專(zhuān)利名稱(chēng)：香菇香九菌種的分子標(biāo)記、其檢測(cè)方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬香燕菌種的檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及一種香菇香九菌種的分子標(biāo)記、其檢測(cè)方 法與應(yīng)用。
技術(shù)背景我國(guó)香燕產(chǎn)量已從1983年的1.95萬(wàn)噸迅速發(fā)展到2005年的242萬(wàn)噸，占全球香薛總 產(chǎn)量的70%以上，改寫(xiě)了世界食用菌產(chǎn)量的排行榜，并不斷縮小與排行第一的雙孢蘑菇產(chǎn) 量差距，有專(zhuān)家預(yù)測(cè)，由于中國(guó)香菇產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，在近10年內(nèi)其將成為世界產(chǎn)量最 高的食用菌。中國(guó)香菇以其驚人的發(fā)展速度，優(yōu)質(zhì)的品質(zhì)及低廉的成本為世界菇業(yè)人士矚 目，中國(guó)香菇已風(fēng)靡世界。優(yōu)質(zhì)菌種在香菇單產(chǎn)和質(zhì)量中的貢獻(xiàn)率舉足輕重，這決定了香菇菌種在香范產(chǎn)業(yè)中 的重要地位。1999年我國(guó)簽署了《國(guó)際植物新品種保護(hù)法》，這不僅要求我們尊重其它國(guó) 家的品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)，同時(shí)也要加強(qiáng)保護(hù)我們國(guó)家自己的品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)，為了建立食用菌新 品種登記制度來(lái)真正保護(hù)我國(guó)的品種產(chǎn)權(quán)，必須首先建立成熟的品種鑒定技術(shù)，為新品種 登記奠定基礎(chǔ)。尤其日本2004年4月1日開(kāi)始實(shí)行《種苗法修正案》，對(duì)我國(guó)食用菌尤其 是香菇的出口構(gòu)成了極大的威脅。就國(guó)內(nèi)而言，香菇栽培菌種"同種異名，異種同名"的 現(xiàn)象，不僅給菇農(nóng)帶來(lái)了極大的損失，影響了他們的栽培積極性，也極大地影響了中國(guó)香 菇的快速發(fā)展；而且，隨著大規(guī)模的工廠化栽培方式的出現(xiàn)，對(duì)香菇栽培菌株質(zhì)量的要求 越來(lái)越高，需要發(fā)展更為簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的菌株鑒定技術(shù)，以保證每批次的用種都準(zhǔn)確 無(wú)誤。面對(duì)這種局勢(shì)，就需要我們進(jìn)一步加快菌種鑒定技術(shù)的研究，在香菇的研究中引進(jìn)更 為有效的菌種鑒定體系。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種香菇香九菌種的分子標(biāo)記、其檢測(cè)方法與應(yīng)用，通過(guò)采用 PCR技術(shù)，經(jīng)過(guò)篩選試驗(yàn)，獲得了香菇菌株香九的特異DNA片斷，以此片段的DNA序列 為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)特異性PCR擴(kuò)增引物，通過(guò)對(duì)香九菌株的特異片段檢測(cè)從而對(duì)香九菌種進(jìn)行 鑒定和檢測(cè)。本發(fā)明的一種香菇香九菌種的分子標(biāo)記，是基因SCAR的分子特異檢測(cè)標(biāo)記，其PCR 擴(kuò)增的專(zhuān)用弓I物是香九F/R，香九F是5' GGTCCATGTATAGTCTG 3 ，， 香九R是5' GTCCATTGGTTCAAAC 3， ， PCR產(chǎn)物大小為750bp。擴(kuò)增出的SCAR片段的序列如下:本發(fā)明的一種香菇香九菌種的分子標(biāo)記的檢測(cè)方法，包括下列步驟(1) 菌絲培養(yǎng)將4i:保藏的香菇菌種轉(zhuǎn)接到PDA平板上，23。C 25。C避光培養(yǎng)，10 d ~14d后接到 100mLPDY培養(yǎng)基中，100rpm 150rpm， 23。C 25。C搖瓶培養(yǎng)10d 14d后收集菌絲，放入 -20°<:冰箱保凍備用；(2) 基因組DNA的提取用改進(jìn)的CTAB (十六垸基三甲基溴化銨)法提取菌絲的基因組DNA:1) 將-2(TC冷凍干燥的香菇菌絲研磨成粉末，加入65'C預(yù)熱的2XCTAB抽提液，65 r保溫45min以上，間或輕搖混勻；2) 12000rpm， 4。C離心20min，取上清液；3) 加入等體積的酚、氯仿和異戊醇的混合液(混合液體積比為25: 24: 1)，輕輕混 勻10min， 12000rpm， 4。C離心10min，取上清液移入新離心管中；4) 加入等體積的氯仿和異戊醇的混合液(混合液體積比為24: 1)，輕輕混勻10min， 12000rpm， (C離心10min，取上清液移入新離心管中；5) 加入2/3體積(相對(duì)于上一步驟中的上清液)的-20。