專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種利用穿透型干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程與組織工程領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種利用細(xì)胞穿透型轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程的方法。
背景技術(shù)：
：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(InducedPluripotentStemcell,iPS)是指將成體分化細(xì)胞經(jīng)人為誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變成多能性干細(xì)胞。2006年8月，日本京都大學(xué)的Yamanaka課題組首次在CelI上報(bào)道，小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)Oct3/4、Sox2、C-myc和Klf4等四種轉(zhuǎn)錄因子，可誘發(fā)產(chǎn)生類(lèi)似胚胎干細(xì)胞的iPS。目前，相關(guān)的研究已經(jīng)擴(kuò)展到了iPS的適用物種、可被誘導(dǎo)細(xì)胞類(lèi)型、誘導(dǎo)因子、篩選方法、干細(xì)胞功能與特性和移植治療潛能等。iPS可方便的直接取材于病人的體細(xì)胞，所獲得的病人特異性iPS細(xì)胞模型可大大提高藥物發(fā)現(xiàn)效率，并提供了用于毒性檢測(cè)的工具；最后，利用iPS形成與病人具有完全免疫相容性的細(xì)胞、組織或器官，將使得基于病人個(gè)性化的藥物篩選和治療策略成為現(xiàn)實(shí)，其社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)前景不可限量。但是目前iPS的研究尚處于起步階段，仍存在許多問(wèn)題和困難。例如，誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的產(chǎn)生效率低，僅3/1000左右；病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因需整合入宿主細(xì)胞的基因組；干細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在iPS細(xì)胞的分化后代中可被重新激活，引發(fā)諸多異常，如c-myc表達(dá)引起腫瘤形成等。這些無(wú)疑將嚴(yán)重阻礙iPS細(xì)胞的實(shí)際應(yīng)用和研究。未來(lái)iPS應(yīng)用時(shí)需要克服使用有害的癌基因、避免使用逆轉(zhuǎn)錄病毒和開(kāi)發(fā)更強(qiáng)力可靠的去分化方法。綜上所述，盡管目前已經(jīng)證明可以通過(guò)干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程，并轉(zhuǎn)分化為多能性細(xì)胞，但現(xiàn)行方法因基于病毒載體而導(dǎo)致產(chǎn)生了很大的不安全性和不可控性，亟需開(kāi)發(fā)一種更加安全可靠的誘導(dǎo)方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種將胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入體細(xì)胞的方法以及利用所述方法獲得的細(xì)胞。在本發(fā)明的第一方面，提供一種將胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入體細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟(1)將細(xì)胞穿透肽(cell-penetratingpeptide,CPP)與胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子融合，獲得融合蛋白；(2)將(l)的融合蛋白與體細(xì)胞共孵育，從而胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子被導(dǎo)入體細(xì)胞內(nèi)。在另一優(yōu)選例中，所述的轉(zhuǎn)錄因子選自O(shè)ct4、Sox2、c-Myc、n-Myc、Klf4、Nanog或Lin28。較佳的，所述的轉(zhuǎn)錄因子選自O(shè)ct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog。更佳的，所述的胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子是Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4。在另一優(yōu)選例中，所述的轉(zhuǎn)錄因子是人、豬、?；蜓虻霓D(zhuǎn)錄因子。在另一優(yōu)選例中，所述的體細(xì)胞是成纖維細(xì)胞，上皮細(xì)胞，胃腸道細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞。較佳的所述的體細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞穿透肽選自反式激活蛋白(Transactivator，TAT)、Penetratin、基于信號(hào)序列的肽、pVEC、Transportan、Amphiphilicmodelpeptide或Arg9。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞穿透肽是反式激活蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞穿透肽的羧基端與胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子的氨基端融合；或者，所述的細(xì)胞穿透肽的氨基端與胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子的羧基端融合。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞穿透肽的羧基端與胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子的氨基端融合。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述的反式激活蛋白具有SEQIDNO:15所示的氨基酸序列；更佳的，所述的反式激活蛋白的編碼基因具有SEQIDNO:16所示的核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的反式激活蛋白的羧基端與胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子的氨基端融合。