一種新的誘導體細胞重編程的方法，試劑盒及用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種新的誘導體細胞重編程的方法，試劑盒及用途。本發(fā)明涉及外胚層分化發(fā)育相關因子和/或中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子作為誘導因子用于誘導多潛能干細胞產(chǎn)生的用途。本發(fā)明通過向分化的細胞提供誘導因子從而誘導產(chǎn)生誘導多潛能干細胞(iPS細胞)，所述誘導因子包含中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子、Sox2、Klf4和任選地c-Myc；外胚層分化相關因子、Oct4、Klf4和任選的c-Myc；或中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子、外胚層分化相關因子、Klf4和任選的c-Myc。在本發(fā)明中獲得的iPS細胞具有和鼠胚胎干細胞相似的特性，即具有維持自我更新的能力以及分化的全能性。
【專利說明】一種新的誘導體細胞重編程的方法，試劑盒及用途

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種誘導體細胞重編程的方法，試劑盒及用途。

【背景技術】
[0002] (一）胚胎干細胞簡介
[0003] 胚胎干細胞（embryonic stem cells, ESCs，簡稱ES細胞。）胚胎干細胞是早期胚 胎（原腸胚期之前）分離出來的一類細胞，它具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化 的特性。
[0004] (二）干細胞多能性（pluripotency)的特點：
[0005] 胚胎干細胞因為具有向三個胚層細胞的分化能力而被稱為"多潛能"干細胞，此 夕卜，胚胎瘤（EC)細胞和胚胎生殖（EG)細胞均具有和胚胎干細胞類似的多能性。多潛能干 細胞共同的特點是：ES細胞具有與早期胚胎細胞相似的形態(tài)結構，細胞核大，有一個或幾 個核仁，胞核中多為常染色質，胞質胞漿少，結構簡單。體外培養(yǎng)時，細胞排列緊密，呈集落 狀生長。細胞克隆和周圍存在明顯界限，形成的克隆細胞彼此界限不清，細胞表面有折光較 強的脂狀小滴。細胞克隆形態(tài)多樣，多數(shù)呈島狀或巢狀（人胚胎干細胞較扁平，而小鼠胚胎 干細胞較為隆起，細胞界限不明顯）。具有AP酶活性，特異地表達SSEA4等表面標志（小鼠 胚胎干細胞還特異性地表達SSEA1，而人胚胎干細胞不表達SSEA1)，及0ct4, Nanog，Sox2， Rexl(ZFP42)，⑶F3, Lin28等標志性基因。此外，還可以在懸浮培養(yǎng)條件下，形成胚胎小體 (Embryonic bodies)結構，并發(fā)生自發(fā)分化，EB形成6-9天后貼壁培養(yǎng)，可檢測到向內(nèi)、中、 外三個胚層分化的細胞。
[0006] (三）胚胎干細胞的研究
[0007] 哺乳動物在正常情況下永遠不會發(fā)生的事情是細胞的"去分化"--細胞倒轉發(fā) 育的進程，回歸為一種更加原始的類型。事實上對于這條規(guī)則的唯一例外是腫瘤細胞，相比 于其來源的組織細胞，它們的分化程度比較低。一些腫瘤細胞會無止境的分裂，顯示了永生 化的特點，而多能性細胞也具有相似的特點。
[0008] 直到最近，將一個正常成體細胞內(nèi)的生物鐘倒轉的唯一辦法是通過一種精細操 作，讓細胞回歸成為胚胎樣細胞的狀態(tài)，這個過程被稱為細胞的重編程。實現(xiàn)重編程的最古 老的方法是體細胞的核移植技術，或者稱為"克隆"，其具體操作是將一個正常成體細胞內(nèi) 的遺傳物質通過顯微注射進入卵細胞內(nèi)，而卵細胞本身的DNA之前被去除掉。這種DNA與卵 細胞形成的雜合體能夠發(fā)育成為早期胚胎，從這種早期胚胎中可以提取多能性的干細胞。
