專(zhuān)利名稱(chēng)：對(duì)萼獼猴桃葉提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及以對(duì)萼獼猴桃葉為原料制備的一 種提取物及提取方法，以及將該提取物用于制備抗腫瘤的藥物及食品。
背景技術(shù)：
目前，包括肝癌在內(nèi)的惡性腫瘤作為常見(jiàn)病、多發(fā)病，嚴(yán)重危害人類(lèi)
的健康。世界衛(wèi)生組織(WHO)和美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(ASC0)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表 明，1990年全世界腫瘤所致死亡數(shù)占總死亡數(shù)的12.3%,預(yù)計(jì)2015年將 達(dá)到14.6%。據(jù)美國(guó)國(guó)立癌癥研究院(National Cancer Institute)數(shù)據(jù) 1998 2002年惡性腫瘤發(fā)病率為469. 7/10萬(wàn)，家庭、國(guó)家及社會(huì)為此付 出的代價(jià)沉重。在惡性腫瘤的多種治療方法中，化療在臨床上發(fā)揮著重要 的作用。目前，從中藥、天然藥物中開(kāi)發(fā)抗腫瘤藥物已經(jīng)成為抗腫瘤新藥 研發(fā)的重要方向。
對(duì)萼獼猴桃(J"/wW^ra/ratoDunn)為獼猴桃科獼猴桃屬植物，又名 鑷合獼猴桃，主要分布于浙江、江西、江蘇等華東地區(qū)，其根入藥即為貓 人參，臨床用于治療惡性腫瘤，為華東地區(qū)常用抗腫瘤中藥。目前，僅見(jiàn) 很少的關(guān)于貓人參化學(xué)成分、藥理作用的研究報(bào)道[張亞妮，劉嶺,凌昌全. 貓人參有效部位對(duì)小鼠移植性腫瘤H22的抑制作用及機(jī)制探討.中國(guó)中藥 雜志，2006, 36(11): 918-920;陸胤，陳紹瑗，吳平，等.藥用植物貓人參有 效成分研究(1)-無(wú)機(jī)元素分析.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)，2004,30(2): 185-188]， 對(duì)于對(duì)萼獼猴桃葉則無(wú)藥用記載和研究報(bào)道。
目前，在植物來(lái)源的三萜總皂苷提取物制備工藝方面，多采用以下工 藝路線(xiàn)
藥材原料(視需要可進(jìn)行適度粉碎)采用醇提(乙醇或甲醇)，提取 液濃縮至無(wú)醇味并調(diào)節(jié)至所需濃度，此濃縮液經(jīng)離心后，上清液過(guò)脫色樹(shù) 脂吸附除雜脫色(常選用HP-20、 DlOl、 AB-8、 MCI-GEL等型號(hào))，以醇溶 液(乙醇或甲醇)梯度洗脫，洗脫液分段合并，濃縮回收，即可達(dá)到脫色
4除雜、富集皂苷類(lèi)成分的目的[雷建飛，賈莉萍.大孔吸附樹(shù)脂分離純化皂
苷工藝研究進(jìn)展.中國(guó)現(xiàn)代中藥，2006， 8 (11): 22-24]。當(dāng)然由于具體 原料的差異，在每個(gè)工藝步驟，需要經(jīng)過(guò)優(yōu)選確定最佳工藝條件?？傮w而
言，此類(lèi)工藝路線(xiàn)存在以下局限性①工藝步驟繁瑣，操作不便，重復(fù)性 差；②乙醇、甲醇等有機(jī)溶劑消耗量大，成本較高；③對(duì)于含有葉綠素
等色素較多的原材料，脫色效果不夠理想。

發(fā)明內(nèi)容
本申請(qǐng)人在抗腫瘤中藥、天然藥物篩選過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)對(duì)萼獼猴桃葉的 提取物具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，進(jìn)一步研究表明此提取物富含科羅索酸、 山楂酸、熊果酸等三萜皂苷類(lèi)成分，具有用于制備抗腫瘤藥物及食品的廣 闊前景。
另外，在本發(fā)明過(guò)程中，申請(qǐng)人曾嘗試采用背景技術(shù)中的樹(shù)脂除雜脫 色工藝路線(xiàn)制備對(duì)萼獼猴桃葉的提取物，結(jié)果表明不僅工藝步驟繁瑣，而 且脫色效果也不理想。對(duì)于本發(fā)明提取物制備而言，良好的除雜脫色方法， 對(duì)于去除雜質(zhì)、富集有效成分、提高產(chǎn)品成色、品質(zhì)至關(guān)重要。
