專利名稱：他汀類物質(zhì)在制備脂肪肝防治藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及他汀類藥物以孤兒核受體Nur77為 靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)作用。
背景技術(shù)：
脂肪肝(Fatty Liver)是指由于各種原因引起的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積過多的病變。 正常肝內(nèi)脂肪占肝重3-4% ，如果脂肪含量超過肝重的5 %即為脂肪肝，嚴(yán)重者脂肪量可達(dá) 40-50%。肝內(nèi)脂質(zhì)過度沉積會(huì)影響正常的肝功能，部分患者最終導(dǎo)致發(fā)展為脂肪性肝炎， 甚至脂肪性肝硬化。脂肪性肝病正嚴(yán)重威脅國人的健康，成為僅次于病毒性肝炎的第二大 肝病，已被公認(rèn)為隱蔽性肝硬化的常見原因。 到目前為止，尚無防治脂肪肝的有效藥物。 一般常選用保護(hù)肝細(xì)胞、去脂藥物及抗 氧化劑等，如維生素B、 C、 E、卵磷脂、熊去氧膽酸、水飛薊素、肌苷、輔酶A、還原型谷胱甘肽、 ?；撬?、肝泰樂，以及某些降脂藥物(例如肝旨清)等等。上述藥物對(duì)脂肪肝的治療作用 分子機(jī)制不明，大多仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證其療效以及安全性。 他汀類藥物具有降低血脂的功能，被廣泛地應(yīng)用于治療心血管系統(tǒng)疾病(LaRosa JC， He J， Vupputuri S. Effect of statins on risk of coronary disease. JAMA 1999 ; 282 :2340-6)，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)他汀類藥物除了具有降低血脂功能外，還具有抗炎、降壓等 多向性效應(yīng)?，F(xiàn)已有5種他汀類藥物可供臨床選用(l)洛伐他汀(lovastatin)，常見 藥物有美降之、羅華寧、洛特、洛之特等，血脂康的主要成分也是洛伐他汀。(2)辛伐他汀 (simvastatin)，常見藥物為舒降之、理舒達(dá)、京必舒新、澤之浩、蘇之、辛可等。(3)普伐他 汀(pravastatin)，常用藥有普拉固、美百樂鎮(zhèn)。(4)氟伐他汀(f luvastatin)，常見藥有來 適可。(5)阿托伐他汀(atorvastatin)，常見藥為立普妥、阿樂。普伐他汀(pravastatin) 為3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-C0A還原酶)的競爭性抑制劑，HMG-C0A還 原酶是膽固醇生物合成初期階段的限速酶?？赡嫘缘匾种艸MG-C0A還原酶，從而抑制膽固 醇的生物合成。主要從二方面發(fā)揮其降脂作用，第一是通過可逆性抑HMG-COA還原酶的活 性使細(xì)胞內(nèi)膽固醇的量有一定程度的降低，導(dǎo)致細(xì)胞表面低密度脂蛋白(LDL)受體數(shù)的增 加，從而加強(qiáng)了由受體介導(dǎo)的LDL-C的分解代謝及血液中LDL-C的清除，第二，是通過抑制 LDL-C的前體一極低密度脂蛋白(VLDL-C)在肝臟中的合成從而抑制LDL-C的生成。
盡管目前已知他汀類藥物的一些用途，然而本領(lǐng)域還有必要研究這些藥物是否還 有其它的作用機(jī)制以及其它方面的藥用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供他汀類物質(zhì)的新用途，用于上調(diào)細(xì)胞中孤兒受體Nur77的 表達(dá)。 在本發(fā)明的第一方面，提供一種他汀類物質(zhì)的用途，用于制備上調(diào)細(xì)胞中孤兒受 體Nur77的表達(dá)的組合物。
在另 一 優(yōu)選例中，所述的他汀類物質(zhì)選自普伐他汀(Pravastatin)或其 藥學(xué)上可接受的鹽，辛伐他汀(Simvastatin)或其藥學(xué)上可接受的鹽，阿托伐他汀 (Atorvastatin)或其藥學(xué)上可接受的鹽，或它們的組合。 在另一優(yōu)選例中，所述的他汀類物質(zhì)是普伐他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于抑制細(xì)胞中脂質(zhì)沉淀。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于減緩細(xì)胞的脂肪變。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于防治脂肪肝。
在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞是肝細(xì)胞。 在本發(fā)明的第二方面，提供一種制備上調(diào)細(xì)胞中孤兒受體Nur77的表達(dá)的組合物
