專利名稱：重編程t細(xì)胞和造血細(xì)胞的方法
重編程T細(xì)胞和造血細(xì)胞的方法
背景技術(shù)：
本申請涉及2009年6月5日提交的美國申請?zhí)?1/184，546和2009年9月4日提交的美國申請?zhí)?1/240，116，它們的全部公開內(nèi)容無所放棄地通過引用方式特別全文并入本文。
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明大體上涉及分子生物學(xué)和干細(xì)胞領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及體細(xì)胞、尤其是τ細(xì)胞和造血細(xì)胞的重編程(!^programming)。2.相關(guān)技術(shù)描述一般而言，干細(xì)胞是未分化的細(xì)胞，其能夠產(chǎn)生成熟的功能性細(xì)胞的演替。例如， 造血干細(xì)胞可以產(chǎn)生任意的不同類型的末端分化的血液細(xì)胞。胚胎干(ES)細(xì)胞源自胚胎， 其是多能的，因此具有發(fā)育成任意器官或組織類型，或至少潛在地發(fā)育成完整胚胎的能力。誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell)，通常簡稱為iPS細(xì)胞或 iPSC，是一類人工地從非多能細(xì)胞(通常為成年體細(xì)胞)衍生而來的多能干細(xì)胞。人們相信，在很多方面，誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞與天然多能干細(xì)胞例如胚胎干細(xì)胞是相同的，例如在以下方面某些干細(xì)胞基因和蛋白的表達(dá)、染色質(zhì)甲基化的式樣、加倍時(shí)間、類胚體(embryoid body)的形成、畸胎瘤的形成、活嵌合體的形成以及潛能和分化能力，但是其與天然多能干細(xì)胞的相關(guān)性的完整程度仍待確定。IPS細(xì)胞首先于2006年從小鼠細(xì)胞中產(chǎn)生(Takahashi等人，2006)，于2007年從人類細(xì)胞中產(chǎn)生(Takahashi等人，2007a ;Yu等人，2007)。這在干細(xì)胞研究中被認(rèn)為是重要的進(jìn)展，因?yàn)檫@可以允許研究人員獲得多能干細(xì)胞而不必爭議性地使用胚胎，多能干細(xì)胞在研究中具有重要意義并且具有潛在的治療性應(yīng)用。在人類中，iPS細(xì)胞通常是從皮膚成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。然而，對于皮膚生物活組織的需求和在體外擴(kuò)增成纖維細(xì)胞數(shù)個(gè)傳代的需要使其成為用于產(chǎn)生患者特異性干細(xì)胞的麻煩的來源。此外，以前的用于重編程人的體細(xì)胞的方法是不方便的，因?yàn)樗鼈冃枰獜娜祟愂茉囌咧苯荧@得體細(xì)胞，或?qū)⒓?xì)胞維持于費(fèi)力的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中。因此，需要開發(fā)用于從替代性來源誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的簡單、方便和易達(dá)的方法。在開發(fā)本發(fā)明時(shí)，本發(fā)明人考慮到血液樣品可以作為來源，因?yàn)檠嚎梢詮幕颊呋蚪】祩€(gè)體中收集，儲(chǔ)存并轉(zhuǎn)移，例如，從中心單位分配至一個(gè)或多個(gè)遠(yuǎn)的地區(qū)。然而，據(jù)本發(fā)明人所知，在本申請之前，沒有關(guān)于從來自這樣的臨床可達(dá)來源的T細(xì)胞產(chǎn)生多能干細(xì)胞的報(bào)道，這說明對于開發(fā)此類技術(shù)的顯著需求。發(fā)明概述本發(fā)明克服了本領(lǐng)域中的主要缺點(diǎn)提供了通過重編程而衍生自T細(xì)胞和/或造血祖細(xì)胞的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。本方法能夠從臨床可達(dá)的τ細(xì)胞來源、例如3ml全血樣品產(chǎn)生iPS細(xì)胞，避免了動(dòng)員造血細(xì)胞的需要。在其它實(shí)施方式中，可以從血液樣品獲得造血細(xì)胞，例如人類或哺乳動(dòng)物⑶34+CD45+CD43+造血前體細(xì)胞，并轉(zhuǎn)化為iPS細(xì)胞?？梢詮耐庵苎难簶悠帆@得造血前體細(xì)胞，例如通過富集⑶34+細(xì)胞或消除非⑶34+細(xì)胞譜系。在一些實(shí)施方式中，可以從血液樣品、例如冷凍或冷凍保存的血液樣品獲得⑶34+造血細(xì)胞 在獲得血液樣品之前不動(dòng)員受試者中的CD34+造血祖細(xì)胞而獲得。通過這種方式，可以從多種血液樣品、包括存在于血庫中的外周血樣品產(chǎn)生iPS細(xì)胞。因此，提供了用于從T細(xì)胞和/或造血祖細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法，包括下列步驟(a)獲得包含T細(xì)胞和/或造血祖細(xì)胞的細(xì)胞群體；和(b)從所述細(xì)胞群體的T 細(xì)胞和/或造血祖細(xì)胞產(chǎn)生iPS細(xì)胞以提供iPS細(xì)胞群體。細(xì)胞群體的示例性來源可以包括但不限于血液樣品、血液成分、骨髓、淋巴結(jié)、胎兒肝臟或臍帶。細(xì)胞群體的來源可以包括血液樣品或源自血液樣品的細(xì)胞，其中所述血液樣品獲自在獲得血液樣品之前不外部動(dòng)員受試者中的造血祖細(xì)胞(例如，通過向受試者外部施用造血生長因子)的受試者。細(xì)胞群體可以獲自冷凍保存的血液樣品，或者細(xì)胞群體的來源或細(xì)胞群體可以經(jīng)過冷凍保存。在實(shí)施例中證明了冷凍保存的血液樣品可以用作T細(xì)胞的來源以成功地重編程為iPS細(xì)胞。本發(fā)明的一些方面的具體特點(diǎn)是通過使用小體積的血液樣品而實(shí)施本發(fā)明的一些方面的能力。血液樣品的適當(dāng)?shù)捏w積可以是大約1至大約5ml，大約1至10ml，大約1至 15ml，或更具體為大約3ml?？梢酝ㄟ^外部施用的G-CSF誘導(dǎo)造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞、例如⑶34+細(xì)胞，以誘動(dòng)進(jìn)入外周血，以在外周血來源中富集。在本發(fā)明的一些方面中發(fā)現(xiàn)來自未動(dòng)員的供體的外周血細(xì)胞能夠?qū)崿F(xiàn)成功的重編程，因此，無需通過外部施用的生長因子動(dòng)員骨髓細(xì)胞。因此，在具體的方面，細(xì)胞群體的來源可以是這樣的受試者其細(xì)胞未經(jīng)過一種或多種外部施用的造血生長因子、例如粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)動(dòng)員。如在本文中可相互替換使用的術(shù)語“外部的(extrinsic)”或“外部的(external) ”是指從生物體外施用動(dòng)員劑 (mobilizing agent)，而不是使用已經(jīng)通過源自生物體內(nèi)的內(nèi)在因子在一定程度上被動(dòng)員了的⑶34+細(xì)胞。為了提供適合于重編程的T細(xì)胞群體，可以在激活T細(xì)胞的條件下在體外制備包含τ細(xì)胞的細(xì)胞群體，例如在存在抗-CD3抗體的情況下進(jìn)行，或在體內(nèi)進(jìn)行(并因此具有針對特定抗原的特定TCR，例如黑素瘤的癌癥抗原，例如GP-100)。這也可以包括使用本領(lǐng)域已知的四聚體、疫苗和/或體外肽刺激。也可以在體外以一種或多種細(xì)胞因子(例如 IL-2)培養(yǎng)細(xì)胞群體以擴(kuò)增其中的T細(xì)胞群體。T細(xì)胞可以是人類T細(xì)胞。在具體的方面， T細(xì)胞可以是⑶4+，⑶8+T細(xì)胞，或其組合。T細(xì)胞的非限制性實(shí)例包括T輔助I(THl)細(xì)胞、 T輔助2 (TH2)細(xì)胞、TH17細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、天然殺傷T細(xì)胞、幼稚T細(xì)胞、記憶T細(xì)胞、γ δ T細(xì)胞和任意T細(xì)胞。在一些方面，細(xì)胞群體包含大約80%至大約99%、大約90%至大約99%、大約 97%至大約99%或任何中間范圍的T細(xì)胞，這可以對應(yīng)于至少、大約或至多1χ103，2χ103， 3χ103，4Χ103，5Χ103，6Χ103，7Χ103，8Χ103，9Χ103，ΙΧΙΟ4，2Χ104，3Χ104，4Χ103，5Χ104，6Χ104， 7χ104，8χ104，9χ104，ΙχΙΟ5，2χ105，3χ105，4χ105，5χ105，6χ105，7χ105，8χ105，9χ105，IxlO6, 2χ106Τ細(xì)胞或其中任意范圍。例如，本發(fā)明人證明了在96孔板中以少至大約1-5χ103Τ細(xì)胞/孔重編程(圖6Α-6Β)。為了提供造血前體細(xì)胞的群體，可以在引起CD34+細(xì)胞的富集或擴(kuò)增的條件下制備包含造血細(xì)胞的細(xì)胞群體。具體地，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)無需動(dòng)員骨髓細(xì)胞以獲得足夠的用于重編程的CD34+細(xì)胞。例如，可以使用磁激活的細(xì)胞分選(MACS)或熒光激活的細(xì)胞分選 (FACS)來富集CD34+造血細(xì)胞；在一些實(shí)施方式中，可以使用Indirect CD34MicroBead Kit ^Direct CD34 MicroBead Kit ( ^nJ ^tg Miltenyi Biotec， Bergisch Gladbach, Germany)與MACS從樣品、例如外周血樣品富集⑶34+造血細(xì)胞。本領(lǐng)域已知還有另外的方法用于從外周血獲得經(jīng)動(dòng)員的⑶34+造血祖細(xì)胞，包括Gratwohl等人(2002)描述的方法。但是，在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，可以從未暴露于一種或多種造血生長因子的受試者獲得 ⑶34+造血前體細(xì)胞；因此，⑶34+造血前體細(xì)胞可有利地獲自未經(jīng)一種或多種外部施用的生長因子動(dòng)員的供體的血液樣品，包括通常存在于血庫中的血液樣品。在其它實(shí)施方式中， 可以通過消除成熟的造血細(xì)胞、例如T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和/或紅細(xì)胞而富集樣品中的CD34+細(xì)胞。對于譜系消除，可以以抗體混合物(例如CD2、 CD3、CDllb、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123、CD235a 中的一項(xiàng)或多項(xiàng))溫育細(xì)胞懸浮液，然后其可用于除掉上述譜系陽性細(xì)胞(例如Karanu等人，2003)。譜系細(xì)胞消除試劑盒 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)也是商業(yè)上可獲得的，并且可用于此目的。