一種用于制備人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的融合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種融合蛋白，所述融合蛋白為人細(xì)胞間粘附分子-l功能結(jié)構(gòu)域和人纖連蛋白功能結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，且所述人細(xì)胞間粘附分子-1功能結(jié)構(gòu)域包含人細(xì)胞間粘附分子-1胞外第I、II結(jié)構(gòu)域，所述人纖連蛋白功能結(jié)構(gòu)域包含人纖連蛋白的細(xì)胞結(jié)合域、肝磷脂域和CS-1結(jié)構(gòu)域。所示融合蛋白用于制備細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞。本發(fā)明還提供了人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的制備方法及采用所述方法制得的細(xì)胞。
【專利說(shuō)明】一種用于制備人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的融合蛋白
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種用于制備人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的融合蛋白以及所述人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤發(fā)病率從有癌癥記錄以來(lái)，一直呈上升的趨勢(shì)，特別是過(guò)去二三十年以來(lái)，腫瘤發(fā)病率以每年3% -5%的速度增長(zhǎng)。隨著腫瘤發(fā)病率的增長(zhǎng)，針對(duì)腫瘤的治療方案也在不斷發(fā)展，免疫治療是其中一種重要的治療手段，此種治療手段對(duì)于清除腫瘤患者體內(nèi)殘留的和轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞、防止腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)及提高患者的生存率具有重要的意義。在免疫治療方法中，細(xì)胞生物治療已經(jīng)初露鋒芒，并成為腫瘤治療的重要發(fā)展方向。繼淋巴因子激活殺傷細(xì)胞(LAK)、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)及CD3單克隆抗體激活的殺傷細(xì)胞(⑶3AK)后,細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(Cytokine induced killer, CIK)的殺瘤作用日益受到重視。
[0003]CIK細(xì)胞最早于1991年由美國(guó)斯坦福大學(xué)Schmidt wolf等首次報(bào)道，他們發(fā)現(xiàn)在多種細(xì)胞因子(干擾素、CD3單克隆抗體、白介素I和白介素2)作用下，外周血淋巴細(xì)胞可以被定向誘導(dǎo)并大量增殖成為腫瘤殺傷細(xì)胞。由于此類細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD3和CD56兩種膜蛋白分子，因此具有T細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和自然殺傷細(xì)胞(NK)的非主要組織相容性復(fù)合物(MHC)限制性殺瘤等優(yōu)點(diǎn)。與其他過(guò)繼性免疫治療細(xì)胞相比，CIK細(xì)胞具有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤范圍廣、副作用小、對(duì)正常骨髓造血影響輕微等優(yōu)點(diǎn)。因此，CIK細(xì)胞被認(rèn)為是新一代腫瘤過(guò)繼免疫治療的首選方案。
`[0004]如何制得CIK細(xì)胞一直受到研究者的關(guān)注。Schmidt Wolf等使用常規(guī)密度梯度離心方法分離健康成人外周血，制備單個(gè)核細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為I X IO6個(gè)/ml進(jìn)行培養(yǎng)，于培養(yǎng)第I天在培養(yǎng)體系中加入lX103U/ml的干擾素- Y (Interferon-gamma,IFN-Y)，培養(yǎng)24小時(shí)后加入3X102U/ml的重組人IL-2、I X 102U/ml的重組人IL_l、50mg/ml的⑶3單克隆抗體，以后每3天更換一次新鮮培養(yǎng)液并補(bǔ)充重組人IL-2，并調(diào)整細(xì)胞濃度至2X IO8L'以獲得CIK細(xì)胞。郝希山、任秀寶等將纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)的活性片段作為細(xì)胞因子添加到CIK細(xì)胞培養(yǎng)體系中，得到的細(xì)胞群中含有高比例的在細(xì)胞表面同時(shí)表達(dá)⑶3、⑶56分子的細(xì)胞。
