專利名稱：麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有不同的減毒重組麻疹-瘧疾載體的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，所述載體包含編碼幾種惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)抗原的異源核酸。優(yōu)選地，其涉及包含核酸的病毒載體，所述核酸編碼惡性瘧原蟲的環(huán)子孢子(circumsporozoite，CS) 蛋白、惡性瘧原蟲的裂殖子表面蛋白l(merozoite surface protein 1，MSP-1)及其糖基化和分泌形式的衍生物(P-42 ；p-83-30-38)和錨定或分泌形式的惡性瘧原蟲的頂膜抗原 Kapical membrane antigen 1，AMA1)。所述病毒載體源自減毒麻疹病毒，其基于用作疫苗并且有效地遞送目的基因還有效地結(jié)合并感染相關(guān)免疫細胞的毒株。在一個優(yōu)選的實施方案中，CS、MSPl和AMAl蛋白從病毒中產(chǎn)生，從而使它們在哺乳動物(優(yōu)選人)中引發(fā)強免疫應答；所述蛋白的表達因為人密碼子優(yōu)化而升高。另外，本發(fā)明涉及所述重組疫苗在瘧疾的預防性治療中的用途。背景信息麻疹病毒本發(fā)明涉及含有重組減毒麻疹病毒(表達惡性瘧原蟲(Pf)的抗原)的疫苗及其用于制備重組的麻疹-瘧疾疫苗的用途，所疫苗賦予針對麻疹和瘧疾抗原兩者的免疫力。麻疹病毒(MV)是單分子負鏈RNA病毒目(Mononegavirales)的成員，即具有非區(qū)段負鏈RNA基因組的病毒。MV的非區(qū)段基因組具有反信使極性(antimessage polarity)；因此，所述基因組RNA不在體內(nèi)或體外翻譯。另外，只有在當其以核糖核蛋白 (ribonucleoprotein,RNP)復合物(見下文)的形式非常特異地與三種病毒蛋白相結(jié)合時才有生物學活性。非區(qū)段(_)鏈RNA病毒的轉(zhuǎn)錄和復制及其病毒顆粒的組裝已被詳細地綜述(1)。麻疹病毒的轉(zhuǎn)錄和復制不涉及所感染細胞的核，而是發(fā)生在所感染細胞的胞質(zhì)中。 麻疹病毒基因組包含編碼來自六個基因(命名為N、P、M、F、H和L)的六個主要結(jié)構(gòu)蛋白以及來自P基因的另外兩個非結(jié)構(gòu)蛋白C和V (涉及對抗基本免疫應答和轉(zhuǎn)錄/復制的調(diào)節(jié)) 的基因?；蝽樞蚴?' N、P(包括C和V)、M、F、H和L 5'。此外，從3'-末端區(qū)轉(zhuǎn)大約 50個核苷酸的短前導RNA。所述基因分別編碼病毒的核殼體(ribonucleocapsid，RNP)蛋白，即核蛋白(N)、磷蛋白(P)和大聚合酶/復制酶蛋白(L)，它們非常緊密地與基因組RNA 結(jié)合，形成RNP。編碼病毒衣殼蛋白的其他基因包括血凝素(H)、融合蛋白(F)和基質(zhì)蛋白 (M)。MV基因的轉(zhuǎn)錄遵循遞減的梯度當聚合酶在基因組模板上操作時，與從下游基因相比其從上游基因合成更多的RNA。在該不連續(xù)的轉(zhuǎn)錄模式下，mRNA被加帽和聚腺苷化。相反， 在復制模式中，L蛋白產(chǎn)生全長的反基因組和基因組RNA，其立即被N、P和L蛋白覆蓋以形成感染性子代RNP。麻疫病毒己于1954年分離Enders禾口 Peebles用David Edmoston (感染麻疫的兒童)的血接種原代人腎細胞，且所得的MV Edmoston毒株O)隨后適于在多種細胞系中生長。對雞胚、雞胚成纖維細胞(chick embryo fibroblast, CEF)和/或犬腎細胞和人二倍體細胞的適應產(chǎn)生了減毒的Edmonston A和B (3)、^igreb (EZ)和AIK-C種。1963年， EdmonstonB被批準為第一個MV疫苗。Edmonston A和B在CEF中進一步傳代產(chǎn)生了更為減毒的Schwarz和Moraten病毒(3)，最近證明它們的序列相同(4,5)。因為Edmonston B疫苗是反應原性的，其于1975年被放棄，并被khwarz/Moraten疫苗所替代。也使用幾種其他疫苗毒株日本的AIK-C、Schwarz F88、CAM70、TD97，俄羅斯的Leningrad-16，還有 Edmonston Zagreb。CAM70 禾口 TD97 中國毒株并不是來自 Edmonston。Schwarz/Moraten 禾口 AIK-C疫苗是在CEF中生產(chǎn)的。^igreb疫苗是在人二倍體細胞(WI-38)中生產(chǎn)的。如今， 通常使用khwarz/Moraten、AIK-C和EZ疫苗(6)，但原則上說，這些減毒疫苗毒株的任何一種都是同一種被證明安全并且誘導長期的免疫應答的獨特MV血清型，它們可用于本發(fā)明的目的。單次或兩次低劑量注射之后，MV疫苗誘導終生免疫力。針對麻疹的保護通過抗體以及⑶4和⑶8T細胞介導。已證明接種后MV特異性抗體和⑶8細胞維持長達25年(7)。在大多數(shù)國家，MV疫苗易于大規(guī)模生產(chǎn)，并可低成本地分發(fā)。因為MV基因組的減毒來自多種突變的優(yōu)勢組合，所以該疫苗非常穩(wěn)定并且從未觀察到致病性的恢復(6)。對于安全性，MV僅在細胞質(zhì)中復制，排除了整合進入宿主DNA的可能性。這些特性使得活減毒MV疫苗成為用作多價接種載體的有吸引力候選。這樣的疫苗可被證明針對其他病原物質(zhì)與針對載體病毒本身一樣有效引發(fā)長期免疫保護。Martin Billeter及同事克隆了對應于Edmonston MV的反基因組的cDNA，并建立了獨創(chuàng)和高效的反向遺傳學方法來拯救所述病毒(8)，如國際專利申請WO 97/06270中所述。從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并表達MV的N和P蛋白以及噬菌體T7RNA聚合酶的輔助細胞系四3_3_46 中回收重組麻疹病毒。為了拯救任何變體或重組MV，隨后用編碼L蛋白的表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染輔助細胞系，且最重要的是與任何反基因組質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染，該反基因組質(zhì)粒被適合地構(gòu)建以獲得適于產(chǎn)生子代MV的任何突變的或重組的反基因組RNA。所述瞬時轉(zhuǎn)染的步驟首先引起轉(zhuǎn)錄，優(yōu)選通過所具有的T7RNA聚合酶引起。所產(chǎn)生的反基因組RNA立即(在新生狀態(tài)中)被病毒N、P和L蛋白覆蓋，以獲得反基因組RNP，從中生產(chǎn)基因組RNP。隨后，基因組RNP由所附的L所轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生全部病毒mRNA及其相應的蛋白質(zhì)。最后，通過復制擴增基因組和反基因組RNP。在對本方法稍加變化的方法中，不使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的四3-3-46輔助細胞，而是瞬時轉(zhuǎn)染市售的細胞，同時使用原專利說明中詳述的全部5種質(zhì)粒，它們編碼Ν、Ρ和Τ7聚合酶(以前用于產(chǎn)生輔助細胞系)，以及編碼L的質(zhì)粒和反基因組質(zhì)粒。注意在“完全瞬時轉(zhuǎn)染”方法中，還可以使用變體表達質(zhì)粒并且為避免共同使用T7RNA聚合酶，而是使用已具有的RNA聚合酶II來表達L蛋白和反基因組(9)。為拯救單個的重組MV，所使用的反基因組質(zhì)粒包含編碼麻疹病毒全長反基因組 (+)RNA的cDNA，結(jié)合編碼異源目的抗原的核酸序列(異源核苷酸序列)，以MV-特異性轉(zhuǎn)錄起始和終止序列為側(cè)翼，從而形成額外的轉(zhuǎn)錄單位(ATU)。該MV Edmonston毒株載體已由最初的MV拯救發(fā)明者開發(fā)用于外源基因的表達(10)，并已證明其大的插入容量(多達 5kb)和表達轉(zhuǎn)基因(例如乙型肝炎病毒表面抗原、猿或人免疫缺陷病毒(SIV或HIV)、腮腺炎病毒和人IL-U)的高穩(wěn)定性(11 ；1幻。特別地，早期就已產(chǎn)生單獨或聯(lián)合表達乙型肝炎病毒表面和核心抗原的重組麻疹病毒，并被證明在遺傳修飾的小鼠中誘導體液免疫應答。通過對麻疹病毒的特性的發(fā)現(xiàn)，尤其是其在體內(nèi)引發(fā)高滴度的中和抗體的能力和其作為長期細胞免疫應答的強誘導劑的特性，本發(fā)明人提出它可能是生產(chǎn)表達來自惡性瘧原蟲抗原的重組病毒以誘導針對所述瘧原蟲的中和抗體的良好候選物，其優(yōu)選可適合在動物中并且更優(yōu)選在人中實現(xiàn)至少一定程度的保護。特別地，本發(fā)明已經(jīng)選擇MV毒株并且尤其是所疫苗毒株在已暴露的嬰兒群體(因為他們沒有MV免疫性)中作為誘導針對麻疹和惡性瘧原蟲(其組分表達在設(shè)計的重組MV 中)的免疫力候選載體。然而成人人群甚至已被MV免疫的個體也可從MV重組免疫中獲益，因為再施用本發(fā)明的重組形式MV病毒引起抗-MV抗體的加強(13)。本發(fā)明尤其涉及具有來自惡性瘧原蟲之異源基因的重組麻疹病毒的制備。本發(fā)明的重組麻疹病毒的有利免疫特性可在動物模型中顯示，所述動物模型選自對麻疹病毒易感的動物，并且在其中測定針對異源抗原和/或針對麻疹病毒的體液和/或細胞免疫應答。在適合用作表征免疫應答的模型的那些動物中，技術(shù)人員尤其可使用表達 ⑶46 (MV的一種特異性受體)的轉(zhuǎn)基因小鼠?？呻S后在猴中測試最有希望的重組體。重組麻疹病毒的核苷酸序列必須包含總數(shù)為6的倍數(shù)的核苷酸。遵從這一 “六規(guī)則(rule of six)”是必要要求，不僅適用于MV，也適用于屬于副粘病毒亞科的所有病毒。 顯然，N蛋白分子(每個接觸六個核苷酸)必須從5’至3’末端精確地覆蓋基因組的和反基因組RNA，。值得注意的是，ATU可在反基因組cDNA的不同位置。因此，利用上述MV mRNA的天然表達梯度，插入的ATU的表達水平可被改變?yōu)檫m合的水平。ATU優(yōu)選的位置為L-基因的上游、M基因的上游和N基因的上游，它們分別導致異源蛋白的低、中和強表達。瘧原蟲瘧疾目前是世界上最普遍的感染性疾病之一，尤其是在熱帶和亞熱帶地區(qū)。在世界范圍內(nèi)，瘧疾感染每年導致數(shù)億個體的嚴重疾病，殺死1至3百萬人，主要是發(fā)展中國家和新興國家的嬰兒。瘧疾的廣泛發(fā)生和升高的發(fā)生率的原因是廣泛禁用DDT和耐藥寄生蟲以及耐殺蟲劑寄生蟲載體數(shù)目的增加。其他因素包括環(huán)境和氣候改變、社會動亂和增加的人口流動性。瘧疾由蚊子傳播的血液原生動物寄生蟲引起，該寄生蟲屬于頂復合器門 (Apicomplexa)瘧原蟲屬(Plasmodium)。瘧原蟲屬中的四個種感染人三日瘧原蟲 (P. malariae)引起三日瘧(Malaria quartana)；間日瘧原蟲(P. vivax)和卵形瘧原蟲 (P. ovale)，二者都引起間日瘧(Malaria tertiana)；和惡性瘧原蟲(P. falciparum)，其為熱帶瘧(Malaria tropica)的病原體并且是幾乎全部致命感染的原因。很多其他種在動物中引起疾病，例如小鼠中的約氏瘧原蟲(P.yoelii)和伯氏瘧原蟲(P.berghei)。