專利名稱：：抗h5n1來源的血凝素蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一類抗禽流感病毒HA蛋白的抗體。
背景技術(shù)：
：禽流感(avaininfluenza,簡稱AI)是由A型禽流感病毒引起的一種家禽和野禽傳染性疾病綜合癥。其病原禽流感病毒(avaininfluenzavirus,AIV)屬正粘病毒科，流感病毒屬，基因組為單股、負(fù)鏈，由8個(gè)分節(jié)段的獨(dú)立RNA片段組成。血凝素基因(HA)是禽流感病毒基因組中變異最大的基因，到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)16種不同的血凝素亞型。禽流感病毒毒株強(qiáng)弱主要體現(xiàn)在血凝素基因的變異，高致病力毒株通常是由非致病力毒株的血凝素基因變異而來。血凝素是構(gòu)成流感病毒囊膜纖突的主要成分之一，是流感病毒所有蛋白中最重要的一個(gè)，由片段4編碼，分子量為75kDa。血凝素主要功能是結(jié)合宿主唾液酸之類的細(xì)胞受體，幫助穿透宿主的胞膜以及改變抗原性，從而逃脫宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。血凝素以三聚體形式與膜結(jié)合成同聚物，形成頭桿狀大釘子般的結(jié)構(gòu)，其變異性很強(qiáng)，尤其存在選擇壓力時(shí)，變異更快。HA變異幅度大小直接影響著AIV流行的程度。HA糖蛋白一級結(jié)構(gòu)具有4個(gè)結(jié)構(gòu)域信號肽(前導(dǎo)序列)、胞漿域、跨膜域和胞外域。N端的信號大約由16個(gè)氨基酸殘基組成，其作用是識別內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。緊接信號肽之后的是328個(gè)氨基酸殘基(分子是36kDa)的HAl部分，羧基端的221個(gè)氨基酸殘基(分子量27kDa)構(gòu)成HA2。HA蛋白從產(chǎn)生到發(fā)揮作用，需要經(jīng)過兩個(gè)切割加工過程通過信號肽酶將信號肽切除，以及通過蛋白水解酶將HA切割為HA1和HA2，兩條肽鏈被一個(gè)二硫鍵連在一起，再加上分子內(nèi)的一些二硫鍵及其它非共價(jià)鍵的相互作用，使HA形成一定的立體結(jié)構(gòu)。在正常禽類和人體內(nèi)不存在凝血酶蛋白，而感染禽流感病毒的禽類和人類體內(nèi)存在特異性的凝血酶蛋白，在感染者的咽、鼻拭子或含漱液、血清、糞便4以及死亡病例的尸檢肺組織、氣管分泌物、其它臟器中都能檢測到凝血酶蛋白HA。對該蛋白的檢測有助于早期診斷禽流感感染。HA的臨床診斷主要方法有基于(l)免疫學(xué)原理的血清學(xué)診斷，(2)基因診斷。核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)需時(shí)短，但是也需要專業(yè)的人員操作和專門的實(shí)驗(yàn)儀器。而現(xiàn)在常用的血清學(xué)診斷依賴于高特異性的抗原抗體?，F(xiàn)有技術(shù)中涉及到HA單抗的方法和檢測形式雖然各有不同，但是這些方法所使用的HA的單克隆抗體非常有限，它們存在的缺陷例如特異性差。因此，通過篩選獲得具有針對不同表位的鼠源單克隆抗體，以制備和開發(fā)特異、靈敏、低成本的診斷產(chǎn)品以及相關(guān)方法是必須的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一類特異性抗禽流感病毒血凝素蛋白(HA)的單克隆抗體。本發(fā)明的另一目的在于提供特異性抗禽流感病毒的檢測試劑盒。在本發(fā)明的第一方面，提供一種特異性抗禽流感病毒血凝素蛋白(HA)的單克隆抗體，所述的單克隆抗體由選自下組的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生保藏號為CCTCCNO:C200807的雜交瘤細(xì)胞株(S-98-10);保藏號為CCTCCNO:C200808的雜交瘤細(xì)胞株(S-145-9);或保藏號為CCTCCNO:C200809的雜交瘤細(xì)胞株(S-157-6)。在另一優(yōu)選例中，所述的單克隆抗體對于禽流感病毒血凝素蛋白的檢測范圍(線性范圍)是10ng/ml-10ug/ml。在另一優(yōu)選例中，所述單克隆抗體的亞型IgGl，ic。在另一優(yōu)選例中，所述單克隆抗體是結(jié)合禽流感病毒血凝素蛋白的線性表位的單克隆抗體。在另一優(yōu)選例中，所述單克隆抗體用于制備檢測禽流感病毒的試劑或試劑盒。