[0005]CIK細(xì)胞體外大量增殖并獲得強(qiáng)大的細(xì)胞毒活性與多種因素密切相關(guān)，這些因素包括細(xì)胞因子IL-1、IL-2、IL-7、IL-12、IFN和CD3單克隆抗體等。其中，IL-2是T細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子(由133個(gè)氨基酸組成的多肽，相對(duì)分子質(zhì)量約為15X103)，是人體免疫應(yīng)答的核心物質(zhì)，能促進(jìn)所有亞型的T細(xì)胞增殖，是效應(yīng)最強(qiáng)的細(xì)胞因子。雖然CIK細(xì)胞的體內(nèi)殺瘤活性不依賴IL-2的存在，但在體外大量培養(yǎng)時(shí)，IL-2可促進(jìn)CIK細(xì)胞增殖和殺傷活性。此外，CD3單克隆抗體(CD3McAb)，作為一種有絲分裂促進(jìn)劑，可促進(jìn)細(xì)胞增殖。在采自淋巴瘤患者外周血的CIK細(xì)胞中加入抗CD3單克隆抗體，并將其與多種淋巴瘤和白血病細(xì)胞株共孵育，可使得這些細(xì)胞株對(duì)于CIK細(xì)胞介導(dǎo)的溶細(xì)胞作用的敏感性明顯增加。[0006]纖連蛋白(fibronectin, FN)是一種位于細(xì)胞外基質(zhì)中的大分子糖蛋白，分子量約550KD。FN由成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等合成并分泌，參與細(xì)胞黏附、遷移、凋亡、形態(tài)改變等過(guò)程，具有止血、損傷修復(fù)等功能。由于FN分子量大，全分子表達(dá)存在基因工程上的困難。因此人們?cè)噲D表達(dá)FN功能多肽并研究其功能，以期代替FN。細(xì)胞與FN的連接由整聯(lián)蛋白介導(dǎo)，主要是整聯(lián)蛋白α 5 β 1，又稱極晚期活化抗原VLA-5，可識(shí)別FN細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域I (Cell-1)的RGD序列；整聯(lián)蛋白α 4 β 1，即VLA-4，可以與細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域II (Cell-1I)的CSl及CS5結(jié)合；硫酸軟骨素蛋白聚糖及⑶44分子可與FN羧基端肝磷脂結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Heparin-1I)結(jié)合。美國(guó)專利第5198423號(hào)中成功構(gòu)建了含有FN三個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌HB101/Pchl02 (FERM BP-2800)。研究表明，含有FN三個(gè)關(guān)鍵的功能結(jié)構(gòu)域，即細(xì)胞結(jié)合域(cell binding domain)、肝磷脂域(heparin domain)和CS-1區(qū)域的多肽能夠發(fā)揮FN的主要生理功能。該多肽可參與細(xì)胞的附著、伸展、分化和增殖。在培養(yǎng)淋巴細(xì)胞時(shí)加入該多肽和抗CD3抗體，該多肽能夠與靜息狀態(tài)的T細(xì)胞表面整合素家族成員VLA-4、VLA-5相結(jié)合，抗CD3抗體可與T細(xì)胞上的TCR結(jié)合，兩者共同作用激活酪氨酸激酶PP125FAK，然后通過(guò)Ras途徑刺激T細(xì)胞的增殖和分化。吸附在培養(yǎng)介質(zhì)上的重組該多肽可以在⑶3單克隆抗體的協(xié)同作用下刺激T細(xì)胞活化。
[0007]細(xì)胞粘附分子(cell adhesion molecule, CAM)是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞與外基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合的膜表面糖蛋白。細(xì)胞間粘附分子-1 (intercellular cell adhesionmolecule-1, I CAM-1)是一種重要的細(xì)胞粘附分子，它由Rothlein等于1986年在研究淋巴細(xì)胞粘附時(shí)發(fā)現(xiàn)。人ICAM-1基因定位于染色體19 P 13.3-13.2區(qū)，長(zhǎng)15.5kb，含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子。人ICAM-1為經(jīng)由長(zhǎng)3.3kb的可誘導(dǎo)的mRNA編碼的單鏈糖蛋白，屬免疫球蛋白超家族。由于糖基化程度不同，不同種類細(xì)胞的ICAM-1分子量有所不同:介于76-114kD，其中核心多肽的分子量為55KD。在結(jié)構(gòu)上ICAM-1分為細(xì)胞外功能區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)。細(xì)胞外功能區(qū)由483個(gè)氨基酸組成，含有5個(gè)免疫球蛋白(Ig)樣功能區(qū)，每個(gè)Ig樣區(qū)由一個(gè)單獨(dú)的外顯子編碼。信號(hào)肽和跨膜區(qū)及胞漿區(qū)分別由兩個(gè)不同的外顯子編碼。其膜外NH2-端的第1、2功能區(qū)為淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1 (lymphocyte functionalantigen-1, LFA-1)的結(jié)合部位。