在一些實(shí)施方式中，可以使用SCF、Flt3L和/或IL-3細(xì)胞因子的組合，使用例如Akkina 等人(1996)描述的方法或 StemPro -34 培養(yǎng)基(可獲自 Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)， 擴(kuò)增并增殖CD34+細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)化為iPS細(xì)胞。本發(fā)明人預(yù)想到通過本發(fā)明描述的方法實(shí)質(zhì)上可以將任意造血祖細(xì)胞或⑶34+ 造血細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，可以通過本文提供的方法將獲自或衍生自外周血樣品的造血前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPS細(xì)胞。造血前體細(xì)胞可以表達(dá)⑶34和⑶45，或 ⑶34，⑶45，和⑶43。在一些情況下，可能需要從干細(xì)胞、例如人類胚胎干細(xì)胞(hESC)產(chǎn)生造血前體細(xì)胞；在這些實(shí)施方式中，可以產(chǎn)生在髓樣祖細(xì)胞中高度富集的⑶34+⑶43+⑶45+ 造血細(xì)胞，例如，按照Choi等人(2009)的描述，通過共培養(yǎng)hESC與0P9飼養(yǎng)細(xì)胞來進(jìn)行。 在一些情況下，造血前體細(xì)胞對于⑶34可以是陰性的(例如Guo等人，2003)；但預(yù)想到這些造血前體細(xì)胞可以分化為iPS細(xì)胞。為了從細(xì)胞群體的T細(xì)胞和/或造血祖細(xì)胞產(chǎn)生iPS細(xì)胞，方法可以包括將一種或多種重編程因子導(dǎo)入T細(xì)胞和/或造血祖細(xì)胞。在一些方面，重編程因子可以是重編程蛋白，包括Sox家族蛋白和Oct家族蛋白，其中一種或多種或每一種可以可操作地連接于用于細(xì)胞進(jìn)入的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，重編程因子可以由一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒編碼，并且可以包括例如，Sox家族蛋白和Oct家族蛋白。Sox和Oct被認(rèn)為對于確定ES細(xì)胞性質(zhì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)層級(jí)具有重要意義。例如，Sox可以是Soxl、Sox2、Sox3、Soxl5或 Soxl8，特別是Sox2 ；Oct可以是0ct4。另外的因素可以增強(qiáng)重編程效率，例如Nanog、Lin28、 Klf4.c-Myc.SV40大T抗原或Esrrb ；重編程因子的特定組合可以是包含Sox2、0ct4、Nanog 和任選包含Lin-28的組合；或包含Sox2、0ct4、Klf和任選包含c_Myc的組合。在具體的實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒可以包含一個(gè)或多個(gè)多順反子轉(zhuǎn)錄單位。多順反子單元可以包含可操作地連接的編碼區(qū)的不同組合，例如(i)至少兩種重編程基因，例如Sox-0ct、c-Myc-Klf或Nanog-Lin28 ；備選地，(ii)連接于可選擇或可篩選標(biāo)記物的重編程基因。方面(i)可以是優(yōu)選的，因?yàn)楸景l(fā)明人發(fā)現(xiàn)使用具有2種重編程因子/ 載體(Sox2和0ct4、cMyc和Klf4、或Nanog和Lin28)而沒有任何熒光標(biāo)志物的雙順反子載體(載體圖譜顯示于圖11A-11C)，而不是使用具有1個(gè)重編程因子和1個(gè)熒光標(biāo)志物的 4個(gè)單獨(dú)的雙順反子載體(此類載體的圖譜顯示于圖10)，使用前一種載體的重編程效率顯著改善，并且iPS集落較早出現(xiàn)( 第10-14天而非第20-24天)。為了在同一多順反子轉(zhuǎn)錄單位中共表達(dá)多個(gè)基因，多順反子轉(zhuǎn)錄單位可以包含內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)或編碼至少一種蛋白酶切割位點(diǎn)和/或自我切割肽的序列以進(jìn)行多順反子轉(zhuǎn)錄。例如，自我切割肽是病毒2A肽。在另一個(gè)實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒包含于選自下列的重編程載體中病毒載體，游離載體或轉(zhuǎn)位子。更具體而言，載體可以是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，例如鼠白血病病毒 (MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)、Akv-MLV、SL-3-3-MLV或其它密切相關(guān)的病毒。病毒載體還可以是慢病毒載體。在一些方面，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件可以包含長末端重復(fù)區(qū)(LTR)以介導(dǎo)病毒基因的整合。在備選方面，載體可以是游離載體，例如基于EBV的載體，或基于轉(zhuǎn)位子的載體。在其它實(shí)施方式中，可以通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、核轉(zhuǎn)染、電穿孔、顆粒轟擊、磷酸鈣、多聚陽離子或多聚陰離子或適合用于將外源元件導(dǎo)入細(xì)胞的任何方法導(dǎo)入重編程因子。在另外一些方面，可以基于一個(gè)或多個(gè)胚胎干細(xì)胞特性來選擇iPS細(xì)胞，例如未分化的形態(tài)、胚胎干細(xì)胞特異性標(biāo)志物、粘附性質(zhì)、多能性、多譜系分化潛力或本領(lǐng)域已知的任何特征。例如，基于未分化的形態(tài)來選擇子代細(xì)胞是特別方便的。胚胎干細(xì)胞特異性標(biāo)志物可以是選自 SSEA-3，SSEA-4, Tra-1-60 或 Tra_l_81，Tra_2_49/6E，GDF3, REXl, FGF4, ESGl, DPPA2，DPPA4和hTERT的一種或多種特異性標(biāo)志物?？梢栽谥鼐幊讨蟮亩鄠€(gè)時(shí)間點(diǎn)執(zhí)行該選擇步驟以確保細(xì)胞處于多能狀態(tài)并且不返回至分化狀態(tài)。就與表面的粘附性質(zhì)而言，iPS細(xì)胞也不同于T細(xì)胞和造血祖細(xì)胞，該性質(zhì)也可用于方便的分離方法中。在具體的方面，可以基于基本上不表達(dá)導(dǎo)入的外源元件、例如包含于表達(dá)盒中的載體遺傳元件或報(bào)告基因來選擇iPS細(xì)胞，因?yàn)殡S著細(xì)胞變成多能性的，重編程的細(xì)胞能夠使外源導(dǎo)入的物質(zhì)沉默。因此，除了形態(tài)特征之外，基本上喪失整合性載體遺傳元件或報(bào)告分子表達(dá)例如熒光，是細(xì)胞被重編程的指示。例如，可以基于導(dǎo)入的報(bào)告分子基因，通過熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)、CAT測定或發(fā)光測定來選擇報(bào)告分子表達(dá)的沉默。外源元件的“基本上喪失”或“基本上不含外源元件”意思是iPS細(xì)胞群體的少于1 %，0. 5%，0. 1 %， 0. 05%或任意中間百分率的細(xì)胞包含外源元件。iPS細(xì)胞群體可以基本上不含整合的、外源的病毒元件。為了 iPS細(xì)胞的臨床施用，方法還可以包括使iPS細(xì)胞分化為分化的細(xì)胞，例如， 心肌細(xì)胞、造血細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)元、成纖維細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、肝細(xì)胞或上皮細(xì)胞。在另一個(gè)方面，可以公開從如上文所述的iPS細(xì)胞群體分化而來的分化的細(xì)胞、組織或器官。組織可以包括神經(jīng)、骨、腸、上皮、肌肉、軟骨或心臟組織；器官可以包括腦、脊髓、心臟、肝、腎、胃、 腸或胰腺。在一些方面，分化的細(xì)胞、組織或器官可用于組織移植、藥物篩選或發(fā)育研究以替代胚胎干細(xì)胞。在另一個(gè)方面，也可以公開根據(jù)如上所述的方法產(chǎn)生的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。還可以提供誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞，其包含含有τ細(xì)胞受體基因的V、D和J區(qū)段的不完整組的基因組(相對于胚胎干細(xì)胞，其可以是人類細(xì)胞)。在具體的方面，誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞可以基本上不含整合的、外源病毒元件。
7
本發(fā)明的方法和/或組合物的上下文中所討論的實(shí)施方式可以就本文描述的任何其它方法或組合物來應(yīng)用。因此，涉及一種方法或組合物的實(shí)施方式也可以應(yīng)用于本發(fā)明的其它方法和組合物。提及核酸時(shí)，如本文使用的術(shù)語“編碼(encode)”或“編碼(encoding) ”用于使本發(fā)明易于被技術(shù)人員所理解，但是這些術(shù)語可以分別與“包含(comprise)”或“包含 (comprising)，，相互替換地使用。如本文說明書中使用的“一種(a)”或“一種(an)”可以指一個(gè)或多個(gè)。如本文權(quán)利要求中所使用，當(dāng)與詞語“包含”一起使用時(shí)，詞語“一種(a)”或“一種(an)”可以指一個(gè)或多個(gè)。除非明確指明僅指替代物或者替代物是相互排斥的，否則權(quán)利要求中使用的術(shù)語 “或”可用于指“和/或”，雖然本公開內(nèi)容支持僅指替代物和“和/或”的定義。如本文使用的“另一個(gè)”可以指至少第二個(gè)或更多個(gè)。在本申請全文中，術(shù)語“大約”用于表示某數(shù)值包括用于測定該數(shù)值的設(shè)備、方法的誤差的內(nèi)在差異，或者存在于研究受試者之間的差異。本發(fā)明的其它內(nèi)容、特征和優(yōu)勢將通過以下詳細(xì)描述變得明顯。但是應(yīng)該理解，雖然詳細(xì)描述和具體實(shí)施例指明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是僅是為了解釋目的而提供， 因?yàn)楸景l(fā)明精神和范圍內(nèi)的多種改變和修飾對于閱讀了該詳細(xì)描述的本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的。


以下附圖構(gòu)成本說明書的一部分，包括這些附圖是為了進(jìn)一步說明本發(fā)明的某些方面。通過參考一個(gè)或多個(gè)這些附圖并聯(lián)合本文提供的具體實(shí)施方式