的方法，所述方法包括將有效量的他汀類物質(zhì)與藥學(xué)上可接受的載體混合。
在另一優(yōu)選例中，所述的他汀類物質(zhì)選自普伐他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽，辛伐
他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽，阿托伐他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽，或它們的組合。 在本發(fā)明的第三方面，提供一種非治療性地上調(diào)細(xì)胞中孤兒受體Nur77表達(dá)的方
法，所述方法包括給予需要上調(diào)的對(duì)象有效量的他汀類物質(zhì)。 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。


圖1是隨著油酸濃度的升高誘導(dǎo)肝H印G2細(xì)胞脂質(zhì)沉積作用逐漸增強(qiáng)的顯微細(xì)胞 圖，其中紅色越多表示脂質(zhì)越多。 圖2是普伐他汀抑制肝H印G2細(xì)胞中脂質(zhì)沉積作用的顯微細(xì)胞圖，其中紅色越多 表示脂質(zhì)越多。 圖3A是Western Blot檢測(cè)法測(cè)定普伐他汀誘導(dǎo)肝H印G2細(xì)胞中孤兒核受體 Nur77表達(dá)的電泳結(jié)果。 圖3B是Western Blot檢測(cè)法測(cè)定他汀類藥物誘導(dǎo)肝H印G2細(xì)胞中孤兒核受體 Nur77表達(dá)的電泳結(jié)果。 圖4是轉(zhuǎn)染GFP-Nur77的肝H印G2細(xì)胞顯示出脂質(zhì)沉積減少的顯微細(xì)胞圖。其中， 箭頭所指為綠色熒光蛋白表達(dá)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)他汀類物質(zhì)具有上調(diào)細(xì)胞內(nèi)孤兒受 體Nur77表達(dá)水平的作用。因此，他汀類物質(zhì)可用于制備細(xì)胞內(nèi)孤兒受體Nur77低表達(dá)或 不表達(dá)所導(dǎo)致的疾?。换蛴糜谕ㄟ^調(diào)節(jié)孤兒受體Nur77表達(dá)來發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化發(fā) 育和凋亡的作用，或調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝和能量代謝。 他汀類物質(zhì) 本文所用的術(shù)語"他汀類物質(zhì)"指一類3-羥基3_甲基戊二酰輔酶A還原酶 (HMG-COA還原酶)抑制劑的總稱。所述的"他汀類物質(zhì)"具有接近的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。所述的 "他汀類物質(zhì)"包括普伐他汀(Pravastatin)，辛伐他汀(Simvastatin)，阿托伐他汀，洛伐 他汀，美伐他汀等。
本發(fā)明還包括上述化合物的異構(gòu)體、外消旋體、藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前 體，只要它們也具有調(diào)節(jié)孤兒受體Nur77表達(dá)等作用。所述的"藥學(xué)上可接受的鹽"是指 一類化合物與無機(jī)酸、有機(jī)酸、堿金屬或堿土金屬等反應(yīng)生成的鹽。這些鹽包括(但不限 于)(l)與如下無機(jī)酸形成的鹽如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸；(2)與如下有機(jī)酸形成的鹽， 如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、馬來酸、或精氨酸。其它的鹽包括與堿金屬或堿土金 屬(如鈉、鉀、鈣或鎂)形成的鹽，以酯、氨基甲酸酯，或其它常規(guī)的"前體藥物"的形式?；?合物具有一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱中心。所以，這些化合物可以作為外消旋的混合物、單獨(dú)的對(duì)映 異構(gòu)體、單獨(dú)的非對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體混合物、順式或反式異構(gòu)體存在。
本文所用的術(shù)語"異構(gòu)體"包括幾何異構(gòu)體、對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體(如順反 異構(gòu)體，構(gòu)象異構(gòu)體)。 所述的"化合物的前體"指當(dāng)用適當(dāng)?shù)姆椒ǚ煤?，該化合物的前體在病人體內(nèi)進(jìn)