第2和第3結(jié)構(gòu)域之間有一段連接序列，富含脯氨酸，類似免疫球蛋白的絞鏈區(qū)、可發(fā)生 扭曲。以此連接區(qū)為界，氨基端的1-1I結(jié)構(gòu)域可結(jié)合LFA-1分子和鼻病毒，而羧基端側(cè)的III結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合巨噬細(xì)胞分億抗原-1分子(Mac-1)。LFA-1是ICAM-1的主要受體。Mac-1與ICAM-1的親和力較低，且在激活的白細(xì)胞上只有一小部分Mac-1 (約10% )可介導(dǎo)ICAM-1粘附。ICAM-1的主要胞外功能結(jié)構(gòu)域?yàn)镹H2段1-1I結(jié)構(gòu)域.經(jīng)序列分析及文獻(xiàn)檢索，ICAM-1 N段Q28-T207的180個(gè)氨基酸為主要功能序列。在TC A M-1與LFA-1分子結(jié)合過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
[0008]在現(xiàn)有的細(xì)胞免疫治療方案中，淋巴細(xì)胞體外高效增殖過(guò)程十分關(guān)鍵，而其中如何提高外周血單個(gè)核細(xì)胞體外擴(kuò)增效率依然是目前本領(lǐng)域尚待完善的問(wèn)題；另一方面，CIK細(xì)胞中起到關(guān)鍵殺瘤作用的是CD3/CD56雙陽(yáng)性細(xì)胞，因此在提高細(xì)胞增殖數(shù)量的基礎(chǔ)上，提高⑶3/⑶56雙陽(yáng)性性細(xì)胞的比例顯得同樣重要?，F(xiàn)有技術(shù)得到的CIK細(xì)胞中⑶3/⑶56雙陽(yáng)性細(xì)胞的比例僅占總細(xì)胞數(shù)的10-30%，無(wú)法充分滿足有效治療的需要，因此需要尋找新的培養(yǎng)方法來(lái)提高CD3/CD56雙陽(yáng)性細(xì)胞的比例。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中外周血單個(gè)核細(xì)胞體外擴(kuò)增效率及CIK細(xì)胞中⑶3/⑶56雙陽(yáng)性細(xì)胞所占比例均偏低的問(wèn)題，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種能夠用于制備CIK細(xì)胞的新型蛋白，該蛋白與CD3單克隆抗體組合使用，可以有效刺激淋巴細(xì)胞增殖，同時(shí)提高CIK細(xì)胞中CD3/CD56雙陽(yáng)性細(xì)胞的比例。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該新型蛋白在培育細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞中的用途。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種提高人體外周血單個(gè)核細(xì)胞體外擴(kuò)增效率和CIK細(xì)胞中CD3/CD56雙陽(yáng)性細(xì)胞所占比例的制備人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的方法以及采用此方法制得的CIK細(xì)胞。
[0010]本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)手段得以實(shí)現(xiàn):
[0011]一方面，本發(fā)明提供一種融合蛋白，所述融合蛋白為人細(xì)胞間粘附分子-1功能結(jié)構(gòu)域和人纖連蛋白功能結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，且所述人細(xì)胞間粘附分子-1功能結(jié)構(gòu)域包含人細(xì)胞間粘附分子-1胞外第1、II結(jié)構(gòu)域，所述人纖連蛋白功能結(jié)構(gòu)域包含人纖連蛋白的細(xì)胞結(jié)合域、肝磷脂域和CS-1結(jié)構(gòu)域。
[0012]優(yōu)選地，所述融合蛋白中人細(xì)胞間粘附分子-1功能結(jié)構(gòu)域與人纖連蛋白功能結(jié)構(gòu)域是通過(guò)柔性肽連接，優(yōu)選為SEQ ID NO:1。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ IDNO: 2所示。
[0014]另一方面，本發(fā)明提供所述融合蛋白在制備人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞中的用途。
[0015]又一方面，本發(fā)明 提供一種人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞，所述殺傷細(xì)胞通過(guò)包括以下步驟的制備方法制得:在人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的前體細(xì)胞培養(yǎng)前，用含有有效量的本發(fā)明的融合蛋白和人CD3單克隆抗體的包被液包被細(xì)胞培養(yǎng)瓶。并且，所述制備方法還包括以下步驟:在所述人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的誘導(dǎo)及培養(yǎng)全過(guò)程中，在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加人CD3單克隆抗體；并且所述人CD3單克隆抗體在所述細(xì)胞培養(yǎng)液中的濃度低于在所述包被液中的濃度。