本發(fā)明的目的在于提供一種以對(duì)萼獼猴桃葉為原料制備的提取物，及 其提取方法，以及將該提取物在制備抗腫瘤藥物及食品中的應(yīng)用。
一種對(duì)萼獼猴桃葉提取物的制備方法，包括如下步驟
(A)制備提取液
將對(duì)萼獼猴桃葉藥材粗粉以水或各種濃度的乙醇或甲醇水溶液作為 提取溶劑提取，合并，過(guò)濾，即得提取液。
本步驟制備提取液所用的溶劑可以為水或各種濃度的乙醇或甲醇水
溶液，優(yōu)選50%-95%乙醇或甲醇水溶液，更優(yōu)選70% 95%乙醇或甲醇水溶 液，最優(yōu)選80%乙醇或甲醇水溶液。當(dāng)然，考慮到可能的有機(jī)溶劑殘留、 生產(chǎn)中的安全因素以及生產(chǎn)成本因素，乙醇水溶液更為常用。
提取方式可以選擇常規(guī)熱回流提取、滲漉提取或浸泡提取，以及其他 藥學(xué)上可接受的提取方式。如熱回流提取可以選擇12倍、10倍、10倍， 1.5小時(shí)、l小時(shí)、l小時(shí)，也可選擇其他可接受的提取溶劑用量、提取次 數(shù)、提取時(shí)間。滲漉提取、浸泡提取可以選擇5-100倍溶劑，選用過(guò)多或過(guò)少的溶劑，盡管也可部分或全部實(shí)現(xiàn)本專(zhuān)利所述的提取物，但并不能對(duì) 本發(fā)明構(gòu)成實(shí)質(zhì)性改變。
(B) 濃縮
將上述提取液減壓回收至無(wú)醇味，即得濃縮液。濃縮方式可以采用
40-iocrc減壓濃縮、烘干濃縮以及其他藥學(xué)上可接受的濃縮方式。當(dāng)然顧
忌過(guò)高的溫度可能對(duì)提取物中化學(xué)成分穩(wěn)定性造成影響，選用50-75'C溫 度濃縮更為可行。
(C) 沉淀
將上述濃縮液放冷，析出沉淀，分取沉淀。沉淀方式可以采用過(guò)濾、 離心及其他可接受的沉淀、分取方法。譬如可采用5000rpm， 1-30分鐘， 離心，將上清液傾出，即可獲取沉淀。
(D) 除雜、脫色
將上述沉淀以適當(dāng)溶劑溶解，加入脫色劑除雜脫色。 本步驟所用的溶劑可以選擇乙醇、甲醇、丙酮等，亦可乙醇、甲醇、 丙酮等的水溶液。若選擇乙醇、甲醇、丙酮等溶劑溶解，優(yōu)選乙醇。若選 擇乙醇、甲醇、丙酮等水溶液，可選擇40-99%濃度，優(yōu)選60-95%濃度， 最優(yōu)選為80%濃度。
本步驟所用的脫色劑可選用活性碳、活性白土或者兩者的組合物。若 選用活性碳用量為原藥材重量的10%-100%，優(yōu)選25%-75%，最優(yōu)選30%。 若選用活性白土用量為原藥材重量的100%-1000%，優(yōu)選300%-800%,最優(yōu) 選600%。若選用活性碳與活性白土組合物，配比為活性碳活性白土=1: 100 100: 1的混合物，用量為原藥材重量的100% 1000%;優(yōu)選配比為h 25 25: 1，用量為為原藥材重量的100%-500%;最優(yōu)選配比為1: 10，用 量為原藥材重量的200%。
(E) 干燥、粉碎
將上述沉淀干燥、粉碎，即得提取物。
干燥方式可以采用50-IO(TC常壓烘干、真空干燥及其他可接受的干燥 方式。粉碎方式可以采用球磨機(jī)、沖擊式粉碎機(jī)、流能磨粉碎以及其他可 接受的粉碎方式。如將噴霧干燥、冷凍干燥技術(shù)用于本步驟，可同時(shí)實(shí)現(xiàn) 烘干、粉碎，應(yīng)用更為方便。本發(fā)明還提供了以上述制備方法制得的對(duì)萼獼猴桃葉提取物，經(jīng)采用 系統(tǒng)化學(xué)成分分離、鑒定，表明其主要含有科羅索酸、熊果酸、山楂酸等 三萜類(lèi)化學(xué)成分。由于本發(fā)明原料采用對(duì)萼獼猴桃葉作為原料，自然更替 快，價(jià)廉，易得，有利于生態(tài)環(huán)境保護(hù)，具有顯而易見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明的 對(duì)萼獼猴桃葉提取物經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)證明具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，因而可用于 制備抗腫瘤的藥物及食品。
本發(fā)明提取物的制備方法具有工藝簡(jiǎn)便，成本低廉，安全有效，無(wú)有 機(jī)溶劑殘留等顯著優(yōu)點(diǎn)，完全可以作為標(biāo)準(zhǔn)提取物的制備工藝。鑒于在現(xiàn) 代社會(huì)中，惡性腫瘤發(fā)病率的急劇上升，缺乏理想、有效的治療藥物，因 而此提取物具有廣闊的應(yīng)用前景，蘊(yùn)藏著巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。