[0009] 自從1997年多利羊的誕生和1998年首次分離得到人類胚胎干細胞以來，核移植 技術作為一種可以量身定制獲得多能性細胞的途徑，進而能夠移植替換疾病受損組織和創(chuàng) 傷組織，受到了廣泛的關注。卵細胞內(nèi)的某些因子（我們了解得還很少）的確將成年供體 細胞內(nèi)的遺傳物質變得年輕了，甚至包括端粒。端粒就像一頂帽子一樣保護著染色體的末 端，并隨著年齡的增長逐漸變短，但重編程仍能讓端粒保持年輕化的狀態(tài)。盡管克隆技術在 動物體內(nèi)取得了長足的進展，但將之用于生成人類胚胎干細胞的努力仍然是不成功的。
[0010] (四）誘導多能性干細胞（iPS細胞）的研究
[0011] 2006年8月，日本京都大學再生醫(yī)學科學研究所教授山中伸彌（Shinya Yamanaka)實驗室首先宣布在小鼠的成纖維細胞中導入4個基因（0ct4, Sox2, c-Myc和 Klf4)成功地將其誘導重編程成為全能性的干細胞，其性質和胚胎干細胞類似。（Takahashi and Yamanaka, 2006)從而首次揭示了通過轉基因可以在分化的細胞中建立全能性。
[0012] 在該實驗中，Yamanaka等人首先選取了和小鼠胚胎干細胞自我更新及維持多能性 相關的24個基因，分別將他們克隆到逆轉錄病毒載體，對胚胎成纖維細胞進行共轉染，在 進行基于Fbxl5報告體系的篩選之后，他們觀察到了 ES-like的細胞集落的形成。經(jīng)過對 這24個基因的進一步分析，他們發(fā)現(xiàn)，僅轉導0ct4, Sox2, c-Myc，Klf4就可以使胚胎成纖 維細胞完全轉變成為誘導的多潛能干細胞（iPS細胞-Induced Pluripotent Stem Cells, 俗稱"誘導的多潛能干細胞"）。該iPS細胞擁有正常的核型，表達類似胚胎干細胞的分子 標志，可以在體外被誘導分化為內(nèi)、中、外三個胚層的終末分化的細胞，能夠在裸鼠體內(nèi)形 成畸胎瘤，在畸胎瘤中含有內(nèi)、中、外三個胚層的分化細胞。
[0013] 同時，研究發(fā)現(xiàn)只用0ct4，Sox2和Klf4 一樣可以獲得iPS細胞，c-Myc并不是體 細胞重編程所必需的轉錄因子。
[0014] 此后，采用Yamanaka的策略，一些新的用于產(chǎn)生誘導多能干細胞的因子被篩選 出來。新加坡的Huck-Hui Ng研究組發(fā)現(xiàn)Nr5a2和Klf4，Sox2，cMyc -起完成重編程 (Jian-Chien Dominic Heng et al.，2009)，并且 0ct4,Esrrb，Klf4,和 cMyc -起也可以完 成重編程。同時，研究發(fā)現(xiàn)只用0ct4并且在特殊的細胞類型，如神經(jīng)干細胞（Kim et al.， 2009)，滋養(yǎng)外胚層細胞（Tong mi et al.，2011)等就可以實現(xiàn)將體細胞重編程為誘導多能 干細胞。并且，在加上小分子的情況下還能實現(xiàn)將小鼠成纖維細胞轉變?yōu)檎T導多能干細胞 (Yanqin Li et al. ,2010)以及人的角質化細胞轉變?yōu)檎T導多能干細胞（Saiyong Zhu et al.，2010)。
[0015] 迄今為止，不同研究組已經(jīng)在許多種不同類型的細胞上嘗試了重編程技術，并取 得了成功。在誘導的方法學上也有了許多的改進。2008年，Hochedlinger課題組利用 不整合基因組的腺病毒（Adenovirus)載體成功誘導了 iPS細胞（Matthias Stadtfeld et al. ,2008);同年，Yamanaka利用質粒載體也成功誘導了 iPS細胞（Keisuke Okita et al. ,2008) ;piggyBac轉座子體系后來也證實可以切除掉外源插入基因的方法完成重編程 (Woltjen K et al.，2009);后來Ding Sheng課題組利用四因子的蛋白也成功誘導iPS細 胞（Zhou H et al.，2009);最近，用 RNA(Luigi Warren et al.，2010)和小RNA(micro RNA) 也能實現(xiàn)成功的重編程（FrederickAnokye-Danso et al.，2011and Alessandro Rosa et al·，2011)。
[0016] S0X7, CEBPa，HNF4a，GRB2作為中內(nèi)胚層分化基因已經(jīng)被廣泛報道，但其在重編程 過程中的作用目前還沒有報道。GMNN作為外胚層分化基因已經(jīng)被廣泛報道，但其在重編程 過程中的作用目前還沒有報道。