瘧原蟲具有由幾階段組成的生活周期。每個階段能誘導針對相應發(fā)生階段特異性抗原的特異性免疫應答。瘧原蟲通過幾種雌性瘧蚊(Anopheles mosquitoe)傳播至人。 感染的蚊子將“子孢子(sporozoite)”形式的瘧原蟲注入哺乳動物血流。侵入肝細胞之前子孢子在循環(huán)中存留幾分鐘。在這個階段，寄生蟲位于細胞外環(huán)境中并且暴露于抗體的攻擊，該攻擊主要針對子孢子表面的主要組分“環(huán)子孢子”(CS)蛋白。一旦進入肝中，寄生蟲復制并發(fā)育成所謂的“裂殖體(schizont) ”。這些裂殖體的存在比率為每個感染細胞多至 20，000。在寄生蟲的該細胞內(nèi)階段，宿主免疫應答中主要起作用的是T-淋巴細胞，尤其是 CD8+T-淋巴細胞。在約一周的肝感染后，數(shù)千個所謂“裂殖子”被釋放進入血流。頂膜抗原1 (AMAl)和裂殖子表面蛋白I(MSPl)都存在于感染的肝細胞產(chǎn)生的裂殖子上它們是負責侵入紅細胞的無性血液階段裂殖體的基本組分。一旦進入紅細胞，它們成為抗體介導的免疫應答和T-細胞分泌的細胞因子的靶標。侵入紅細胞后，裂殖體進行幾個階段的復制，產(chǎn)生所謂的“營養(yǎng)體”和裂殖體與裂殖子，它們可感染新的紅細胞。有限量的營養(yǎng)體可演變成為構(gòu)成寄生蟲有性階段的“配子體”。當易感的蚊子消化紅細胞時，配子體從紅細胞中釋放， 產(chǎn)生幾個雄性配子體和一個雌性配子體。這些配子受精導致合子形成并隨后轉(zhuǎn)化成為動合子，之后成為卵囊，并最終成為唾液腺子孢子。針對配子體階段的特異性表面抗原的靶向抗體可在蚊子的中腸(mid gut)中阻斷該周期。這樣的抗體不會保護哺乳動物宿主，但會通過降低感染的蚊子及其寄生蟲負荷的數(shù)目來降低瘧疾的傳播。MSP-I以190-200kDa(d-190)前體合成，其在裂殖過程中被蛋白水解加工成為83、 30、38*42kDa(d-^)的片段(14)。在侵入紅細胞時，42kDa被進一步地切割產(chǎn)生從復合物剩余部分脫落的33kDa片段和含有兩個表皮生長因子(EGF)樣結(jié)構(gòu)域的19kDa片段，其在侵入過程中與裂殖子膜保持連接。該繼發(fā)切割是成功侵入紅細胞的先決條件(15)。MSP-I基本上是雙態(tài)蛋白，在以Kl和MAD20原型為特征的雙態(tài)等位基因中表現(xiàn)出高保守性。AMA-I (16)是結(jié)構(gòu)上保守的I型膜內(nèi)在蛋白質(zhì)，在惡性瘧原蟲中其包含 622aa(Pf/AMA-l)，組成為胞質(zhì)區(qū)(50aa)、跨膜區(qū)和胞外結(jié)構(gòu)域，其折疊為N-末端前序列 (pro-sequence)和三個結(jié)構(gòu)域(DI、DII、DIII)。所述蛋白的表達在裂殖后期最多蛋白水解加工AMA-I的前體(83kDa)以切去前序列，將所述蛋白轉(zhuǎn)化成為66kDa的形式，這允許裂殖子的重新定位?？贵w主要識別DI和DII，并且似乎與幾個等位基因變體有同樣好的反應性。對DIII應答的抗體一般較低，在成人中水平增加(17，18)。PfAMA-I含有64個多態(tài)性位置(所述前序列中9個，胞外結(jié)構(gòu)域中52個，胞質(zhì)區(qū) 3個)，其中多數(shù)是雙態(tài)的，它們是宿主免疫應答的重要表位。為開發(fā)基于PfAMA-I的疫苗， 覆蓋多態(tài)性應是重要的多樣性覆蓋(Diversity Covering) (DiCo 1、2和3)PfAMA-I是人工序列，它以可能的最大程度代表PfAMAl胞外結(jié)構(gòu)域的天然多態(tài)性。已證明它們誘導針對多種攜帶不同PfAMAl等位基因的寄生蟲有功能的免疫應答。該方式可提供這樣的手段，通過它可產(chǎn)生靶向PfAMAl的疫苗，從而可誘導針對大范圍的天然PfAMAl等位基因的強且具有功能性的保護(19)。CS蛋白(CSP)具有約420個aa和58kDa的分子量。它是子孢子的主要表面蛋白 對于從卵囊成熟為子孢子和侵入肝細胞(由帶正電荷的氨基酸的保守基序介導)來說，其功能是必不可少的。CSP的組成為5’和3’末端的兩個非重復區(qū)和由多個重復的4殘基長的基序組成的可變物種特異性中央?yún)^(qū)，其是CSP中的主要表位。因為CSP至少在裂殖前3 天還可以檢測到，所以無論是抗體介導的針對細胞外子孢子的免疫應答還是細胞介導的針對裂殖體的免疫應答，它都被認為是吸引人的疫苗靶點00)。目前，開發(fā)瘧疾疫苗的途徑可根據(jù)上文所述的寄生蟲可存在的不同階段來分類。疫苗可以分為三種可能類型i)紅細胞前疫苗，其針對子孢子和/或裂殖體感染的細胞。這些類型疫苗主要基于CS，并應當理想地賦予由體液和細胞免疫應答介導的無蟲免疫，阻止瘧疾感染；ii)無性血液期疫苗，其針對裂殖子感染的細胞:MSP1和AMAl是主要的瘧疾疫苗候選物，設(shè)計用于將臨床嚴重程度最小化。這些疫苗應降低發(fā)病率和死亡率，并旨在阻止寄生蟲進入紅細胞和/或在其中發(fā)育；iii)傳播阻斷疫苗，其設(shè)計用于阻止寄生蟲在蚊子宿主中的生長。這類疫苗應當有利于降低大量人群的瘧疾感染率。除了這些疫苗，正在研究所謂的多組分和/或多階段疫苗以來尋求開發(fā)靶向寄生蟲生命周期的多個階段的瘧疾疫苗的可行性。目前的全球瘧疾疫苗形勢看起來很有希望，有47個新的疫苗候選物，31個在臨床前開發(fā)，在臨床試驗中縮小至16個。這些中的一個，GSKBiologicals和PATH-MVI開發(fā)的RTS，S疫苗應當在2008年進入最終的III期臨床試驗Ql)。其他令人感興趣的疫苗候選物是基于使用活重組病毒作為載體，例如國際專利申請US2006127413中描述的 Modified Vaccinia Ankara (MVA)、痘病毒(US6214353、AU7060294、AU1668197、W09428930 和 US5756101)、腺病毒(US2007071726、US2005265974、US2007088156 和 CA2507915)、冷適應減毒流感病毒或基于酵母(例如畢赤酵母(Pichia pastoris)和酵母屬(Saccharomyces spp.))或基于細菌(例如沙門氏菌屬(Salmonella spp.) (US5112749)和大腸埃希氏菌 (Escherichia coli) (EBO 191748))表達系統(tǒng)的疫苗(22)。盡管針對瘧疾的疫苗開發(fā)在30多年前就已開始，但是當前還沒有上市的針對瘧疾的疫苗。很多因素使得瘧疾疫苗的開發(fā)困難并具有挑戰(zhàn)。首先，該寄生蟲的大小和遺傳復雜性意味著每次感染向人免疫系統(tǒng)呈現(xiàn)數(shù)千種抗原。理解其中哪些可成為疫苗開發(fā)的有用靶標是復雜的，到現(xiàn)在為止，已經(jīng)鑒定出了至少40個不同的有希望的抗原。第二，該寄生蟲經(jīng)過幾個生命階段的改變，甚至在人宿主中也是如此，在生命周期的每個階段，其向免疫系統(tǒng)呈現(xiàn)不同的分子組。第三，該寄生蟲已經(jīng)進化出了一系列措施以迷惑、隱藏于和誤導人免疫系統(tǒng)。最后，可能同時有不僅物種不同并且毒株不同的多重瘧疾感染。因此，通過提供包含不同減毒重組麻疹-瘧疾載體(包含編碼幾種惡性瘧原蟲抗原的異源核酸)的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，本發(fā)明完成了現(xiàn)有技術(shù)長久以來的需求。發(fā)明_既述本發(fā)明的一個實施方案中提供了包含表達瘧疾抗原之重組麻疹疫苗病毒的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，其能引發(fā)針對麻疹和瘧疾兩者的免疫應答和保護的。在另一實施方案中，本發(fā)明提供具有表達MSPl瘧疾抗原的核苷酸序列的重組麻疹疫苗病毒。在一個優(yōu)選的實施方案中，重組麻疹疫苗病毒具有核苷酸序列，其表達來自 3D7毒株和FCBl毒株的錨定和分泌兩種形式的瘧疾抗原dl90或d83-30_38或d42。在又一實施方案中，本發(fā)明提供具有表達多樣性覆蓋(DiCo，Diversity Covering) AMAl瘧疾抗原的核苷酸序列的重組麻疹疫苗病毒。在另一實施方案中，本發(fā)明提供具有表達CS瘧疾抗原的核苷酸序列的重組麻疹疫苗病毒。


圖1 麻疹病毒的反基因組DNA p(+) MV-EZ的示意圖。ρ (+) MV-EZ是衍生自 pBluescript的含有麻疹病毒(Edmoston Zagreb)完整序列的質(zhì)粒，其在T7RNA聚合酶啟動子(T7)的控制下，在位置1(麻疹病毒N基因之前)、2(麻疹病毒的P和M基因之間)和 3(麻疹病毒的H和L基因之間)分別含有三個ATU，并由肝炎δ核酶和T7RNA聚合酶終止子(ST7t)精確地終止。該質(zhì)粒的大小為18941bp。
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圖2:來自3D7毒株的MSP-I合成基因(d_190)的示意圖。顯示了 d_190基因片段(d-83-30-38和d-似)側(cè)翼區(qū)的編碼核苷酸和相應的氨基酸。以彩色表示為克隆程序而添加的獨特限制性位點；SP 信號肽；GPI 編碼的糖基磷脂酰肌醇序列，其用于膜錨定區(qū)。圖3:來自FCBl毒株的MSP-I合成基因(d_190)的示意圖。顯示了 d_190基因片段(d-83-30-38和d-似)側(cè)翼區(qū)的編碼核苷酸和相應的氨基酸。以彩色表示為克隆程序而添加的獨特限制性位點；SP 信號肽；GPI 編碼的糖基磷脂酰肌醇序列，其用于膜錨定區(qū)。 SP和GPI區(qū)來自3D7毒株。圖4 重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒p(+)MV2-EZ-dl90_3D7的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有 d-190瘧疾基因(3D7毒株)的p(+)MV-EZ，該基因為525;3bp，編碼GPI錨定形式的蛋白，通過SgrAl-BssHII消化克隆于麻疹基因組的位置2。該重組質(zhì)粒的大小是M32!3bp。圖5 重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒ρ (+)MV2-EZ-dl90 * -3D7的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有 d-190*瘧疾基因(3D7毒株)的p(+)MV-EZ，該基因為5160bp，編碼分泌形式的蛋白，通過 SgrAI-BssHII消化克隆于麻疹基因組的位置2該重組質(zhì)粒的大小是M227bp。圖 6 重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒 ρ (+) MV3-EZ-d 190-3D7 或 ρ (+)MV3-EZ_dl90 * -3D7 的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有d-190瘧疾基因(3D7毒株)(525;3bp，編碼GPI錨定形式的蛋白) 或d-190*瘧疾基因(3D7毒株)(5160bp，編碼分泌形式的蛋白)的ρ (+) MV-EZ，所述基因通過SgrAI-BssHII消化克隆于麻疹基因組的位置3。重組質(zhì)粒ρ (+)MV3-EZ_dl90為M32!3bp， ρ (+) MV3-EZ-Cl 190 * 為 24227bp。