圖l:本發(fā)明提取物的體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明的實(shí)施 并不僅限于此。
實(shí)施例l制備對(duì)萼獼猴桃葉提取物
對(duì)萼獼猴桃葉藥材粗粉lkg，以80%乙醇，12倍、10倍、10倍，1.5小 時(shí)、l小時(shí)、l小時(shí)，回流提取，提取液趁熱過(guò)濾，合并提取液，減壓回收 溶劑至無(wú)醇味，蒸餾水調(diào)節(jié)濃度為lg (生藥)/ml， 5000rpm，離心15分鐘， 分取沉淀，以適量無(wú)水乙醇溶解，補(bǔ)加至10000ml。加入混合脫色劑(活 性炭活性白土=1: 10) 2000g除雜脫色，脫色后溶液呈極淡黃綠色(+)， 將其減壓濃縮，6(TC真空干燥，粉碎，得提取物23，20g，產(chǎn)品外觀淡黃色 (+ )。采用UV法進(jìn)行總皂苷含量測(cè)定，提取物總皂苷含量以熊果酸計(jì) 74.28%
實(shí)施例2制備對(duì)萼獼猴桃葉提取物
對(duì)萼獼猴桃葉藥材粗粉lkg，以95%乙醇作為提取溶劑，其余同實(shí)施例 1，得提取物18.64g，脫色后溶液呈極淡黃綠色(+ )，產(chǎn)品外觀淡黃色(+)， 總皂苷含量以熊果酸計(jì)70.32%。 實(shí)施例3制備對(duì)萼獼猴桃葉提取物對(duì)萼獼猴桃葉藥材粗粉lkg，以50倍80%乙醇作為提取溶劑滲漉提取， 其余同實(shí)施例l，脫色后溶液呈極淡黃綠色(+)，得提取物21.54g，產(chǎn)品外 觀淡黃色(+ )，總皂苷含量以熊果酸計(jì)72.65%。 實(shí)施例4制備對(duì)萼獼猴桃葉提取物
對(duì)萼獼猴桃葉藥材粗粉lkg，加入活性碳300g脫色，其余同實(shí)施例l， 結(jié)果脫色后溶液呈淡綠色(++)，得提取物27.25g，產(chǎn)品外觀黃棕色(++)， 總皂苷含量以熊果酸計(jì)49.21 % 。 實(shí)施例5制備對(duì)萼獼猴桃葉提取物
對(duì)萼獼猴桃葉藥材粗粉lkg，加入活性碳1000g脫色，其余同實(shí)施例l， 結(jié)果脫色后溶液無(wú)色透明，得提取物7.86g，產(chǎn)品外觀白色，總皂苷含量以 熊果酸計(jì)42.21%。
實(shí)施例6制備對(duì)萼獼猴桃葉提取物
對(duì)萼獼猴桃葉藥材粗粉lkg，以60%乙醇作為提取溶劑，其余同實(shí)施例 1，脫色后溶液呈淡黃綠色(++)，得提取物19.53g，產(chǎn)品外觀淡黃色(++)， 總皂苷含量以熊果酸計(jì)58.52%。 實(shí)施例7制備對(duì)萼獼猴桃葉提取物
對(duì)萼獼猴桃葉藥材粗粉lkg，混合脫色劑用量1000g，其余同實(shí)施例l， 脫色后溶液呈淡黃綠色(++)，得提取物33.23g，產(chǎn)品外觀黃褐色(+++)， 總皂苷含量以熊果酸計(jì)47.87%。 實(shí)施例8制備對(duì)萼獼猴桃葉提取物
對(duì)萼獼猴桃葉藥材粗粉lkg，混合脫色劑用量2000g (活性炭活性白 土=1: 5)，其余同實(shí)施例l，脫色后溶液呈極淡黃綠色(+)，得提取物16.74g， 產(chǎn)品外觀淡黃色(++)，總皂苷含量以熊果酸計(jì)64.85%。 實(shí)施例9制備對(duì)萼獼猴桃葉提取物
對(duì)萼獼猴桃葉藥材粗粉lkg，混合脫色劑用量1000g (活性炭活性白 土=1: 1)，其余同實(shí)施例l，脫色后溶液呈淡黃綠色(++)，得提取物13.73g， 產(chǎn)品外觀淡黃色(++)，總皂苷含量以熊果酸計(jì)48.98%。 實(shí)施例IO制備對(duì)萼獼猴桃葉提取物
對(duì)萼獼猴桃葉藥材粗粉lkg，活性白土用量5000g，其余同實(shí)施例l， 脫色后溶液呈深綠色(++++)，得提取物37.74g，產(chǎn)品外觀黃褐色(++++)，總皂苷含量以熊果酸計(jì)39.46%。 實(shí)施例ll制備對(duì)萼獼猴桃葉提取物
對(duì)萼獼猴桃葉藥材粗粉lkg，混合脫色劑(活性炭活性白土=1: 25)
6000g，脫色后溶液呈淡黃綠色(+)，得提取物17.25g，產(chǎn)品外觀淡黃色(+ )，
總皂苷含量以熊果酸計(jì)52.64%。
實(shí)施例12對(duì)萼獼猴桃葉提取物的藥理實(shí)驗(yàn)