的詳細(xì)描述將更好地理解本發(fā)明。圖1 :T-細(xì)胞重編程過程的概覽，開始于激活的T細(xì)胞，并產(chǎn)生具有hESC樣形態(tài)的 iPSC集落。在Olympus 1X71顯微鏡下分別以10倍和20倍物鏡獲得T細(xì)胞和iPSC集落圖像。圖2A-2C 來自人T細(xì)胞的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的衍生和表征。圖2A 輸入細(xì)胞的 CD3表面表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析。(i)來自代表性供體的PBMC群體的第-3天非激活的PBMC 和第0天激活的T細(xì)胞上的CD3表面表達(dá)。(ii)對代表性供體中的轉(zhuǎn)導(dǎo)后72小時(shí)的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群體(GFP+)設(shè)門的⑶3表達(dá)，以顯示⑶3+細(xì)胞的優(yōu)先轉(zhuǎn)導(dǎo)。(iii) 10個(gè)供體真空采血管產(chǎn)生的樣品的平均的上述度量(i-ii)的直方圖。圖2B:代表性的白細(xì)胞去除術(shù)(“TiPS L-2”)和Vacutainer ( "Tips ν-ι”)衍生的 TiPS 系中的 hESC 多能性標(biāo)記物 0CT4、 Tra-l-81、SSEA-3和SSEA-4的流式細(xì)胞術(shù)分析。圖2C:使用靶向TCR^基因座的V-J區(qū)內(nèi)的保守區(qū)的多重PCR引物，分析T細(xì)胞受體(TCR) β鏈重排。多克隆的起始T細(xì)胞群體由電泳圖譜上的正確片段大小范圍內(nèi)的擴(kuò)增子峰的鐘形曲線表示。成纖維細(xì)胞(非T細(xì)胞) iPS細(xì)胞("Fib-iPS")在TCRi3基因座上缺少種系重排，并作為陰性對照?？寺⊙苌?TiPS系(來自2個(gè)白細(xì)胞去除術(shù)系和ι個(gè)Vacutainer 系的代表性數(shù)據(jù)，分別是"TiPS L-l，，，“TiPS L-2，，;和“TiPS ν-2，，)顯示出確定大小的一個(gè)特征峰。DNA片段分析是在ABI 3730DNA分析儀上進(jìn)行的。
圖3A-3D 來自人T細(xì)胞的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的表征。圖3A 就hES細(xì)胞標(biāo)志物基因 DNMT38，LEFTB, NODAL, REXl，ESGl，TERT, GDF3 和 UTFl 的表達(dá)，通過 RT-PCR 分析來自白細(xì)胞去除術(shù)(“Tips L-I 和 L-2”)和Vacutainer ( "Tips v-2”)的代表性的 TiPS 細(xì)胞系。GAPDH用作每個(gè)樣品的陽性上樣對照。圖3B 通過PCR分析基因組DNA確認(rèn)轉(zhuǎn)基因的整合。使用針對目標(biāo)重編程基因(“RG”)的正向引物和針對IRES的反向引物。0CT4正向和反向引物用作PCR反應(yīng)陽性對照，如載體圖譜所示。圖3C:TiPS細(xì)胞系的RT-PCR分析顯示了外源轉(zhuǎn)基因的沉默，GAPDH作為每個(gè)樣品的陽性對照。hESC系Hl和成纖維細(xì)胞衍生的iPSC系(Fib-iPS)作為陽性細(xì)胞對照，激活的供體的T細(xì)胞作為陰性細(xì)胞對照。圖3D TiPS克隆表達(dá)人胚胎干細(xì)胞特異性多能標(biāo)志物，如流式細(xì)胞術(shù)分析所示。圖4A-4E :TiPS細(xì)胞系的體內(nèi)和體外分化潛力。圖4A 畸胎瘤的形成顯示了體內(nèi)分化潛力。注射進(jìn)入SCID/beige小鼠的TiPS細(xì)胞在5-12周時(shí)形成畸胎瘤。蘇木精和伊紅染色顯示了與從三個(gè)原始胚層的衍生一致的組織，包括具有杯狀細(xì)胞的簡單上皮，其表示胃腸或呼吸組織(內(nèi)胚層)、軟骨(中胚層)和視網(wǎng)膜色素上皮(外胚層)。使用Olympus 1X71顯微鏡，使用40倍物鏡獲得來自TiPS L-2細(xì)胞系的代表性圖像。圖4B 體外分化為神經(jīng)元。將TiPS L-2細(xì)胞誘導(dǎo)為神經(jīng)元分化，作為聚集體，然后使用Alexa Fluor 594 二抗就神經(jīng)元標(biāo)志物β III-微管蛋白進(jìn)行染色；以Hoechst對比染色細(xì)胞核。使用20倍物鏡獲得圖像。調(diào)節(jié)對比度，使用Image J軟件合并圖像。圖4C 通過細(xì)胞聚集方法進(jìn)行TiPS 細(xì)胞的心臟誘導(dǎo)。細(xì)胞聚集體在第14-15天含有跳動(dòng)的心臟肌鈣蛋白T(cTNT)陽性的心肌細(xì)胞。顯示了來自代表性樣品的流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)。使用10倍物鏡獲得圖像。圖4D 體外分化為造血祖細(xì)胞。通過無血清類胚體(EB)分化程序，在兩個(gè)TiPS系中分化12天而產(chǎn)生的造血祖細(xì)胞(HPC)，與hESC系(Hl)和成纖維細(xì)胞衍生的iPSC系(Fib-iPS)進(jìn)行對比。通過流失細(xì)胞術(shù)，通過將EB分離為單個(gè)細(xì)胞并以熒光團(tuán)綴合的針對⑶34，⑶45，⑶43，⑶31， ⑶41和⑶235a的單克隆抗體進(jìn)行染色來定量HPC。圖4E 通過將EB分化和個(gè)體化的細(xì)胞置于無血清的MethoCult培養(yǎng)基而進(jìn)行造血克隆形成性(CFU)檢驗(yàn)，所述培養(yǎng)基中含有細(xì)胞因子SCF，G-CSF, GM-CSF, IL_3，IL-6和EP0。溫育14天之后，根據(jù)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)將集落測評(píng)為紅細(xì)胞(CFU-E/BFU-E)、巨噬細(xì)胞(CFU-M，數(shù)據(jù)未顯示)、粒細(xì)胞(CFU-G，數(shù)據(jù)未顯示)、 粒細(xì)胞_巨噬細(xì)胞(CFU-GM)和粒細(xì)胞-紅細(xì)胞-巨噬細(xì)胞_巨核細(xì)胞(CFU-GE^)。也標(biāo)示出了總CFU計(jì)數(shù)(CFU)。使用Olympus CKX41顯微鏡以2倍物鏡獲取圖像。圖5 :iPSC克隆追蹤。從畸胎瘤樣品分離基因組DNA并與它們的親代細(xì)胞系就 TCR^鏈的重排進(jìn)行比較。顯示了來自細(xì)胞系TiPSV-I的代表性數(shù)據(jù)。衍生的畸胎瘤具有親代細(xì)胞系的克隆性重排。使用靶向TCRP基因座的V-J區(qū)內(nèi)的保守區(qū)的多重引物進(jìn)行 PCR分析。在ABI 3730DNA分析儀上進(jìn)行DNA片段分析。背景彡1000RFU。圖6A-6B 以96-細(xì)胞形式重編程T細(xì)胞。圖6A 以雙順反子載體S0(Sox2和0ct4) 和CK(c-Myc和Klf4)感染供體A的T細(xì)胞并鋪板于MEF。進(jìn)行活細(xì)胞抗-Tral_60標(biāo)記以檢測iPS細(xì)胞集落。圖6B 以雙順反子載體S0(Sox2和0ct4)和NL (Nanog和Lin28)感染供體A的T細(xì)胞并鋪板于MEF。進(jìn)行活細(xì)胞抗-Tral-60標(biāo)記以檢測iPS細(xì)胞集落。輸入細(xì)胞數(shù)顯示為“輸入數(shù)目(Input#)，，以表示起始材料中的T細(xì)胞數(shù)。圖7 =DNA指紋分析。在所分析的8個(gè)STR基因座上檢測的所有15個(gè)等位基因多態(tài)性而言，短串聯(lián)重復(fù)(STR)分析顯示TiPS細(xì)胞系與親代的激活的T細(xì)胞是相同的。顯示了來自2個(gè)TiPS系(TiPS L-I和TiPS L-2)的代表性數(shù)據(jù)。圖8 堿性磷酸酶(AP)染色。TiPS系TiPS L-I和TiPS L-2是AP陽性的。在HP Scanjet G3110計(jì)算機(jī)掃描儀上獲取圖像。圖9 :TiPS細(xì)胞系顯示出正常核型。TiPS細(xì)胞系“TiPS L-1”和“TiPS L-2”在MEF 上生長6個(gè)傳代，系“TiPS V-1”和“TiPS V-2”分別在Matrigel上生長總共18個(gè)傳代中的8個(gè)傳代，總共34個(gè)傳代中的30個(gè)傳代。使細(xì)胞進(jìn)行G顯帶分析，沒用檢測到克隆性異
堂
巾ο圖10.用于重編程實(shí)驗(yàn)的MMLV逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體的載體圖譜。“RG”表示重編程基因。圖11A-11C 用于重編程實(shí)驗(yàn)(具有改善的重編程)的雙順反子MMLV逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體的載體圖譜。圖1IA :MMLV-0ct4-IRES-Sox2的載體圖譜(簡寫為 “0ct4-Sox2”)。圖 IlB 匪LV-cMyc-IRES-Klf4 的載體圖譜(簡寫為 “cMyc_Klf4”)。圖 IlC :MMLV-Nanog-IRES-Lin28 的載體圖譜(簡寫為 “Nanog_Lin28，，)。
具體實(shí)施例方式1.緒論通過病毒轉(zhuǎn)移確定的因子例如S0X2，0CT4，NANOG和LIN28或S0X2，0CT4，c-Myc和 KLF4，在體外重編程體細(xì)胞為未分化的多能狀態(tài)(Yu等人，2007 ；Takahashi等人，2007b)， 已經(jīng)開啟了使用多種細(xì)胞類型產(chǎn)生患者特異性人iPSC的方式(Loh等人，2009 ；Aasen等人，2008)。通過短暫表達(dá)基因或通過使用適當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過衍生iPSC，進(jìn)一步發(fā)展了該想法。到目前為止，人類中的主要的iPSC研究著眼于以成纖維細(xì)胞作為細(xì)胞來源。雖然成纖維細(xì)胞由于其商業(yè)可獲得性和基因遞送的容易性而提供了作為起始材料的數(shù)種優(yōu)點(diǎn)，但它們對于大規(guī)模臨床衍生iPSC系是亞最佳的，這是因?yàn)樾枰秩胄云つw活組織檢查，并且難以從原代組織建立穩(wěn)定的系。未動(dòng)員的外周血可能是用于重編程的理想細(xì)胞來源，因?yàn)槿菀撰@得患者樣品(Maherali and Hochedlinger，2008)。另外，在世界范圍內(nèi)的生物貯庫中儲(chǔ)存了來自活的和死亡的供體的大量的冷凍的血液樣品(Kleeberger等人， 1999)。本發(fā)明通過從T細(xì)胞和/或造血前體細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞而克服了與目前的重編程技術(shù)相關(guān)的數(shù)個(gè)主要問題。如本發(fā)明所發(fā)現(xiàn)可以從Iml全血的等量物獲得更豐富的和易處理的血液細(xì)胞來源以從T淋巴細(xì)胞衍生iPSC。這些T細(xì)胞衍生的iPSC(“TiPS”) 與hESC以及成纖維細(xì)胞衍生的iPSC系具有共同的基本特征。另外，它們保留它們的特征性T細(xì)胞受體(TCR)基因重排，該性質(zhì)可用于例如，作為遺傳追蹤標(biāo)志物或用于再分化實(shí)驗(yàn)以研究人類T細(xì)胞發(fā)育。在本發(fā)明之前，本發(fā)明人對于重編程T細(xì)胞或造血祖細(xì)胞的成功的可能性是非常不確定的，有數(shù)個(gè)原因首先，不確定血液樣品中的T細(xì)胞和/或造血前體細(xì)胞是否以足以進(jìn)行重編程的量存在。