圖7 重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒ρ (+)MV2-EZ-d83-30-8-3D7的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有d-83-30-38瘧疾基因(3D7毒株)的ρ (+)MV_EZ，該基因為4122bp，編碼GPI錨定形式的蛋白，通過SgrAl-BssHII消化克隆于麻疹基因組的位置2。該重組質(zhì)粒的大小是231%bp。圖8 重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒ρ (+)MV2-EZ-d83-30-38 * -3D7的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有d-83-30-38*瘧疾基因(3D7毒株)的ρ (+)MV_EZ，該基因為4(^9bp，編碼分泌形式的蛋白，通過SgrAl-BssHII消化克隆于麻疹基因組的位置2。該重組質(zhì)粒的大小是231(^bp。圖 9 重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒 ρ (+) MV3-EZ-d83-30-38-3D7 或 ρ (+) MV3-EZ-d83-30_38 *_3D7的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有d-83-30-38瘧疾基因(3D7毒株M4122bp，編碼GPI 錨定形式的蛋白)或d-83-30-38*瘧疾基因(3D7毒株)0O29bp，編碼分泌形式的蛋白)的 p(+)MV-EZ，所述基因通過SgrAl-BssHII消化克隆于麻疹基因組的位置3。重組質(zhì)粒ρ (+) MV3-EZ-d83-30-38 為 23195bp，ρ (+)MV3-EZ-d83-30_38 'k 為 23105bp。圖10 :重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒p(+)MV2-EZ-d42_3D7的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有 d-42瘧疾基因(3D7毒株)的p(+)MV-EZ，該基因為1347bp，編碼GPI錨定形式的蛋白，通過 SgrAI-BssHII消化克隆于麻疹基因組的位置2。該重組質(zhì)粒的大小是20417bp。圖11 重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒p(+)MV2-EZ-d42*_3D7的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有d-42*瘧疾基因(3D7毒株)的p(+)MV-EZ，該基因為12Mbp，編碼分泌形式的蛋白，通過 SgrAI-BssHII消化克隆于麻疹基因組的位置2。該重組質(zhì)粒的大小是2034^p。圖 12 重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒 ρ (+) MV3-EZ-d42-3D7 或 ρ (+) MV3-EZ_d42 * -3D7 的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有d-42瘧疾基因(3D7毒株)(1347bp，編碼GPI錨定形式的蛋白)或d-42*瘧疾基因(3D7毒株)(1254bp，編碼分泌形式的蛋白)的ρ (+)MV_EZ，通過 SgrAI-BssHII消化克隆于麻疹基因組的位置3。重組質(zhì)粒ρ (+) MV3-EZ_d42為20417bp，p (+)MV3-EZ-d42 * 為 20345bp。圖13 重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒ρ (+)MV2-EZ-d 190-FCB1的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有 d-190瘧疾基因(FCB1毒株)的p(+)MV-EZ，該基因為5013bp，編碼GPI錨定形式的蛋白，通過SgrAl-BssHII消化克隆于麻疹基因組的位置2。該重組質(zhì)粒的大小是MOSiBbp。圖14 重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒p(+)MV3-EZ-dl90_FCBl的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有d-190瘧疾基因(FCB1毒株)的p(+)MV-EZ，該基因為50i;3bp，編碼GPI錨定形式的蛋白，通過SgrAl-BssHII消化克隆于麻疹基因組的位置3。該重組質(zhì)粒ρ (+)MV3-EZ_dl90為 24083bpo圖15 :CS合成基因的示意圖。顯示了 CS基因側(cè)翼區(qū)的編碼核苷酸和相應的氨基酸。以彩色表示為克隆程序而添加的獨特限制性位點。圖16 重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒ρ (+)MV2-EZ-CS的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有CS基因的p(+)MV-EZ，該基因為1119bp，通過SgrAl-BssHII消化克隆于麻疹基因組的位置2。該重組質(zhì)粒的大小是20219bp。圖17 重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒ρ (+)MV3-EZ-CS的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有CS基因的p(+)MV-EZ，該基因為1119bp，通過SgrAl-BssHII消化克隆于麻疹基因組的位置3。該重組質(zhì)粒的大小是20219bp。圖18 =DiCo-I完整合成基因的示意圖。顯示了 DiCo-I完整基因結(jié)構(gòu)域(胞外 (ECTO)和跨膜-胞內(nèi)(TRANS-CYT0))側(cè)翼區(qū)的編碼核苷酸和相應的氨基酸。以彩色表示為克隆程序添加的獨特限制性位點；SP 人密碼子優(yōu)化的信號肽。圖19 :DiCo-l胞外合成基因的示意圖。顯示了 DiCo-I胞外基因結(jié)構(gòu)域側(cè)翼區(qū)的編碼核苷酸和相應的氨基酸。以彩色表示為克隆程序而添加的獨特限制性位點；SP:人密碼子優(yōu)化的信號肽。圖20 重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒p(+)MV2-EZ_DiCol-完整的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有 DiCol完整基因的p(+)MV-EZ，該基因為1689bp，編碼跨膜形式的蛋白，通過SgrAl-BssHII 消化克隆于麻疹基因組的位置2。該重組質(zhì)粒的大小是2075;3bp。圖21 重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒p(+)MV3-EZ_DiCol-完整的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有 DiCol完整基因的p(+)MV-EZ，該基因為1689bp，編碼跨膜形式的蛋白，通過SgrAl-BssHII 消化克隆于麻疹基因組的位置3。該重組質(zhì)粒的大小是2075;3bp。圖22 重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒p(+)MV2-EZ_DiCol-胞外的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有 DiCol胞外基因的ρ (+)MV-EZ,該基因為1458bp，編碼分泌形式的蛋白，通過SgrAI-BssHII 消化克隆于麻疹基因組的位置2。該重組質(zhì)粒的大小是2052^p。圖23 重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒p(+)MV3-EZ_DiCol-胞外的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有 DiCol胞外基因的ρ (+)MV-EZ,該基因為1458bp，編碼分泌形式的蛋白，通過SgrAI-BssHII 消化克隆于麻疹基因組的位置3。該重組質(zhì)粒的大小是2052^p。圖M :p (+) MV2EZ-GFP的完整核苷酸序列。參照核苷酸位置可如下所述描述序列-592-608 T7 啟動子-609-17354 MV Edmoston Zagreb 反基因組-4049-4054 MluI 限制性位點-4060-4067 SgrAI 限制性位點
-4079-4084 BssHII 限制性位點-4085-4801 綠色熒光蛋白(GFP)ORF-4805-4810 BssHII 限制性位點-4817-4822 AatII 限制性位點-17355-17580 HDV 核酶和 T7 終止子圖25 :p (+) MV3EZ-GFP的完整核苷酸序列。參照核苷酸位置可如下所述描述序列-592-608T7 啟動子-609-17359 MV Edmoston Zagreb 反基因組-9851-9856 MluI 限制性位點-9862-9869 SgrAI 限制性位點-9886-9891 BssHII 限制性位點-9892-10608 綠色熒光蛋白(GFP)ORF-10612-10617 BssHII 限制性位點-10624-10629 AatII 限制性位點-17360-17585 HDV 核酶和 T7 終止子圖沈:AN101TE 這是由本發(fā)明人克隆的MSPl d_1903D7序列0RF。參照核苷酸位置可如下所述描述序列-1-3起始密碼子-4-99d-190 3D7 信號月太-100-105 BamHI 限制性位點-4014-4020 BstEII 限制性位點-5152-5157 AclI 限制性位點-5158-5250 GPI 序列-5251-5253 終止密碼子圖27 :AN102TE 這是由本發(fā)明人克隆的MSPl d-190 * 3D7序列0RF。參照核苷酸位置可如下所述描述序列-1-3起始密碼子-4-99d-190 * 3D7 信號肽-100-105 BamHI 限制性位點-4014-4020 BstEII 限制性位點-5152-5157 AclI 限制性位點-5158-5160 終止密碼子圖28 :AN103TE 這是由本發(fā)明人克隆的MSPl d-83-30_383D7序列0RF。參照核苷酸位置可如下所述描述序列-1-3起始密碼子-4-99d-83-30-38 3D7 信號月太-100-105 BamHI 限制性位點-4014-4020 BstEII 限制性位點-4021-4026 AclI 限制性位點