[0017](五）應用前景
[0018] 誘導多能干細胞的建立很好的解決了胚胎干細胞研究的倫理問題，對于生命科學 以及人類的健康有著重要意義。誘導多能干細胞的研究可以幫助揭示人及動物的發(fā)育機制 及影響因素；建立轉基因動物或基因打靶動物，制備人類疾病模型；體外誘導分化提供各 種類型的人體細胞，進行藥學研究；通過形成嵌合體，在嚴格控制下使動物的某些器官來源 于人體細胞，從而用于臨床移植；最誘人的前景就是用于細胞治療和基因治療的靶細胞，為 細胞移植提供無免疫原性的材料以及通過基因修飾改造的人體細胞移植回體內(nèi)，達到治愈 疾病的目的等等。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 本發(fā)明提供了一種通過導入中內(nèi)胚層分化相關基因和/或外胚層分化基因誘導 細胞重編程的方法，這類基因可替代0ct4和/或Sox2,同其它重編程基因一起，誘導產(chǎn)生誘 導多潛能干細胞（iPS細胞）。該方法通過向分化的細胞中提供中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關的 基因（如GATA3)并且在外源Sox2等其它基因的共同作用下，或向分化的細胞提供外胚層 分化發(fā)育相關的基因（如GMNN)并且在外源0ct4等其它基因的共同作用下，或向分化的細 胞同時提供中內(nèi)胚層和外胚層分化相關的基因，在其他重編程基因一起，誘導產(chǎn)生iPS細 胞 -誘導的多潛能干細胞（Induced Pluripotent Stem Cells)。
[0020] 因此，本發(fā)明一方面涉及中內(nèi)胚層和/或外胚層分化發(fā)育相關因子作為誘導因子 用于誘導多潛能干細胞產(chǎn)生的用途。
[0021] 本發(fā)明還一方面涉及一種制備誘導多潛能干細胞的方法，包括向分化的細胞提供 誘導因子的步驟。在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明的制備方法包括將分化的細胞與誘 導因子接觸的步驟。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述誘導因子包含中內(nèi)胚層和/或外胚 層分化發(fā)育相關因子。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述誘導因子包含中內(nèi)胚層分化發(fā)育 相關因子、Sox2和Klf4的組合。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述誘導因子進一步包含 c-Myc。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述誘導因子包含中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子、Sox2、 Klf4和c-Myc的組合。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述誘導因子包含外胚層分化發(fā)育 相關因子、0ct4和Klf4的組合。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述誘導因子進一步包含 c-Myc。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述誘導因子包含外胚層分化發(fā)育相關因子、0ct4、 Klf4和c-Myc的組合。在本發(fā)明的方法中，中內(nèi)胚層基因能替代0ct4和/或c-Myc，因此 不必使用0ct4和/或c-Myc。在本發(fā)明的方法中，夕卜胚層基因能替代Sox2和/或c-Myc， 因此不必使用Sox2和/或c-Myc。在本發(fā)明的方法中，中內(nèi)胚層基因和外胚層基因能同時 替代0ct4和Sox2,因此不必使用0ct4和Sox2/或c-Myc。
[0022] 在本發(fā)明中，所使用的分化的細胞可以是本領域已知的任何分化的細胞，例如，皮 膚細胞，肝細胞，胃細胞，角質細胞或血液細胞，優(yōu)選地，所述細胞來自胚胎期，剛出生后或 成體期。