第二，尚未研究過由τ細(xì)胞受體基因的V(D) J重組造成基因喪失在重編程中的可能的效應(yīng)。第三，目前已經(jīng)被重編程的多數(shù)細(xì)胞類型是粘附性細(xì)胞。T細(xì)胞是非粘附性的，并且以懸浮方式培養(yǎng)。直至本發(fā)明，尚不清楚進(jìn)行重編程的T細(xì)胞可以轉(zhuǎn)變?yōu)檫m合于粘附性iPS細(xì)胞的粘附培養(yǎng)條件。因此，本發(fā)明的方法是首次從T細(xì)胞或造血前體細(xì)胞產(chǎn)生iPS細(xì)胞。T細(xì)胞可以容易地從多種來源獲得，例如小體積的血液樣品。類似的， 造血前體細(xì)胞例如“⑶34+/⑶43+/⑶45+/⑶38-，，或“⑶34—，⑶133+/⑶38—，，造血前體細(xì)胞可以從外周血樣品富集。本發(fā)明的特別的優(yōu)點(diǎn)在于T細(xì)胞受體的重排的和減少的V、D、J基因區(qū)段，其可以在重編程的子代細(xì)胞中保留。這作為T細(xì)胞衍生的iPS細(xì)胞的不同克隆群體的特定特征或 “條形碼”，也可以輔助那些未經(jīng)歷V(D)J重組的來自多能干細(xì)胞的iPS細(xì)胞的分化。另外， T細(xì)胞與iPS細(xì)胞之間的粘附性質(zhì)的差異帶來了自動(dòng)化分離上的優(yōu)勢。類似的，造血前體細(xì)胞與iPS細(xì)胞之間的粘附性質(zhì)的差異可用于分離。通過將重編程的T細(xì)胞或造血祖細(xì)胞轉(zhuǎn)移到適合于粘附的培養(yǎng)條件，例如將經(jīng)輻射的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)置于T細(xì)胞的培養(yǎng)容器的底部，衍生自T細(xì)胞或造血祖細(xì)胞的iPS細(xì)胞可以粘附至底部，而T細(xì)胞和/或造血祖細(xì)胞保留在懸浮液中。以下描述了本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式和優(yōu)點(diǎn)。II.定義“重編程”是這樣的方法相對于沒有進(jìn)行重編程的相同條件，其賦予細(xì)胞可測的增加的形成至少一種新細(xì)胞類型的能力的子代(無論是在培養(yǎng)物中還是在體內(nèi))的能力。 更具體而言，重編程是賦予體細(xì)胞多能潛力的方法。意思是，在足夠的增殖之后，可測比例的子代具有新細(xì)胞類型的表型特征(如果在重編程之前基本上沒有此類子代能夠形成)； 或者，具有新細(xì)胞類型的特征的比例比重編程之前是可測的增加。在某些條件下，具有新細(xì)胞類型的特征的子代比例可以是至少大約1%、5%、25%或更高，按次序以漸增為優(yōu)選。T細(xì)胞的“激活劑”或激活T細(xì)胞的條件是指激活T細(xì)胞的刺激物，并且包括抗原，其可以呈遞于抗原呈遞細(xì)胞上或其它的表面；多克隆激活劑，其結(jié)合很多T細(xì)胞受體 (TCR)復(fù)合物而與特異性無關(guān)，并包括凝集素，例如伴刀豆球蛋白-A(Con-A)和植物凝集素 (PHA)以及試劑，例如特異性結(jié)合TCR或CD3蛋白上的不變的框架表位的抗體；和超抗原 (superantigen)，其刺激大量的T細(xì)胞，并且包括例如，腸毒素，例如葡萄球菌腸毒素。術(shù)語“T淋巴細(xì)胞”和“T細(xì)胞”相互替換地使用，是指表達(dá)T細(xì)胞抗原受體(TCR) 的細(xì)胞，所述受體當(dāng)與一種或多種MHC分子或一種或多種非經(jīng)典的MHC分子一起顯示于抗原呈遞細(xì)胞表面或基質(zhì)上時(shí)，能夠識(shí)別抗原?！阿?+T細(xì)胞”是指在其表面表達(dá)⑶4并且與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答相關(guān)的T細(xì)胞子集。它們的特征在于刺激之后的分泌譜，其可以包括分泌細(xì)胞因子，例如IFN-γ、TNF-α、 IL-2、IL-4和IL-10?！阿?”是55kD的糖蛋白，其最初定義為T淋巴細(xì)胞上的分化抗原，但也存在于其它細(xì)胞上，包括單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞。CD4抗原是免疫球蛋白超基因家族的成員，并且被指是II類MHC(主要組織相容性復(fù)合體)限制性免疫應(yīng)答中的聯(lián)合識(shí)別元件。在 T淋巴細(xì)胞上，它們定義了輔助/誘導(dǎo)子集?！阿?+T細(xì)胞”是指在其表面表達(dá)⑶8的T細(xì)胞子集，是I類MHC限制性的，并作為細(xì)胞毒性T細(xì)胞發(fā)揮作用?！癈D8”分子是存在于胸腺細(xì)胞和細(xì)胞毒性和抑制性T淋巴細(xì)胞上的分化抗原。CD8抗原是免疫球蛋白超基因家族的成員，并且是I類主要組織相容性復(fù)合體限制性相互作用中的聯(lián)合識(shí)別元件?！霸煅婕?xì)胞”或“造血前體細(xì)胞”是指定向于造血譜系但能夠進(jìn)一步造血分化的細(xì)胞，其包括造血干細(xì)胞、多潛能造血干細(xì)胞(成血細(xì)胞)、髓樣祖細(xì)胞、巨核細(xì)胞祖細(xì)胞、 紅細(xì)胞祖細(xì)胞和淋巴樣祖細(xì)胞。造血干細(xì)胞(HSC)是多潛能干細(xì)胞，其產(chǎn)生所有的血液細(xì)胞類型，包括髓樣(單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞/血小板、樹突細(xì)胞)和淋巴樣譜系(T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞)。造血祖細(xì)胞可以表達(dá)⑶34。造血祖細(xì)胞可以共表達(dá)⑶133并且對于⑶38之表達(dá)是陰性的。在一些實(shí)施方式中，某些人類造血細(xì)胞可以不表達(dá)⑶34，但這些細(xì)胞也可以通過本文公開的方法轉(zhuǎn)化為iPS細(xì)胞。造血前體細(xì)胞包括⑶34+/⑶45+造血前體細(xì)胞和⑶34+/⑶45+/⑶43+造血前體細(xì)胞。⑶347⑶43+/⑶45+造血前體細(xì)胞可以就髓樣前體細(xì)胞高度富集。造血細(xì)胞的多個(gè)譜系，例如⑶347⑶43+/⑶45+造血前體細(xì)胞，可以通過本文公開的方法轉(zhuǎn)化為iPS細(xì)胞。 造血細(xì)胞可以包括原始造血細(xì)胞的多個(gè)子集，包括⑶347⑶133+/⑶38_(原始造血前體細(xì)胞)、CD43 (+) CD235a (+) CD4Ia (+/-)(紅細(xì)胞-巨核細(xì)胞生成性的)、1 in (-) CD34 (+) CD43 (+) CD45 (_)(多潛能)，以及 Iin (-) CD34 (+) CD43 (+) CD45 (+)(偏髓樣的)細(xì)胞、CD133+/ ALDH+(醛脫氫酶)(例如Hess等人2004 ；Christ等人，2007)。預(yù)想到可以按照本文的描述將任意這些原始造血細(xì)胞類型或造血前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPS細(xì)胞。“載體”或“構(gòu)建體”(有時(shí)稱作基因遞送或基因轉(zhuǎn)移“介質(zhì)”)是指大分子或分子復(fù)合物，其包含要被遞送(體外或體內(nèi))進(jìn)入宿主細(xì)胞的多核苷酸。載體可以是線性或環(huán)形分子。“質(zhì)?！笔峭ǔｎ愋偷妮d體，是分離自染色體DNA的染色體外DNA分子，其能夠獨(dú)立于染色體DNA而復(fù)制。在一些情況下，其是環(huán)形的和雙鏈的?！氨磉_(dá)構(gòu)建體”或“表達(dá)盒”意思是能夠指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的核酸分子。表達(dá)構(gòu)建體至少包括啟動(dòng)子或功能上等同于啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)。還可以包括另外的元件，例如增強(qiáng)子和/或轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。當(dāng)用于與細(xì)胞或生物體中的蛋白、基因、核酸或多核苷酸相關(guān)時(shí)，術(shù)語“外源的”是指通過人工或天然方法被導(dǎo)入該細(xì)胞或生物體中的蛋白、基因、核酸或多核苷酸；或者，當(dāng)用于與細(xì)胞相關(guān)時(shí)，是指通過人工或天然方法被分離然后被導(dǎo)入其它細(xì)胞或?qū)肷矬w的細(xì)胞。外源核酸可以來自不同的生物體或細(xì)胞，或者其可以是天然存在于生物體或細(xì)胞中的核酸的一個(gè)或多個(gè)另外的拷貝。外源細(xì)胞可以來自不同的生物體，或者其可以來自相同的生物體。通過非限制性舉例來講，外源核酸位于與天然細(xì)胞中的染色體位置不同的染色體位置上，或者其兩側(cè)是不同于天然狀態(tài)下的核酸序列。術(shù)語“對應(yīng)于”在本文中用于意指多核苷酸序列與參考多核苷酸序列的全部或一部分是同源的(即相同的，非嚴(yán)格進(jìn)化相關(guān))；或，多肽序列與參考多肽序列是相同的。與此對比，術(shù)語“互補(bǔ)于”在本文中用于意指互補(bǔ)性序列與參考多核苷酸序列的全部或一部分是同源的。舉例解釋核苷酸序列"TATAC"對應(yīng)于參考序列"TATAC"并且互補(bǔ)于參考序列"GTATA ”?！熬幋a”特定蛋白的“基因”、“多核苷酸”、“編碼區(qū)”、“序列”、“區(qū)段”、“片段”或“轉(zhuǎn)
基因”是指在體外或體內(nèi)時(shí)，當(dāng)被置于合適的調(diào)節(jié)序列控制下時(shí)，轉(zhuǎn)錄并任選也被翻譯成基因產(chǎn)物例如多肽的核酸分子。編碼區(qū)可以以cDNA、基因組DNA或RNA形式存在。當(dāng)以DNA 形式存在時(shí)，核酸分子可以是單鏈的(即正義鏈)或雙鏈的。編碼區(qū)的邊界由5’(氨基) 末端的起始密碼子和3’(羧基)末端的翻譯終止密碼子來確定?；蚩梢园ǖ幌抻?， 來自原核或真核mRNA的cDNA，來自原核或真核DNA的基因組DNA序列，以及合成的DNA序列。轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于基因序列的3’端。