在另一優(yōu)選例中，所述的禽流感病毒選自H5N1型禽流感病毒，H5N2型禽流感病毒。在本發(fā)明的第二方面，提供一種雜交瘤細(xì)胞株，所述的雜交瘤細(xì)胞株選自保藏號為CCTCCNO:C200807的雜交瘤細(xì)胞株；保藏號為CCTCCNO:C200808的雜交瘤細(xì)胞株；或保藏號為CCTCCNO:C200809的雜交瘤細(xì)胞株。在本發(fā)明的第三方面，提供一種檢測禽流感病毒的試劑盒，所述的試劑盒含有所述的單克隆抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒含有固相載體，所述的固相載體上包被有第一抗體，該第一抗體是所述的單克隆抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還含有第二抗體，該第二抗體是抗禽流感病毒血凝素蛋白的多克隆抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還含有酶聯(lián)免疫檢測試劑，包括但不限于標(biāo)記物(如酶)，標(biāo)記物對應(yīng)的底物，顯色劑，洗滌液或終止液。在本發(fā)明的第四方面，提供體外(非診斷或治療性地)檢測禽流感病毒的方法，包括以下步驟(a)將待測樣品加樣于包被有第一抗體的固相載體，從而使待測樣品中的禽流感病毒血凝素蛋白與固相載體上的第一抗體結(jié)合，形成帶有"血凝素蛋白-第一抗體"二元復(fù)合物的固相載體；所述的第一抗體選自所述的單克隆抗體；(b)將第二抗體加樣于(a)獲得的固相載體，從而形成帶有"第二抗體-血凝素蛋白-第一抗體"三元復(fù)合物的固相載體；所述的第二抗體是抗禽流感病毒血凝素蛋白的多克隆抗體；且所述的第二抗體攜帶一標(biāo)記物；(c)檢測三元復(fù)合物中的標(biāo)記物，確定待檢測樣品中禽流感病毒血凝素蛋白的存在與否以或存在的量，從而確定禽流感病毒的存在與否；或者，包括以下步驟(al)將待測樣品包被于固相載體；(a2)將檢測抗體加樣于(al)的固相載體，從而使待測樣品中的禽流感病毒血凝素蛋白與固相載體上的檢測抗體結(jié)合，形成帶有"血凝素蛋白-檢測抗體"二元復(fù)合物的固相載體"；所述的檢測抗體選自所述的單克隆抗體，且所述的檢測抗體攜帶一標(biāo)記物；(a3)檢測二元復(fù)合物中的標(biāo)記物，確定待檢測樣品中禽流感病毒血凝素蛋白的存在與否以或存在的量，從而確定禽流感病毒的存在與否。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖1顯示了HA抗原包被濃度摸索曲線，其中，A為對應(yīng)于S-98-10單克隆抗體的HA抗原包被濃度線性范圍；B為對應(yīng)于S-145-9單克隆抗體的HA抗原包被濃度線性范圍；C為對應(yīng)于S-157-6單克隆抗體的HA抗原包被濃度線性范圍；其中，無關(guān)蛋白是人源谷氨酸脫羧酶GAD蛋白。圖2顯示了間接ELISA實(shí)驗(yàn)檢測三株單抗對滅活病毒(H5N2來源)的識別，無關(guān)蛋白是人源谷氨酸脫羧酶GAD。圖3顯示了抗體配對ELISA實(shí)驗(yàn)確定三株單抗是否由一個(gè)抗原決定簇決定。其中，A:S-98-10單克隆抗體作為包被抗體，多抗以及S-98-10、S-145陽9、S-157-6單克隆抗體作為第二抗體；B:S-145-9單克隆抗體作為包被抗體，多抗以及S-98-10、S-145隱9、S-157-6單克隆抗體作為第二抗體；C:S-157-6單克隆抗體作為包被抗體，多抗以及S-98-10、S-145-9、S-157-6單克隆抗體作為第二抗體其中，抗原為HA抗原和無關(guān)抗原，該無關(guān)抗原是重組人源谷氨酸脫羧酶GAD。圖4顯示了雙抗體夾心ELISA法檢測各包被的抗體對于抗原量的線性檢測范圍。其中，A:S-98-10單克隆抗體作為包被抗體，HA抗原作為抗原，以HRP標(biāo)記的多抗作為第二抗體；7B:S-145-9單克隆抗體作為包被抗體，HA抗原作為抗原，以HRP標(biāo)記的多抗作為第二抗體；C:S-157-6單克隆抗體作為包被抗體，HA抗原作為抗原，以HRP標(biāo)記的多抗作為第二抗體。圖5顯示了雙抗體夾心ELISA法檢測各抗體H5N2滅活病毒的識別作用。以S-98-10單克隆抗體^98);S-145-9單克隆抗體(們45);S-157-6單克隆抗體(弁157)作為包被抗體，以HRP標(biāo)記的多抗作為第二抗體。其中，無關(guān)蛋白是人源谷氨酸脫羧酶GAD。