[0023] 在本發(fā)明中，所使用的分化的細胞可以來源于哺乳動物或非哺乳動物。在本發(fā)明 的一些實施方案中，本發(fā)明使用的分化的細胞來源于人。在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā) 明使用的的分化的細胞來源于非人哺乳動物。在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明使用的 分化的細胞來源于鼠如小鼠或大鼠或靈長類動物。
[0024] 本發(fā)明又一方面涉及一種制備誘導多潛能干細胞的試劑盒，包括誘導因子。在本 發(fā)明的一些實施方案中，所述試劑盒還包括用于轉化細胞的試劑和載體。所述載體可以 是例如慢病毒系統(tǒng)的載體。本發(fā)明的試劑盒中還可以包括培養(yǎng)基和說明書。在本發(fā)明的 一些實施方案中，所使用的誘導因子包括中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子Sox2、Klf4和任選 地c-Myc。在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明的試劑盒包括中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子， Sox2和Klf4的組合。在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括中內(nèi)胚層分化發(fā)育相 關因子、Sox2、Klf4和c-Myc的組合。在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明的試劑盒中的誘 導因子包括外胚層分化發(fā)育相關因、0ct4、Klf4,任選地，所述誘導因子還包括c-Myc。在本 發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明的試劑盒中的誘導因子包括中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子、 外胚層分化發(fā)育相關因子、Klf4,任選地，所述誘導因子還包括c-Myc。在本發(fā)明的一些實 施方案中，試劑盒中的中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子包括GATA3, GATA6, GATA4, PAX1，S0X7， CEBPa，HNF4a或GRB2中的至少一個，例如，GATA3,試劑盒中的外胚層分化發(fā)育相關因子包 括S0X1，S0X3或GMNN中的至少一個，例如，GMNN。
[0025] 在本文中，誘導因子以其最廣泛意義使用，包括產(chǎn)生誘導多潛能干細胞的基因 (其編碼多核苷酸或其蛋白產(chǎn)物）或基因的組合，誘導因子可以是核酸如DNA，mRNA或蛋白 形式。
[0026] 在本文中，中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子和/或外胚層分化發(fā)育相關因子以其最廣 泛的意義使用，包括本領域已知的任何中內(nèi)胚層、外胚層分化發(fā)育相關基因、編碼所述基因 的多核苷酸、所述基因表達產(chǎn)生的蛋白質。例如，在本發(fā)明的一些實施方案中，所述中內(nèi)胚 層分化發(fā)育相關因子包括GATA3, GATA6, GATA4, PAX1，S0X7, CEBPa，HNF4a或GRB2中的至 少一個。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子選自GATA3，GATA6， GATA4, PAX1，S0X7, CEBPa，HNF4a或GRB2中的至少一個的至少一個。在本發(fā)明的一些實 施方案中，所述中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子選自GATA3, GATA6, GATA4, PAX1，S0X7, CEBPa， HNF4a或GRB2。在本發(fā)明的一些實施方案中，僅使用選自GATA3，GATA6，GATA4，PAX1，S0X7， CEBPa，HNF4a或GRB2中的一個中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子。