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，所述制備方法包括:1)用有效量的重組ICAM-FN和人CD3單克隆抗體包被細(xì)胞培養(yǎng)瓶，然后用該細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)經(jīng)分離得到的人外周血單個(gè)核細(xì)胞；2)在所述人外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，于細(xì)胞培養(yǎng)液中加入人CD3單克隆抗體進(jìn)行持續(xù)刺激，且人CD3單克隆抗體在細(xì)胞培養(yǎng)液中的濃度小于所述包被液中的濃度；和3)檢測(cè)由誘導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞得到的CIK細(xì)胞的各項(xiàng)指標(biāo)；
[0017]優(yōu)選地，在所述包被液中，所述融合蛋白濃度為5_25μ g/ml，優(yōu)選濃度為10-15 μ g/ml,所述人CD3單克隆抗體的濃度為1_10 μ g/ml,優(yōu)選濃度為4_7 μ g/ml,最優(yōu)選濃度為5 μ g/ml ;在所述細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述人CD3單克隆抗體的濃度為50-100ng/ml。
[0018]還一方面，本發(fā)明提供一種人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的制備方法，所述制備方法包括以下步驟:在人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的前體細(xì)胞培養(yǎng)前，用含有有效量的本發(fā)明的融合蛋白和人CD3單克隆抗體的包被液包被細(xì)胞培養(yǎng)瓶。并且，所述制備方法還包括以下步驟:在所送人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的誘導(dǎo)及培養(yǎng)全過(guò)程中，在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加人CD3單克隆抗體的步驟；且所述人CD3單克隆抗體在所述細(xì)胞培養(yǎng)液中的濃度低于在所述包被液中的濃度。[0019]根據(jù)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，在所述包被液中，所述融合蛋白濃度為5_25yg/ml，優(yōu)選濃度為10-15 μ g/ml，所述人⑶3單克隆抗體的濃度為1_10 μ g/ml，優(yōu)選濃度為4-7 μ g/ml，最優(yōu)選濃度為5 μ g/ml ;在所述細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述人CD3單克隆抗體的濃度為50_100ng/ml。
[0020]實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的新型融合蛋白(命名為ICAM-FN)，可以引入到細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的制備方法中，用于制備CIK細(xì)胞。并且，在該細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中加入CD3單克隆抗體，使所述融合蛋白與CD3單克隆抗體共同作用，更好地刺激了淋巴細(xì)胞的增殖，同時(shí)提高CIK細(xì)胞中CD3/CD56雙陽(yáng)性細(xì)胞所占比例，從而使得外周血單個(gè)核細(xì)胞體外擴(kuò)增效率是傳統(tǒng)方法的1.3倍，所得CIK細(xì)胞中⑶3/⑶56雙陽(yáng)性細(xì)胞所占比例是傳統(tǒng)方法的1.3-6倍，同時(shí)還提高了 CD3/CD8雙陽(yáng)性細(xì)胞所占比例，增強(qiáng)了 CIK細(xì)胞的殺瘤活性，方法殺瘤活性提高10-40%。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中:
[0022]圖1為本發(fā)明構(gòu)建的pColdll-1CAM-FN表達(dá)質(zhì)粒；
[0023]圖2為IPTG誘導(dǎo)前后及不同濃度IPTG誘導(dǎo)的BL21 (DE)表達(dá)的ICAM-FN融合蛋白的SDS-PAGE電泳圖，其中各泳道如下:A:蛋白Marker，B:1PTG誘前陽(yáng)性菌裂解液上清，C:0.1mM IPTG誘導(dǎo)3h后陽(yáng)性菌裂解液上清，D:0.5mM IPTG誘導(dǎo)3h后陽(yáng)性菌裂解液上清，E:1.0mM IPTG誘導(dǎo)3h后陽(yáng)性菌裂解液上清；
[0024]圖3為ICAM-FN融合蛋白表達(dá)的Western Blot檢測(cè)結(jié)果，其中，泳道A:陽(yáng)性菌裂解液上清；泳道B:空白對(duì)照菌裂解液上清；
[0025]圖4為純化后的ICAM-FN融合蛋白的SDS-PAGE電泳圖，泳道A:純化后的目的蛋白；泳道B:蛋白Marker ；
[0026]圖5為PI染色檢測(cè)CIK細(xì)胞活率的流式細(xì)胞檢測(cè)圖譜，其中活細(xì)胞比率為98.47% ;