在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中，所述獲得融合蛋白的方法包括(a)提供一構(gòu)建物，所述的構(gòu)建物中含有一基因表達(dá)盒，所述基因表達(dá)盒含有以下操作性相連的元件細(xì)胞穿透肽編碼基因與胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子編碼基因；(b)將(a)的構(gòu)建物導(dǎo)入細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，從而表達(dá)和純化獲得所述融合蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)包括原核表達(dá)系統(tǒng)或真核表達(dá)系統(tǒng)。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞穿透肽編碼基因的3'端與胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的5'端融合；或者，所述的細(xì)胞穿透肽編碼基因的5'端與胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的3'端融合。較佳的，所述的細(xì)胞穿透肽編碼基因的3'端與胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的5'端融合。在另一優(yōu)選例中，釆用原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(優(yōu)選大腸桿菌)表達(dá)所述的融合蛋白，采用0.8土0.2mmol/L(較佳的0.8±0.lmmol/L)異丙基P-D硫代半乳糖苷(IPTG)，32±2°C(較佳的32士rC)誘導(dǎo)4土2小時(shí)(較佳的4土1小時(shí))。在另一優(yōu)選例中，尿素的濃度是8±2mol/L;更佳的是8士1mol/L。在另一優(yōu)選例中，并采用尿素變性方法對(duì)表達(dá)獲得的融合蛋白包涵體進(jìn)行變性，采用Ni-NTA親和層析純化；并且在進(jìn)行尿素變性前，用1±0.3(較佳的l士0.2;更佳的l士0.1)mol/L的尿素(含尿素的緩沖液)洗滌包涵體；或采用250土50mmol/L咪唑(含咪唑的緩沖液)洗脫所述融合蛋白。在本發(fā)明的第二方面，提供一種利用所述的方法獲得的細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)記分子；更特別的，所述的細(xì)胞表達(dá)Oct4、Nanog和Fgf4。在本發(fā)明的第三方面，提供一種誘導(dǎo)體細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記分子的方法，所述的方法包括以下步驟(1)將細(xì)胞穿透肽(cell-penetratingpeptide,CPP)與胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子融合，獲得融合蛋白；(2)將(l)的融合蛋白與體細(xì)胞共孵育，從而融合蛋白進(jìn)入體細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)體細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記分子。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。圖h人ES細(xì)胞RNA提取電泳圖，M為DNAMarker,1，2為兩個(gè)細(xì)胞樣本，從電泳可以看出2號(hào)樣品的提取效果較好，適于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖2A:1為Oct4PCR產(chǎn)物電泳圖，片段大小為1096bp;2為Sox2PCR產(chǎn)物電泳圖，片段大小為956bp;M為DNAMarker。圖2B:1為C-mycPCR產(chǎn)物電泳圖，片段大小為1372bp。M為DNAMarker。圖2C:1為Klf4PCR產(chǎn)物電泳圖，片段大小為1438bp;M為DNAMarker。圖3:l-4依次為pETs、pETc、pETo禾QpETk轉(zhuǎn)染BL21表達(dá)菌株后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物，5為未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的BL21表達(dá)菌株，6為IPTG誘導(dǎo)未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的BL21表達(dá)菌株，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖4:M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；1-4，5-8依次為含尿素濃度為1，2，3，4mo1/1的緩沖液洗滌結(jié)果，其中l(wèi)-4為洗滌離心后上清樣品；5-8為洗滌離心后沉淀樣品；箭頭所指為目的蛋白Sox2分子量大小約為40kD。圖5A:純化Oct4重組蛋白電泳結(jié)果圖，1為上樣液，2為流穿液，3-10為洗脫峰不同時(shí)段樣品；圖5B:純化Sox2重組蛋白電泳結(jié)果圖，l為上樣液，2，3為流穿液，4-12為洗脫峰不同時(shí)段樣品；圖5C:純化C-myc重組蛋白電泳結(jié)果圖，1為上樣液，2，3為流穿液，4-13為洗脫峰不同時(shí)段樣品；圖5D:純化Klf4重組蛋白電泳結(jié)果圖，l為流穿液，2為上樣液，3-9為洗脫峰不同時(shí)段樣品；M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；圖中箭頭所指即所需目的蛋白，Oct4、Sox2、C-myc禾nKlf4分子量大小依次約為46kD、40kD、58kD和60kD。圖6:AOct4基因檢測(cè)圖譜，片段大小為143bp,l-5依次為ES細(xì)胞樣品，陰性對(duì)照，正常人成纖維細(xì)胞，蛋白處理后兩天細(xì)胞樣本，蛋白處理后6天細(xì)胞樣本，M為DNAmarkerBNanog基因檢測(cè)圖譜，片段大小為389bp，樣品順序同上CFgf4基因檢測(cè)圖譜，片段大小為369bp，樣品順序同上。圖7:誘導(dǎo)細(xì)胞蛋白檢測(cè)電泳圖。l為誘導(dǎo)第l天細(xì)胞樣本；2為誘導(dǎo)第2天細(xì)胞樣本；M為蛋白分子量標(biāo)記；3為誘導(dǎo)第2天細(xì)胞樣本；4為人成纖維細(xì)胞。圖8:A為人成纖維細(xì)胞，B為經(jīng)重組蛋白誘導(dǎo)后形成干細(xì)胞樣的細(xì)胞。圖9:pET28bTATvl質(zhì)粒圖譜。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛的研究，通過(guò)選擇合適的穿膜蛋白(優(yōu)選反式激活蛋白)，結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，將一類(lèi)蛋白(包括Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4)轉(zhuǎn)入到細(xì)胞內(nèi)。所述的穿膜蛋白與Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4分別融合后，可有效地將這些蛋白同時(shí)轉(zhuǎn)入到細(xì)胞內(nèi)，且良好地保留了它們的生物活性。