在本發(fā)明的一些實施方案中， 使用選自GATA3, GATA6, GATA4, PAX1，S0X7, CEBPa，HNF4a或GRB2中的兩個或更多中內(nèi)胚 層分化發(fā)育相關因子的組合。在本發(fā)明的一些實施方案中，使用的中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關 因子為GATA3。所述外胚層分化發(fā)育相關因子包括S0X1，S0X3或GMNN中的至少一個。在 本發(fā)明的一些實施方案中，所述外胚層分化發(fā)育相關因子選自S0X1，S0X3或GMNN中的至少 一個的至少一個。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述外胚層分化發(fā)育相關因子選自S0X1， S0X3或GMNN。在本發(fā)明的一些實施方案中，僅使用選自S0X1，S0X3或GMNN中的一個外胚 層分化發(fā)育相關因子。在本發(fā)明的一些實施方案中，使用選自S0X1，S0X3或GMNN中的兩個 或更多外胚層分化發(fā)育相關因子的組合。在本發(fā)明的一些實施方案中，使用的外胚層分化 發(fā)育相關因子為GMNN。
[0027] 本發(fā)明又一方面涉及使用本發(fā)明的方法或試劑盒制備的誘導多潛能干細胞。
[0028] 本發(fā)明還一方面涉及所制備的誘導多潛能干細胞的用途。例如，用于本領域已知 的各種用途。
[0029] 如本發(fā)明中所證實的，中內(nèi)胚層和/或外胚層分化發(fā)育相關因子可以用于制備誘 導多潛能干細胞。在這一方面，中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子可以與Sox2、Klf4和任選地 c-Myc組合用于制備誘導多潛能干細胞。外胚層分化發(fā)育相關因子可以與0ct4、Klf4和任 選地c-Myc組合用于制備誘導多潛能干細胞。中內(nèi)胚層，外胚層分化發(fā)育相關因子可以與 Klf4和任選地c-Myc組合用于制備誘導多潛能干細胞。
[0030] 如本發(fā)明中所證實的，中內(nèi)胚層和/或外胚層分化發(fā)育相關因子還可以用于提高 重編程效率。在這一方面，中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子可以與Sox2、Klf4和c-Myc組合用于 提高重編程效率。在另外一個方面，外胚層分化發(fā)育相關因子、0ct4、Klf4和任選地c-Myc 組合用于提高重編程效率。在又一個方面，中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子、外胚層分化發(fā)育相 關因子、Klf4和任選地c-Myc組合用于提高重編程效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1 :中內(nèi)胚層基因 S0X7, CEBPa，HNF4a，GRB2等可以替代0CT4。MDF為小鼠真皮 成纖維細胞；GFP為綠色熒光蛋白。
[0032] 圖2 :外胚層基因 GMNN可以替代S0X2。
[0033] 圖3中內(nèi)胚層基因 GATA3, GATA6, PAX1分別與外胚層基因 S0X1，S0X3和GMNN組 合可以在小鼠重編程過程中同時替代0CT4和S0X2。
[0034] 圖4用G6GmKM誘導的iPS細胞系表達多潛能性標志蛋白，如NANOG，UTF-1和 SSEA-1。比例尺為 ΙΟΟμπι。
[0035] 圖5用G6GmKM誘導的iPS細胞系，G6GmKM的iPS細胞系注射獲得的畸胎瘤以及 G6GmKM的iPS細胞系注射獲得的二代小鼠各個組織中都沒有0CT4和S0X2外源病毒基因的 整合。
[0036] 圖6用G6GmKM誘導的iPS細胞系表達干性標志基因并且外源病毒基因已經(jīng)基本 沉默。
[0037] 圖7用G6GmKM誘導的iPS細胞系的多潛能基因 0ct4, Nanog啟動子DNA甲基化水 平很低，和胚胎干細胞類似。
[0038] 圖8用G6GmKM誘導的iPS細胞系的基因表達譜和胚胎干細胞接近.