術(shù)語“細(xì)胞”在本文中以其在本領(lǐng)域中最寬的含義使用，是指作為多細(xì)胞生物體的組織的結(jié)構(gòu)單元的活體，其由膜結(jié)構(gòu)環(huán)繞，所述膜結(jié)構(gòu)將其與外界隔離，其具有自我復(fù)制的能力，并且具有遺傳信息和用于表達(dá)它的機(jī)制。如本文使用的“細(xì)胞”可以是天然存在的細(xì)胞或人工修飾的細(xì)胞(例如，融合細(xì)胞、遺傳修飾的細(xì)胞等)。如本文使用的術(shù)語“干細(xì)胞”是指能夠自我復(fù)制和具有多能性的細(xì)胞。通常而言， 干細(xì)胞能夠使受損的組織再生。本文的干細(xì)胞可以是但不限于，胚胎干(ES)細(xì)胞或組織干細(xì)胞(也稱作組織特異性干細(xì)胞，或成體干細(xì)胞)。任何具有上述能力的人工產(chǎn)生的細(xì)胞 (例如本文使用的融合細(xì)胞、重編程細(xì)胞等)都可以是干細(xì)胞?！芭咛ジ?ES)細(xì)胞”是源自早期胚胎的多能干細(xì)胞。ES細(xì)胞首先于1981年建立， 從1989年開始，其也被用于產(chǎn)生敲除小鼠。在1998年建立了人ES細(xì)胞，目前正開始應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)。與ES細(xì)胞不同，組織干細(xì)胞具有有限的分化潛力。組織干細(xì)胞存在于組織中的特定位置，并且具有未分化的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。因此，組織干細(xì)胞的多能性通常較低。組織干細(xì)胞具有較高的核質(zhì)比并且具有極少的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器。多數(shù)組織干細(xì)胞具有低的多能性、長的細(xì)胞周期和超出個(gè)體壽命的增殖能力?；诩?xì)胞所來源的位點(diǎn)例如皮膚系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、骨髓系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等，組織干細(xì)胞被分成多個(gè)類別。皮膚系統(tǒng)中的組織干細(xì)胞包括表皮干細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞等。消化系統(tǒng)中的組織干細(xì)胞包括胰腺(普通)干細(xì)胞、肝臟干細(xì)胞等。骨髓系統(tǒng)中的組織干細(xì)胞包括造血干細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞等。神經(jīng)系統(tǒng)中的組織干細(xì)胞包括神經(jīng)干細(xì)胞、視網(wǎng)膜干細(xì)胞等。“誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞”通常簡寫為iPS細(xì)胞或iPSC，是指通過導(dǎo)入被稱作重編程因子的某些因子以人工方式從非多能細(xì)胞制備的一類多能干細(xì)胞，所述非多能細(xì)胞通常是成年體細(xì)胞或末端分化的細(xì)胞，例如成纖維細(xì)胞、造血細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)元、表皮細(xì)胞等。“多能性”是指干細(xì)胞具有分化成構(gòu)成一種或多種組織或器官或特別是三個(gè)胚層中的任一個(gè)的所有細(xì)胞的潛力內(nèi)胚層(胃內(nèi)層、胃腸道、肺)、中胚層(肌肉、骨骼、血液、 泌尿生殖器)或外胚層(表皮組織和神經(jīng)系統(tǒng))。如本文使用的“多能干細(xì)胞”是指能夠分化成源自三個(gè)胚層中的任一個(gè)的細(xì)胞的細(xì)胞，例如，全能細(xì)胞或誘導(dǎo)的多能細(xì)胞的直接后代。就核酸分子而言的“可操作地連接”意指按照允許核酸分子轉(zhuǎn)錄的方式連接的兩個(gè)或更多個(gè)核酸分子(例如待轉(zhuǎn)錄的核酸分子、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件)。就肽和/或多肽分子而言，“可操作地連接”意指按照產(chǎn)生單一多肽鏈、即融合多肽(其具有融合物的每個(gè)肽和/或多肽成分的至少一個(gè)性質(zhì))的方式連接的兩個(gè)或更多個(gè)肽和/或多肽分子。特別地，融合多肽是嵌合的，即，由異源分子組成?！巴葱浴笔侵竷蓚€(gè)多核苷酸或兩個(gè)多肽之間的同一性百分率。一個(gè)序列與另一個(gè)之間的對應(yīng)性可以通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)來確定。例如，同源性可以這樣確定通過比對序列信息并使用容易獲得的計(jì)算機(jī)程序而直接比較兩個(gè)多肽分子之間的序列信息。備選地， 同源性可以這樣確定在同源區(qū)形成穩(wěn)定雙鏈體的條件下使多核苷酸雜交，然后以單鏈特異性核酸酶消化，并測定消化片段的大小。當(dāng)使用如上所述的方法測定，至少大約80%、特別是至少大約90%、最特別是至少大約95%的核苷酸或氨基酸各自在確定長度的分子上匹配時(shí)，兩個(gè)DNA或兩個(gè)多肽序列彼此是“實(shí)質(zhì)上同源的”。
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III.干細(xì)胞的一般背景在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，公開了通過將重編程因子導(dǎo)入體細(xì)胞中而重編程體細(xì)胞、尤其是T細(xì)胞的方法。這些細(xì)胞的子代可以在如下所述的多個(gè)方面與胚胎干細(xì)胞相同，但基本上不含外源遺傳元件。理解胚胎干細(xì)胞的特征可以輔助選擇誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。 從干細(xì)胞重編程研究中獲知的重編程因子可用于這些新方法。還考慮到這些誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞可以潛在地用于替換胚胎干細(xì)胞以用于治療性和研究性應(yīng)用，因?yàn)槭褂煤笳呔哂袀惱矸矫娴淖璧K。A.干細(xì)胞多數(shù)情況下(如果不是全部)干細(xì)胞是發(fā)現(xiàn)于多細(xì)胞生物體中的細(xì)胞。其特征在于通過有絲細(xì)胞分裂進(jìn)行自我更新的能力以及分化為多種特化細(xì)胞類型的能力。兩種主要類型的哺乳動(dòng)物干細(xì)胞是發(fā)現(xiàn)于胚泡的胚胎干細(xì)胞，和發(fā)現(xiàn)于成體組織中的成年干細(xì)胞。 在發(fā)育中的胚胎中，干細(xì)胞能夠分化成所有的特化胚胎組織。在成年生物體中，干細(xì)胞和祖細(xì)胞作為身體的修復(fù)系統(tǒng)，補(bǔ)充特化細(xì)胞，但也維持再生器官例如血液、皮膚或腸組織的正常周轉(zhuǎn)。由于干細(xì)胞可以通過細(xì)胞培養(yǎng)而生長并轉(zhuǎn)化為具有與多種組織例如肌肉或神經(jīng)的細(xì)胞一致的特征性特化細(xì)胞，所以已經(jīng)建議其用于醫(yī)學(xué)治療。尤其是，通過治療性克隆產(chǎn)生的胚胎細(xì)胞系、自體同源胚胎干細(xì)胞，以及來自臍帶血或骨髓的高度可塑性的成年干細(xì)胞被認(rèn)為是有前景的候選物。最近，成年細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞已經(jīng)具有替代胚胎干細(xì)胞的巨大潛力。B.胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞系(ES細(xì)胞系)是源自胚泡或更早的桑葚胚時(shí)期的胚胎的內(nèi)細(xì)胞群 (ICM)的外胚層組織的細(xì)胞培養(yǎng)物。胚泡是早期胚胎——在人類中是大約4至5天，由 50-150個(gè)細(xì)胞組成。ES細(xì)胞是多能的，在發(fā)育過程中產(chǎn)生三個(gè)主要胚層外胚層、內(nèi)胚層和中胚層的所有衍生物。換言之，當(dāng)給予特定細(xì)胞類型的足夠和必需的刺激時(shí)，它們可以發(fā)育為成體的200種以上的細(xì)胞類型中的每一種。它們對胚胎外的膜或胎盤沒有貢獻(xiàn)。到目前為止，幾乎所有的研究都是使用小鼠胚胎干細(xì)胞(mES)或人類胚胎干細(xì)胞 (hES)進(jìn)行的。二者都具有實(shí)質(zhì)性的干細(xì)胞特征，但是它們需要差異極大的環(huán)境以維持未分化狀態(tài)。小鼠ES細(xì)胞可以生長于明膠層上，并且需要白血病抑制因子(LIF)的存在。人 ES細(xì)胞可以生長于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)層上，通常需要堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF或FGF-2)的存在。如果沒有最佳培養(yǎng)條件或遺傳操作(Chambers等人，2003)，胚胎干細(xì)胞將迅速分化。人類胚胎干細(xì)胞還可以根據(jù)數(shù)種轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞表面蛋白的存在來確定。轉(zhuǎn)錄因子0ct4、Nanog和Sox2構(gòu)成核心調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，其確保引起分化的基因的阻抑和多能性的維持 (Boyer等人，2005)。最常使用的鑒定hES細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原包括糖脂SSEA3和SSEA4以及硫酸角質(zhì)素抗原Tra-1-60和Tra-l_81。經(jīng)過20年的研究之后，沒有經(jīng)批準(zhǔn)的使用胚胎干細(xì)胞的治療或人類試驗(yàn)。ES細(xì)胞是多能細(xì)胞，其需要特定的信號(hào)以進(jìn)行正確的分化——如果直接注入體內(nèi)，ES細(xì)胞將分化成很多不同類型的細(xì)胞，引起畸胎瘤。使ES細(xì)胞分化為可用的細(xì)胞并避免移植排斥僅僅是胚胎干細(xì)胞研究仍然面臨的障礙中的一小部分。很多國家目前禁止ES細(xì)胞的研究或新的ES細(xì)胞系的產(chǎn)生。由于胚胎干細(xì)胞具有無限擴(kuò)增和多能性的組合能力，胚胎干細(xì)胞仍然是損傷或疾病之后的再生醫(yī)學(xué)和組織替換的理論潛在來源。比較而言，解決這些問題的一種方案是通過直接重編程在體細(xì)胞中誘導(dǎo)多能狀態(tài)。IV.重編程因子用于誘導(dǎo)的重編程因子對于iPS細(xì)胞的產(chǎn)生具有關(guān)鍵意義。以下因子或其組合可用于本發(fā)明公開的方法中。在一些方面，重編程載體中將包括編碼Sox和Oct (特別是 0ct3/4)的核酸。例如，一個(gè)或多個(gè)重編程載體可以包含編碼Sox2、0ct4、Nanog和任選 Lin28的表達(dá)盒，或編碼Sox2、0ct4、Klf4和任選c_Myc的表達(dá)盒，或編碼Sox2、0ct4和任選 Esrrb 的表達(dá)盒，或編碼 Sox2、0ct4、Nanog、Lin_28、Klf4、c-Myc 和任選 SV40 大的 T 抗原的表達(dá)盒。編碼這些重編程因子的核酸可以包含在同一表達(dá)盒中、不同表達(dá)盒中、同一重編程載體中，或不同重編程載體中。0ct4和Sox基因家族的一些成員(Soxl、Sox2、Sox3和Soxl5)已經(jīng)被鑒定為參與誘導(dǎo)過程的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，其缺失會(huì)使誘導(dǎo)不能進(jìn)行。另一方面，另外的基因，包括Klf 家族的一些成員(Klfl、Klf2、Klf4*Klf5)、Myc 家族的一些成員(c_Myc、L-Myc 和 N-Myc)、 Nanog和Lin28已經(jīng)被鑒定為增強(qiáng)誘導(dǎo)效率。0ct4(Pou5fl)是八聚合體(octamer，‘‘ Oct")家族轉(zhuǎn)錄因子之一，在維持多能性方面具有關(guān)鍵作用。0ct4+細(xì)胞例如卵裂球和胚胎干細(xì)胞中0ct4的缺失會(huì)導(dǎo)致自發(fā)的滋養(yǎng)層分化，因此0ct4的存在產(chǎn)生胚胎干細(xì)胞的多能性和分化潛力。