-4027-4119 GPI 序列-4120-4122 終止密碼子圖29 :AN104TE 這是由本發(fā)明人克隆的MSPl d-83-30-38 * 3D7序列0RF。參照核苷酸位置可如下所述描述序列-1-3起始密碼子-4-99d-83-30-38 * 3D7 信號月太-100-105 BamHI 限制性位點-4014-4020 BstEII 限制性位點-4027-4029 終止密碼子圖30 :AN105TE 這是由本發(fā)明人克隆的MSPl d_423D7序列0RF。參照核苷酸位置可如下所述描述序列-1-3起始密碼子-4-99d-42 3D7 信號月太-100-105 BamHI 限制性位點-108-114 BstEII 限制性位點-1246-1251 AclI 限制性位點-1252-1344 GPI 序列-1345-1347 終止密碼子圖31 :AN106TE 這是由本發(fā)明人克隆的MSPl d_42 * 3D7序列0RF。參照核苷酸位置可如下所述描述序列-1-3起始密碼子-4-99d-42 * 3D7 信號肽-100-105 BamHI 限制性位點-108-114 BstEII 限制性位點-1246-1251 AclI 限制性位點-1252-1254 終止密碼子圖32 :AN107TE 這是由本發(fā)明人克隆的MSPl d-190 FCBl序列0RF。參照核苷酸位置可如下所述描述序列-1-3起始密碼子-4-99d-190 FCBl 信號月太-100-105 BamHI 限制性位點-146-151 HindIII 限制性位點-3825-3831 BstEII 限制性位點-4912-4917 AclI 限制性位點-4918-5010 GPI 序列-5011-5013 終止密碼子圖33 :AN108TE 這是由本發(fā)明人克隆的CS序列0RF。參照核苷酸位置可如下所述描述序列-1-3起始密碼子
-4-1116 CS 序列-1117-1119 終止密碼子圖34 :AN109TE 這是由本發(fā)明人克隆的DiCo 1完整序列0RF。參照核苷酸位置可如下所述描述序列-1-3起始密碼子-4-99DiCol 完整信號肽-100-105 BamHI 限制性位點-106-1686 DiCol 完整序列 ORF-1687-1689 終止密碼子圖35 :AN110TE 這是由本發(fā)明人克隆的DiCol胞外序列0RF。參照核苷酸位置可如下所述描述序列-1-3起始密碼子-4-99DiCol 胞外信號肽-100-105 BamHI 限制性位點-106-1455 DiCol 胞外序列 ORF-1456-1458 終止密碼子圖36 感染重組麻疹-p-42瘧疾病毒MV病毒疫苗后，Vero細胞上產(chǎn)生可比的細胞病理效應。圖37 插入麻疹載體位置3的d-423D7轉(zhuǎn)基因(MV3EZ-d_42 SgrAI)的表達。用 Western印記法對照空麻疹載體(MVEZ)和陰性對照(MV3Ll,重組MV-乳頭瘤病毒)分析1、 5和10代的細胞裂解液。圖38 采用免疫熒光法分析插入麻疹載體(MV3EZ-d-42 SgrAI)位置3的d_423D7 轉(zhuǎn)基因與空麻疹載體(MVEZ)和陰性對照(MV2EZL1，重組MV乳頭瘤病毒)相比的表達。箭頭指向免疫染色之前和之后使用光學顯微鏡觀察的相同合胞體。圖39 重組麻疹-p-42瘧疾病毒的生長動力學曲線，將其與MV病毒疫苗的進行比較。圖 40 插入麻疹載體(MV2_3EZ-d-190 SgrAl FCB1)位置 2 禾Π 3 的 d-190 FCBl 轉(zhuǎn)基因的表達。用Western印記法對照空麻疹載體(MVEZ)和陰性對照(MV2EZL1，重組MV-乳頭瘤病毒)分析細胞裂解液。圖41 重組麻疹-p-190-FCBl瘧疾病毒的生長動力學曲線，將其與MV病毒疫苗的進行比較。發(fā)明詳述本發(fā)明的一個目的是從能含有穩(wěn)定整合的DNA序列的重組麻疹載體產(chǎn)生麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，所述DNA序列編碼分泌或表面錨定形式的惡性瘧原蟲CS、MSP-1或其部分區(qū)段和AMA-I或其部分區(qū)段。本發(fā)明還包括重組MV-瘧疾病毒的拯救，所述病毒能夠在易感的轉(zhuǎn)基因小鼠、猴和人宿主中感染、復制和表達PfCS、PfMSP-I和PfAMA-I抗原。此外，本發(fā)明意在包括多價重組麻疹-瘧疾載體的構(gòu)建，其中在相同的載體中同時克隆和表達兩個不同的抗原，以賦予針對它們二者的免疫力。
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此外，本發(fā)明涉及三種不同的重組麻疹-瘧疾病毒的組合，它們每個都以在宿主中引發(fā)針對該寄生物生命周期之不同階段的免疫應答的方式攜帶不同的基因并且表達不同的抗原。此外，本發(fā)明包括生成不含缺陷型干擾顆粒(interfering particle, DI)的重組麻疹-瘧疾病毒的方法。已知DI顯著地抑制病毒在任何生產(chǎn)系統(tǒng)中的生長并成功地抑制人個體中的免疫應答。此外，本發(fā)明包括含有該重組病毒的疫苗的生產(chǎn)方法。以下實施例描述了實施本發(fā)明的優(yōu)選方式。應當理解的是，提供這些實施例僅是為進行說明并且不應當被解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例1 重組MV-PfMSP-I質(zhì)粒的構(gòu)建所有的克隆程序都按照Sambrook等(1989)中描述的技術(shù)進行。所有的限制性酶都來自New England BioLabs ；寡核苷酸PCR引物和DNA多接頭來自hvitrogen?；瘜W合成分泌或錨定形式的PfMSP-I及其片段(d-83-30_38和d_42)并且進行人密碼子優(yōu)化。將它們克隆進PZE21MV中間載體中，并通過在5’末端添加SgrAI克隆位點和其后優(yōu)化的Kozak序列(TCATCA)而稍加修飾。通過在MWG Biotech測序來檢查這些修飾。來自3D7毒株(屬于MAD20原型)和FCBl毒株(屬于Kl原型)的PGI錨定和分泌(* )形式的重組的MV-PfMSP-I質(zhì)粒的列表ρ (+) MV2EZ-d-190-SgrAI (3D7)ρ (+) MV3EZ-d-190-SgrAI (3D7) ρ (+) MV2EZ-d-83-30-38-SgrAI (3D7)ρ (+) MV3EZ-d-83-30-38-SgrAI (3D7)ρ (+) MV2EZ-d-42-SgrAI (3D7)ρ (+) MV3EZ-d-42-SgrAI (3D7)ρ (+) MV2EZ-d-190 * -SgrAI (3D7)ρ (+) MV3EZ-Cl-190 * -SgrAI (3D7)ρ (+) MV2EZ-d-83-30-38 * -SgrAI (3D7)ρ (+) MV3EZ-d-83-30-38 * -SgrAI (3D7)ρ (+) MV2EZ-d-42 * -SgrAI (3D7)ρ (+) MV3EZ-d-42 * -SgrAI (3D7)
ρ (+) MV2EZ-d-190-SgrAI (FCBl)ρ (+) MV3EZ-d-190-SqrAI (FCBl)la) ρ (+)MV2EZ-d-190-SgrAI (3D7, 24323bp)禾口 ρ (+) MV3EZ-d-190-SgrAI (3D7， 24323bp)的構(gòu)建。在其最適溫度下以50 μ 1的終體積用1單位的SgrAI和BssHII兩種限制性酶消 Klyg 含有綠色熒光蛋白(GFP)的 MV 質(zhì)粒 DNA (p (+) MV2_3EZ_GFP Berna 毒株，19774bp 圖對和25)2小時。將所有消化的DNA上樣到瓊脂糖凝膠中，80伏運行約2小時。隨后， 從凝膠中切下正確的條帶(19048bp)，用QIAEX凝膠純化進行純化，通過^Onm的吸光度計算DNA濃度并調(diào)整至1 μ g/ml。
通過在其最適溫度下以50 μ 1的終體積用SgrAl-BssHII消化(每種酶1個單位)2 小時，取出插入到中間質(zhì)粒(pZE21 MV-d-190 SgrAI，7564bp，)中的Iyg d_190基因。將所有消化的DNA上樣到瓊脂糖凝膠中，80伏運行約2小時。隨后，從凝膠中切下正確的條帶(527^p)，用QIAEX凝膠純化試劑盒純化，通過^Onm的吸光度計算DNA濃度并調(diào)整至 1 μ g/mlο從而在16°C下在10 □ μ 1終體積中，使用1單位的T4DNA連接酶及其反應緩沖液以等摩爾比過夜連接載體(MV DNA 圖1)和插入片段(d-190 =DNA圖2)。隨后，按照標準的轉(zhuǎn)化方案(Sambrook等，1989)，用全部連接體積轉(zhuǎn)化XLlO Gold 化學感受態(tài)細胞，鋪板并在LB-瓊脂板上對氨芐青霉素抗性進行選擇。通過DNA質(zhì)粒制備 (QIAGEN，小提-、中提和大提試劑盒)和限制性酶消化篩選克隆。正確的克隆被送到MWG測序使用DNA Strider軟件與推定序列進行比對，顯示100%同一性。圖 4 顯示插入到 MV 載體位置 2 (SgrAI，4060 位，BssHI I，9335 位)的 d-190_3D7 基因，并且其開放讀碼框(ORF)列在圖沈中。圖 6 中顯示插入到 MV 載體位置 3 (SgrAI，9862 位，BssHII，15137 位)的 d-190_3D7基因。重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒的基因組的長度(始于ACC，609位，至GGT，21884位)是6 的倍數(shù)，允許重組MV2_3-d-190-3D7病毒的拯救。lb) ρ ( + ) MV2EZ-d-83-30-38-SgrAI (3D7，2 3 1 9 5bp)禾口 ρ ( + ) MV3EZ-d-83-30-38-SgrAI (3D7, 23195bp)的構(gòu)建。按照實施例3a中的詳細描述制備麻疹載體。BstEII-AclI 消化 p^21MV-d_190SgrAI 以切取 d_42 片段；已連接具有 BstEII-AclI 粘末端的多接頭以獲得中間質(zhì)粒 pZE21MV-d-83-30-38-SgrAI (6436bp)。多接頭的序列是5' -GTCACCAGCGGCCGCAA-3'。在其最適溫度下以50 μ 1的終體積用 SgrAI-BssHII (每種酶 1 單位)消化pZE21MV-d-83-30_38 SgrAI2 小時。將所有消化的DNA上樣到瓊脂糖凝膠中，80伏運行約2小時。隨后，從凝膠中切下正確的條帶0147bp)，用QIAEX凝膠純化試劑盒純化，通過^Onm的吸光度計算DNA濃度并調(diào)整至 1 □ μ g/ml ο從而在16°C下在10 □ μ 1終體積中，使用1單位的T4DNA連接酶及其反應緩沖液以等摩爾比過夜連接載體(MV DNA 圖1)和插入片段(d-83-30-38DNA 圖2)。隨后，按照標準的轉(zhuǎn)化方案(Sambrook等，1989)用全部連接體積轉(zhuǎn)化XLlO Gold 化學感受態(tài)細胞，鋪板并在LB-瓊脂板上對氨芐青霉素抗性進行篩選。通過DNA質(zhì)粒制備 (QIAGEN，小提-、中提和大提試劑盒)和限制性酶消化篩選克隆。正確的克隆被送到MWG測序然后使用DNA Strider軟件將該序列與推定序列進行比對。正確的克隆被送到MWG測序使用DNA Strider軟件將該序列與推定序列進行比對，顯示100%同一性。圖7中顯示插入到MV載體位置2 (SgrAI，4060位，BssHII，8207位)的 d-83-30-38-3D7基因，并且其開放讀碼框(ORF)列在圖28中。圖9中顯示插入到MV載體位置3 (SgrAI，9862位，BssHII，14006位)的 d-83-30-38-3D7 基因。