C預(yù)冷的異丙醇，輕輕搖動(dòng)5min，8000rpm， 4'C離心10min，去上清；6) 沉淀用75% (體積百分?jǐn)?shù))乙醇、1Ommol/L醋酸鉀洗滌2 3次，每次8000rpm， 室溫離心5min;7) 加入預(yù)冷的95% (體積百分?jǐn)?shù))乙醇，輕輕上下顛倒，8000rpm室溫離心10min， 棄乙醇，真空抽干或自然晾干；8) 加入100pL10XTE (Tris/EDTA)緩沖液，輕輕敲打使沉淀溶解；9) 加入lpL10mg/mLRNaseA37。C水浴，lhr，去除RNA;紫外分光光度法檢測(cè)總基因組DNA濃度和純度，調(diào)整樣品DNA的濃度一致，冷藏 備用；(3) SCAR分子標(biāo)記的檢測(cè)擴(kuò)增體系(總體積25nL): 10XPCRbuffer2.5pL， 25mmol/LMgCL22pL， 10mmol/L dNTP 0.25L， 2.5U L DNA酶0.5pL， lOpmol/L香九F/R引物各lpL，提取的模板 DNAl(iL (濃度lng 10ng/nL)， ddH20 18單;PCR反應(yīng)條件:94°C lmin; 94°C 15second， 60°C 15second， 72°C lmin， 30個(gè)循環(huán); 72 °C 5min;(4) 電泳檢測(cè)取上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8pL，與lpL加樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上， 于0.5 X TBE緩沖液(Tris-硼酸緩沖液)中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用EB (溴化乙錠)染色，然后在凝膠成像儀上照相，分析結(jié)果。本發(fā)明的一種香菇香九菌種的分子標(biāo)記的應(yīng)用，是利用香菇香九菌種基因SCAR的 PCR擴(kuò)增專(zhuān)用引物，進(jìn)行基因SCAR擴(kuò)增，存在SCAR標(biāo)記的即是香菇香九菌種。 本發(fā)明的有益效果該檢測(cè)方法與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)相比，具有檢測(cè)時(shí)間短，準(zhǔn)確性 高的優(yōu)點(diǎn)。該檢測(cè)所需時(shí)間只需要2-3天，而常規(guī)的拮抗試驗(yàn)所需時(shí)間至少需要兩周時(shí)間， 出燕試驗(yàn)則需要至少3個(gè)月的時(shí)間；該方法在所收集的我國(guó)30個(gè)香菇主栽菌種中具有香 九菌種的專(zhuān)一性。


圖1是香菇香九菌種的SCAR擴(kuò)增圖譜，其中M是100bpDNAladder， NC是空白對(duì) 照，箭頭所指是香菇香九菌種的特異性標(biāo)記。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限 定的范圍。實(shí)施例11、 菌絲培養(yǎng)將4"C保藏的香菇菌種轉(zhuǎn)接到PDA平板上，25'C避光培養(yǎng)。14d后接到100mL PDY 培養(yǎng)基中，150rpm， 25'C搖瓶培養(yǎng)。待菌絲生長(zhǎng)達(dá)到一定量時(shí)，收集菌絲，放入-2(TC冰箱 保凍備用。2、 基因組DNA的提取用改進(jìn)的CTAB法提取基因組DNA。紫外分光光度法檢測(cè)總基因組DNA濃度和純度， 調(diào)整樣品DNA的濃度一致，冷藏備用。3、 SCAR分子標(biāo)記的檢測(cè)擴(kuò)增體系(總體積25^L): 10XPCRbuffer 2.5nL，25mmol/LMgCl22pL， 10mmol/LdNTP 0.25L， 2.5U/|aL T叫DNA酶0.5pL， 10pmol/L香九F/R各lpL，模板DNAlnL(濃度lng 10ng/VL)， ddH20 18.6pL。PCR反應(yīng)條件:94°C lmin; 94°C 15second， 60°C 15second， 72°C lmin， 30個(gè)循環(huán); 72 。C 5min。4、 電泳檢測(cè)取上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8uL，與lpL加樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上， 于0.5 X TBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用EB染色，然后在凝膠成 像儀上照相。采用專(zhuān)用香九檢測(cè)引物對(duì)香菇菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，香九菌株能擴(kuò)增出分子量為750bp 的特殊DNA條帶。如圖1中箭頭標(biāo)注所示。
權(quán)利要求
1. 一種香菇香九菌種的分子標(biāo)記，其特征在于該分子標(biāo)記是基因SCAR的分子特異檢測(cè)標(biāo)記，其PCR擴(kuò)增的專(zhuān)用引物是香九F/R，香九F是5’GGTCCATGTATAGTCTG3’，香九R是5’GTCCATTGGTTCAAAC3’，PCR產(chǎn)物大小為750bp。