[0027]圖6為CIK細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；
[0028]圖7為本發(fā)明的方法得到的CIK細(xì)胞與傳統(tǒng)方法得到的CIK細(xì)胞的細(xì)胞表型流式細(xì)胞檢測(cè)圖譜比較，其中，A:傳統(tǒng)方法得到的CIK檢測(cè)結(jié)果；B:本發(fā)明的方法得到的CIK檢測(cè)結(jié)果；
[0029]圖8為本發(fā)明的方法得到的CIK細(xì)胞與傳統(tǒng)方法得到的CIK細(xì)胞的殺瘤活性比較，其中，A:傳統(tǒng)方法得到的CIK殺傷效率；B:本發(fā)明的方法得到的CIK殺傷效率。
【具體實(shí)施方式】
[0030]為了使本發(fā)明的目的/技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0031]本發(fā)明的實(shí)施方案中構(gòu)建了人細(xì)胞間粘附分子-1功能結(jié)構(gòu)域和人纖連蛋白功能結(jié)構(gòu)域融合蛋白ICAM-FN，并在原核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)純化。其中，所述人細(xì)胞間粘附分子-1功能結(jié)構(gòu)域(ICAM-1)包含人細(xì)胞間粘附分子-1胞外第1、11結(jié)構(gòu)域，所述人纖連蛋白功能結(jié)構(gòu)域(FN)包含人纖連蛋白的細(xì)胞結(jié)合域、肝磷脂域和CS-1結(jié)構(gòu)域。
[0032]并且，所述人細(xì)胞間粘附分子-1功能結(jié)構(gòu)域(ICAM-1)和人纖連蛋白功能結(jié)構(gòu)域(FN)通過(guò)柔性肽連接，以利用其柔性使融合的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域ICAM-1和FN在空間上可自由伸展，避免了活性位點(diǎn)的相互掩蓋。
[0033]優(yōu)選地，所述柔性肽序列為GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:1)。
[0034]優(yōu)選地，所述含有柔性肽的人細(xì)胞間粘附分子-1功能結(jié)構(gòu)域和人纖連蛋白功能結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的的DNA序列為SEQ ID NO: 2。在所述融合蛋白的構(gòu)建過(guò)程中，所述人細(xì)胞間粘附分子-1功能結(jié)構(gòu)域的正向引物為Pl (SEQ ID NO: 3)，反向引物為P2 (SEQ IDNO: 4);所述人纖連蛋白功能結(jié)構(gòu)域的正向引物P3 (SEQ ID NO: 5)，反向引物為P4 (SEQID NO: 6)，通過(guò)兩步PCR法得到拼接到一起的目的基因序列SEQ ID NO: 2。
[0035]優(yōu)選地，所述人細(xì)胞間粘附分子-1功能結(jié)構(gòu)域和人纖連蛋白功能結(jié)構(gòu)域的融合蛋白于大腸桿菌中表達(dá)，大腸桿菌表達(dá)載體是分子生物學(xué)常用表達(dá)載體，具有成本較低，生長(zhǎng)周期短的優(yōu)點(diǎn)。
[0036]優(yōu)選地，所述人細(xì)胞間粘附分子-1功能結(jié)構(gòu)域和人纖連蛋白功能結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的表達(dá)載體為pColdll，并采用低溫誘導(dǎo)的方式表達(dá)，優(yōu)選于15°C誘導(dǎo)表達(dá)，以抑制大腸桿菌自身蛋白表達(dá)，便于目的蛋白的純化。
[0037]本發(fā)明的實(shí)施方案采用提供的新型融合蛋白來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞，步驟包括:
[0038]I)用有效量的重組ICAM-FN和人⑶3單克隆抗體包被細(xì)胞培養(yǎng)瓶，并用該細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)經(jīng)分離得到的人外`周血單個(gè)核細(xì)胞；
[0039]2)在該人外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，于細(xì)胞培養(yǎng)液中加入人CD3單克隆抗體進(jìn)行持續(xù)刺激，且人CD3單克隆抗體在細(xì)胞培養(yǎng)液中濃度小于前述包被液中濃度，以達(dá)到最佳刺激效果；和
[0040]3)檢測(cè)由誘導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞得到的CIK細(xì)胞的各項(xiàng)指標(biāo)。
[0041]其中所述重組ICAM-FN的原核表達(dá)采用低溫誘導(dǎo)的辦法進(jìn)行，以抑制大腸桿菌自身蛋白表達(dá)，便于目的蛋白的純化。本發(fā)明的實(shí)施方案中重組ICAM-FN構(gòu)建及表達(dá)過(guò)程中使用的分子生物學(xué)方法為常規(guī)的分子生物學(xué)方法，未詳述的技術(shù)方案可從例如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第3版)》中獲得。