“Oct"家族中的多個(gè)其它基因，包括0ct4的近親Octl和0ct6，不能引發(fā)誘導(dǎo)，因此證明了 Oct-4在誘導(dǎo)過程中的專有性。與0ct4類似，Sox基因家族與維持多能性相關(guān)，雖然其與多潛能(multipotent)和單能干細(xì)胞相關(guān)，而0ct4與此相反，0ct4專有性地在多能干細(xì)胞中表達(dá)。雖然Sox2是用于重編程誘導(dǎo)的最初基因，但是發(fā)現(xiàn)Sox家族中的其它基因也在誘導(dǎo)過程中同樣起作用。 Soxl以類似于Sox2的效率產(chǎn)生iPS細(xì)胞，基因Sox3、Soxl5和Soxl8也產(chǎn)生iPS細(xì)胞，雖然效率較低。在胚胎干細(xì)胞中，Nanog以及0ct4和Sox2是促進(jìn)多能性所需的。因此，當(dāng) Yamanaka等人報(bào)道“Nanog對于誘導(dǎo)不是必需的、但Thomson等人報(bào)道可以使用Nanog作為因子之一來產(chǎn)生iPS細(xì)胞時(shí)，是令人驚奇的。Lin28是一種mRNA結(jié)合蛋白，其在胚胎干細(xì)胞和胚胎癌細(xì)胞中表達(dá)，與分化和增殖相關(guān)。Thomson等人證明其是產(chǎn)生iPS的一個(gè)因子，雖然其不是必需的。Klf基因家族的Klf4最初由Yamanaka等人鑒定，并由Jaenisch等人確認(rèn)為用于產(chǎn)生小鼠iPS細(xì)胞的因子，并由Yamanaka等人證明是用于產(chǎn)生人類iPS細(xì)胞的因子。然而，Thompson等人報(bào)道Klf4對于人類iPS細(xì)胞的產(chǎn)生不是必需的，事實(shí)上其不能產(chǎn)生人類iPS細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)Klf2和Klf4是能夠產(chǎn)生iPS細(xì)胞的因子，相關(guān)的基因Klfl和Klf5同樣也是，雖然效率較低。Myc基因家族是牽涉于癌癥的原癌基因。Yamanaka等人和Jaenisch等人證明 c-Myc是牽涉于小鼠iPS細(xì)胞之產(chǎn)生中的因子，Yamanaka等人證明其是牽涉于人類iPS細(xì)胞之產(chǎn)生中因子。然而，Thomson等人和Yamanaka等人報(bào)道c_Myc對于產(chǎn)生人類iPS細(xì)胞不是必需的。將"Myc"基因家族用于誘導(dǎo)iPS細(xì)胞對于iPS細(xì)胞最終作為臨床治療具有麻煩，因?yàn)?5%的移植了 c-Myc誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞的小鼠產(chǎn)生致命性畸胎瘤。N-Myc和L-Myc 已經(jīng)被鑒定為以類似的效率進(jìn)行誘導(dǎo)(替代c-myc)。SV40大抗原可用于減少或防止當(dāng)表達(dá)c-Myc時(shí)可能發(fā)生的細(xì)胞毒性。本發(fā)明中使用的重編程蛋白可以被具有大約相同的重編程功能的蛋白同源物替代。編碼這些同源物的核酸也可用于重編程。保守性氨基酸置換是優(yōu)選的，即，例如，作為極性酸性氨基酸的天冬氨酸/谷氨酸；作為極性堿性氨基酸的賴氨酸/精氨酸/組氨酸；作為非極性或疏水性氨基酸的亮氨酸/異亮氨酸/甲硫氨酸/纈氨酸/丙氨酸/甘氨酸/脯氨酸；作為極性或不帶電的親水性氨基酸的絲氨酸/蘇氨酸。保守性氨基酸置換還包括基于側(cè)鏈的分組。例如，具有脂肪族側(cè)鏈的一組氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族_羥基側(cè)鏈的一組氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側(cè)鏈的一組氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族側(cè)鏈的一組氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸； 具有堿性側(cè)鏈的一組氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有含硫側(cè)鏈的一組氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，可以合理預(yù)期將亮氨酸替換為異亮氨酸或纈氨酸、將天冬氨酸替換為谷氨酸、將蘇氨酸替換為絲氨酸、或類似地將氨基酸替換為結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸將不會(huì)對得到的多肽的性質(zhì)產(chǎn)生大的影響。可以通過測定多肽的比活性容易地確定氨基酸替換是否產(chǎn)生功能性多肽。V. T細(xì)胞和/或造血前體細(xì)胞的重編程為了從目前本領(lǐng)域通常使用的皮膚成纖維細(xì)胞之外的備選來源提供iPS細(xì)胞，提供了用于重編程包含T細(xì)胞的細(xì)胞群體的方法。在一些實(shí)施方式中，激活并擴(kuò)增T細(xì)胞以提供顯著數(shù)目的T細(xì)胞用于重編程。A.T 細(xì)胞術(shù)語“T細(xì)胞”是指如本領(lǐng)域中定義的T淋巴細(xì)胞并意在包括胸腺細(xì)胞、未成熟T 淋巴細(xì)胞、成熟的T淋巴細(xì)胞、靜止的T淋巴細(xì)胞或激活的T淋巴細(xì)胞。T細(xì)胞可以是⑶4+T 細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+CD8+T細(xì)胞或⑶4_CD8_細(xì)胞。T細(xì)胞也可以是T輔助細(xì)胞，例如T輔助1 (THl)或T輔助2 (TH2)細(xì)胞或TH17細(xì)胞，以及細(xì)胞毒性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞、幼稚T細(xì)胞、記憶T細(xì)胞或γ δ T細(xì)胞(Wilson等人，2009 ；Wynn, 2005 ；Ladi等人，2006)。彼此差別在于至少一種標(biāo)志物例如CD4的T細(xì)胞，在本文中被稱作T細(xì)胞的“子
皇”朱。輔助T細(xì)胞(效應(yīng)T細(xì)胞或Th細(xì)胞)是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的“中間者”。一旦被激活，它們迅速分裂并分泌被稱作細(xì)胞因子的小的蛋白，所述細(xì)胞因子調(diào)節(jié)或輔助免疫應(yīng)答。 取決于大小、接收到的細(xì)胞因子信號(hào)，這些細(xì)胞分化為TH1、TH2、TH3、TH17、THF或其它子集中的一種，它們分泌不同的細(xì)胞因子。⑶4+細(xì)胞與II類MHC相關(guān)。細(xì)胞毒性T細(xì)胞(TC細(xì)胞或CTL)破壞被病毒感染的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，并且也被指參與移植排斥。這些細(xì)胞也被稱作CD8+T細(xì)胞(與I類MHC相關(guān))，因?yàn)樗鼈冊谄浔砻姹磉_(dá) ⑶8糖蛋白。通過SLOB與T調(diào)節(jié)性⑶4+⑶25+FoxP3+細(xì)胞的相互作用，這些細(xì)胞可以被滅活為無變應(yīng)性狀態(tài)，這預(yù)防了自身免疫疾病，例如實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎。記憶T細(xì)胞是感染消退之后長期持續(xù)的抗原特異性T細(xì)胞的子集。在重新暴露于它們的同種抗原(cognate antigen)之后，它們迅速擴(kuò)增為大量的效應(yīng)T細(xì)胞，從而為免疫系統(tǒng)提供針對過往感染的“記憶”。記憶T細(xì)胞包括兩個(gè)子集中心記憶T細(xì)胞(TCM細(xì)胞)和效應(yīng)記憶T細(xì)胞(TEM細(xì)胞)。記憶細(xì)胞可以是⑶4+或⑶8+。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)，以前被稱作抑制性T細(xì)胞，對于維持免疫耐受是關(guān)鍵性的。它們類似于表達(dá)常規(guī)α β TCR的⑶4+細(xì)胞。它們可以進(jìn)一步表征為⑶25和Foxp3 蛋白的共表達(dá)。它們的主要作用是在將近免疫反應(yīng)的末期關(guān)閉T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力，并且抑制那些逃脫了胸腺中的陰性選擇過程的自身反應(yīng)性T細(xì)胞。已經(jīng)描述了 CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的兩個(gè)主要類別，包括自然產(chǎn)生的Treg細(xì)胞和適應(yīng)性Treg細(xì)胞。自然產(chǎn)生的Treg細(xì)胞 (也稱作⑶4+⑶25+FoxP3+Treg細(xì)胞)產(chǎn)生于胸腺中，而適應(yīng)性Treg細(xì)胞(也稱作Trl細(xì)胞或Th3細(xì)胞)可以在正常免疫應(yīng)答過程中起源。通過被稱作FoxP3的細(xì)胞內(nèi)分子的存在可以將自然產(chǎn)生的Treg細(xì)胞與其它T細(xì)胞區(qū)別開。F0XP3基因的突變可以阻止調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)育，引起胎兒自身免疫疾病IPEX。自然殺傷T細(xì)胞(NK T細(xì)胞)是異質(zhì)的T細(xì)胞群體，其特征在于共表達(dá)α β或 Y 3!~0 和多種^(受體，包括0016，0056，00161，0094，001583和0015813。NK T 細(xì)胞具有在激活后迅速分泌大量細(xì)胞因子的能力。NK T細(xì)胞克隆分泌1型、2型或這兩種類型的細(xì)胞因子，其可以影響ThO細(xì)胞向Thl或Th2細(xì)胞的分化。NK T細(xì)胞被描述為在小鼠中是表達(dá)不變的TCR Va 14的細(xì)胞，在人類中是表達(dá)不變的TCR V a 24的細(xì)胞。最近，也已經(jīng)認(rèn)識(shí)到了表達(dá)多種TCR的NK T細(xì)胞。⑶3+CD56+細(xì)胞代表NK T細(xì)胞群體的一種。NK T細(xì)胞可以是 CD4+CD8+，CD4XD8、CD4TD8.或 CD4+CD8-。γ δ T細(xì)胞(伽瑪?shù)聽査細(xì)胞)代表在它們的表面具有獨(dú)特的T細(xì)胞受體(TCR) 的T細(xì)胞的小的子集。大多數(shù)T細(xì)胞具有由被稱作α-和β-TCR鏈的兩個(gè)糖蛋白鏈構(gòu)成的 TCR0然而，在Y δ T細(xì)胞中，TCR由1個(gè)Y-鏈和1個(gè)δ-鏈組成。該組T細(xì)胞相對于α βΤ 細(xì)胞較不常見(全部T細(xì)胞的5% )，但是在腸道粘膜中其豐度最高，在被稱作上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(IEL)的淋巴細(xì)胞群體內(nèi)。激活Y δ T細(xì)胞的抗原性分子仍然是未知的。但是，γ δ T 細(xì)胞不是MHC限制性的，并且似乎能夠識(shí)別整個(gè)蛋白，而不需要抗原呈遞細(xì)胞上的MHC分子呈遞肽。一些識(shí)別IB類MHC分子。