2. 香菇香九菌種的分子標(biāo)記的檢測(cè)方法，包括下列步驟(1) 菌絲培養(yǎng)將香菇菌種轉(zhuǎn)接到PDA平板上，23。C 25。C避光培養(yǎng)，10 d ~14d后接到100mL PDY 培養(yǎng)基中，100rpm 150rpm， 23。C 25。C搖瓶培養(yǎng)10d 14d后收集菌絲；(2) 基因組DNA的提取用改進(jìn)的CTAB法提取菌絲的基因組DNA，紫外分光光度法檢測(cè)總基因組DNA濃度 和純度，調(diào)整樣品DNA的濃度一致；(3) SCAR分子標(biāo)記的檢測(cè)將提取的DNA進(jìn)行基因SCAR的PCR擴(kuò)增；(4) 電泳檢測(cè)上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與加樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠上，電泳，用EB染色， 在凝膠成像儀上照相，分析結(jié)果。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的香菇香九菌種的分子標(biāo)記的檢測(cè)方法，其特征在于所述歩驟 (2)中的改進(jìn)的CTAB法.- 1) 將-2(TC冷凍干燥的香菇菌絲研磨成粉末，加入65。C預(yù)熱的2XCTAB抽提液，65 XM呆溫45min以上，間或輕搖混勻； 2) 12000rpm， 4。C離心20min，取上清液； 3) 加入等體積的酚、氯仿和異戊醇的混合液，其混合液的混合體積比為25: 24: 1， 輕輕混勻10min， 12000rpm， 4。C離心10min，取上清液移入新離心管中； 4) 加入等體積的氯仿、異戊醇混合液，其混合液的混合體積比為24: 1，輕輕混勻 10min， 12000rpm， 4。C離心10min，取上清液移入新離心管中； 5) 加入2/3體積的-2(TC預(yù)冷的異丙醇，輕輕搖動(dòng)5min， 8000rpm， 4。C離心10min， 去上清； 6) 沉淀用體積百分?jǐn)?shù)為75%的乙醇、1Ommol/L醋酸鉀，洗滌2 3次，每次8000rpm， 室溫離心5min; 7) 加入預(yù)冷的體積百分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，輕輕上下顛倒，8000rpm室溫離心10min， 棄乙醇，真空抽干或自然晾干；8) 加入100WL10XTE緩沖液，輕輕敲打使沉淀溶解；9) 加入luL10mg/mLRNaseA37。C水浴，lhr，去除RNA;10) DNA提取物于-2(TC冰箱貯藏備用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的香菇香九菌種的分子標(biāo)記的檢測(cè)方法，其特征在于所述歩驟(3) 中的PCR擴(kuò)增的總體積為25pL，包括10XPCRbuffer 2.5pL， 25mmol/LMgCL22|iL， 10mmol/LdNTP0.25L， 2.5U&L T叫DNA酶0.5nL， 1Opmol/L香九F/R引物各lpL，濃 度lng 10ng/VL提取的模板DNA lpL， ddH20 18.6pL;PCR反應(yīng)條件94°C lmin; 94°C 15second， 60°C 15second， 72°C lmin， 30個(gè)循環(huán)； 72 。C 5min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的香菇香九菌種的分子標(biāo)記的檢測(cè)方法，其特征在于所述歩驟(4) 中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是8pL，加樣緩沖液為lpL，瓊脂糖凝膠為1.5%,電泳是在0.5 X TBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳。
6. —種香菇香九菌種的分子標(biāo)記的應(yīng)用，是利用香菇香九菌種基因SCAR的PCR擴(kuò)增專(zhuān) 用引物，進(jìn)行基因SCAR擴(kuò)增，存在SCAR標(biāo)記的即是香菇香九菌種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種香菇香九菌種的分子標(biāo)記、其檢測(cè)方法及應(yīng)用，該分子標(biāo)記是基因SCAR的分子特異檢測(cè)標(biāo)記，其PCR專(zhuān)用引物對(duì)序列為香九F5’GGTCCATGTATAGTCTG3’與香九R5’GTCCATTGGTTCAAAC 3’；檢測(cè)方法1)菌絲培養(yǎng)；2)基因組DNA的提?。?)SCAR分子標(biāo)記的檢測(cè)；4)電泳檢測(cè)；應(yīng)用將香菇菌種進(jìn)行基因SCAR擴(kuò)增，存在SCAR標(biāo)記的即是香菇香九菌種。本發(fā)明與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)相比，具有檢測(cè)時(shí)間短，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)，在收集的我國(guó)30個(gè)香菇主栽菌種中具有香九菌種的專(zhuān)一性。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101265494SQ20081003726
公開(kāi)日2008年9月17日 申請(qǐng)日期2008年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月9日
發(fā)明者宋春艷, 尚曉冬, 琦 譚, 陳明杰 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院