[0042]因此，本發(fā)明的實(shí)施方案提供了一種人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的制備方法，包括在人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的前體細(xì)胞培養(yǎng)前用含有有效量的融合蛋白和人CD3單克隆抗體的包被液包被細(xì)胞培養(yǎng)瓶的步驟，和在所述人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的誘導(dǎo)及培養(yǎng)全過(guò)程中在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加人CD3單克隆抗體的步驟；其中所述融合蛋白為人細(xì)胞間粘附分子-1功能結(jié)構(gòu)域和人纖連蛋白功能結(jié)構(gòu)域融合蛋白，且所述人細(xì)胞間粘附分子-1功能結(jié)構(gòu)域包含人細(xì)胞間粘附分子-1胞外第Ι、Π結(jié)構(gòu)域，所述人纖連蛋白功能結(jié)構(gòu)域包含人纖連蛋白的細(xì)胞結(jié)合域、肝磷脂域和CS-1結(jié)合域，所述人CD3單克隆抗體在所述細(xì)胞培養(yǎng)液中的濃度低于在所述包被液中的濃度。
[0043]所述本發(fā)明的CIK細(xì)胞制備方法引入了融合蛋白ICAM-FN，對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行更有效的刺激，并在細(xì)胞培養(yǎng)全過(guò)程中加入CD3單克隆抗體，以形成持續(xù)的刺激。經(jīng)測(cè)得，該方法得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞體外擴(kuò)增效率是傳統(tǒng)方法的1.3倍，得到的CIK細(xì)胞中CD3/CD56雙陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為傳統(tǒng)方法的1.3-6倍，同時(shí)提高了 CD3/CD8雙陽(yáng)性細(xì)胞所占比例，因而增強(qiáng)了 CIK細(xì)胞的殺瘤活性，提高了細(xì)胞免疫治療的效果。
[0044]優(yōu)選地，本發(fā)明實(shí)施例的人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的制備方法中，所述細(xì)胞培養(yǎng)瓶的包被液中，所述融合蛋白濃度為5-25 μ g/ml，優(yōu)選濃度為10-15 μ g/ml，所述人⑶3單克隆抗體濃度為1-10 μ g/ml,優(yōu)選濃度為4-7 μ g/ml,最優(yōu)選濃度為5 μ g/ml。該實(shí)施例的優(yōu)選濃度條件下，可得到最佳的刺激效果，有效提高細(xì)胞免疫治療的效果。
[0045]優(yōu)選地，本發(fā)明實(shí)施例的人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的制備方法中，所述細(xì)胞培養(yǎng)液中人CD3單克隆抗體濃度為50-100ng/ml。
[0046]以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0047]實(shí)施例1融合蛋白的獲得
[0048]1.目的基因的獲得
[0049]根據(jù)人的ICAM-1和FN基因序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物--人ICAM-1的正向引物P1，反向引物P2;人FN的正向引物P3，反向引物P4。并通過(guò)兩步PCR獲得目的基因序列。弓丨物序列如下:
[0050]Pl:5，-CATCATCATCATCATCATATGCAGACATCTGTGTCCCC-3’ (SEQ ID NO: 3)
[0051]
【權(quán)利要求】
1.一種融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白為人細(xì)胞間粘附分子-1功能結(jié)構(gòu)域和人纖連蛋白功能結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，且所述人細(xì)胞間粘附分子-1功能結(jié)構(gòu)域包含人細(xì)胞間粘附分子-1胞外第1、II結(jié)構(gòu)域，所述人纖連蛋白功能結(jié)構(gòu)域包含人纖連蛋白的細(xì)胞結(jié)合域、肝磷脂域和CS-1結(jié)構(gòu)域。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白中人細(xì)胞間粘附分子-1功能結(jié)構(gòu)域與人纖連蛋白功能結(jié)構(gòu)域是通過(guò)柔性肽連接； 優(yōu)選地，所述柔性肽氨基酸序列為SEQ ID NO:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的DNA序列如SEQID NO: 2 所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的融合蛋白在制備人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞中的用途。