行代謝或化學(xué)反應(yīng)而轉(zhuǎn)變成一種他汀類化合物，或他汀類化合物的鹽或溶液。
作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的他汀類物質(zhì)選自普伐他汀(I)或其藥學(xué)上
可接受的鹽，辛伐他汀(II)或其藥學(xué)上可接受的鹽，阿托伐他汀(III)或其藥學(xué)上可接受
的鹽，或它們的組合。更優(yōu)選地，所述的他汀類物質(zhì)選自普伐他汀(I)或其藥學(xué)上可接
受的鹽，辛伐他汀(II)或其藥學(xué)上可接受的鹽，這兩種他汀類物質(zhì)具有非常接近的化學(xué)結(jié)
構(gòu)。
<formula>formula see original document page 5</formula> 作為本發(fā)明的一種更優(yōu)選的方式，所述的他汀類物質(zhì)是普伐他汀或其藥學(xué)上可接 受的鹽；本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，普伐他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽具有比其它他汀類物質(zhì)具 有更優(yōu)異的上調(diào)孤兒受體Nur77表達(dá)的效果。 本領(lǐng)域人員應(yīng)理解，可通過多種本領(lǐng)域熟知的方法、利用公知的原料，來獲得本發(fā) 明的他汀類物質(zhì)或其異構(gòu)體、外消旋體、藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前體，比如化學(xué)合成 或從生物(如動(dòng)物或植物)中提取的方法，這些方法均包含在本發(fā)明中。此外，所述的他汀 類物質(zhì)也可通過商購的途徑獲得。
合成化學(xué)改造、保護(hù)官能團(tuán)方法學(xué)(保護(hù)或去保護(hù))對(duì)合成應(yīng)用化合 物是很有幫助的，并且是現(xiàn)有技術(shù)中公知的技術(shù)，如R. Larock， Comprehensive OrganicTransformations, VCH Publishers(1989) ;T.W.Greene and P.G.M. Wuts， Protective Groups in Organic Synthesis,3rd Ed. ， John Wiley and Sons(1999); L Fieser and M. Fieser， Fieser and Fieser' s Reagents for Organic Synthesis, JohnWiley and Sons(1994); 禾口 L Paquette， ed. ， Encyclopedia of Reagents for OrganicSynthesis， John Wiley and Sons (1995)中者瞎公開。
用途 基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了他汀類物質(zhì)或其異構(gòu)體、外消旋體、藥學(xué)上 可接受的鹽、水合物或前體的用途，用于制備上調(diào)細(xì)胞中孤兒受體Nur77的表達(dá)的組合物； 或用于制備通過上調(diào)細(xì)胞中孤兒受體Nur77的表達(dá)來抑制細(xì)胞中脂質(zhì)沉淀的組合物；或用 于制備通過上調(diào)細(xì)胞中孤兒受體Nur77的表達(dá)來減緩細(xì)胞的脂肪變的組合物；或用于制備 通過上調(diào)細(xì)胞中孤兒受體Nur77的表達(dá)來防治脂肪肝的組合物。 孤兒受體Nur77又稱為TR3或NGFI-B，是核受體超家族的重要成員，它也是一種 立刻早期基因，其表達(dá)可以被血清、生長因子、十四烷酰佛波醋酸酯-13(TPA)以及鈣信號(hào) 迅速誘導(dǎo)(Zhang XK. et. al. ， Expert 0pin Ther Tar 2007 ;11 :69_79 ;Moll UM， et. al.， Oncogene 2006;25:4725-43)。它參與調(diào)節(jié)多種重要不同的生物學(xué)功能，涉及細(xì)胞增殖、 分化發(fā)育和凋亡過程。有研究提示Nur77調(diào)控了骨骼肌細(xì)胞中脂質(zhì)和能量代謝所涉及 的關(guān)鍵基因，如AMP-激活蛋白激酶Y3(AMPKY3)，解偶聯(lián)蛋白(UCP) 3， CD36，脂質(zhì)素受 體2(adiponectinrec印tor 2)，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4 (GLUT4)，以及小窩蛋白3 (caveolin-3) (M. A. Maxwell, M. E. Cleasby， Nur77 regulates lipolysis in skeletal muscle cells. Evidencefor cross—talk between the beta-adrenergic and an orphan nuclear hormonerec印tor pathway, J. Biol. Chem. 2005 ;280 :12573-12584)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Nur77在棕 色和白色脂肪組織上有表達(dá)。