1. 體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)(MTT測(cè)試)
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562、 HL60腫瘤細(xì)胞(由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所 引進(jìn))，用含10^小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基分別配成7xl04、 1.05xl()S個(gè) /ml的細(xì)胞懸液，分別接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種90)il;分別加入含 不同濃度提取物(實(shí)施例1制備)的PBS溶液1(V1，使終濃度分別為50、 100、 200、 300、 400、 500 pg/ml，空白對(duì)照組加10pl RPMI 1640培養(yǎng)基，每組設(shè) 5個(gè)平行孔，37°C， 5%C02培養(yǎng)3d;每孔加5mg/ml MTT生理鹽水溶液10pl， 37。C繼續(xù)培養(yǎng)4h; 96孔板800g離心10min，棄去上清，每孔加DMSO 150|il， 振蕩混勻，在酶標(biāo)儀上以492nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度值。按下式計(jì)算藥物對(duì)腫 瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率
腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(％) 二(l一實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD值)xi00 以濃度對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率作圖得量效關(guān)系曲線(xiàn)(如圖1所示)， 用對(duì)數(shù)機(jī)率單位法，以直線(xiàn)回歸方程計(jì)算腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為50%的藥 物濃度，即為IC50半數(shù)殺傷濃度。提取物對(duì)K562、 HL60腫瘤細(xì)胞株的 ICso分別為217.31pg/ml和207.61pg/ml。表明提取物具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒作 用。
2、 體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)
小鼠肝癌細(xì)胞系H22 (由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所引進(jìn))復(fù)蘇傳代 培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，用生理鹽水調(diào)整至lXl()S個(gè)/ml，以每只0.5ml 接種于小鼠腹腔中， 一周后抽取小鼠腹水，用生理鹽水按照1 :4稀釋成 細(xì)胞懸液，以0.2ml/只接種于小鼠(昆明種小鼠由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 提供)右前肢腋部皮下。在接種24h后，小鼠完全隨機(jī)分配至空白對(duì)照組、 提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組(提取物為實(shí)施例1制備)，每組 10只。采用灌胃給藥方法，連續(xù)給藥14天；采用頸椎脫臼法處死小鼠，
9剝離瘤塊稱(chēng)重，按照以下公式計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率-
腫瘤生長(zhǎng)抑制率(％)=(對(duì)照組平均瘤重一治療組平均瘤重)/對(duì)照組平
均瘤重xioo
結(jié)果表明給予提取物低、中、高劑量均能抑制腫瘤的生長(zhǎng)(表l)，表 明提取物具有較強(qiáng)的抗腫瘤效果。
表l對(duì)萼獼猴桃根、莖對(duì)小鼠移植瘤的抑制作用(n=10) S^j SS 瘤重(g)~"~腫瘤抑制率(％)
空白對(duì)照組等量空白溶劑 1.84±0.20 /