圖6顯示了間接ELISA檢測各單抗(S-98-10，S-145-9，S-157-6，S-315-12,S-337-7，S-445-ll)對天然蛋白的識別。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究，首次找到一類特異性抗禽流感血凝素蛋白(HA)的單克隆抗體，其是結(jié)合禽流感病毒血凝素蛋白的線性表位的單克隆抗體。所述的單克隆抗體對于抗禽流感病毒血凝素蛋白的檢測范圍寬。并且，其可良好地識別復(fù)雜體系中的HA抗原，不與其它蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性和靈敏度均非常咼=在本領(lǐng)域人員的實(shí)踐中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)，禽流感血凝素蛋白HA氨基酸序列長，抗原決定簇很多被包在蛋白結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，因此難以找到一種特異性高的單克隆抗體。HA的很多抗體識別表位為空間表位，很多表位是在序列中間，沒有在蛋白序列N端或者C端。本發(fā)明的抗原在制備過程中因?yàn)槭亲冃约兓?，所以識別該變性蛋白的抗體是識別HA空間結(jié)構(gòu)上的線性表位區(qū)而非空間表位區(qū)。目前，盡管本領(lǐng)域已經(jīng)開發(fā)出一些抗HA單克隆抗體，然而當(dāng)將這些抗體用于實(shí)際檢測時(shí)，仍然遭遇到與天然HA蛋白結(jié)合特性差的問題，這是由于待測樣品中HA蛋白的抗原決定簇被包在蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)部，無法接觸到抗體造成的。當(dāng)用這種單克隆抗體檢測樣品時(shí)，需要將樣品進(jìn)行處理(如加熱變性)，使被包埋的抗原決定簇暴露出來，這一方面造成臨床檢測程序的復(fù)雜化，使得檢測時(shí)間過長；另一方面，由于加熱變性會導(dǎo)致待測樣品中其它各種蛋白的變性，從而大大提高非特異性結(jié)合的發(fā)生率，造成干擾，降低檢測的準(zhǔn)確性。針對上述技術(shù)難題，本發(fā)明人制備了許多種針對HA蛋白的單克隆抗體，經(jīng)過大量的、反復(fù)的研究試驗(yàn)，最終找到了本發(fā)明的抗HA單克隆抗體(分別由雜交瘤細(xì)胞株S-98-10;S-145-9;S-157-6產(chǎn)生)，所述單克隆抗體對于HA蛋白具有很高的特異性，不結(jié)合于HA以外的其它蛋白。并且，當(dāng)用于檢測時(shí)，無需對待測樣品進(jìn)行過多的處理即可方便地獲得精確的檢測結(jié)果。為了獲得較好的效果，本發(fā)明人選擇HA蛋白的片段來免疫免疫動物，獲取動物的脾細(xì)胞用于制備雜交瘤細(xì)胞株。優(yōu)選的HA蛋白的片段是去除了信號肽的HA1蛋白；更佳地由HA1基因第75-1049位序列編碼而成。并且，以所述的單克隆抗體為基礎(chǔ)，可制備方便、快速且準(zhǔn)確地檢測禽流感病毒的試劑盒。禽流感病毒血凝素蛋白的原核表達(dá)本發(fā)明提供了一種表達(dá)禽流感病毒血凝素蛋白HA的方法，所述方法包括(a)PCR擴(kuò)增獲得血凝素蛋白(HA蛋白)的編碼序列；(b)將(a)所述的血凝素蛋白的編碼序列插入表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中，獲得插入了血凝素蛋白編碼序列的表達(dá)載體；(c)使(b)獲得的插入了血凝素蛋白編碼序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(d)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出血凝素蛋白；(e)分離獲得禽流感病毒血凝素蛋白HA。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，PCR擴(kuò)增HA1蛋白或其蛋白片段的編碼基因。更優(yōu)選的，擴(kuò)增HA1編碼基因的第75-1049位。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的表達(dá)載體為pET28a載體(購自Novagen公司)，其中自帶有His標(biāo)簽。將表達(dá)載體引入到基因工程化的宿主細(xì)胞中，即可表達(dá)所述的蛋白。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，釆用的宿主細(xì)胞為大腸桿菌ROSSETA。