眾所周知，這兩種脂肪組織在能量代謝平衡上起著不同作用， 前者在小型哺乳類動(dòng)物主司非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱，因此只有少數(shù)基因會(huì)同時(shí)表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)用低溫 暴露的方法誘導(dǎo)小鼠Nur77表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其可以抑制UCP1增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄激活(Kanz 1 eiter T， Schneider T， Walter I， Bolze F等，Evidence for Nr4al as a cold-induced effector of brown fat thermogenesis. PhysiolGenomics 2005 ;24 :37-44) 。 2006年Bonta又有
報(bào)導(dǎo)NR4A亞家族成員在人類動(dòng)脈粥樣硬化斑塊處的巨噬細(xì)胞上有表達(dá)；并發(fā)現(xiàn)高表達(dá)
NR4A因子的THP-1和U937細(xì)胞比敲除了 Nur77或NOR-1的細(xì)胞明顯減少了氧化脂質(zhì)顆 粒的攝取，與脂質(zhì)攝入相關(guān)的基因SR(清道夫受體)-A、 CD36和CDllb mRNA的表達(dá)也降 低了約2倍(Bonta PI， van Tiel CM， Vos M， et al. Nuclear rec印tors Nur77， Nurrl， and N0R—1 expressed in atherosclerotic lesion macrophages reduce lipidloading and inflammatory responses. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2006 Oct ;26(10): 2288-94)。 基于所述的他汀類物質(zhì)可以上調(diào)Nur77的表達(dá)，它們對(duì)于任何Nur77表達(dá)過低或 不表達(dá)導(dǎo)致的失調(diào)、紊亂及相關(guān)疾病都是有用的。包括但不限于通過調(diào)節(jié)孤兒受體Nur77 表達(dá)來發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化發(fā)育和凋亡的作用，或調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝和能量代謝。例 如，所述的他汀類物質(zhì)可用于癌癥的防治。
本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)他汀類物質(zhì)可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Nur77的高表達(dá)，并通過Nur77的 介導(dǎo)減少細(xì)胞中脂質(zhì)沉積的量。并且，還發(fā)現(xiàn)他汀類物質(zhì)可以用于治療脂肪肝。他汀類物 質(zhì)通過調(diào)控孤兒核受體Nur77的表達(dá)從而抑制肝細(xì)胞的脂質(zhì)沉積并減緩細(xì)胞的脂肪變。他 汀類物質(zhì)對(duì)肝細(xì)胞的脂質(zhì)沉積的抑制與對(duì)調(diào)控孤兒核受體Nur77的高表達(dá)密切相關(guān)。從而 為他汀類物質(zhì)開發(fā)出了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域，擴(kuò)展了其商業(yè)開發(fā)前景，并進(jìn)一步為其參與治 療脂肪肝提供了 一個(gè)分子靶點(diǎn)。
組合物 如本文所用，術(shù)語"本發(fā)明的組合物"通常是藥物組合物，其含有他汀類物質(zhì)或其 異構(gòu)體、外消旋體、藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前體作為上調(diào)細(xì)胞孤兒受體Nur77表達(dá)的 活性成分；以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。所述的組合物也可以是一種食物組合物。