提取物低劑量組 50mg/kg 0.91土0.13" 46.47
提取物中劑量組100mg/kg 0.78±0.11** 54.12
提取物高劑量組 200mg/kg 0.75士0.09" 61.76 ~~注與對(duì)照組比較**P<0.01 。
權(quán)利要求
1、一種對(duì)萼獼猴桃葉提取物的制備方法，包括如下步驟(A)制備提取液將對(duì)萼獼猴桃葉藥材藥材用水或乙醇或甲醇水溶液作為提取溶劑提取，得提取液；(B)濃縮將上述提取液減壓回收至無(wú)醇味，得濃縮液；(C)沉淀將上述提取液濃縮液放冷，分取沉淀；(D)除雜脫色將上述沉淀以溶劑溶解，加入脫色劑除雜脫色；(E)干燥、粉碎將上述脫色后沉淀干燥，粉碎，得提取物。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于(A)步驟中選用的提取 溶劑為50% 95%乙醇或甲醇水溶液。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于(A)步驟中選用的提取 溶劑為70% 95%乙醇或甲醇水溶液。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于(B)步驟中濃縮的方式 是40-10(TC減壓濃縮或烘干濃縮。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于(C)步驟中分取沉淀的 方法為過(guò)濾或離心。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于(C)步驟采用5000rpm， 1-30分鐘，離心，分取沉淀。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于(D)步驟中以溶劑溶解， 所用的溶劑是乙醇、甲醇或丙酮，或乙醇、甲醇、丙酮的水溶液。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于(D)步驟中所用的脫色 劑為活性碳、活性白土或者兩者的組合。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于(D)步驟中所用的脫色劑為活性碳活性白土=1: 100 100: 1的混合物，用量為原藥材重量的100% 1000%。
10、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于(D)步驟中所用的脫色劑為活性碳活性白土=25: 1 1: 25的混合物，用量為原藥材重量的100 500%。
11、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于(D)步驟中所用的脫 色劑為活性碳活性白土=1: IO的混合物，用量為原藥材重量的200%。
12、 一種如權(quán)利要求1至11任一所述的制備方法制得的對(duì)萼獼猴桃葉提 取物。
13、 一種如權(quán)利要求12所述的對(duì)萼獼猴桃葉提取物在制備抗腫瘤藥物及 食品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，對(duì)萼獼猴桃的根入藥即為貓人參，臨床用于治療惡性腫瘤，而對(duì)萼獼猴桃葉則無(wú)藥用記載和研究報(bào)道。本發(fā)明提供了一種對(duì)萼獼猴桃葉提取物的制備方法，該方法包括制備提取液、濃縮、沉淀、除雜脫色、干燥、粉碎步驟。本發(fā)明提取物的制備方法具有工藝簡(jiǎn)便、成本低廉、安全高效、有機(jī)溶劑殘留低等顯著優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明制得的對(duì)萼獼猴桃葉提取物富含科羅索酸、山楂酸、熊果酸等三萜皂苷類(lèi)成分，經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)證明具有較好的抗腫瘤作用，因而可將其用于制備抗腫瘤的藥物及食品。
文檔編號(hào)A23L1/29GK101584718SQ20081003758
公開(kāi)日2009年11月25日 申請(qǐng)日期2008年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月19日
發(fā)明者凌昌全, 吳迎春, 徐燕豐, 朱麗杰, 盛佳鈺, 辛海量, 鄭國(guó)銀 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)