重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒的基因組的長度(始于ACC，609位，至GGT，20756位)是6 的倍數(shù)，允許對重組MV2_3-d-83-30-38-3D7病毒的拯救。lc)p(+)MV2EZ-d-42-SgrAI(3D7，20417bp)禾口 ρ (+) MV3EZ-d-42-SgrAI (3D7， 20417bp)的構(gòu)建。按照實施例3a中的詳細描述制備麻疹載體。通過在其最適溫度下以50 μ 1終體積用SgrAl-BssHII消化(每種酶1個單位)2 小時，取出已插入中間質(zhì)粒(pZE21MV-d-42 SgrAI, 3658bp)中的Iyg d_42基因。將所有消化的DNA上樣到瓊脂糖凝膠中，80伏運行約2小時。隨后，從凝膠中切下正確的條帶(1369bp)，用QIAEX凝膠純化試劑盒純化，通過260nm的吸光度計算DNA濃度并調(diào)整至 1 □ μ g/ml0從而在16°C下以10 □ μ 1終體積，使用1單位的T4DNA連接酶及其反應緩沖液以等摩爾比過夜連接載體(MV DNA 圖1)和插入片段(d-42DNA 圖2)。隨后，按照標準的轉(zhuǎn)化方案(Sambrook等，1989)，用全部連接體積轉(zhuǎn)化XLlO Gold 化學感受態(tài)細胞，鋪板并在LB-瓊脂板上對氨芐青霉素抗性進行篩選。通過DNA質(zhì)粒制備 (QIAGEN，小提-、中提和大提試劑盒)和限制性酶消化篩選克隆。正確的克隆被送到MWG測序使用DNA Strider軟件將該序列與推定序列進行比對，顯示100%同一性。圖10顯示插入到MV載體位置2 (SgrAI，4060位，BssHII，5似9位)的d-42_3D7基因，并且其開放讀碼框(ORF)列在圖30中。圖12中顯示插入到MV載體位置3(SgrAI，9862位，和BssHII，11231位)的 d-42-3D7 基因。重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒的基因組的長度(始于ACC，609位，至GGT，17978位)是6 的倍數(shù)，允許重組MV2_3-d-42-3D7病毒的拯救。重組麻疹-p-42瘧疾病毒和MV疫苗誘導類似的細胞病理效應(圖36)。該轉(zhuǎn)基因的表達相當穩(wěn)定在人二倍體細胞MRC5中進行10系列次病毒傳代之后所有分析的源自單個初始拯救的克隆的子代克隆全部保持表達(圖37-38)。重組的MV-瘧疾病毒和MV疫苗的生長曲線顯示相同的動力學(圖39)。Id) ρ (+)MV2EZ-Cl-190 * -SgrAI (3D7, 24227bp)和 ρ (+)MV3EZ-d_190 * -SgrAI (3D7, 24227bp)的構(gòu)建。按照實施例3a中的詳細描述制備麻疹載體。使用中間載體pZE21MVd-190-SgrAI為模板，進行PCR反應以缺失GPI錨定區(qū)，其位于AclI (5434位)和ClaI (5536位)位點之間。使用保真型Pfu DNA聚合酶(Stratagene)進行PCR擴增。合成寡核苷酸引物的 DNA序列以小寫字母表示MV核苷酸，并以大寫字母表示非MV核苷酸；相關(guān)的限制性核酸內(nèi)切酶識別位點序列有下劃線。使用了如下的寡核苷酸引物For-ClaI，5 ‘ -CCAATAAACGTTTAAT AGatcgattacgcgcgctctagc-3‘,和 Rev-Avrll, 5‘ -gcctttgagtgagctgatacc-3‘。在ClaI和BssHII位點的水平，F(xiàn)or-ClaI與模板是同源的，并且含有帶有兩個終止密碼子的突出端(TAATAG) ,AclI位點(AACGTT)和6bp長AclI保護位點(CCAATA)(以大寫字母表示)。在所謂的PCR-GPI和在最終構(gòu)建體d-190 *中，AclI會靠近ClaI。
Rev-AvrII與所述模板同源(從5704至57 位)。PCR產(chǎn)物長207bp 用AclΙ+AvrII消化并與用AclΙ+AvrII預消化的中間載體 pZE21MVd-190-SgrAI 連接產(chǎn)生 pZE21MVd_190 * -SgrAI。具體地，使用Acll+Avrll消化載體產(chǎn)生了 7318bp和M6bp (含有待缺失的GPI區(qū)) 的兩個條帶使用QIAEX II純化試劑盒Oiiagen)從瓊脂糖凝膠中純化7. 3kb片段，并連接到 AclI-AvrII 消化的 PCR(插入片段)，以獲取 pZE21MVd_190 * -SgrAI0為了篩選陽性克隆，需要進行NcoI消化，從d-190 *中間載體中產(chǎn)生71Λ的單條帶，并從初始的GPI-錨定構(gòu)建體中產(chǎn)生1. 3和5. 7kb的兩個條帶。根據(jù)“六規(guī)則(rule of six) ”，為構(gòu)建最終的重組ρ⑴MeV2EZ-dl90 *和ρ (+) MeV3EZ-dl90 * (圖5和圖6)，用SgrAI+BssHII消化MeV載體和中間質(zhì)粒，隨后將它們彼此連接。具體地，使用SgrAI+BssHII 消化 pZE21MVd_190 * -SgrAI 產(chǎn)生了 5. 2kb+l. 31ib+900bp三個條帶。D-190*序列包含在5. 2kb的片段中，該片段被切下、純化并與SgrAI+BssHII消化的MeV2EZ和MeV3EZ載體(長度為191Λ)以等摩爾比在16°C下使用1 單位的T4 DNA連接酶連接過夜。隨后，按照標準的轉(zhuǎn)化方案(Sambrook等，1989)，用全部連接體積轉(zhuǎn)化XLlO Gold 化學感受態(tài)細胞，鋪板并在LB-瓊脂板上對氨芐青霉素抗性進行篩選。通過DNA質(zhì)粒制備 (QIAGEN，小提-、中提和大提試劑盒)和限制性酶消化篩選克隆。正確的克隆被送到MWG測序使用DNA Strider軟件將該序列與推定序列進行比對，顯示100%同一性。圖5顯示插入到MV載體位置2 (SgrAI，4060位，和BssHII，9239位)中的d_190 *-3D7基因，并且其開放讀碼框(ORF)列在圖27中。圖6顯示插入到MV載體位置3 (SgrAI，9862位，和BssHII，15041位)中的d_190 *-3D7基因。重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒的基因組的長度(始于ACC，609位，至GGT，21788位)是6 的倍數(shù)，允許重組MV2_3-d-190 * -3D7病毒的拯救。le)p(+)MV2EZ-d-83-30-38 * -SgrAI (3D7, 23105bp)和 ρ (+) MV3EZ-d-83-30-38 *-SgrAI (3D7,23105bp)的構(gòu)建。按照實施例3a中的詳細描述制備麻疹載體。用BstEII-ClaI消化pZE21MVd-190_SgrAI中間載體，以切取d_42片段和位于 AclI 6434位)和ClaI (5536位)位點之間的GPI區(qū)；已連接具有BstEII和ClaI粘末端的多接頭，以獲得中間質(zhì)粒pZE21MV-d-83-30-38 *-SgrAI (6346bp)。多接頭的序列是 5' -GTCACCGGGGAATAATAGCGCAT-3‘。合成寡核苷酸多接頭的DNA序列以大寫字母表示非MV核苷酸；相關(guān)的限制性核酸內(nèi)切酶識別位點序列用下劃線表示。多接頭含有BstEII (GTCACC)和ClaI (AT)粘末端、兩個終止密碼子(TAATAG)和為保持六規(guī)則的三聯(lián)體(GCG)。在其最適溫度下以50 μ 1的終體積用SgrAl-BssHII (每種酶1個單位)消化1 μ g 的pZE21MV-d-83-30-38 * SgrAI 2小時。將所有消化的DNA上樣到1 %瓊脂糖凝膠中，80伏運行約2小時。隨后，從凝膠中切下正確條帶(4057bp)，用QIAEX凝膠純化試劑盒純化，通過^Onm的吸光度計算DNA濃度并調(diào)整至1 口 μ g/ml。從而在16°C下以10 口 μ 1終體積使用1單位的T4DNA連接酶及其反應緩沖液以等摩爾比連接載體(MV DNA 圖1)和插入片段(d-83-30-38 * =DNA 圖2)過夜。隨后，按照標準的轉(zhuǎn)化方案(Sambrook等，1989)，用全部連接體積轉(zhuǎn)化XLlO Gold 化學感受態(tài)細胞，鋪板并在LB-瓊脂板上對氨芐青霉素抗性進行篩選。通過DNA質(zhì)粒制備 (QIAGEN，小提-、中提和大提試劑盒)和限制性酶消化篩選克隆。將正確的克隆送到MWG測序然后使用DNA Strider軟件將該序列與推定序列進行比對。將正確的克隆送到MWG測序使用DNA Strider軟件將該序列與推定序列進行比對，顯示100%同一性。圖8中顯示插入到MV載體位置2(SgrAI，4060位，和BssHII，8117位)中的 d-83-30-38 *-3D7基因，并且其開放讀碼框(ORF)列在圖四中。圖9中顯示插入到MV載體位置3(SgrAI，9862位，和BssHII，13919位)中的 d-83-30-38 *-3D7 基因。重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒的基因組的長度(始于ACC，609位，至GGT，20666位)是6 的倍數(shù)，允許對重組MV2_3-d-83-30-38 * -3D7病毒的拯救。If) ρ (+) MV2EZ-d-42 * -SgrAI (3D7, 20345bp)禾Π ρ (+) MV3EZ-d_42 * -SgrAI (3D7, 20345bp)的構(gòu)建。按照實施例3a中的詳細描述制備麻疹載體。使用中間載體pZE21MVd-42-SgrAI (3658bp)為模板，進行PCR反應以缺失GPI錨定區(qū)，其位于AclI (15 位)和ClaI (1630位)位點之間。使用保真型Pfu DNA聚合酶(Stratagene)進行PCR擴增。合成寡核苷酸引物的 DNA序列以小寫字母表示MV核苷酸，并以大寫字母表示非MV核苷酸；相關(guān)的限制性核酸內(nèi)切酶識別位點序列用下劃線表示。使用了如下的寡核苷酸引物For-ClaI，5 ‘ -CCAATAAACGTTTAAT AGatcgattacgcgcgctctagc-3‘,和 Rev-Avrll, 5‘ -gcctttgagtgagctgatacc-3‘。在ClaI (1630位)和BssHII (1639位)位點的水平，R)r-Clal與模板是同源的， 并且含有帶有兩個終止密碼子(TAATAG)、AclI位點(AACGTT)和6bp長AclI保護位點 (CCAATA)的突出(以大寫字母表示)。在所謂的PCR-GPI和在最終構(gòu)建體d-42*中，AclI 會接近ClaI。Rev-AvrII與模板同源(從1798至1818位)。PCR產(chǎn)物長207bp 將其用Acll+Avrll消化并與預先Acll+Avrll消化的中間載體 pZE21MVd-42-SgrAI 連接產(chǎn)生 pZE21MVd-42 * -SgrAI 具體地，使用Ac 11 +Avr11消化載體產(chǎn)生了 3412bp和246bp (含有要缺失的GPI區(qū)) 的兩個條帶使用QIAEX II純化試劑盒^jiagen)從瓊脂糖凝膠中純化3. 4kb-片段，并連接到Acll+Avrll消化的PCR(插入片段)，以獲取pZE21MVd_42 * -SgrAI0為了篩選陽性克隆，需要進行NcoI消化，從d-42*中間載體中產(chǎn)生3.41Λ的單條帶，并從初始的GPI-錨定構(gòu)建體中產(chǎn)生1. 