本發(fā)明中，術(shù)語"含有"表示各種成分可一起應(yīng)用于本發(fā)明的混合物或組合物中。 因此，術(shù)語"主要由...組成"和"由...組成"包含在術(shù)語"含有"中。 本發(fā)明中，"藥學(xué)上可接受的"成分是適用于人和/或動(dòng)物而無過度不良副反應(yīng) (如毒性、剌激和變態(tài)反應(yīng))即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。 本發(fā)明中，"藥學(xué)上可接受的載體"是用于將本發(fā)明的他汀類物質(zhì)或其異構(gòu)體、外 消旋體、藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前體傳送給動(dòng)物或人的藥學(xué)上或食品上可接受的溶 劑、懸浮劑或賦形劑。載體可以是液體或固體。適用于本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的載體包括 (但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。 本發(fā)明還提供了制備上調(diào)細(xì)胞中孤兒受體Nur77的表達(dá)的組合物的方法，所述方 法包括將有效量的他汀類物質(zhì)與藥學(xué)上可接受的載體混合。活性成分在組合物中的重量 比例例如可以是0. 0001-50wt% ;較佳地可以是0. 001-20wt%。 本發(fā)明所述的組合物的劑型可以是多種多樣的，只要是能夠使活性成分有效地到 達(dá)哺乳動(dòng)物體內(nèi)(如肝組織上)的劑型都是可以的。所述的劑型例如可選自溶液、懸浮 液、片劑、膠囊、粉末、顆粒、糖漿。當(dāng)所述化合物或其組合物用于上述用途時(shí)，它們與一種 或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑混合，如溶劑、稀釋劑等，而且可以用如下形式口服給 藥片劑、膠囊、可分散的粉末、顆粒或懸浮液(含有如約0. 05_5%懸浮劑)、糖漿(含有如 約10-50%糖)、和酏劑(含有約20-50%乙醇)，或者以無菌可注射溶液或懸浮液形式(在 等滲介質(zhì)中含有約0. 05-5%懸浮劑)進(jìn)行非腸胃給藥。 所用的活性成分的有效施用劑量可隨所用的化合物、給藥的模式和待治療的疾 病的嚴(yán)重程度而變化。然而，通常當(dāng)本發(fā)明的他汀類物質(zhì)每天以約0. 01-1000mg/kg動(dòng)物 體重的劑量給予時(shí)，能得到令人滿意的效果，較佳地每天以l-3次分開的劑量給予，或以 緩釋形式給藥。對(duì)大部分大型哺乳動(dòng)物而言，每天的總劑量約為l-6000mg，較佳地約為 10-1000mg?？烧{(diào)節(jié)此劑量方案以提供最佳治療應(yīng)答。例如，由治療狀況的迫切要求，可每 天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于 (1)本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)他汀類物質(zhì)可以誘導(dǎo)Nur77的表達(dá)，并且可以減少細(xì)胞中
脂質(zhì)沉積的量，為他汀類物質(zhì)提供了一個(gè)新的應(yīng)用途徑，增強(qiáng)了其商業(yè)價(jià)值。 (2)基于本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，他汀類物質(zhì)可用于防治細(xì)胞內(nèi)孤兒受體Nur77低表達(dá)
或不表達(dá)所導(dǎo)致的疾病；或用于通過調(diào)節(jié)孤兒受體Nur77表達(dá)來發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化發(fā)育和凋亡的作用，或調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝和能量代謝。 (2)本發(fā)明提供的孤兒核受體Nur77可以用于指導(dǎo)篩選其他藥物及中草藥的活性 成分，通過模擬他汀類物質(zhì)和孤兒核受體Nur77的作用，從而指導(dǎo)篩選其他藥物及中草藥， 從中獲得具有治療脂肪肝的活性成分。 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)算。 在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，使用的試劑如下 油酸Oleic acid(簡寫為0A， Sigma)溶于二甲基亞砜(DMS0)，制成終濃度為1M/ L，保存于-2(TC。 oil red O(bio basic inc)染液將100ml異丙醇倒入三角瓶中，再加入0. 5g油 紅0，于水浴中慢慢加熱使之溶解，待完全溶解后取出。冷卻至室溫后過濾，裝于棕色小磨 砂口瓶中保存。臨用前取6ml濾液加4ml蒸餾水，混合后靜止10min，過濾。室溫下染色 15min。Harris氏蘇木素液 甲液蘇木素lg，無水酒精10ml ;乙液硫酸鋁鉀20g，蒸餾水200ml ;丙液一氧化