細(xì)胞穿透肽如本文所用，所述的"細(xì)胞穿透肽"是指一類(lèi)具有細(xì)胞穿透作用的多肽，其自身或其與其它蛋白的融合蛋白可通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。所述的細(xì)胞穿透肽包括反式激活蛋白(TAT)、Penetratin、基于信號(hào)序列的肽、pVEC、Transportan、Amphiphilicmodelpeptide禾口Arg9等。作為本發(fā)明的特別優(yōu)選的方式，所述的細(xì)胞穿透肽是TAT。TAT來(lái)源于人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)，其是HIV復(fù)制和基因表達(dá)所必須的，又稱(chēng)為反式激活因子。本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，TAT可特別有效地將Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4導(dǎo)入到同一體細(xì)胞內(nèi)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的TAT的氨基酸序列可以與SEQIDNO:15所示的序列基本上相同；更佳的，TAT的核苷酸序列可以與SEQIDNO:16所示的序列或其簡(jiǎn)并分子基本上相同。轉(zhuǎn)錄因子所述的細(xì)胞穿透肽，特別是反式激活蛋白(TAT)可將胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子攜帶到細(xì)胞內(nèi)。所述的胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子可以是Oct4、Sox2、c-Myc、n-Myc、Klf4、Nanog或Lin28等。特別優(yōu)選的，所述的胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子是Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4。Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4等轉(zhuǎn)錄因子是本領(lǐng)域已知的胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子，例如可從人ES細(xì)胞基因組DNA中通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得。Oct4、Sox2、c-Myc禾卩Klf4的序列分別參見(jiàn)GenBank登錄號(hào)NM一013633(Oct4)、NM—003106(Sox2)、K02276(c-Myc)、NM一004235(Klf4)。本發(fā)明還提供了一種融合蛋白，所述的融合蛋白含有胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子和TAT。將胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入體細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明還提供了將胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入體細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟(1)將TAT與胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子融合，獲得融合蛋白；(2)將(l)的融合蛋白與體細(xì)胞共孵育，從而胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子被導(dǎo)入體細(xì)胞內(nèi)。優(yōu)選的，所述的胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子是Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4。盡管以往有利用TAT來(lái)攜帶某些蛋白進(jìn)入細(xì)胞的先例，然而TAT并非適合于攜帶所有種類(lèi)的蛋白進(jìn)入到細(xì)胞，適合的蛋白受到蛋白長(zhǎng)度、性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)等因素的限制。并且，針對(duì)同一細(xì)胞，TAT是否可同時(shí)將幾種蛋白攜帶入細(xì)胞內(nèi)且保留蛋白的功能或活性也是不可知的。而本發(fā)明人特別意外地發(fā)現(xiàn)，所述的TAT分別與Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4融合后，構(gòu)成4種融合蛋白，所述4種融合蛋白與體細(xì)胞共孵育后，可同時(shí)被轉(zhuǎn)入到細(xì)胞內(nèi)，從而使得細(xì)胞內(nèi)同時(shí)存在該4種融合蛋白。并且，Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4在同時(shí)被導(dǎo)入到細(xì)胞后，仍然保留有作為轉(zhuǎn)錄因子的蛋白活性。獲得融合蛋白的方法包括(a)提供一構(gòu)建物，所述的構(gòu)建物中含有一基因表達(dá)盒，所述基因表達(dá)盒含有以下操作性相連的元件細(xì)胞穿透肽編碼基因與胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子編碼基因；(b)將(a)的構(gòu)建物導(dǎo)入細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，從而表達(dá)和純化獲得所述融合蛋白。所述的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)沒(méi)有特別的限制，可以是原核表達(dá)系統(tǒng)或真核表達(dá)系統(tǒng)。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是原核表達(dá)系統(tǒng)，例如釆用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，釆用尿素變性方法對(duì)表達(dá)獲得的融合蛋白包涵體進(jìn)行變性，釆用Ni-NTA親和層析純化。通常，尿素被溶解于緩沖液中制備成變性液，緩沖液的配制是本領(lǐng)域人員熟知的。較佳的，尿素的濃度是8土2mol/L;更佳的是8土lmol/L。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在進(jìn)行尿素變性前，用1土0.3(較佳的l士0.2;更佳的l士0.1)mol/L的尿素(含尿素的緩沖液)洗滌包涵體。在變性前洗滌包涵體可有效地去除雜蛋白，然而需要選擇適合的洗滌液才能達(dá)到較好的雜蛋白去除效果。本發(fā)明人采用了多種濃度的尿素洗滌包涵體并比較雜蛋白的去除效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用含有l(wèi)士0.3mol/L尿素的緩沖液洗滌可洗出最多的雜蛋白，效果最優(yōu)異。