人VY9/VS2T細(xì)胞構(gòu)成外周血中的主要Y δ T細(xì)胞群體，它們是獨(dú)特的，因?yàn)樗鼈兲禺愋郧已杆賹π〉姆请奈⑸锎x物HMB-PP(異戊烯焦磷酸前體)作出應(yīng)答。存在于來自健康供體的外周血中的T細(xì)胞的百分率估計(jì)如下CD3+ =70. 78% 士4. 71 ；CD3+CD4 = 38. 97% 士5. 66 ；CD3+CD8 = 28. 955% 士7. 43 ；CD3+CD56+ = 5. 22% 士 1. 74 ；CD3XD56+ = 10. 305% 士 4. 7 ；CD3+CD45RA = 45. 00% 士 7. 19 ；CD3+CD45R0+ =27. 21% 士 7. 34。T細(xì)胞可以是T細(xì)胞的純化的群體，或者備選地，T細(xì)胞可以在與不同類型的細(xì)胞、 例如B細(xì)胞和/或其它外周血細(xì)胞的群體中。T細(xì)胞可以是T細(xì)胞的子集、例如CD4+T細(xì)胞的純化的群體，或者，它們可以是包含T細(xì)胞的不同子集的T細(xì)胞的群體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，T細(xì)胞是已經(jīng)在培養(yǎng)物中維持了延長的時(shí)間段的T細(xì)胞克隆。T細(xì)胞克隆可以轉(zhuǎn)化至不同程度。在具體的實(shí)施方式中，T細(xì)胞是在培養(yǎng)物中無限增殖的T細(xì)胞克隆。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，T細(xì)胞是原代T細(xì)胞。術(shù)語“原代T細(xì)胞”意指包括獲自個(gè)體的T細(xì)胞，與在培養(yǎng)物中維持了延長的時(shí)間段的T細(xì)胞不同。因此，原代T細(xì)胞特別是獲自受試者的外周血T細(xì)胞。原代T細(xì)胞的群體可以主要由T細(xì)胞的一個(gè)子集組成。 備選地，原代T細(xì)胞的群體可以由T細(xì)胞的不同子集組成。T細(xì)胞可以來自之前儲(chǔ)存的血液樣品，來自健康個(gè)體，或備選地，來自被某病況影響的個(gè)體。所述病況可以是感染性疾病，例如由病毒感染、細(xì)菌感染或任何其它微生物感染引起的病況，或過度增生性疾病，例如癌癥，例如黑素瘤。在具體的實(shí)施方式中，T細(xì)胞來自感染了人免疫缺陷病毒(HIV)的個(gè)體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，T細(xì)胞來自患有自身免疫疾病或T細(xì)胞病癥或?qū)ζ湟赘械氖茉囌摺細(xì)胞可以來源于人、鼠或任何其它哺乳動(dòng)物物種。B.造血祖細(xì)胞由于造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞的顯著的醫(yī)學(xué)潛在意義，已經(jīng)進(jìn)行了實(shí)質(zhì)性工作以試圖改善從胚胎干細(xì)胞分化造血祖細(xì)胞的方法。在成人中，主要存在于骨髓中的造血干細(xì)胞產(chǎn)生活躍分裂的造血(CD34+)祖細(xì)胞的異質(zhì)群體，所述祖細(xì)胞分化為血液系統(tǒng)的所有細(xì)胞。雖然預(yù)期到CD34+內(nèi)皮細(xì)胞可以被轉(zhuǎn)化為iPS細(xì)胞，但是在一些實(shí)施方式中，使用非內(nèi)皮細(xì)胞的造血細(xì)胞可能是理想的；例如，在一些情況下，使用不表達(dá)CD31或VE-鈣粘蛋白的造血祖細(xì)胞或造血前體細(xì)胞可能是理想的。其它標(biāo)志物，例如⑶43和/或⑶45標(biāo)志物，也可用于輔助鑒定造血祖細(xì)胞(例如，Kadaja-Saarepuu等人，2008 ；Vodyanik等人，2006)。 造血細(xì)胞包括原始造血細(xì)胞的多個(gè)子集，包括⑶43 (+)⑶235a (+)⑶41a (+/-)(紅細(xì)胞-巨核細(xì)胞生成性的)，1 in (_) CD34 (+) CD43 (+) CD45 (_)(多潛能)，和 1 in (-) CD34 (+) CD43 (+) CD45(+)(偏髓樣的)細(xì)胞。在成人中，造血祖細(xì)胞增殖并分化，引起每日產(chǎn)生數(shù)千億成熟的血液細(xì)胞。造血祖細(xì)胞也存在于臍帶血中。在體外，人胚胎干細(xì)胞可以分化為造血祖細(xì)胞。 也可以從外周血樣品擴(kuò)增或富集造血祖細(xì)胞。造血細(xì)胞可以來源于人、鼠或任何其它哺乳動(dòng)物物種。C.細(xì)胞群體的來源造血干細(xì)胞(HSC)通常產(chǎn)生于骨髓中，但可被迫使進(jìn)入血液，該過程被稱作動(dòng)員 (mobilization)，在臨床上用于收獲外周血中大量數(shù)目的HSC。所選的一種動(dòng)員劑是粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)?？梢酝ㄟ^血液成分去除法，在無擾狀態(tài)，或在外部施用造血生長因子例如G-CSF 動(dòng)員之后，收集在外周血中循環(huán)的CD34+造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。在動(dòng)員之后收集的干或祖細(xì)胞的數(shù)目大于在無擾狀態(tài)下在血液成分去除法之后獲得的數(shù)目。在本發(fā)明的具體方面， 細(xì)胞群體的來源是這樣的受試者其細(xì)胞未經(jīng)外部施用的因子動(dòng)員，因?yàn)闊o需富集造血干細(xì)胞或造血祖細(xì)胞。用于本文描述的方法中的細(xì)胞的群體可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如人類細(xì)胞，非人靈長類細(xì)胞，嚙齒類細(xì)胞(例如小鼠或大鼠)，牛細(xì)胞，羊細(xì)胞，豬細(xì)胞，馬細(xì)胞，綿羊細(xì)胞， 犬細(xì)胞，貓細(xì)胞，或其混合物。非人靈長類細(xì)胞包括獼猴細(xì)胞。細(xì)胞可以獲自動(dòng)物，例如人類患者，或者它們可以來自細(xì)胞系。如果細(xì)胞是獲自動(dòng)物，則它們可以用作，例如，未分離的細(xì)胞(即，混合的群體)；它們可以已經(jīng)在培養(yǎng)物中建立，例如，通過轉(zhuǎn)化；或者它們可以已經(jīng)經(jīng)歷初步純化方法。例如，可以基于細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)通過陽性或陰性選擇操作細(xì)胞群體；在體外或在體內(nèi)以一種或多種抗原刺激；在體外或在體內(nèi)以一種或多種生物修飾劑處理；或這些中的任意或全部項(xiàng)的組合。在示例性實(shí)施方式中，細(xì)胞群體經(jīng)歷陰性選擇以消除非T細(xì)胞和/或特定T細(xì)胞子集。陰性選擇可以基于多種分子的細(xì)胞表面表達(dá)來進(jìn)行，包括B細(xì)胞標(biāo)志物，例如⑶19和⑶20 ；單細(xì)胞標(biāo)志物⑶14 ；NK細(xì)胞標(biāo)志物⑶56。 備選地，細(xì)胞群體可以經(jīng)歷陰性選擇以消除非CD34+造血細(xì)胞和/或特定的造血細(xì)胞子集。陰性選擇可以基于多種分子的細(xì)胞表面表達(dá)來進(jìn)行，例如，抗體的混合物(例如，CD2，CD3， CDllb, CD14, CD15, CD16, CD19, CD56, CD123和CD235a)，其可用于分離其它細(xì)胞類型，例如通過MACS或柱分離。細(xì)胞的群體包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、含有混合群體的全血或其級(jí)份，脾細(xì)胞， 骨髓細(xì)胞，腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞，通過白細(xì)胞去除術(shù)獲得的細(xì)胞，生物活組織檢查樣品，淋巴結(jié)，例如從腫瘤引流的淋巴結(jié)。合適的供體包括經(jīng)免疫的供體、非免疫的(原態(tài))供體、 經(jīng)處理的或未經(jīng)處理的供體?！敖?jīng)處理的”供體是已經(jīng)暴露于一種或多種生物修飾劑的供體?！拔唇?jīng)處理的”供體是未暴露于一種或多種生物修飾劑的供體。獲得包含T細(xì)胞的細(xì)胞群體的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法獲得外周血單核細(xì)胞(PBMC)。此類方法的實(shí)例見實(shí)施例部分并由Kim等人(1992)； Biswas 等人(1990) ；Biswas 等人(1991)討論。從細(xì)胞群體獲得造血前體細(xì)胞的方法也是本領(lǐng)域熟知的。可以使用多種細(xì)胞因子擴(kuò)增造血前體細(xì)胞，例如hSCF、hFLT3和/或IL-3 (Akkina等人，1996)，或者可以使用MACS 或FACS富集⑶34+細(xì)胞。如上所述，也可使用陰性選擇技術(shù)來富集⑶34+細(xì)胞。也可以從受試者獲得細(xì)胞樣品，然后就所需的細(xì)胞類型富集之。例如，可以根據(jù)本文的描述從血液分離PBMC和/或CD34+造血細(xì)胞?？梢允褂媚媪麟x心法(淘析)從PBMC 中富集T細(xì)胞。也可以使用多種技術(shù)從其它細(xì)胞分離細(xì)胞，例如，使用結(jié)合于所需的細(xì)胞類型的細(xì)胞表面上的表位的抗體來分離和/或激活，例如，一些T細(xì)胞分離試劑盒使用綴合于珠子的抗體激活細(xì)胞，然后使用相同的珠子進(jìn)行柱分離?？梢允褂玫牧硪环N方法包括使用針對細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體進(jìn)行陰性選擇，以選擇性富集特定細(xì)胞類型而不通過受體的介入激活細(xì)胞。骨髓細(xì)胞可以獲自髂嵴、股骨、脛骨、脊骨、肋骨或其它骨髓腔?？梢詮幕颊呷〕龉撬璨⑼ㄟ^多種分離和洗滌程序分離。用于分離骨髓細(xì)胞的已知程序包括以下步驟a) 將骨髓懸浮液離心分離為3個(gè)級(jí)份，并收集中間級(jí)份，或棕黃層；b)在單獨(dú)的液體、通常為 Ficoll (Pharmacia Fine Chemicals AB的商標(biāo))中再離心來自步驟a)的棕黃層級(jí)份1次， 收集含有骨髓細(xì)胞的中間級(jí)份；和c)洗滌來自步驟b)的收集的級(jí)份以回收可輸送的骨髓細(xì)胞。如果希望使用富含T細(xì)胞的細(xì)胞群體，則可以通過白細(xì)胞去除術(shù)和機(jī)械血液成分去除法，使用連續(xù)流動(dòng)細(xì)胞分離器，從混合的細(xì)胞群體獲得此類細(xì)胞群體。例如，可以通過任意已知的方法從棕黃層分離T細(xì)胞，包括在Ficoll-Hypaque 梯度上分離，在Percoll梯度上分離，或通過淘析。D. T細(xì)胞激活在一些方面，T細(xì)胞被試劑激活，所述試劑結(jié)合T細(xì)胞受體以激發(fā)用于T細(xì)胞激活的信號(hào)級(jí)聯(lián)。例如，可以使用CD3抗體。為了使T細(xì)胞擴(kuò)增為大量的數(shù)目和增殖性狀態(tài)以用于重編程，也可以使用細(xì)胞因子，例如IL-2。幼稚T細(xì)胞可以生存很多年而不分裂。這些小的靜止細(xì)胞具有致密的染色質(zhì)和貧乏的細(xì)胞質(zhì)并合成極少的RNA或蛋白質(zhì)。在激活后，它們必須重新進(jìn)入細(xì)胞周期并迅速分裂以產(chǎn)生大量的子代，所述子代將分化為武裝的效應(yīng)T細(xì)胞。它們的增殖和分化由被稱作白介素-2(IL-2)的細(xì)胞因子介導(dǎo)，該細(xì)胞因子是由激活的T細(xì)胞本身產(chǎn)生的。