3和2. 3kb的兩個條帶。根據(jù)“六規(guī)則，，，為構(gòu)建最終的重組ρ (+) MeV2EZ_d42 *和ρ (+) MeV3EZ_d42 *，用 SgrAI+BssHII消化MeV載體和中間質(zhì)粒，并隨后將它們彼此連接。具體地，使用SgrAI+BssHII+Spel 消化 pZE21MVd_42 * -SgrAI 產(chǎn)生了 1. 3kb+936bp+800bp+400bp四個條帶。D-42*序列包含在1. 3kb的片段中，該片段被切下、純化并與SgrAI+BssHII消化的MeV2EZ和MeV3EZ載體(長度為191Λ)以等摩爾比在16°C 下使用1單位的T4DNA連接酶連接過夜。隨后，按照標準的轉(zhuǎn)化方案(Sambrook等，1989)，用全部連接體積轉(zhuǎn)化XLlO Gold 化學感受態(tài)細胞，鋪板并在LB-瓊脂板上對氨芐青霉素抗性進行篩選。通過DNA質(zhì)粒制備 (QIAGEN，小提-、中提和大提試劑盒)和限制性酶消化篩選克隆。正確的克隆被送到MWG測序使用DNA Strider軟件將該序列與推定序列進行比對，顯示100%同一性。圖11顯示插入至IJ MV載體(SgrAI，4060位，和BssHH, 5357位)位置2中的d_42 *-3D7基因，并且其開放讀碼框(ORF)列在圖31中。圖12顯示插入到MV載體(SgrAI，9862位，和BssHII，11159位)位置3的d_42 *-3D7基因。重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒的基因組的長度(始于ACC，609位，至GGT，17906位)是6 的倍數(shù)，允許重組MV2_3-d-42 * -3D7病毒的拯救。Ig) ρ (+) MV2EZ-d-190-SgrAI (FCB1, 24083bp)和 ρ (+)MV3EZ-d-190-SgrAI (FCB1, 24083bp)的構(gòu)建。首先，將FCBl毒株的MSP-I合成基因克隆進中間質(zhì)粒pZE21MV_SgrAI，保留來自 3D7毒株MSP-I的信號肽和GPI-錨定區(qū)。從稱為pZE23f-GX_190H的中間載體中逐步獲得 D-190基因(FCBl)，步驟如下i).在其最適溫度下以50 μ 1的終體積用Hindlll+Acll限制性酶消化IygW pZE21MV-d-190-SgrAI (3D7)質(zhì)粒2小時。將所有消化的DNA上樣到瓊脂糖凝膠中，80 伏運行約2小時。隨后，從凝膠中切下對應載體的正確條帶(2558bp)，用QIAEX凝膠純化進行純化，通過260nm的吸光度計算DNA濃度。ii).使用pZE23f-GX-190H為模板進行PCR反應以擴增并回收MSP-1/FCB1的d_42 部分。使用保真型Pfu DNA聚合酶(Stratagene)進行PCR擴增。合成寡核苷酸引物的DNA 序列以小寫字母表示MV核苷酸，并以大寫字母表示非MV核苷酸；相關(guān)的限制性核酸內(nèi)切酶識別位點序列用下劃線表示。使用了如下的按照pZE23f-GX_190H序列設(shè)計的寡核苷酸引物For_l FCB1, 5' -CCCAAGCTTccaggtggtcaccggAgagctgtcactcc-3‘,和 Rev-lFCBl,5‘ -GCCTGCaacgttG CTagagctggagcaGaaGatcccgtcg-3‘。For-I FCBl從4509位至4538位與模板同源，其包含BstEII位點(ggtcacc)。A (大寫)在模板中為t，且其被修飾以去除SgrAI位點。在其3bp長保護位點(CCC)之后，其含有具有HindIII位點(AAGCTT)和突出端(大寫)。在6-bp保護位點(GCCTGC)之前，Revl FCBl含有AclI位點(aacgtt)。其中引入編碼絲氨酸的三聯(lián)體GCT以保持六規(guī)則；在G處，兩個a被修飾以避免多聚(A)位點。用HindIII+AclI 消化所獲得的 PCR-HindIII-AclI (1. Ikb)，在 16 °C 下以等摩爾比過夜連接至用Hindlll+Acll預消化的p^21MV-d-190_SgrAI (步驟i)，獲得 pZE21MV-d-42-SgrAI-FCBl (3657bp)。隨后，按照標準的轉(zhuǎn)化方案(Sambrook 等，1989)，用全部連接體積轉(zhuǎn)化XLlO Gold化學感受態(tài)細胞，鋪板并在LB-瓊脂板上對氨芐青霉素抗性進行篩選。通過DNA質(zhì)粒制備QIAGEN，小提-、中提和大提試劑盒)和Hindlll+Acll限制性酶消化篩選克隆(預計片段為2558bp+1099bp)。
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iii).用 HindIII+BstEII(HindIII，^8 位，和 BstEII，440 位)消化按步驟 ii 中的描述獲得的pZE21MV-d-42-SgrAI-FCBl，將對應于打開的載體的正確條帶(364^p)上樣至IJ瓊脂糖凝膠中，將其從凝膠中切下，用QIAEX凝膠純化進行純化，以^Onm的吸光度值計算DNA濃度。iv).用Hindlll+BstEII消化pZE23f-GX_190H，按照之前所述從凝膠中純化對應于d-83-30-38/FCBl片段的3679bp的正確條帶(插入片段)。v).將獲得自 pZE21MV-d-42-SgrAI-FCBl 的 3657bp (載體)Hindlll+BstEII 消化片段連接到HindIII+BstEII消化的3679bp片段(插入片段)，后者含有d-83-30_38/FCBl 且獲得自pZE23f-GX-190H的消化。在16°C下使用1單位的T4DNA連接酶以等摩爾比連接過夜，獲得pZE21MV-d-190-SgrAI-FCBl (7324bp)。之后，按照標準的轉(zhuǎn)化方案(Sambrook 等，1989)，用全部連接體積轉(zhuǎn)化XLlO Gold化學感受態(tài)細胞，鋪板并在LB-瓊脂板上對氨芐青霉素抗性進行篩選。通過DNA質(zhì)粒制備0HAGEN，小提-、中提和大提試劑盒)和限制性酶消化篩選克隆。為構(gòu)建ρ (+) MV2EZ-d-190-SgrAI-FCBl 和 ρ (+)MV3EZ-d-190-SgrAI_FCBl，按照實施例3a中的詳細描述制備麻疹載體。在其最適溫度下以50 μ 1的終體積用SgrAl-BssHII消化(每種酶1個單位)2小時取得插入中間質(zhì)粒中的 1 μ g d-190/FCBl 基因(pZE21MV-d-190 SgrAI-FCBl，7324bp)。 將所有消化的DNA上樣到瓊脂糖凝膠中，80伏運行約2小時。隨后，從凝膠中切下正確的條帶(503^p)，用QIAEX凝膠純化試劑盒純化，通過^Onm的吸光度計算DNA濃度并調(diào)整至 1 □ μ g/ml。從而在16°C下，以10 □ μ 1的終體積用1單位的T4DNA連接酶及其反應緩沖液以等摩爾比連接載體(MV DNA 圖1)和插入片段(d-190/FCBl DNA 圖3)過夜。隨后，按照標準的轉(zhuǎn)化方案(Sambrook等，1989)，用全部連接體積轉(zhuǎn)化XLlO Gold 化學感受態(tài)細胞，鋪板并在LB-瓊脂板上對氨芐青霉素抗性進行篩選。通過DNA質(zhì)粒制備 (QIAGEN，小提-、中提和大提試劑盒)和限制性酶消化篩選克隆。正確的克隆被送到MWG測序使用DNA Strider軟件將該序列與推定序列進行比對，顯示100%同一性。圖13中顯示插入到MV載體位置2(SgrAI，4060位，和BssHII，9095位)中的 d-190-FCBl基因，并且其開放讀碼框(ORF)列在圖32中。圖14顯示插入到MV載體位置3(SgrAI，9862位，和BssHII，14897位)中的 d-190-FCBl 基因。重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒的基因組的長度(始于ACC，609位，至GGT，21884位)是6 的倍數(shù)，允許重組MV2_3-d-190-FCBl病毒的拯救。該轉(zhuǎn)基因的表達相當穩(wěn)定在人二倍體細胞MRC5中進行10次系列病毒傳代之后所有分析的源自單個初始拯救的克隆的子代克隆均保持表達(圖40)。重組的MV-瘧疾病毒和MV疫苗的生長曲線顯示相同的動力學(圖41)。實施例2 =DiCol核酸序列的設(shè)計。始于DiCol氨基酸序列(胞外、跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域aa 97-622)并且使用DNA Strider軟件，將DiCol DNA簡并序列與選取的PfAMAl基因(登錄號AAG 141. 1)(是BLAST 比對后與DiCol最相似的序列)進行對比來設(shè)計對應的核酸序列。
在5’末端添加合適的獨特限制性位點(MuI和SgrAI)作為克隆位點，其后添加最佳的KOZAC序列和人優(yōu)化的信號肽(SP)。在3’末端，添加兩個終止密碼子和BssHII克隆位點。按照該方案，我們設(shè)計了兩個核苷酸序列(遵守“六規(guī)則”，以進一步在麻疹載體中表達)，它們編碼錨定和分泌形式的DiCol蛋白第一個基因包含胞質(zhì)外、跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域 (圖18)，而第二個基因僅對應于胞外結(jié)構(gòu)域(圖19)。這兩個序列通過GENEART進行人密碼子優(yōu)化以降低AT%含量，來避免多聚(A)序列和RNA不穩(wěn)定基序。DiCol完整ORF和DiCol胞外結(jié)構(gòu)域ORF分別列在圖；34和；35中。實施例3 重組MV-PfAMA-I質(zhì)粒的構(gòu)建所有的克隆過程都按照Sambrook等(1989)中描述的技術(shù)進行?；瘜W合成分泌和錨定形式的PfMSP-I (特別是多樣性覆蓋序列1 (DiCol))并且進行人密碼子優(yōu)化。用SgrAI+BssHII消化密碼子優(yōu)化的DiCol分泌和錨定形式，并在16°C下使用 1單位的T4DNA連接酶以等摩爾比過夜連接到預先消化的MeV2EZ和MeV3EZ載體(長度為19Kb)上，以獲得如下重組MV-PfAMA-I質(zhì)粒ρ (+)MV2EZ-DiCol-完整(圖20)、ρ (+) MV3EZ-DiCol-完整(圖 21)、p(+)MV2EZ-DiCol-胞外(圖 22)和 ρ (+)MV3EZ-DiCol-胞外(圖 23)。 實施例4 重組MV-PfCS質(zhì)粒的構(gòu)建ρ (+) MV2EZ-CS-SgrAI (20219bp)和 d (+) MV2EZ-CS-SgrAI (20219bp)的構(gòu)津所有的克隆過程都基本上按照Sambrook等(1989)所述進行。用PCR擴增克隆進入pAdApt35Bsu. CS. Pfalc. aa-sub. gcc中間載體的PfCSl，并直接克隆進入最終的MV載體， 獲得兩個重組 MV-PfCS 質(zhì)粒p (+) MV2EZ-CS 和 ρ (+)MV3EZ_CS。具體地，使用pAdApt;35Bsu. CS. Pfalc. aa-sub. gcc為模板進行PCR反應以擴增并回收CS基因(圖15)。使用保真型Pfu DNA聚合酶(Stratagene)進行PCR擴增。合成寡核苷酸引物的DNA序列以小寫字母表示MV核苷酸，并以大寫字母表示非MV核苷酸；相關(guān)的限制性核酸內(nèi)切酶識別位點序列用下劃線表示。