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在蛋白與親和層析柱上的Ni離子結(jié)合后(即被吸附于親和層析柱后)，采用250士50mmol/L咪唑(含咪唑的緩沖液)洗脫所述融合蛋白。本發(fā)明采用了含有多種濃度咪唑的緩沖液洗過(guò)所述融合蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約250mmol/L咪唑洗脫效果最為理想，其使得4種重組蛋白均可獲得特異性的純化效果。本發(fā)明還提供了采用所述將胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入體細(xì)胞的方法獲得的細(xì)胞，所述的細(xì)胞表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)記分子。更特別的，所述的胚胎干細(xì)胞標(biāo)記分子是Oct4、Nanog和Fgf4。本發(fā)明還提供了一種誘導(dǎo)體細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記分子的方法，所述的方法包括以下步驟(1)將細(xì)胞穿透肽(cell-penetratingpeptide,CPP)與胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子融合，獲得融合蛋白；(2)將(l)的融合蛋白與體細(xì)胞共孵育，從而融合蛋白進(jìn)入體細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)體細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記分子。在本發(fā)明的實(shí)施例中，為檢測(cè)所誘導(dǎo)的人成纖維細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)情況，本發(fā)明人利用RT-PCR分析了誘導(dǎo)后干細(xì)胞標(biāo)記分子oct4、nanog和fgf4的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)三種標(biāo)記的均有表達(dá)且特征相同。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于采用本發(fā)明的方法，在不向宿主細(xì)胞內(nèi)引入外源基因、不改變受體細(xì)胞的基因組的情況下將外源蛋白導(dǎo)入細(xì)胞，從而更安全，更具有可控性。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。I.試驗(yàn)材料1.1菌種、細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人ES細(xì)胞獲自上海第二醫(yī)科大學(xué)健康科學(xué)研究所。1.2質(zhì)粒載體及引物質(zhì)粒pEGFP-Nl，pcDNA3購(gòu)自Invitrogen公司，PCR引物合成及測(cè)序由上海英駿生物公司完成。質(zhì)粒pET28bTATvl(下稱(chēng)pET)獲自HowardHughesMedicalInstitute。1.3主要試劑材料各種限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自NEB公司，LB培養(yǎng)基及其瓊脂購(gòu)自Clontech公司，DMEM，DMEM/F12,L-Glu，F(xiàn)BS，胰酶，血清替代物購(gòu)自Gibco公司，非必需氨基酸，bFGF，DMSO，青霉素，鏈霉素購(gòu)自SIGMA公司，Taq酶購(gòu)自Takara公司，其它普通化學(xué)試劑購(gòu)自上海生工公司或invitrogen公司，各類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)板(瓶)是Nunc和Costar公司的產(chǎn)品，各類(lèi)因子抗體購(gòu)自chemicon公司，其余辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自鼎國(guó)生物工程有限公司。1.4主要試劑的配制LB培養(yǎng)基組分體積蛋白胨1%(w/v)11酵母抽提物0.5%(w/v)NaCl1%TE緩沖液(pH8.0^_Tris-Cl(pH8.0)10mmol/1EDTA(pH8.0)1mmol/11XTAE:_Tris-乙酸0.04mol/1EDTA1mmol/11XTBE:_Tris堿89mmol/l硼酸89mmol/lEDTA(pH8.0)1mmol/1質(zhì)粒抽提溶液I:_Tris-Cl(pH8.0)25mmol/1葡萄糖50mmol/1EDTA(pH8.0)10mmol/1質(zhì)粒抽提溶液II:_NaOH0.2mol/1SDS_1%(w/v)質(zhì)粒抽提溶液III:_組分5mol/1乙酸鉀冰乙酸ddH20體積60ml11.5ml28.5mlSOB培養(yǎng)液:Bacto蛋白胨2%Bacto酵母抽提物0.5%NaCllOmmol/1KC12.5mmol/lMgS0410mmol/1MgCl210mmol/1退火緩沖液Tris-cl10mmol/1EDTA1mmol/1NaCl50mmol/1Ni柱再生緩沖液鹽酸胍0.6mol/l冰醋酸0.2mol/lTris-甘氨酸電泳緩沖液Tris25mmol/l甘氨酸(電泳級(jí))(pH8.3)250mmol/1SDS0.1%SDS-PAGE染色液甲醇450ml水450ml冰乙酸100ml考馬斯亮藍(lán)R2502.5g用whatmanl號(hào)濾紙過(guò)濾染液以除去顆粒狀物質(zhì)SDS-PAGE脫色液:甲醇450ml水450ml冰乙酸100mlTBS:_NaCl8g1MTrisHCl(pH7.6)20ml溶于1000ml水中，調(diào)整pH到7.62XSDS上樣緩沖液:Tris-HCl，pH6.8125mmol/lSDS4%2-ME5%DTT150mmol/l甘油20%溴酚藍(lán)0.01%Western-blot轉(zhuǎn)膜液:甘油39mmol/1Tris48mmol/1SDS0,037%甲醇20%TBST:_Tween-200.1%用TBS溶解封閉液_脫脂奶粉5%用TBST溶解人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)培液:組份終濃度D-MEM81%FBS15%P-Nal00mMlmmol/1N-AA0.lmmol/1S-P50IU/mlP、50昭/mlSGlu2mmol/l胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液:組份終濃度D-MEM/F1277%Serumreplacetment20%P-巰基乙醇0.lmmol/1N-AA0.lmmol/1S-P50IU/mlP、50pg/mlSGlu2mmol/lbFGF5ng/mlPBS緩沖液:KC10.2g/1KH2P040.24g/1NaCl8.0g/1Na2HP041.44g/1II.實(shí)施例實(shí)施例l.融合蛋白的克隆與表達(dá)載體構(gòu)建用Trizol試劑分別提取人ES細(xì)胞的總RNA，主要包括氯仿抽提，異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌，使沉淀完全溶于20ulRNaseFreeddH20水中。