單克隆抗體本領(lǐng)域技術(shù)人員均了解，一種抗原可能含有多個(gè)抗原表位(抗原決定簇)，9因此，針對同一個(gè)抗原可以獲得不止一個(gè)抗體，這些抗體對抗原的結(jié)合特性(如特異性等)均可能是不同的。因此，針對同一個(gè)抗原，本領(lǐng)域人員需要進(jìn)行大量的反復(fù)比較、篩選和鑒定，才能找到適合于特異性結(jié)合的單抗。本發(fā)明人做了大量的工作，找到了本發(fā)明的抗HA單克隆抗體(分別由雜交瘤細(xì)胞株S-98-10;S-145-9:S-157-6產(chǎn)生)，其具有高特異性結(jié)合HA蛋白的能力，可見其結(jié)合的是HA蛋白(或含該蛋白的復(fù)合物)空間結(jié)構(gòu)上被暴露于表面的抗原決定簇(表位)。且與HA蛋白以外的其它蛋白沒有交叉反應(yīng)。本發(fā)明的抗體是對禽流感病毒HA具有特異性的單克隆抗體，所述的單克隆抗體的抗體亞型均為IgGl，ic型。這里，"特異性"是指所述抗體能結(jié)合于HA蛋白或其片段；更特別地，指那些能與HA蛋白或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明的單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等，Nature256;495，1975;Kohler等人，Eur丄Imm腸l.6:511，1976;Kohler等，Eur丄Immunol.6:292，1976;Hammerling等，InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas,Elsevier,N.Y.，1981)。本發(fā)明的單克隆抗體的一種雜交瘤的制備方法是(1)利用抗血凝素蛋白HA免疫小鼠；(2)分離經(jīng)免疫的小鼠的脾細(xì)胞，與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞株融合；(3)加入小鼠腹腔飼養(yǎng)細(xì)胞與融合細(xì)胞共培養(yǎng)，并篩選陽性株；(4)有限稀釋法克隆化篩選，從而獲得單克隆抗體細(xì)胞株，從所述細(xì)胞株中篩選可生產(chǎn)所需單克隆抗體的細(xì)胞株。本發(fā)明的單克隆抗體還可以利用HA基因產(chǎn)物或片段或功能區(qū)，通過免疫技術(shù)獲得。此外，還可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。本領(lǐng)域人員均了解，在得到了所述的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系或通過測序等手段得知所述的單克隆抗體后，本領(lǐng)域人員可以方便地獲得所述的抗體。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述的單克隆抗體可以由下列制備方法所制備，所述方法包括步驟(1)提供佐劑預(yù)處理的小鼠；(2)在小鼠腹腔內(nèi)接種所述的雜交瘤細(xì)胞并分泌單克隆抗體；(3)抽取腹水，分離獲得所述的單克隆抗體。作為一種方式，從腹水中分離單克隆抗體的方法是收集腹水，用經(jīng)硫酸銨、辛酸沉淀，接著用ProteinG預(yù)裝層析柱純化，獲得高純度的抗HA單克隆抗體。此外，也可按照常規(guī)的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法，體外培養(yǎng)擴(kuò)增所述的雜交瘤細(xì)胞，從而使之分泌所述的單克隆抗體。在獲得了本發(fā)明的抗HA單克隆抗體后，本領(lǐng)域人員可通過多種途徑來靈敏地檢測樣品中HA蛋白及其濃度，采用的技術(shù)可以是免疫學(xué)領(lǐng)域中常用的技術(shù)。檢測試劑盒本發(fā)明提供了一種用于檢測樣品中是否存在禽流感病毒的檢測試劑盒，該試劑盒中含有一種或多種本發(fā)明的抗HA單克隆抗體(分別由雜交瘤細(xì)胞株S-98-10;S-145-9;S-157-6產(chǎn)生)。在獲得了本發(fā)明提供的抗HA單克隆抗體后，可以方便地制備出用于特異性檢測禽流感病毒的檢測試劑盒。所述試劑盒中除了含有本發(fā)明的抗HA單克隆抗體以外，還可以包含其它檢測試劑或輔劑，如顯色劑、標(biāo)記物、二抗、抗抗體、增敏劑等。本領(lǐng)域人員應(yīng)理解，各種變化形式的檢測試劑盒均是包含在本發(fā)明中的，只要其中利用了本發(fā)明的抗HA單克隆抗體作為與HA特異性結(jié)合的試劑。