汞0. 5g。先將甲液加熱溶解后，密封待用，再將乙液加熱溶解至沸，去火，待溶液仍處于小沸
騰狀態(tài)時(shí)再將甲液徐徐傾入其中，全部混合后，再使溶液在短時(shí)間內(nèi)加熱至沸騰，去火，最
后，將一氧化汞緩慢傾入溶液中。此時(shí)液體變?yōu)樯钭仙谎趸糠湃牒?，再將溶?br> 加溫至沸騰片刻，立即將溶液放入流動(dòng)的冷水中，并緩緩地連續(xù)搖晃至溶液完全冷卻為止。
隔夜后過濾，加入冰醋酸(按5%比例)混勻，再過濾后保存于冰箱內(nèi)備用。 在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，油紅0染色的方法如下吸去24孔板中的培液，冷凍
PBS洗3次。10%多聚甲醛固定10min，冷凍PBS洗3次，油紅0染色15min，冷凍PBS洗3
次，85%丙二醇浸漬3min，水洗3次，蘇木素復(fù)染0. 5-lmin，水洗3次，甘油封片。 在本發(fā)明的下述實(shí)施例中使用的質(zhì)粒GFP-Nur77按Zhang XK等提供的方法
(Zhang XK， et al. ， Molecular and Cellular Biology, 23 (23) :8651-8667,2003)構(gòu)建獲得。 在本發(fā)明的下述實(shí)施例中使用的普伐他汀溶液是由普伐他汀鈉片(中美上海施 貴寶制藥有限公司)溶于二甲基亞砜(匿SO)，制備成不同濃度的溶液。 在本發(fā)明的下述實(shí)施例中使用的辛伐他汀溶液由辛伐他汀溶于二甲基亞砜 (DMS0)，制備成不同濃度的溶液。 在本發(fā)明的下述實(shí)施例中使用的阿托伐他汀溶液由阿托伐他汀溶于二甲基亞砜 (DMS0)，制備成不同濃度的溶液。 實(shí)施例1、隨著油酸含量依次增高肝H印G2細(xì)胞中的脂質(zhì)沉積逐漸增加
將在含10%小牛血清(杭州四季青)的DMEM(Gibco)中培養(yǎng)的H印G2細(xì)胞(ATCC， HB-8065)按7X 103個(gè)/孔的密度均勻鋪于24孔板，之前將lcmX lcm的玻片放入制作細(xì)胞 爬片。過2h，等細(xì)胞基本貼壁后每孔補(bǔ)加500mllOXDMEM，培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)過夜的H印G2細(xì)胞加入油酸處理12h或24h。油酸濃度分別為O. 125mM，0. 25mM，0. 5mM，1.0mM。不同的濃 度和時(shí)間均設(shè)置2個(gè)孔。 加藥處理24h后，在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)用油酸處理后的細(xì)胞與沒有經(jīng)過任何處 理的對(duì)照組相比形態(tài)發(fā)生明顯變化，如細(xì)胞變圓，變大，圍繞細(xì)胞核的胞質(zhì)中有很多透明 顆粒，為脂肪顆粒。且隨著油酸濃度的升高，時(shí)間的加長這種現(xiàn)象更加明顯。收細(xì)胞進(jìn)行油 紅O染色，再用蘇木素染細(xì)胞核。熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果如圖l所示。
根據(jù)圖1的結(jié)果，油酸可以明顯誘導(dǎo)H印G2細(xì)胞中的脂質(zhì)沉積(染色顯示紅色)， 且油酸濃度越高，效果越明顯。此結(jié)果說明油酸誘導(dǎo)H印G2細(xì)胞脂肪變性可以作為本次研 究的模型，將1. OmM的油酸處理24h定為誘導(dǎo)H印G2細(xì)胞脂肪變的最佳濃度。
實(shí)施例2、普伐他汀可降低油酸誘導(dǎo)的肝H印G2細(xì)胞中的脂質(zhì)沉積
H印G2細(xì)胞按7 X 103個(gè)/孔的密度均勻鋪于在24孔板，之前將lcmX lcm的玻片放 入制作細(xì)胞爬片。過2h，等細(xì)胞基本貼壁后每孔補(bǔ)加500mllOXDMEM，培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)過夜 后普伐他汀和油酸共同加藥處理如下對(duì)照(Con，正常培養(yǎng)，不加藥)，1. OmM油酸，10—7mol/ L普伐他汀+l. OmM油酸，10—6mol/L普伐他汀+l. OmM油酸，10—5mol/L普伐他汀+1. OmM油酸。 在24孔板中取細(xì)胞生長狀態(tài)良好的10個(gè)孔進(jìn)行加藥，不同的處理設(shè)2個(gè)孔。