經(jīng)OD26q/OD28o的比僮(UV754)和電泳檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)RNA的純度和質(zhì)量，并計(jì)算RNA含量(RNAug/m卜OD26oX40X稀釋倍數(shù))，樣品置于-70。C保存。RNA質(zhì)量分析見(jiàn)圖1。cDNA合成期間，反應(yīng)體系中含3ug總RNA，4u1MgCl2(25mmol/l)，2u110XRNAPCR緩沖液，2u1dNTPMixture,0.5u1RNA酶抑制劑(40U/u1)，1y1AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(5U/y1)，1lU隨機(jī)引物(OligodT)，以RNaseFreeddH20補(bǔ)至總體積為20ul，混勻，合成條件為50°C45min，99°C5min，然后終止反應(yīng)。取2ul逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，其余-20'C保存。表1各因子PCR引物及雙哲<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>PCR擴(kuò)增過(guò)程為各取2ulcDNA模板，加入2iMMgCl2(25mmol/l)，2.5ii110XRNAPCR緩沖液，0.25n1TaKaRaTaq聚合酶，上下游引物各lul，以ddH20補(bǔ)至總體積25U1?；靹螂x心后進(jìn)行PCR反應(yīng)。擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)條件為94X:預(yù)變性5min;然后94'C變性30sec,退火30see,72'C延伸lmin，共進(jìn)行30循環(huán)；最后72'C延伸5min(引物序列和退火溫度見(jiàn)表1)。PCR結(jié)果表明，獲得了相應(yīng)的與預(yù)期大小相符的目的片段，見(jiàn)圖2。根據(jù)產(chǎn)物Qiagen公司回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收。各因子回收產(chǎn)物經(jīng)雙酶切(酶切位點(diǎn)見(jiàn)表l)后，定向克隆入經(jīng)過(guò)同樣酶切的pET28bTATvl載體中，構(gòu)成pET重組質(zhì)粒(連接入Sox2、Oct4、C-myc、Klf4基因的重組載體分別稱(chēng)為pETs、pETo、pETc和pETk)。送測(cè)序鑒定，結(jié)果表明其中的人Qct4、Sox2、C-myc和Klf4基因序列與GenBank中相應(yīng)的序列一致。實(shí)施例2.蛋白原核表達(dá)將實(shí)施例1中獲得的pET重組質(zhì)粒pETs、pETo、pETc和pETk分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，形成重組蛋白表達(dá)菌。挑取含有目的質(zhì)粒的菌落接種于4ml含有50mg/mlkana的LB培養(yǎng)基中，37°C，250rpm搖菌。當(dāng)菌液濃度為OD600=0.6-0.8，加入IPTG，使其終濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L，37°C，250rpm搖菌3、4或5h。取lml菌液離心，10000rpm，lmin，收集菌體后加入O.lml預(yù)冷PBS重懸，保存以備檢測(cè)。最終確定這四種蛋白的表達(dá)條件均為IPTG終濃度為0.8mmol/L、37。C誘導(dǎo)4h。樣品蛋白的SDS-PAGE分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。挑取含有目的質(zhì)粒的菌落接種于20ml含有50mg/mlkana的LB培養(yǎng)基中，37°C，250rpm搖菌過(guò)夜。按照1:100接種過(guò)夜的含有目的質(zhì)粒的菌液于含有50mg/mlkana的LB培養(yǎng)基，37°C，250rpm，3h。加入IPTG，使其終濃度為0.8mmol/l，37°C，250rpm搖菌3h，3000g，10min離心，收獲菌體。用100ml預(yù)冷PBS重懸菌體，3000g，10min離心，收獲菌體，如此重復(fù)3遍，菌體可儲(chǔ)存于-8(TC備用。實(shí)施例3.蛋白的純化1、蛋白樣品前期處理方法摸索(1)每克細(xì)菌濕重加入3ml的裂解液。細(xì)菌裂解后，沉淀重新用原體積的裂解緩沖液懸起。(2)分4管，取200ul，12,000g，4。C離心10min，收集沉淀，分別用裂解緩沖液含有l(wèi)、2、3和4mo1/1的尿素和0.5%TritonX-IOO，室溫混勻1Omin。(3)同上離心，收集沉淀，并重懸于200tUH20中。上清保留，并進(jìn)行SDS-PAGE分析。(4)加入等體積的2XSDS-PAGE緩沖液。沸水煮5min后，進(jìn)行SDS-PAGE分析，見(jiàn)圖4。2、Ni-NTA親和層析純化目的蛋白洗脫條件摸索(1)將含有目的蛋白的菌體用預(yù)冷的裂解液2-5ml/g重懸，渦旋震蕩；(2)加入溶菌酶lmg/ml，冰上放置30min;(3)將裂解的菌體放置在冰上，超聲，強(qiáng)度60W，間隔2s，超聲30min;(4)10000g，30min，離心，取上清，置于冰上備用；(5)用裂解緩沖液平衡柱子，0.5ml/min，使其光吸收平穩(wěn)于基線(xiàn)處；(6)取3)中的上清用0.45nm的過(guò)濾器過(guò)濾后上樣，上樣速度0.5ml/min;(7)上樣結(jié)束后，用裂解液洗柱子，去除未結(jié)合于介質(zhì)以及結(jié)合力較弱的雜蛋白，直至紫外吸收值平穩(wěn)，不再下降；(8)同時(shí)用裂解液和緩沖液A洗柱子，從0-100。/。A梯度洗脫，0.5ml/min，洗脫總體積為50ml，收集所需洗脫液；(9)100%A緩沖液繼續(xù)洗脫直至紫外吸收值降到100mAU，合并大于250mAU的所有收集的洗脫液，其中即含有目的蛋白；(10)用無(wú)菌去離子水沖洗5柱體積后用20%乙醇封柱，保存于4。C;(11)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western-blotting檢測(cè)各峰中的蛋白組分。裂解液_Na3P04NaCl咪唑尿素pH7_緩沖液A:_Na3P0420mmol/1NaCl0.5mol/1咪唑250mmol/1尿素pH7.5_8mol/13、Ni-NTA目的蛋白變性純化(1)-(7)和上述相同，裂解液中含有8mol/l尿素，然后用梯度洗脫中最適宜的咪唑洗脫濃度來(lái)洗脫目的蛋白，至紫外吸收值降到100mAU，合并大于250mAU的所有收集的洗脫液，其中即含有目的蛋白。其余步驟與上述相同。20mmol/10.5mol/120mmol/18mol/14、Ni柱再生1)用2倍柱體積的再生緩沖液沖洗柱子；2)5倍柱體積水沖洗柱子；3)3倍柱體積2。/。SDS沖洗柱子；4)1倍柱體積25%乙醇沖洗柱子；5)1倍柱體積50%乙醇沖洗柱子；6)1倍柱體積75%乙醇沖洗柱子；7)1倍柱體積100%乙醇沖洗柱子；8)1倍柱體積75%乙醇沖洗柱子；9)1倍柱體積50%乙醇沖洗柱子；10)1倍柱體積25%乙醇沖洗柱子；11)1倍柱體積水沖洗柱子；12)5倍柱體積0.1mo1/1EDTA(PKN8.0)沖洗柱子；13)水沖洗柱子；14)2倍柱體積0.1mol/lNiS04沖洗柱子；15)2倍柱體積水沖洗柱子；16)2倍柱體積再生緩沖液沖洗柱子；17)2倍柱體積適宜緩沖液沖洗柱子，后用于純化。