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，本發(fā)明人根據(jù)雙抗夾心法的原理，制備了一種用于檢測HA蛋白水平的試劑盒。雙抗夾心法常規(guī)的做法是將一抗固定于載體，然后一抗與抗原反應(yīng)，洗滌后再與二抗反應(yīng)(所述的二抗攜帶可檢測信號，或可與攜帶可檢測信號的物質(zhì)結(jié)合)，最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光或酶聯(lián)顯色反應(yīng)檢測信號。雙抗夾心法特別適用于具有兩個(gè)或兩個(gè)以上表位的抗原的檢測。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明的抗HA單克隆抗體與另一種抗體(優(yōu)選的為一種抗HA多克隆抗體)來將目標(biāo)抗原HA吸附及定位，其定位和放大效果更好，從而進(jìn)一步提高特異性和精密度。相對于單抗體的競爭法來說，雙抗體夾心法的測定效果更為優(yōu)良，因而測定時(shí)只需很少的樣品量。所以采用雙抗體夾心法無論在靈敏度、精確度、準(zhǔn)確度、特異性及穩(wěn)定性上更具有優(yōu)勢。作為另一種可選擇的檢測方式，釆用間接ELISA法，將待測的抗原包被于固相載體上，利用本發(fā)明的單克隆抗體檢測HA。如本文所用，所述的"捕獲抗體"、"包被抗體"、"第一單克隆抗體"、"第一抗體"與"一抗"可互換使用，都是指本發(fā)明的抗HA單克隆抗體。所述的第一抗體被包被在固相載體上。本發(fā)明對所采用的固相載體沒有特別的限制，只要其能夠與第一單克隆抗體相偶聯(lián)(連接)即可。例如，所述的固相載體選自微量滴定板(如96孔板)、或微球等。如本文所用，所述的"第二抗體"與"二抗"可互換使用，都是指特異性地抗HA的抗體。對于抗原HA而言，相應(yīng)的第一抗體和第二抗體是不同的，并且可同時(shí)結(jié)合于所述的HA的不同表位(抗原決定簇)。所述的第二抗體可以是不同于本發(fā)明的抗HA單克隆抗體的另一種可特異性結(jié)合HA蛋白的單克隆抗體(即其與本發(fā)明的抗HA單克隆抗體所結(jié)合的HA表位是不相同的)或者，所述的第二抗體可以是一種多克隆抗體。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例中，采用了抗HA多克隆抗體作為第二抗體。所述的多克隆抗體可通過常規(guī)的方法來制備，例如，可通過將所述的HA蛋白導(dǎo)入動物中來獲得，例如將HA蛋白或滅活的病毒與弗氏佐劑按照適當(dāng)比例(如1:1)混合后免疫動物。免疫方法可使用動物皮下注射。所述動物可選自兔、羊、牛等。免疫方法例如可使用動物皮下注射。例如將HA蛋白與Freund's佐劑按照適當(dāng)比例(如l:l)混合后免疫動物；兔免疫1.5-4個(gè)月(更優(yōu)選的，為2個(gè)月左右)，優(yōu)選間隔2-4周重復(fù)免疫；然后可從兔靜脈血中收獲抗血清并純化，獲得抗HA多克隆抗體。H5N1疫苗免疫多抗的制備例如將H5N1疫苗免疫兔，免疫的間隔時(shí)間為3周；第三次免疫后l周，兔放血，收集抗血清，獲得H5N1疫苗免疫多抗。如本文所用，所述的"標(biāo)記物"是指用于確定待檢測樣品中HA的存在與否以及存在的量的標(biāo)志物。在確定了本發(fā)明的試劑盒所采用的包被抗體和/或檢測抗體后，可以采用本領(lǐng)域常規(guī)用于與檢測抗體結(jié)合來進(jìn)行檢測的各種標(biāo)記物。本發(fā)明對所采用的標(biāo)記物沒有特別的限制，只要是能夠與所述的檢測抗體結(jié)合，且在適當(dāng)處理后能夠準(zhǔn)確地指示待檢測樣品中HA蛋白的存在與否以及存在量的標(biāo)記物均是可用的。所述的標(biāo)記物可直接被設(shè)置于檢測抗體上；或者，所述的標(biāo)記物也可被設(shè)置于特異性抗檢測抗體的抗抗體上，本領(lǐng)域人員可根據(jù)所采用的抗體的種類和特性，選擇適宜的標(biāo)記物。例如，所述的標(biāo)記物可以選自辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、{3-D-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶、或葡萄糖淀粉酶。當(dāng)采用如上所示的一些酶標(biāo)記物時(shí)，還需要采用一些與相應(yīng)的酶結(jié)合的底物，從而可通過顯色等方式來報(bào)導(dǎo)標(biāo)記物的存在情況或者存在量。