[0039] 圖9用G6GmKM誘導的iPS細胞系在體內(nèi)具有三個胚層組織細胞類型的分化能力。 比例尺為50 μ m。
[0040] 圖10用G6GmKM誘導的iPS細胞系具有囊胚注射產(chǎn)生嵌合小鼠和種系傳遞小鼠的 能力。

【具體實施方式】
[0041] 以通過實施例進一步舉例說明本發(fā)明。本領域的普通技術人員可以理解本發(fā)明 并不限于所述實施例，并且本領域的普通技術人員可以基于說明書的教導對實施例進行修 改。這些修改同樣包含在本發(fā)明由后附的權利要求所定義的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0042] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0043] 1.小鼠品系
[0044] 轉基因鼠品系：TgN(G0FGFP) lllmeg(OG)購自 RIKEN BioResource Center。小鼠 品系ICR購自維通利華。
[0045] 2.細胞培養(yǎng)
[0046] 原代小鼠胚胎成纖維細胞（MEF)與成體小鼠皮膚細胞（MDF)均來自ICRX 0G轉基 因小鼠。MEF和293T細胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清（FBS，Invitrogen)的DMEM(Hyclone) 培養(yǎng)基。小鼠胚胎干細胞系R1和iPS細胞培養(yǎng)基為 ：80%DMEM/F12(Invitrogen)，N2，B27， ImM L-谷氨酰胺，1%非必需氨基酸，0.055mM beta-巰基乙醇（均購自Invitrogen)以及 1μΜΡ?0325901，3μΜ CHIR99021(Stemgent)。小鼠胚胎干細胞系R1和iPS細胞培養(yǎng)在絲 裂霉素 C處理后的MEF飼養(yǎng)層細胞上，培養(yǎng)基每天換液。用胰酶消化傳代。
[0047] 3. iPS 的誘導
[0048] Tet-on慢病毒體系詳見（N. Maherali et al.，2008)。慢病毒的制備，收集與感染 詳見（Y. Zhao et al.，2008)。細胞感染24小時后的培養(yǎng)基為80% knockout DMEM，10%胎 牛血清，1〇%敲除的血清替代物0?1〇，非必須氨基酸，1〇〇111^仏/1111雙抗，111111^-谷氨酰 胺，55μΜβ-巰基乙醇，lyg/mlDox。每3天進行一次換液。感染8天后，細胞的培養(yǎng)基變 為小鼠胚胎干細胞培養(yǎng)基。感染12天后，GFP陽性且形態(tài)象iPS的克隆被挑出來并傳代到 小鼠胚胎干細胞培養(yǎng)基中。
[0049] 4. iPS 的鑒定
[0050] 基因組PCR，RT-PCR分析，堿性磷酸酶檢測，DNA芯片，畸胎瘤與嵌合體鑒定方 法詳見（Y.Li et al，.2010)。免疫組化鑒定所用一抗為 SSEA-Ul : 100;Chemicon)， UTF1(1 : 200;Abcam)，and Nanog(l : 100;R&D)。二抗為羅丹明標記的驢抗兔 IgG 和羅 丹明標記的羊抗鼠 IgM(Santa Cruz Biotechnology, 1 : 200)。DAPI用來進行核染?；?因組PCR引物見表格1，RT-PCR引物見表格2。甲基化分析用的試劑盒是the CpGenome? Fast DNA modification kit(Millipore)。甲基化分析所用檢測引物詳見（K.Takahashi, S. Yamanaka,2006)。
[0051] 表格1基因組PCR引物
[0052]

【權利要求】
1. 外胚層分化發(fā)育相關因子或其與中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子的組合作為誘導因子 用于誘導多潛能干細胞產(chǎn)生的用途，所述中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子優(yōu)選為GATA3，GATA6， GATA4, PAX1，S0X7, CEBPa，HNF4a或GRB2中的至少一個，所述中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子更 優(yōu)選為GATA3, GATA6, PAX1中的至少一個。
2. -種制備誘導多潛能干細胞的方法，包括向分化的細胞提供誘導因子的步驟，所述 誘導因子包含外胚層分化發(fā)育相關因子、0ct4、Klf4,任選地，所述誘導因子還包含c-Myc。