5、鹽沉法粗純蛋白1)用等體積的PBS稀釋菌體裂解后的可溶蛋白；2)緩慢加入飽和硫酸銨溶液，硫酸銨的最終飽和度分別為10%，15%，20%，25%，30%，40%，50%,60%和70%，混勻30min;3)放入4。C冰箱沉淀過(guò)夜；4)4°C，10000rpm離心30min;5)吸除上清，將沉淀溶于最少量的PBS，分別檢測(cè)上清與沉淀樣品。6、離子交換法純化l)用平衡液將離子交換柱平衡5柱體積，使其光吸收平穩(wěn)于基線(xiàn)處2)以lmL/min流速將樣品泵入交換柱，以相同流速用平衡液沖洗柱子，去除未結(jié)合于介質(zhì)以及結(jié)合力較弱的雜蛋白，約3柱體積后吸光度可平穩(wěn)于基線(xiàn)3)在平衡液中加入洗脫液形成鹽濃度梯度用于洗脫結(jié)合于介質(zhì)的蛋白，條件流速lmL/min，鹽濃度范圍0.4lmol/lNaCl，200min達(dá)到最大鹽濃度。收集所有洗脫峰4)4mo1/1NaCl清洗層析柱5)柱的還原與保養(yǎng)待高鹽溶液之后，用0.5mol/LNaOH清洗柱子，使介質(zhì)上結(jié)合較緊的蛋白被變性洗出，并防止微生物留于柱內(nèi)進(jìn)行繁殖。6)用無(wú)菌去離子水沖洗5柱體積后用20%乙醇封柱，保存于4°C7)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western-blotting檢測(cè)各峰中的蛋白組分平衡液_磷酸鹽緩沖液(PB)20mmol/1NaCl0.1mol/l磷酸鹽緩沖液配制時(shí)，常先配制0.2mol/L的NaH2POj[l0.2mol/L的Na2HP04，兩者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液，根據(jù)需要可配制不同濃度的PB。0.2mol/L的NaH2P04;稱(chēng)取NaH2P04.2H2031.2g加重蒸水至1000ml溶解；0.2mol/L的Na2HP04;稱(chēng)取Na2HP04'7H2053.65g加重蒸水至1000ml溶解。_0.2mol/l磷酸鹽緩沖液pH0.2mol/lNaH2PO4(ml)0.2mol/lNa2HP04(ml)6.087.712.37.039.061.08,05.394.77、純化蛋白Western-blot鑒定(1)SDS-PAGE電泳；(2)轉(zhuǎn)膜由下往上依次排放3層Waterman3mm濾紙(先用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡，大小8.2cmX5.2cm)—硝酸纖維素膜(先用去離子水浸泡)一膠一3層Waterman3mm濾紙(先用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡)，12V(<15V)、100mA、45min條件下轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后用麗春紅染色，看轉(zhuǎn)膜情況。將膜用TBST清洗兩遍，每次5min;(3)清洗過(guò)后的膜再用封閉液4。C過(guò)夜。取出膜用TBST沖洗三遍，每次5min;(4)一抗反應(yīng)1.5pl—抗+5ml封閉液，溫育lh，取出膜用TBST沖洗5min，重復(fù)2遍。二抗反應(yīng)1.5nl二抗+5ml封閉液，溫育lh，取出膜用TBST沖洗5min，重復(fù)2遍'，(5)DAB(3，3-二氨基聯(lián)苯胺，diaminobenzidine)—片(5mg)溶于10ml去離子水中，再加10pl30%H2O2，用于顯色。觀察四種蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)重組蛋白有很明顯的特異表達(dá)，雖然絕大多數(shù)在包涵體中，但仍有部分以可溶形式存在，為了更好的保證目的蛋白純化后的體外活性，決定首先對(duì)可溶性蛋白進(jìn)行純化。依據(jù)pET載體中含有一段his序列，所以本發(fā)明人選擇了Ni-NTA親和層析純化。首先，本發(fā)明人首先用濃度為250mmo1/1咪唑洗脫液進(jìn)行洗脫，但是電泳分析表明沒(méi)有起到目的蛋白的富集作用，洗脫峰里雜蛋白很多，沒(méi)有純化的效果。因此本發(fā)明人選用咪唑梯度洗脫進(jìn)行純化，試圖找出目的蛋白合適的咪唑濃度進(jìn)行洗脫，但是無(wú)論調(diào)整結(jié)合緩沖液中的咪唑濃度至5mmol/L、10mmol/L禾卩15mmol/L，還是調(diào)整其pH至8.0和7.5的條件下，均不能使重組蛋白成功結(jié)合到介質(zhì)上。隨后調(diào)整菌體裂解條件，如添加溶菌酶(lmg/ml)、DNase(5ug/ml)和RNase(10ug/ml)等方法以提高菌體裂解效率或降低裂解液粘稠度等，也未能解決這一問(wèn)題。隨后本發(fā)明人對(duì)四種蛋白利用鹽沉淀方法進(jìn)行蛋白粗純，雖然Sox2蛋白在硫酸銨濃度為10%有較好的純化效果，但在10%-70%的硫酸銨濃度范圍內(nèi)，Klf4和C-myc完全沒(méi)有粗純效果。從蛋白的等電點(diǎn)入手，兩個(gè)等電點(diǎn)偏堿性蛋白Sox2和Klf4，其等電點(diǎn)分別為9.74和8.76，利用SP陽(yáng)離子交換層析用來(lái)純化這兩種蛋白，但發(fā)現(xiàn)緩沖液pH在5.0、6.0、7.0和8.0的等各種結(jié)合條件下，重組蛋白均大量從流穿液中穿出，不能特異與介質(zhì)相結(jié)合。鑒于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，無(wú)論本發(fā)明人怎么改變實(shí)驗(yàn)條件，始終無(wú)法從可溶狀態(tài)純化出目的蛋白，因此最終選擇以尿素變性方法進(jìn)行目的蛋白的純化，發(fā)現(xiàn)在變性條件下，重組蛋白能夠很好的與Ni離子結(jié)合。首先，對(duì)包涵體進(jìn)行前期處理，用含l、2、3和4mol/L尿素的裂解緩沖液洗滌，除去雜蛋白，最好的洗緩沖液為洗滌上清中含有最多的雜蛋白，很少或無(wú)目的蛋白。電泳結(jié)果，發(fā)現(xiàn)1mol/l尿素洗滌樣品時(shí)上清中的目的蛋白最少，起到了洗除雜蛋白的作用，且效果最好。樣品前期處理之后，利用咪唑濃度線(xiàn)性梯度分別對(duì)四種蛋白的咪唑洗脫濃度進(jìn)行確定，發(fā)現(xiàn)咪唑濃度為250mmo1/1時(shí)，四種重組蛋白(TAT-Oct4、TAT-Sox2、TAT-C-myc和TAT-Klf4)均可獲得特異性的純化效果，結(jié)果見(jiàn)圖5。實(shí)施例4.蛋白的復(fù)性1.在柱復(fù)性1)通過(guò)變性純化方法將含有His標(biāo)簽的重組蛋白吸附在Ni-NTA介質(zhì)上；2)尿素濃度線(xiàn)性遞減的平衡液沖洗，尿素濃度從8mol/l遞減至0mo1/1,流速為0.3ml/min，共10柱體積；3)用緩沖液(20mmol/1Na3P04，0.5mol/lNaCl，250mmol/l咪唑，pH7.5)洗脫，經(jīng)超濾濃縮，緩沖液替換為(20mmol/1Na3P04，0.5mol/lNaCl，10%甘油，pH7.5)，-2(TC保存。2.透析復(fù)性1)4。C下變性純化的重組蛋白蛋白依次經(jīng)含4mo1/1、2mo1/1、lmo1/1、0mo1/1尿素的50倍體積透析緩沖液透析，時(shí)間間隔為3h。2)用不含尿素的透析液中過(guò)夜透析，次日收集蛋白，-201:保存。