使用了如下的按pAdApt35Bsu. CS. Pfalc. aa-sub. gcc序列設(shè)計的寡核苷酸引物 For SgrAI,5' -ACTTCTCACCGGTGTRRaaRcttRccac catgat_3'，和Rev-BssHII-CS，5‘ -TAG CGCGCtctagaggatccttatcagc-3‘。For-SgrAI與模板的1356位至1375位同源，其包含HindIII位點(aagctt)。在其6-bp長保護位點(ACTTCT)后，其含有具有SgrAI限制性位點(CACCGGTG)的突出端(大寫)。Rev-BssHII-CS含有具有BssHII限制性位點(GCGCGC)的突出端(大寫)，其在 PCR-CS (1187bp)中接近 Xbal (tctaga)。用SgrAI+BssHII消化所獲得的PCR-CS，并在16°C下使用1單位的T4DNA連接酶以等摩爾比過夜連接至預先用SgrAI+BssHII消化的MeV2EZ和MeV3EZ載體(長度為19Kb)， 分別獲得 P (+)MV2EZ-CS-SgrAI (20219bp,圖 16)和 ρ (+)MV3EZ-CS-SgrAI (20219bp,圖 17)。 圖33中列出了 CS的0RF。隨后，按照標準的轉(zhuǎn)化方案(Sambrook等，1989)，用全部連接體積轉(zhuǎn)化XLlO Gold 化學感受態(tài)細胞，鋪板并在LB-瓊脂板上對氨芐青霉素抗性進行篩選。通過DNA質(zhì)粒制備(QIAGEN，小提-、中提和大提試劑盒)和限制性消化篩選克隆。正確的克隆被送到MWG測序使用DNAMrider軟件將該序列與推定序列進行比對，顯示100%同一性。實施例5 細胞和病毒細胞在Dulbecco改良的fegles培養(yǎng)基(DMEM)中以單層維持，對Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)補充5%的胎牛血清(FCS)，對293T細胞(人胚腎細胞)補充10% FCS和
青霉素/鏈霉素(ΡΛ)；對MRC-5(人胚胎成纖維細胞)使用補充Glutamax (FU)和10% FCS 的 DMEM ；對 293-3-46 使用補充 10% FCS 禾口 1. 2mg/ml G 418 的 DMEM0為將MV病毒儲液培養(yǎng)至達到約l(fpfu/ml的滴度，將重組病毒和疫苗毒株 Edmoston Zagreb在MRC-5細胞中增殖通過將合胞體轉(zhuǎn)移到35mm的MRC-5細胞培養(yǎng)物中來進行噬斑純化，將其首先擴增至IOcm皿，然后擴增175cm瓶中。當合胞體形成約有90% 顯著時，從175cm2培養(yǎng)物制備病毒儲液。收集對應于所謂“無細胞病毒級分”的培養(yǎng)基，凍融三次并離心以除去細胞碎片。隨后將培養(yǎng)基保存于-80°C。刮下對應于所謂“細胞相關(guān)病毒級分”的細胞放入3ml OPTIMEM(Gibco BRL)中，隨后凍融三次，離心并將澄清的上清液保存于_80°C。實施例6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和MV病毒的拯救將細胞接種于35mm孔，以在轉(zhuǎn)染時達到約50-70%匯合。轉(zhuǎn)染前4小時，將培養(yǎng)基更換為含10% FCS的:3ml DMEM。所有重組質(zhì)粒均根據(jù)QIAGEN質(zhì)粒制備試劑盒進行制備。用于DNA的磷酸鈣共沉淀的試劑盒購自hvitrogen。用以下終濃度的質(zhì)粒對細胞進行共轉(zhuǎn)染pCA_L 0. 5 μ g、pCA_N 0. 5 μ g、pCA-P 0. 1 μ g> pCA T7 Iyg和重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒4 μ g。將所有5種質(zhì)粒用H2O稀釋，加入含有2M CaCl2的Eppendorf管中，在振搖條件下將混合物加入另一支含有HEPES緩沖液的 Eppendorf管中，室溫(RT)下孵育30分鐘。這樣，將共沉淀物逐滴加入培養(yǎng)物中，轉(zhuǎn)染在 37°C和5% CO2下進行約18小時。隨后，將轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基更換為含10% FCS的!MIDMEM。下面描述獲得重組麻疹-瘧疾疫苗病毒的另一種方式，使用四3-3_46輔助細胞 (人胚腎細胞)，該細胞穩(wěn)定表達麻疹N和P蛋白以及T7 RNA聚合酶。病毒RNA聚合酶(大蛋白，L)通過與15ng質(zhì)粒peMCLa—起對細胞進行共轉(zhuǎn)染來表達。為提高轉(zhuǎn)染效率，添加 300ng pSC6-T7 Neo0用磷酸鈣法進行轉(zhuǎn)染。第一批合胞體出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后3-4天，此時細胞仍然為亞匯合狀態(tài)。為使合胞體的形成進行得更容易，將各個35mm孔中已接近匯合的細胞單層轉(zhuǎn)移至IOcm皿中。將各合胞體置于300 μ 1轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中，放入含有700 μ 1 OPTIMEM的無菌Eppendorf管中，凍融三次， 保存于_80°C。實施例7 病毒滴度的噬斑測定用OPTIMEM制備病毒制備物的10倍連續(xù)稀釋液，至終體積為0. 5ml。將各稀釋液加到35mm Vero細胞培養(yǎng)物上。病毒吸附后1小時，移除接種物并用含5% FCS和低熔點瓊脂糖(LMP瓊脂糖)的aiilDMEM覆蓋感染細胞。以37°C和5% CO2孵育5天后，將培養(yǎng)物用lmllO% TCA固定1小時，然后UV交聯(lián)30分鐘。移除覆蓋的瓊脂糖之后，用溶于4% 乙醇的結(jié)晶紫染色細胞單層，用水清洗，并在倒置顯微鏡下對噬斑進行計數(shù)。實施例8 重組病毒的MRC-5病毒連續(xù)傳代將拯救病毒在MRC5細胞上連續(xù)傳代10次，所述細胞接種在IOcm直徑的平板上，
23用標準和重組MV病毒以0. OlPFU/細胞的MOI進行感染。在單層細胞被完全感染后，用各培養(yǎng)物的上清液感染后續(xù)的MRC5細胞單層。為測試轉(zhuǎn)基因的表達和穩(wěn)定性，將來自第 1、5和10代的病毒用于通過Western印跡和免疫熒光進一步表達的表征。。實施例9 =Western印記法、免疫熒光法實施Wfestern印記和免疫熒光法以分析MV和瘧疾的表達。為進行^festern印跡，將接種在；35讓皿上的Vero細胞(1-5X105)在次日監(jiān)測至 90%匯合，用來自于細胞相關(guān)病毒級分的澄清病毒懸液以0. IMOI (感染復數(shù))進行感染，包括MVEZ作為對照。當觀察到約80%合胞體形成時，將細胞首先用PBS清洗，然后刮入Iml PBS中并收集至Eppendorf管，2000RPM/4分鐘離心。隨后用補充有蛋白酶抑制劑混合物 (Complete Mini, Roche, 1836153)的 70 μ 1 裂解緩沖液(1 % NP-40，50mM Tris pH 8,150mM NaCl)5分鐘/室溫裂解細胞。通過13000RPM/5分鐘離心使上清液澄清，轉(zhuǎn)移至新管內(nèi)力口 Λ30μ 1 4Χ上樣緩沖液(Invitrogen)；混和樣品，95°C煮2分鐘，離心后保存于_20°C。進行SDS-PAGE遷移，在還原條件下的NuPAGE 12%雙丙烯酰胺膠中電泳，使用1 X 電泳緩沖液，以200V電泳50分鐘(以100-125mA開始，以60_80mA結(jié)束)。然后，用半干法以14V/1小時30分鐘將分開的細胞蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用PBST至少1 30000稀釋的抗MSPl-p-83和至少1 50000稀釋的抗MSPl-p-42 的兔多克隆抗體作為一抗。二抗是偶聯(lián)了辣根過氧化物酶的豬抗兔抗體，以通過增強化學發(fā)光試劑盒(ECL ，Amersham LifeScience)使條帶可視化。為進行免疫熒光，將Vero細胞接種到35mm孔中的24mmX 24mm玻璃蓋玻片上，過夜培養(yǎng)并用拯救的重組病毒感染。感染后3天，用PBS中3. 7%多聚甲醛固定蓋玻片上的細胞，并用0. TX-100透化，用封閉液(含有BSA的PBS)洗1小時，用特異性的抗體染色。使用1 100稀的識別p-42的p-19部分中EGF-樣結(jié)構(gòu)域的小鼠雜交瘤上清液 mAb5.2，而后使用1 250稀釋的FITCH綴合的山羊抗小鼠血清。實施例10 生長動力學曲線監(jiān)測接種在35mm皿上的MRC5細胞(1-5X105)至90%匯合，并用來自于細胞相關(guān)病毒級分的澄清病毒懸液以0. IMOI進行感染，包括MVEZ作為對照。每日收集對應于所謂 “無細胞病毒級分”和所謂“細胞相關(guān)病毒級分”的樣品，收集一周并進行滴定。實施例11:小鼠免疫通過在對MV感染易感的IFNAR/⑶46轉(zhuǎn)基因小鼠中進行免疫測試證明所述拯救的重組MV-瘧疾病毒的致免疫能力。在最佳衛(wèi)生條件下飼養(yǎng)動物，并在6-8周齡時免疫。以下提供用兩種重組麻疹-瘧疾病毒(MeV2EZ-d-p42-SgrAI(GPI錨定形式)和MeV2EZ_d-p42 * (分泌形式))免疫小鼠的例子。在第0、4和8周，使用IO5PFU的每種重組MV-瘧疾肌內(nèi)注射3次進行免疫。用重組空麻疹(rMVEZ13-空克隆)免疫的小鼠作為陰性對照。用UV 失活的rMV作為對照，以確定病毒復制對免疫應答活化的影響。測試了 MV載有的抗原與純化的d-42蛋白(0.5mg/ml)相比的免疫應答用弗氏不完全佐劑中的20 μ g蛋白皮下免疫小鼠。通過ELISA測定經(jīng)免疫的IFNAR/⑶46小鼠(6只/試驗組和3只/對照組)血清中MV-特異性抗體的存在情況，其中使用包被有麻疹病毒EIA bulk(ATCC VR_M)(用于檢測IgG抗體)的96微孔板。將蛋白用0.05M碳酸鹽緩沖液(pH 9.4)稀釋至0. 6 μ g/ml，以100 μ 1每孔加入96孔微滴定板中。將板在4°C下孵育過夜，用PBS/0.05% Tween 20 (PT) (ph 7.4)清洗，與PT (0.1ml/孔)-10% BSA在37 °C下孵育60分鐘，再用PT清洗。加入受試血清的2倍連續(xù)稀釋液(ΙΟΟμΙ/孔)，并將板在37°C下孵育60分鐘。將板用PT清洗后與1 2000稀釋于PT的100 μ 1山羊抗小鼠IgG HRP在37°C下孵育30分鐘。將板用PT清洗并與100 μ 1 OPD (對苯二胺，F(xiàn)luka 78411)孵育。在3_4分鐘后終止反應。在 MicroElisaReader上以490nm波長讀板。高于三倍陰性對照的讀數(shù)記為陽性反應。通過ELISA測定來測定經(jīng)免疫⑶46小鼠(至少10只/試驗組)的血清中MV-瘧疾特異性抗體的存在。簡言之，將96微孔板用50ng/孔的以碳酸鹽緩沖液(pH 9.4)稀釋的MSP-l-d423D7毒株包被。將板在4°C下孵育過夜，用PBS/0. 05% Tween 20 (PT)清洗。 隨后，在37°C下用溶于PT的10%脫脂乳封閉非特異性相互作用1小時，再次用PT清洗孔。 將板依次與不同的小鼠血清稀釋液(從1 200開始，其后為2倍連續(xù)稀釋)、綴合有過氧化物酶的山羊抗小鼠IgG和用OPD底物進行孵育。測量490nm處的吸光度。高于取舍值背景水平(MV免疫小鼠的血清平均值乘以2. 1的系數(shù))的數(shù)值視作陽性。滴度表述為最終稀釋度的倒數(shù)。針對麻疹的體液免疫應答見圖A。針對瘧疾p42的體液免疫應答見圖B。圖A 針對麻疹的體液應答