加藥處理24h后，顯微鏡下觀察，可以看到加入1. OmM油酸的孔中細(xì)胞變圓，變大， 胞質(zhì)中圍繞細(xì)胞核有很多透明顆粒。同時(shí)加入普伐他汀處理的細(xì)胞，10—^01/L普伐他汀 +1. OmM油酸的孔中有類似的形態(tài)變化，10—6mol/L普伐他汀+1. OmM油酸的孔中形態(tài)變化不 是很明顯，10—5mol/L普伐他汀+1. OmM油酸的孔中細(xì)胞狀態(tài)與對(duì)照(Con)相似，幾乎沒有變 化。收細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色，再用蘇木素染細(xì)胞核。熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果如圖2所示。
根據(jù)圖2的結(jié)果，普伐他汀可以降低因油酸引起的H印G2細(xì)胞的脂質(zhì)沉積。其作 用效果呈濃度依賴性。此結(jié)果說明，普伐他汀的確可以抑制H印G2細(xì)胞的脂肪變。
實(shí)施例3、他汀類藥物對(duì)肝H印G2細(xì)胞中孤兒核受體Nur77蛋白表達(dá)的調(diào)控
本實(shí)施例中使用的免疫蛋白印跡檢測(cè)(Western Blot)的方法參考《分子克隆實(shí)驗(yàn) 室手冊(cè)》，具體方案如下 將肝H印G2細(xì)胞，均勻接種于6cm細(xì)胞板中，于37t:，5X的二氧化碳箱中，培養(yǎng) 過夜。待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期后，換成無血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓24h，然后用濃度分別為0、 10—7mol/L (12h， 24h) 、 10—6mol/L (12h， 24h) 、 10—5mol/L (12h， 24h)的他汀類藥物(分別選用普 伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀)處理H印G2細(xì)胞24h后，用0. 5%的胰酶消化細(xì)胞，用細(xì)胞 裂解液裂解消化好的細(xì)胞，得到蛋白樣品。 用60ii g的上樣量進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，測(cè)定裂 解液蛋白濃度，接著用轉(zhuǎn)膜儀把蛋白用電轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。之后，用含5%奶粉的 TBST溶液，于室溫封閉lh，然后加入l : 1000稀釋的兔抗Nur77多克隆抗體(Santa Cruz) 作為一抗，4t:孵育過夜，吸掉一抗后，用TBST洗滌3次，每次洗滌5min ;然后加入l : 10000 稀釋的偶聯(lián)辣根過氧化物酶的抗兔二抗(Pierce)，于室溫?fù)u床孵育1小時(shí)后，吸掉二抗，用 TBST洗滌3次，每次洗滌5min。用ECL試劑盒(Thermo)顯色，在壓片盒中壓片，然后顯影， 定影得到膠片。結(jié)果如圖3A和圖3B所示。 根據(jù)圖3A的結(jié)果，表明普伐他汀能夠誘導(dǎo)孤兒核受體Nur77蛋白在H印G2細(xì)胞中 的高表達(dá)，且加藥時(shí)間越長表達(dá)量越高。
根據(jù)圖3B的結(jié)果，表明多種他汀類藥物都能夠誘導(dǎo)孤兒核受體Nur77蛋白在
H印G2細(xì)胞中的高表達(dá)，其中普伐他汀誘導(dǎo)效果最佳。 實(shí)施例4、轉(zhuǎn)染GFP-Nur77的肝H印G2細(xì)胞中脂質(zhì)沉積減少 H印G2細(xì)胞按7X 103個(gè)/孔的密度均勻鋪于在24孔板，之前將lcmX lcm的玻片 放入制作細(xì)胞爬片。過2h，等細(xì)胞基本貼壁后每孔補(bǔ)加500mllOXDMEM，培養(yǎng)過夜。將培 養(yǎng)過夜的H印G2細(xì)胞，換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)lh，之后轉(zhuǎn)染質(zhì)粒GFP-Nur77。轉(zhuǎn)染6小時(shí)后使 用新的無血清DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行換液，待細(xì)胞生長24h后，加入1. OmM的油酸處理24h。收 細(xì)胞，油紅染色，水洗3次，以lii g/ml DAPI(Sigma)30。C避光染色10min，水洗3次。封片。 用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果如圖4所示。 根據(jù)圖4的結(jié)果，與同視野內(nèi)沒有被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染GFP-Nur77的H印G2細(xì) 胞中脂質(zhì)沉積有所減少。