透析緩沖液TrisHC1(pH7.9)50mmol/1KC10.1mol/1MgCl212.5mmol/1EDTA1mmol/1甘油10%DTT1mmol/1PMSF0.1mmol/13.目的蛋白濃縮超濾濃縮將目的蛋白放入milliporeMWCO10000的超濾管中3000g離心30min，管內(nèi)約余l(xiāng)-2ml蛋白溶液后，吸出蛋白溶液，-80匸保存；PEG濃縮將目的蛋白放入透析袋中，將其埋入PEG8000中，每過(guò)lh觀察，待袋內(nèi)剩余體積適當(dāng)時(shí)將其中液體吸出，-S(TC保存。4.目的蛋白的定量蛋白濃度測(cè)定參照《DCProteinAssayInstructionManual》。1)取標(biāo)準(zhǔn)濃度的BSA樣品，依次稀釋至5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.313mg/ml。再依次取無(wú)菌去離子水及1X，2X，4X蛋白樣品；2)在以上各溶液中分別加入0.05ml試劑A，再分別加入0.4ml試劑B，立刻混合均勻。室溫靜置15min。測(cè)定以上各溶液在750nm處的吸光度值；3)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)濃度蛋白的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得其線(xiàn)性方程后計(jì)算蛋白溶液稀釋2倍，4倍時(shí)濃度，最終換算成蛋白濃度。根據(jù)DC蛋白定量，測(cè)得四種融合蛋白TAT-Oct4、TAT-Sox2、TAT-C-myc和TAT-Klf4的濃縮后的濃度分別為0.5mg/ml，0.4mg/ml，0.4mg/ml和0.8mg/ml。實(shí)施例5.重組蛋白誘導(dǎo)效果分析1、蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)1)復(fù)蘇人成纖維細(xì)胞；2)將重組蛋白(TAT-Oct4、TAT-Sox2、TAT-C-myc和TAT-Klf4)加入細(xì)胞培養(yǎng)基，濃度均為2pmo1/1，在細(xì)胞間超凈工作臺(tái)上，0.22jam的過(guò)濾器過(guò)濾除菌；3)成纖維細(xì)胞長(zhǎng)至50-60%滿(mǎn)，PBS洗3遍后，加入2)所得培養(yǎng)基。37°C，5。/oC02處理3h。3h后去除含有目的蛋白的培養(yǎng)基，用PBS洗三遍，加入人ES的細(xì)胞培養(yǎng)基，37°C，5%0)2培養(yǎng)；4)觀察并收集培養(yǎng)不同天數(shù)的細(xì)胞樣品以備檢測(cè)。2、細(xì)胞檢測(cè)試驗(yàn)A.形態(tài)觀察每天觀察細(xì)胞，并照相記錄；B.基因檢測(cè)將收集不同天數(shù)的細(xì)胞樣品，用Trizol法進(jìn)行RNA提取，lmlTrizol/l()S個(gè)細(xì)胞，方法同前，并將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板進(jìn)行ES細(xì)胞標(biāo)志性因子(Oct4，Nanog，F(xiàn)gf4)的檢測(cè)，檢測(cè)所需引物見(jiàn)表2。C.蛋白檢測(cè)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，每個(gè)樣品為105個(gè)細(xì)胞。離心樣品，10000rpm，3min。50|nl預(yù)冷PBS重懸，加入2XSDS上樣緩沖液，超聲，強(qiáng)度20，間隔2s，超聲lmin，95。C處理10min，取10pl上樣。SDS-PAGE步驟同前。表2引物序列表<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>細(xì)胞實(shí)驗(yàn)本發(fā)明人分別收集了蛋白處理后的細(xì)胞樣品，經(jīng)RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行ES標(biāo)志基因的PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖6。經(jīng)RT-PCR分析，誘導(dǎo)后的人成纖維細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)到干細(xì)胞標(biāo)記分子Oct4、Nanog和Fgf4的表達(dá)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在選取的兩個(gè)時(shí)間樣本里，細(xì)胞在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第2天時(shí)，并沒(méi)有檢測(cè)到標(biāo)志基因的表達(dá)，但是另外一個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)后第6天的細(xì)胞樣本卻已經(jīng)可以檢測(cè)到3種基因的明顯表達(dá)，且3種標(biāo)記的表達(dá)特征相同，此特征和對(duì)照ES細(xì)胞相同，見(jiàn)圖6。同時(shí)，將細(xì)胞進(jìn)行蛋白電泳同樣可以明顯觀察到蛋白表達(dá)也發(fā)生了改變，見(jiàn)圖7。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)當(dāng)20余天時(shí)，細(xì)胞形態(tài)變化明顯，特征有細(xì)胞貼壁性能降低，細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)鎖型轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形，細(xì)胞開(kāi)始聚集成團(tuán)，見(jiàn)圖8。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。序列表<110〉上海轉(zhuǎn)基因研究中心；上海杰隆生物工程股份有限公司<120〉一種利用穿透型干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程的方法<130〉083018<160>16<170〉Patentlnversion3.3<210>1<211〉33<212>DNA<213>人工序列〈220〉<221>misc—feature<223〉引物<400〉1atggatcccatggcgggacacctggcttcggat33<210〉2<211〉33<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc_feature<223〉引物〈400〉2atgtcgacagggcaggcacctcagtttgaatgc33<210>3<211>33<212〉DNA<213〉人工序列—<220><221〉misc—feature<223〉引物<400〉3atggatccccgcatgtscaaC3tgatggagscg33<210〉4<211〉33<212〉艦<213>人工序列<220〉<221>misc—feature<223〉引物〈400〉4gcaagcttacatgtgtgagaggggcagtgtgcc33<210〉5<211〉31<212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