權(quán)利要求
1.一種包含表達瘧疾抗原之重組麻疹疫苗病毒的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，其能引發(fā)針對麻疹和瘧疾兩者的免疫應答和保護。
2.權(quán)利要求1的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，其中所述重組麻疹疫苗病毒表達單個的或不同的瘧疾抗原。
3.權(quán)利要求1的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，其中所述重組麻疹疫苗病毒表達MSPl瘧疾抗原。
4.權(quán)利要求1的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，其中MSPl瘧疾抗原為190至200KDa(dl90)。
5.權(quán)利要求1的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，其中MSPl瘧疾抗原為d83-30-38。
6.權(quán)利要求1的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，其中MSPl瘧疾抗原為d42。
7.前述權(quán)利要求中任一項的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，其中所述重組麻疹疫苗病毒表達錨定形式和分泌形式的MSPl瘧疾抗原。
8.前述權(quán)利要求中任一項的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，其中所述重組麻疹疫苗病毒表達 3D7毒株和MAD 20優(yōu)選FCBl毒株的錨定形式和分泌形式的MSPl瘧疾抗原。
9.前述權(quán)利要求中任一項的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，其中所述重組麻疹疫苗病毒表達 FCBl毒株的錨定形式和分泌形式的MSPl瘧疾抗原。
10.權(quán)利要求1的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，其中所述重組麻疹疫苗病毒表達多樣性覆蓋 (DiCo)AMAl瘧疾抗原。
11.權(quán)利要求1的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，其中所述重組麻疹疫苗病毒表達AMAl瘧疾抗原的 DiCo-I。
12.權(quán)利要求1的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，其中所述重組麻疹疫苗病毒表達AMAl瘧疾抗原的 DiCo-2。
13.權(quán)利要求1的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，其中所述重組麻疹疫苗病毒表達AMAl瘧疾抗原的 DiCo-3。
14.權(quán)利要求1的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，其中所述重組麻疹疫苗病毒表達AMAl瘧疾抗原的 DiCo-I、DiCo-2 和 DiCo-3。
15.權(quán)利要求10至14的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，其中所述重組麻疹疫苗病毒表達跨膜形式和分泌形式的多樣性覆蓋(DiCo)AMAl瘧疾抗原。
16.權(quán)利要求1的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，其中所述重組麻疹疫苗病毒表達CS瘧疾抗原。
17.前述權(quán)利要求中任一項的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，其中所述瘧疾抗原被克隆在重組麻疹疫苗病毒的P和M蛋白之間或H和L蛋白之間。
18.—種麻疹疫苗病毒載體，其包含瘧疾抗原的核苷酸序列。
19.權(quán)利要求18的載體，其中所述核苷酸序列選自圖沈至圖35。
20.權(quán)利要求18和19的載體，其中所述麻疹疫苗病毒載體還包含選自圖M至圖25的核苷酸序列。
21.權(quán)利要求18的載體，其中所述核苷酸序列編碼瘧疾抗原，所述抗原選自MSPl的 d83-30-38和d42和dl90片段或者多樣性覆蓋(DiCo)AMAl或CS蛋白。
22.—種宿主，其包含權(quán)利要求18的載體。
23.權(quán)利要求22的宿主，其選自大腸桿菌或哺乳動物細胞系。
24.前述權(quán)利要求中任一項的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，其中所述重組麻疹病毒源于衍生自Edmoston Zagreb的疫苗株。
25.前述權(quán)利要求中任一項的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，其中重組麻疹病毒表達選自MSPl 的d83-30-38和d42和dl90片段或者多樣性覆蓋(DiCo)AMAl或CS蛋白的至少一種瘧疾抗原。
26.前述權(quán)利要求中任一項的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，其中重組麻疹疫苗病毒表達選自 MSPl的d83-30-38和d42和dl90片段或多樣性覆蓋(DiCo)AMAl或CS蛋白或其組合的兩種或更多種瘧疾抗原。
27.前述權(quán)利要求中任一項的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，其中重組麻疹疫苗病毒包含如下序列MSP-I d-190-3D7AN101TEMSP-I d-190 *-3D7 AN102TE MSP-I d-83-30-38-3D 7AN103TE MSP-I d-83-30-38 *-3D7 AN104TE MSP-I d-42-3D7AN105TEMSP-I d-42 *-3D7AN106TEMSP-I d-190-FCBlAN107TECSAN108TEDiCol-completeAN109TEDiCol-ectoANlIOTE
28.前述權(quán)利要求中任一項的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，其中重組麻疹疫苗病毒除所述瘧疾抗原外還編碼具有佐劑特性的蛋白質(zhì)。
29.前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其包含重組麻疹病毒，所述病毒除所述瘧疾抗原外還編碼白介素，優(yōu)選白介素2。
30.前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其包含所述重組麻疹瘧疾病毒之一，或包含兩種至幾種這些種病毒的混合物。
31.前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其中所述重組麻疹瘧疾病毒或兩種至多種該病毒的混合物沒有缺陷型干擾顆粒(DI)。
32.前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其中偶然產(chǎn)生的DI顆粒已通過噬斑純化去除。
33.前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其中偶然產(chǎn)生的DI顆粒已通過終點稀釋而去除。
34.前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其中偶然產(chǎn)生的DI顆粒已通過物理方法如差速離心而去除。
35.前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其作為聯(lián)合疫苗的組分，其中其他組分為單獨或組合的天然減毒或重組的風疹、腮腺炎、水痘或其他的活減毒疫苗病毒。
36.前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其包含適用于腸胃外應用的合適穩(wěn)定劑如明膠和 /或人血清白蛋白和山梨醇為主要組分。
37.前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其包含適用于鼻內(nèi)應用的合適穩(wěn)定劑和/或佐劑。
38.前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，其包含適用于吸入應用的合適穩(wěn)定劑和/或佐劑。
39.前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，包含適用于口服應用的合適穩(wěn)定劑和/或佐劑。
40.前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，包含適用于透皮應用的合適穩(wěn)定劑和/或佐劑。
41.前述權(quán)利要求中任一項的疫苗，包含適用于任何栓劑的合適穩(wěn)定劑和/或佐劑。
42.一種麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗的組合物，其包含穩(wěn)定劑和/或佐劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有不同的減毒重組麻疹-瘧疾載體的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，所述載體包含編碼幾種惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)抗原的異源核酸。優(yōu)選地，其涉及包含核酸的病毒載體，所述核酸編碼惡性瘧原蟲的環(huán)子孢子(circumsporozoite，CS)蛋白、惡性瘧原蟲的裂殖子表面蛋白1(merozoite surface protein 1，MSP-1)及其糖基化和分泌形式的衍生物(p-42；p-83-30-38)和錨定或分泌形式的惡性瘧原蟲的頂膜抗原1(apical membrane antigen 1，AMA1)。所述病毒載體源自減毒麻疹病毒，其基于用作疫苗并且有效地遞送目的基因還有效地結(jié)合并感染相關(guān)免疫細胞的毒株。在一個優(yōu)選的實施方案中，CS、MSP1和AMA1蛋白從病毒中產(chǎn)生，從而使它們在哺乳動物(優(yōu)選人)中引發(fā)強免疫應答；所述蛋白的表達因為人密碼子優(yōu)化而升高。另外，本發(fā)明涉及所述重組疫苗在瘧疾的預防性治療中的用途。
文檔編號C12N7/04GK102458427SQ201080024777
公開日2012年5月16日 申請日期2010年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月5日
發(fā)明者維維安娜·賈尼諾, 賴因哈德·格呂克, 阿加塔·法齊奧, 馬丁·比耶泰 申請人:卡迪拉保健有限公司