說明孤兒核受體Nur77的高表達(dá)具有抑制肝H印G2細(xì)胞中脂質(zhì)沉 積的作用。 肝H印G2細(xì)胞作為研究肝脂肪代謝已被作為一個(gè)公認(rèn)的研究工具，除了利用 H印G2細(xì)胞外，本發(fā)明人還在原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞中同樣發(fā)現(xiàn)上述現(xiàn)象。 綜上所述，普伐他汀可顯著抑制肝細(xì)胞中的脂質(zhì)沉積；其機(jī)制是通過誘導(dǎo)孤兒核 受體Nur77蛋白表達(dá)介導(dǎo)的。 本發(fā)明提供的孤兒核受體Nur77靶點(diǎn)可以用于指導(dǎo)篩選治療脂肪肝的藥物，指導(dǎo)
篩選其他他汀類藥物和中草藥，從中獲得能夠治療脂肪肝的活性成分。 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)
引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可
以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
一種他汀類物質(zhì)的用途，用于制備上調(diào)細(xì)胞中孤兒受體Nur77的表達(dá)的組合物。
2. 如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的他汀類物質(zhì)選自普伐他汀或其藥學(xué) 上可接受的鹽，辛伐他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽，阿托伐他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽，或它 們的組合。
3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的他汀類物質(zhì)是普伐他汀或其藥學(xué)上 可接受的鹽。
4. 如權(quán)利要求1所述的所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于抑制細(xì)胞中脂 質(zhì)沉淀。
5. 如權(quán)利要求1所述的所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于減緩細(xì)胞的脂肪變。
6. 如權(quán)利要求1所述的所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于防治脂肪肝。
7. 如權(quán)利要求1所述的所述的用途，其特征在于，所述的細(xì)胞是肝細(xì)胞。
8. —種制備上調(diào)細(xì)胞中孤兒受體Nur77的表達(dá)的組合物的方法，所述方法包括將有 效量的他汀類物質(zhì)與藥學(xué)上可接受的載體混合。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的他汀類物質(zhì)選自普伐他汀或其藥學(xué) 上可接受的鹽，辛伐他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽，阿托伐他汀或其藥學(xué)上可接受的鹽，或它 們的組合。
10. —種上調(diào)細(xì)胞中孤兒受體Nur77表達(dá)的方法，所述方法包括給予需要上調(diào)的對(duì)象 有效量的他汀類物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及他汀類物質(zhì)在制備脂肪肝防治藥物中的用途。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)他汀類物質(zhì)具有上調(diào)細(xì)胞內(nèi)孤兒受體Nur77表達(dá)水平的作用。因此，他汀類物質(zhì)可用于防治細(xì)胞內(nèi)孤兒受體Nur77低表達(dá)或不表達(dá)所導(dǎo)致的疾??；或用于通過調(diào)節(jié)孤兒受體Nur77表達(dá)來發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化發(fā)育和凋亡的作用，或調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝和能量代謝。
文檔編號(hào)A61K45/00GK101745113SQ20081020390
公開日2010年6月23日 申請(qǐng)日期2008年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月3日
發(fā)明者儲(chǔ)瑞藹, 張曉坤, 曾錦章, 郎園園 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院;上海生茂投資有限公司