3. -種制備誘導多潛能干細胞的方法，包括向分化的細胞提供誘導因子的步驟，所 述誘導因子包含中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子、外胚層分化發(fā)育相關因子、Klf4,任選地，所 述誘導因子還包含c-Myc，所述中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子優(yōu)選為GATA3, GATA6, GATA4， PAX1，S0X7, CEBPa，HNF4a或GRB2中的至少一個，所述中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子更優(yōu)選為 GATA3, GATA6, PAX1 中的至少一個。
4. 一種制備誘導多潛能干細胞的方法，包括向分化的細胞提供誘導因子的步驟，所 述誘導因子包含中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子、Sox2、Klf4,任選地，所述誘導因子還包含 c-Myc，其中所述中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子為S0X7, CEBPa，HNF4a和GRB2中的至少一個。
5. 中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子作為誘導因子用于誘導多潛能干細胞產(chǎn)生的用途，其中 所述中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子為S0X7, CEBPa，HNF4a和GRB2中的至少一個。
6. 權利要求2-4中任一項的方法，其中所述分化的細胞是皮膚細胞，肝細胞，胃細胞， 角質細胞或血液細胞，優(yōu)選地，所述細胞來自胚胎期，剛出生后或成體期。
7. 權利要求2-4或7中任一項的方法，其中所述分化的細胞來源于哺乳動物，優(yōu)選地， 所述哺乳動物是人、鼠或靈長類動物。
8. -種制備誘導多潛能干細胞的試劑盒，包括誘導因子，所述誘導因子包含中內(nèi)胚層 分化發(fā)育相關因子、Sox2、Klf4,任選地，所述誘導因子還包含c-Myc，其中所述中內(nèi)胚層分 化發(fā)育相關因子為S0X7, CEBPa，HNF4a和GRB2中的至少一個。
9. 一種制備誘導多潛能干細胞的試劑盒，包括誘導因子，所述誘導因子包含外胚層分 化發(fā)育相關因、0ct4、Klf4,任選地，所述誘導因子還包含c_Myc。
10. -種制備誘導多潛能干細胞的試劑盒，包括誘導因子，所述誘導因子包含中內(nèi)胚層 分化發(fā)育相關因子、外胚層分化發(fā)育相關因子、Klf4,任選地，所述誘導因子還包含c-Myc， 所述中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子優(yōu)選為GATA3, GATA6, GATA4, PAX1，SOX7, CEBPa，HNF4a或 GRB2中的至少一個，所述中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子更優(yōu)選為GATA3, GATA6, PAX1中的至 少一個。
11. 權利要求1的用途或權利要求2-3、6-7中任一項的方法或權利要求9-10的試劑 盒，其中所述外胚層分化發(fā)育相關因子包括SOX1，SOX3或GMNN中的至少一個，例如，GMNN。
12. 權利要求1-11任一項的用途、方法或試劑盒，其中所述誘導因子是DNA，mRNA或蛋 白形式。
13. 權利要求2-4和6-12中任一項的方法或試劑盒制備的誘導多潛能干細胞。
14. 權利要求1、5、11或12中任一項的用途，其中所述外胚層分化發(fā)育相關因子和/或 中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子用于制備誘導多潛能干細胞。
15. 權利要求1、5、11或12中任一項的用途，其中所述外胚層分化發(fā)育相關因子和/或 中內(nèi)胚層分化發(fā)育相關因子用于提高重編程效率。
【文檔編號】C12N5/10GK104120107SQ201310156718
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月28日 優(yōu)先權日:2013年4月28日
【發(fā)明者】鄧宏魁, 趙揚, 舒健, 吳晨, 吳業(yè)濤 申請人:北京大學