5.一種人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞，其特征在于，所述殺傷細(xì)胞通過(guò)包括以下步驟的制備方法制得: 在人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的前體細(xì)胞培養(yǎng)前，用含有有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的融合蛋白和人⑶3單克隆抗體的包被液包被細(xì)胞培養(yǎng)瓶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的殺傷細(xì)胞，其特征在于，所述制備方法還包括以下步驟:在所述人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的誘導(dǎo)及培養(yǎng)全過(guò)程中，在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加人CD3單克隆抗體；并且所述人CD3單克隆抗體在所述細(xì)胞培養(yǎng)液中的濃度低于在所述包被液中的濃度。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的殺傷細(xì)胞，其特征在于，所述制備方法包括:` 1)用有效量的重組ICAM-FN和人⑶3單克隆抗體包被細(xì)胞培養(yǎng)瓶，然后用該細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)經(jīng)分離得到的人外周血單個(gè)核細(xì)胞； 2)在所述人外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，于細(xì)胞培養(yǎng)液中加入人CD3單克隆抗體進(jìn)行持續(xù)刺激，且人CD3單克隆抗體在細(xì)胞培養(yǎng)液中的濃度小于所述包被液中的濃度；和 3)檢測(cè)由誘導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞得到的CIK細(xì)胞的各項(xiàng)指標(biāo)； 優(yōu)選地，在所述包被液中，所述融合蛋白濃度為5-25 μ g/ml，優(yōu)選濃度為10-15 μ g/ml,所述人⑶3單克隆抗體的濃度為1-10 μ g/ml,優(yōu)選濃度為4_7 μ g/ml,最優(yōu)選濃度為5 μ g/ml ;在所述細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述人CD3單克隆抗體的濃度為50-100ng/ml。
8.一種人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟: 在人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的前體細(xì)胞培養(yǎng)前，用含有有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的融合蛋白和人⑶3單克隆抗體的包被液包被細(xì)胞培養(yǎng)瓶。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法還包括以下步驟:在所述人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的誘導(dǎo)及培養(yǎng)全過(guò)程中，在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加人CD3單克隆抗體；并且所述人CD3單克隆抗體在所述細(xì)胞培養(yǎng)液中的濃度低于在所述包被液中的濃度。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的殺傷細(xì)胞，其特征在于，所述制備方法包括: I)用有效量的重組ICAM-FN和人⑶3單克隆抗體包被細(xì)胞培養(yǎng)瓶，然后用該細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)經(jīng)分離得到的人外周血單個(gè)核細(xì)胞；2)在所述人外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，于細(xì)胞培養(yǎng)液中加入人CD3單克隆抗體進(jìn)行持續(xù)刺激，且人CD3單克隆抗體在細(xì)胞培養(yǎng)液中的濃度小于所述包被液中的濃度；和 3)檢測(cè)由誘導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞得到的CIK細(xì)胞的各項(xiàng)指標(biāo)； 優(yōu)選地，在所述包被液中，所述融合蛋白濃度為5-25 μ g/ml，優(yōu)選濃度為10-15 μ g/ml,所述人⑶3單克隆抗體的濃度為1-10 μ g/ml,優(yōu)選濃度為4_7 μ g/ml,最優(yōu)選濃度為.5 μ g/ml ;在所述細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述人CD3單克隆抗體的濃度為50-100ng/ml。
【文檔編號(hào)】C12N5/0783GK103483454SQ201310155532
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月13日
【發(fā)明者】鄭意端 申請(qǐng)人:深圳市陽(yáng)溪生物科技有限公司