镃GA，同時將第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃ACCACCAC，將538-540位核苷酸由GGG突變?yōu)镃TC，并且將第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)門TC。
[0020]含有所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0021]所述重組表達(dá)載體具體可為將所述基因插入載體pET_22b(+)的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。所述重組表達(dá)載體具體可為將所述基因插入載體pET-22b (+)的BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)之間得到的重組質(zhì)粒。
[0022]所述重組菌具體可為將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌得到的重組菌。所述大腸桿菌具體可為大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0023]本發(fā)明還保護(hù)所述蛋白質(zhì)的應(yīng)用，為如下(I )或(II)或(III):
[0024]( I )制備環(huán)狀糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶；
[0025]( II )降解淀粉(如可溶性淀粉);
[0026](III)生產(chǎn)α-環(huán)狀糊精。
[0027]本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，生產(chǎn)α -⑶的專一性更高，生產(chǎn)效率更高，在工業(yè)生產(chǎn)上具有重大價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為重組質(zhì)粒甲的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0029]圖2為α -CD標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0030]圖3為β -CD標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0031 ] 圖4為Y -CD標(biāo)準(zhǔn)曲線【具體實(shí)施方式】
[0032]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值?？扇苄缘矸?北京現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號:20070216。載體pET-22b(+):Novagen，產(chǎn)品目錄號為69744-3。大腸桿菌BL21 (DE3):北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號為CD601-01。
[0033]TB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨12、酵母提取膏24、甘油4mL，蒸餾水定容。
[0034]實(shí)施例1、突變蛋白及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)
[0035]從自然界篩選到一株軟腐芽孢桿菌(Bacillus macerans)，可以生產(chǎn)環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，該菌株中的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶基因如序列表的序列2所不，編碼序列表的序列I所不的蛋白質(zhì)。
[0036]將序列I所不蛋白質(zhì)命名為ct-CGTase-1蛋白，將其編碼基因命名為a-CGTase-1基因(如序列2所不)。將序列3所不蛋白質(zhì)命名為a-CGTase-WT蛋白(NCBI中公開的序列)，將其編碼基因命名為α _CGTase-WT基因(如序列4所不)。
[0037]序列I與序列3的差異僅在于第590位氨基酸殘基(Μ/V)和第677位氨基酸殘基(S/G)。序列2與序列4的差異僅在于第1768位核苷酸(Α/G)和第2029位核苷酸(Α/G)。
[0038]以序列表的序列1所示雙鏈DNA為模板，對167位氨基酸進(jìn)行突變，得到一個突變體；對167和195位氨基酸同時進(jìn)行定點(diǎn)突變，得到一個突變體；對89、167和195位氨基酸同時進(jìn)行定點(diǎn)突變，得到一個突變體；對89、167、180和195位氨基酸同時進(jìn)行突變，得到一個突變體。通過對突變體庫中各個基因表達(dá)的蛋白進(jìn)行酶活鑒定，發(fā)現(xiàn)了一系列酶的產(chǎn)物專一性區(qū)別于序列I所示a-CGTase-WT蛋白的突變蛋白及其編碼基因。
[0039]實(shí)施例2、酶活鑒定
[0040]一、分別人工合成如下雙鏈DNA分子:
[0041](1)雙鏈DNA分子1:與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)榱?CACCACCAC ;相應(yīng)的將序列I中的第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槿齻€連續(xù)的組氨酸。雙鏈DNA分子I編碼的蛋白命名為蛋白I。
[0042](2)雙鏈DNA分子2:與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃ACCACCAC，并將自5’末端第583-585位核苷酸由TAT突變?yōu)镃GA ;相應(yīng)的將序列I中的第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槿齻€連續(xù)的組氨酸，并將第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楸奖彼?。雙鏈DNA分子2編碼的蛋白命名為蛋白2。
[0043](3)雙鏈DNA分子3:與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第265-267位核苷酸由TAT突變?yōu)镃GA，同時將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃ACCACCAC,并將自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)門TC ;相應(yīng)的將序列I中的第89位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榫彼?，同時將第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槿齻€連續(xù)的組氨酸，并將第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楸奖彼?。雙鏈DNA分子3編碼的蛋白命名為蛋白3。[0044](4)雙鏈DNA分子4:與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第265-267位核苷酸由TAT突變?yōu)镃GA，同時將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃ACCACCAC，并將自5’末端第538-540位核苷酸由GGG突變?yōu)镃TC，并將自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)門TC ;相應(yīng)的將序列I中的第89位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榫彼幔瑫r將第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槿齻€連續(xù)的組氨酸，將第180位氨基酸殘基由甘氨酸突變?yōu)榱涟彼幔⒌?95位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楸奖彼?。雙鏈DNA分子3編碼的蛋白命名為蛋白3。
[0045](5)雙鏈DNA分子5:即序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。
[0046](6)雙鏈DNA分子6:即序列表的序列4所不的雙鏈DNA分子。
[0047]二、重組質(zhì)粒的構(gòu)建(結(jié)構(gòu)示意圖見圖1)
[0048]1、設(shè)計(jì)一對弓丨物，由S2和A3組成。
【權(quán)利要求】
1.將序列表的序列I所示蛋白質(zhì)進(jìn)行如下(a)、(b)、(c)和(d)四個突變得到的蛋白質(zhì): (a)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槿齻€連續(xù)的組氨酸； (b)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槿齻€連續(xù)的組氨酸，同時將第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楸奖彼幔? (c)將序列表的序列I自N末端第89位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榫彼?，同時將第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槿齻€連續(xù)的組氨酸，并且將第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楸奖彼帷? Cd)將序列表的序列I自N末端第89位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榫彼?，同時將第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槿齻€連續(xù)的組氨酸，同時將第180位氨基酸殘基由甘氨酸突變?yōu)榱涟彼?，并且將?95位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楸奖彼帷?br> 2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因?qū)⑿蛄斜淼男蛄?所示蛋白質(zhì)進(jìn)行如下(e)、(f)、(g)和(h)四個突變得到的DNA分子: Ce)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃ACCACCACCf)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃ACCACCAC，同時將第583-585位核苷酸由TAT突變?yōu)镃GA ； (g)將序列表的序列2自5’末端第265-267位核苷酸由TAT突變?yōu)镃GA，同時將第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃A`CCACCAC，并且將第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)門TC。 (h)將序列表的序列2自5’末端第265-267位核苷酸由TAT突變?yōu)镃GA，同時將第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃ACCACCAC，將538-540位核苷酸由GGG突變?yōu)镃TC，并且將第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)門TC。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于:所述重組表達(dá)載體為將所述基因插入載體pET-22b (+)的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。
6.如權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于:所述重組菌是將權(quán)利要求7所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌得到的重組菌。
7.一種制備權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的方法，是培養(yǎng)權(quán)利要求4或6所述重組菌，得到權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)。
8.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的應(yīng)用，為如下(I)或(II)或(III): (I )制備環(huán)狀糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶； (II)降解淀粉； (III)生產(chǎn)α-環(huán)狀糊精。
【文檔編號】C12N1/21GK103589697SQ201310488430
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月17日
【發(fā)明者】孫艷, 岳洋 申請人:北京航空航天大學(xué)