<221〉misc一feature<223〉引物<400〉5ggatccgacgctggatttttttcgggtagtg31<210〉6〈211〉31<212>脆<213〉人工序列<220〉<221〉misc一feature〈223〉引物<400〉6aagctttccttacgcacaagagttccgtagc31<210〉7〈211〉33<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400〉7atggatcccatggctgtcagcgacgcgctgetc33<210〉8<211〉33<212>隨<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400〉8acaagcttgtgtgggtcatatccactgtctggg33<210〉9<211〉24<212〉DNA<213〉人工序列<220><221〉misc一feature<223〉引物<400〉9gacagggggaggggaggagctagg24<210>10<211〉26〈212〉鵬<213>人工序列<220>〈221>misc一feature<223>引物〈400>10cttccctccaaccagttgccccaaac26<210〉11<211〉25<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400〉11cagccccgattcttccaccagtccc25<210〉12<211〉25<212>DNA<213>人工序列<220〉<221>misc—feature<223>引物<400〉12cggaagattcccagtcgggttcacc25<210>13<211〉23〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<221〉misc—feature<223>引物<400〉13ctacaacgcctacgagtcctaca23<210>14<211〉24<212〉隨<213〉人工序列<220><221〉misc—feature〈223〉引物〈400〉14gttgcaccagaaaagtcagagttg24<210〉15<211〉24<212〉DNA<213>人免疫缺陷病毒〈400〉15agga卿agcggagacagcgacga24<210〉16〈211〉8<212〉PRT<213〉人免疫缺陷病毒〈400〉16ArgLysLysArgArgGinArgArg1權(quán)利要求1.一種將胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入體細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(1)將細(xì)胞穿透肽與胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子融合，獲得融合蛋白；(2)將(1)的融合蛋白與體細(xì)胞共孵育，從而胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子被導(dǎo)入體細(xì)胞內(nèi)。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)錄因子選自O(shè)ct4、Sox2、c-Myc、n-Myc、Klf4、Nanog或Lin28。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子是Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4。4.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞穿透肽是反式激活蛋白。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的反式激活蛋白的羧基端與胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子的氨基端融合。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述獲得融合蛋白的方法包括(a)提供一構(gòu)建物，所述的構(gòu)建物中含有一基因表達(dá)盒，所述基因表達(dá)盒含有以下操作性相連的元件細(xì)胞穿透肽編碼基因與胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子編碼基因；(b)將(a)的構(gòu)建物導(dǎo)入細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，從而表達(dá)和純化獲得所述融合蛋白。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，采用原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)所述的融合蛋白，采用0.8土0.2mmol/L異丙基e-D硫代半乳糖苷，32土2。C誘導(dǎo)4±2小時(shí)。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，采用尿素變性方法對(duì)表達(dá)獲得的融合蛋白包涵體進(jìn)行變性，采用Ni-NTA親和層析純化；并且.-在進(jìn)行尿素變性前，用l土0.3mol/L的尿素洗滌包涵體；或采用250士50mmol/L咪唑洗脫所述融合蛋白。9.一種利用權(quán)利要求1所述的方法獲得的細(xì)胞。10.—種誘導(dǎo)體細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記分子的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟(1)將細(xì)胞穿透肽與胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子融合，獲得融合蛋白；(2)將(l)的融合蛋白與體細(xì)胞共孵育，從而融合蛋白進(jìn)入體細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)體細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記分子。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種將胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入體細(xì)胞的方法，包括將細(xì)胞穿透肽與胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子融合，獲得融合蛋白；將所述融合蛋白與體細(xì)胞共孵育，從而胚胎干細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子被導(dǎo)入體細(xì)胞內(nèi)。本發(fā)明還公開(kāi)了所述方法獲得的細(xì)胞。文檔編號(hào)C12N5/08GK101591640SQ200810038360公開(kāi)日2009年12月2日申請(qǐng)日期2008年5月30日優(yōu)先權(quán)日2008年5月30日發(fā)明者劉思國(guó),琦張,成國(guó)祥,陳建泉申請(qǐng)人:上海轉(zhuǎn)基因研究中心;上海杰隆生物工程股份有限公司