在存在所需的共刺激信號(hào)的情況下，與特定抗原的最初相遇會(huì)激發(fā)T細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的Gl期；同時(shí)，其還誘導(dǎo)IL-2以及IL-2受體的α鏈的合成。IL-2受體具有3條鏈α、β和Y。靜止T細(xì)胞表達(dá)由β和γ鏈組成的該受體，其以中等親和性結(jié)合IL-2， 允許靜止T細(xì)胞對非常高濃度的IL-2作出應(yīng)答。α鏈與β和γ鏈的結(jié)合會(huì)產(chǎn)生具有針對IL-2的高得多的親和性的受體，允許細(xì)胞對非常低濃度的IL-2作出應(yīng)答。然后，IL-2與高親和性受體的結(jié)合激發(fā)越過細(xì)胞周期的靜止期的進(jìn)程。通過這種方式激活的T細(xì)胞能夠在1天內(nèi)分裂2-3次，持續(xù)數(shù)天，允許1個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生由數(shù)千個(gè)子代組成的克隆，所述子代都攜帶相同的針對抗原的受體。IL-2還促進(jìn)這些細(xì)胞分化為武裝的效應(yīng)T細(xì)胞。雖然不同類別的T細(xì)胞的具體激活機(jī)理稍有差別，但對于多數(shù)而言，CD4+T細(xì)胞采用“雙信號(hào)模式”。⑶4+Τ細(xì)胞的激活通過T細(xì)胞受體與T細(xì)胞上的⑶28的嚙合進(jìn)行，分別通過APC上的主要組織相容性復(fù)合物肽和Β7家族成員進(jìn)行。二者對于產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答都是必需的；在不存在CD28共刺激的情況下，單獨(dú)的T細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致無反應(yīng)性。 CD28和T細(xì)胞受體下游的信號(hào)傳導(dǎo)途徑涉及很多蛋白。第一信號(hào)是通過T細(xì)胞受體與另一細(xì)胞上的主要組織相容性復(fù)合物(MHC)呈遞的短肽的結(jié)合而提供的。這確保了只有那些具有特異于該肽的TCR的T細(xì)胞被激活。伴侶細(xì)胞通常是專職的抗原呈遞細(xì)胞(APC)，在原始應(yīng)答的情況下，通常是樹突細(xì)胞，雖然B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞也可以是重要的APC。由I類MHC分子呈遞至⑶8+Τ細(xì)胞的肽的長度是8-9個(gè)氨基酸；由II類MHC分子呈遞至⑶4+Τ細(xì)胞的肽更長，因?yàn)镮I類MHC分子的結(jié)合裂口的末端是開放的。第二信號(hào)來自共刺激，其中APC上的表面受體是由數(shù)量相對少的刺激物誘導(dǎo)的， 通常是病原體的產(chǎn)物，但有時(shí)是細(xì)胞的分解產(chǎn)物，例如壞死體或熱激蛋白。幼稚T細(xì)胞組成型表達(dá)的僅有的共刺激受體是⑶28，所以這些細(xì)胞的共刺激來自APC上的⑶80和⑶86蛋白。在T細(xì)胞激活后也表達(dá)其它受體，例如0X40和IC0S，但它們的表達(dá)很大程度上依賴于 CD28。第二信號(hào)許可T細(xì)胞對抗原作出應(yīng)答。如果沒有它，T細(xì)胞變得無反應(yīng)性，并且其將來的激活也變得更難。該機(jī)制防止對自身的不適當(dāng)應(yīng)答，因?yàn)樽陨黼耐ǔ２慌c適宜的共刺激呈遞。在一些方面，當(dāng)涉及共刺激時(shí)，抗-⑶3和抗-⑶28 二者可用于T細(xì)胞激活。在備選方面，可以應(yīng)用抗-CD3的交聯(lián)，例如結(jié)合于平板的抗-CD3。如果可溶性抗-CD3用于激活 PBMC中的T細(xì)胞，該可溶性抗-CD3抗體可以與PBMC中的APC結(jié)合，然后其將抗體呈遞至T 細(xì)胞。如果在純化的T細(xì)胞的群體中僅使用可溶性抗-CD3抗體，因?yàn)樯鲜鲈?，將?dǎo)致無反應(yīng)性。本發(fā)明的一些實(shí)施方式包括在存在抗_CD3(0KT3)和IL2的情況下培養(yǎng)T細(xì)胞，這是有利的和方便的，因?yàn)闊o需使用昂貴和麻煩的珠子或結(jié)合于平板的抗體；在加入0KT3和 IL2之后，PBMC的細(xì)胞環(huán)境將輔助激活T細(xì)胞。然后，T細(xì)胞由于優(yōu)先擴(kuò)增而相對于PBMC 培養(yǎng)物中的其它細(xì)胞類型變得過密。T細(xì)胞受體以數(shù)個(gè)蛋白的復(fù)合物存在。實(shí)際的T細(xì)胞受體由兩個(gè)單獨(dú)的肽鏈組成， 其是由獨(dú)立的T細(xì)胞受體α和β (TCRa和TCRi^)基因產(chǎn)生的。復(fù)合物中的其它蛋白是 ⑶3蛋白⑶3 ε γ和⑶3 ε δ異二聚體，以及，最重要的，⑶3 ζ同二聚體，其具有總共6個(gè) ITAM基序。CD3 ζ上的ITAM基序可以被Lck磷酸化，繼而募集ZAP-70。Lck和/或ΖΑΡ-70 也可以將很多其它分子(同樣重要的CD28、LAT和SLP-76)上的酪氨酸磷酸化，這允許信號(hào)
20傳導(dǎo)復(fù)合物在這些蛋白周圍聚集。磷酸化的1^11募集51^-76至膜，在那里其可以引來？11^、￥4￥1、Itk和潛在地， PI3K。PLCy和PI3K 二者都作用于膜的內(nèi)小葉上的PI (4，5)P2，以產(chǎn)生活性中間體二?；视?DAG)、肌醇-1，4，5-三磷酸(IP3)和磷脂酰肌醇_3，4，5-三磷酸(PIP3)。DAG結(jié)合并激活T細(xì)胞上的一些PKC，例如PKC θ，該過程對于激活轉(zhuǎn)錄因子NF- κ B和AP-I具有重要意義。ΙΡ3由PLCy從膜釋放，并迅速擴(kuò)散以激活ER上的受體，這誘導(dǎo)鈣的釋放。然后，釋放的鈣激活鈣神經(jīng)素，鈣神經(jīng)素激活NFAT，然后其轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核。NFAT是轉(zhuǎn)錄因子，其激活多向性的一組基因的轉(zhuǎn)錄，最特別是IL-2，其是促進(jìn)激活的T細(xì)胞的長期增殖的細(xì)胞因子。根據(jù)本發(fā)明的方法，將核酸分子導(dǎo)入活躍增殖(即擴(kuò)增)的T細(xì)胞?？梢酝ㄟ^將 T細(xì)胞與多種試劑(例如提供原始刺激信號(hào)的試劑與針對T細(xì)胞的共刺激信號(hào)的組合)接觸來刺激T細(xì)胞以使其擴(kuò)增?？捎糜诖碳細(xì)胞以使其擴(kuò)增的試劑是本領(lǐng)域熟知的，并且在下文中描述。被刺激而增殖的T細(xì)胞的特征在于細(xì)胞擴(kuò)大、簇集和培養(yǎng)基的酸化。因此， T細(xì)胞增殖可以通過例如檢查T細(xì)胞的尺寸或測定其體積(例如使用庫耳特計(jì)數(shù)器)來證明。靜止τ細(xì)胞具有大約6. 8微米的平均直徑。在最初激活和刺激之后，T細(xì)胞的平均直徑將在第4天時(shí)增加至超過12微米，并在約第6天時(shí)開始降低。此外，可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定T細(xì)胞增殖，例如通過氚標(biāo)記的胸苷攝取。本發(fā)明的方法涉及，在將核酸分子導(dǎo)入增殖中的T細(xì)胞之前將增殖中的T細(xì)胞與至少一種刺激劑接觸。術(shù)語“刺激劑”意在包括向T細(xì)胞提供信號(hào)的試劑，從而，相對于導(dǎo)入核酸分子之前不將T細(xì)胞與刺激劑接觸的情況，當(dāng)在將核酸分子導(dǎo)入T細(xì)胞之前將T細(xì)胞與刺激劑接觸時(shí)，被轉(zhuǎn)染進(jìn)入T細(xì)胞的核酸分子中包含的基因的表達(dá)水平較高。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，刺激劑是向T細(xì)胞提供原始激活信號(hào)的試劑。表述 “原始激活信號(hào)”意在包括通常通過TCR/CD3復(fù)合物激活的信號(hào)，其誘導(dǎo)T細(xì)胞的激活。T細(xì)胞的激活意在包括T細(xì)胞的修飾，從而T細(xì)胞在接收到第二信號(hào)、例如共刺激信號(hào)之后被誘導(dǎo)以增殖并分化。在具體的實(shí)施方式中，原始激活信號(hào)由接觸T細(xì)胞受體或與T細(xì)胞受體相關(guān)的CD3復(fù)合物的試劑提供。在優(yōu)選實(shí)施方式中，試劑是針對CD3的反應(yīng)性抗體，例如單克隆抗體0ΚΤ3(可獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Md. ；No. CRL 8001)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，刺激劑是刺激T細(xì)胞上的CD2復(fù)合物的試劑，例如抗體的組合，例如 Til. 3+T11. 1，或 Til. 3+T11. 2(見，例如 Meuer 等人，1984)。在方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，刺激劑是淋巴因子，例如IL-2。淋巴因子特別與另一試劑組合使用，例如向T細(xì)胞提供原始激活信號(hào)的試劑，用于刺激T細(xì)胞。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，在以核酸分子轉(zhuǎn)染T細(xì)胞之前，將T細(xì)胞與向T細(xì)胞提供原始激活信號(hào)的試劑(例如，抗-CD3抗體)和有效量的IL-2的組合接觸，從而核酸分子在T細(xì)胞中表達(dá)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，T細(xì)胞被刺激T細(xì)胞中的原始激活信號(hào)和共刺激信號(hào)的試劑組合所激活。術(shù)語“共刺激試劑”意在包括向T細(xì)胞提供共刺激信號(hào)的試劑，從而已經(jīng)接收到原始激活信號(hào)的T細(xì)胞(例如激活的T細(xì)胞)被刺激而增殖或分泌細(xì)胞因子， 例如IL-2、IL-4或干擾素-Y。在具體的實(shí)施方式中，共刺激試劑與T細(xì)胞表面上的⑶28 或CTLA4分子相互作用。在更具體的實(shí)施方式中，共刺激信號(hào)是CD28或CTLA4的配體，例如B-淋巴細(xì)胞抗原B7-1或B7-2。詞語“刺激形式的⑶28的天然配體”意在包括B7-1和B7-2分子，其片段或其修飾，它們能夠向T細(xì)胞提供共刺激信號(hào)。刺激形式的CD28的天然配體可以這樣鑒定例如，將激活的外周血淋巴細(xì)胞與一定形式的CD28的天然配體接觸， 并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的T細(xì)胞增殖檢驗(yàn)。因此，刺激形式的CD28的天然配體能夠刺激T細(xì)胞的增殖。 刺激形式的CD28/CTLA4的天然配體描述于例如PCT
發(fā)明者A·麥克, D·拉杰什, E·R·多明格斯, E·努韋瑟, M·布朗, R·萊亞里什 申請人:細(xì)胞動(dòng)力國際有限公司