如本文所用，所述的"與標(biāo)記物相對應(yīng)的底物"是指可被標(biāo)記物所催化顯色，用于顯示檢測抗體與HA發(fā)生結(jié)合的識別信號。所述的底物例如用于辣根過氧化物酶的鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、ABTS;用于堿性磷酸酯酶的對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate,p-NPP);等等。本領(lǐng)域人員可根據(jù)所采用的標(biāo)記物的種類和特性，選擇適宜的底物。為了獲得定量結(jié)果，可以在檢測過程中設(shè)置含已知濃度的多個(gè)HA蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品。對于標(biāo)準(zhǔn)品的設(shè)置方法可采用常規(guī)的方法。利用所述的標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線如下設(shè)置以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值檢測結(jié)果為縱坐標(biāo)(Y軸)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X軸)繪制成用于定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。從而，根據(jù)待測樣品檢測獲得的OD值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算出待測樣品中HA蛋白的濃度。為了消除假陽性和假陰性，也可在檢測過程中設(shè)置質(zhì)控(對照)。此外，為了使本發(fā)明的試劑盒在檢測時(shí)更方便，所述的試劑盒中優(yōu)選的還包含其它一些輔助試劑，所述的輔助試劑是ELISA試劑盒中常規(guī)使用的一些試劑，這些試劑的特性以及它們的配制方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。所述的試劑例如(但不限于)顯色劑、洗滌液、終止液、增敏稀釋液。此外，在所述試劑盒中還可包含使用說明書，用于說明其中裝載的試劑的使用方法。檢測禽流感病毒的方法在獲得了本發(fā)明提供的抗HA單克隆抗體和/或試劑盒后，可以利用多種免疫學(xué)相關(guān)方法來檢測樣品中HA蛋白或其含量，從而得知待測樣品的供體是否感染禽流感，這些方法均被包含在本發(fā)明中。作為一種優(yōu)選方式，本發(fā)明提供一種體外(非診斷或治療性地)檢測禽流感病毒的方法，包括以下步驟(a)將待測樣品加樣于包被有第一抗體的固相載體，從而使待測樣品中的禽流感病毒HA與固相載體上的第一抗體結(jié)合，形成帶有"HA-第一抗體"二元復(fù)合物的固相載體；所述的第一抗體是本發(fā)明所述的單克隆抗體；(b)將第二抗體加樣于(a)獲得的固相載體，從而形成帶有"第二抗體-HA-第一抗體"三元復(fù)合物的固相載體；所述的第二抗體是抗HA的多克隆抗體且攜13帶一標(biāo)記物；(C)檢測三元復(fù)合物中的標(biāo)記物，從而確定待檢測樣品中禽流感病毒HA的存在與否以或存在的量，從而確定禽流感病毒的存在與否。作為另一種可選擇的檢測方式，釆用間接ELISA法，包括以下步驟(al)將待測樣品包被于固相載體；(a2)將檢測抗體加樣于(al)的固相載體，從而使待測樣品中的禽流感病毒HA與固相載體上的檢測抗體結(jié)合，形成帶有"HA-檢測抗體"二元復(fù)合物的固相載體"；所述的檢測抗體是本發(fā)明所述的單克隆抗體，且所述的檢測抗體攜帶一標(biāo)記物；(a3)檢測二元復(fù)合物中的標(biāo)記物，確定待檢測樣品中禽流感病毒HA的存在與否以或存在的量，從而確定禽流感病毒的存在與否。按照上述方法，只要設(shè)置已知濃度的抗原對照，制作濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過比照濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以得出待測樣品中的HA含量。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，定量檢測HA蛋白的方法具體如下(i)抗原抗體反應(yīng)將本發(fā)明的抗HA單克隆抗體包被在多孔板上，之后在多孔板的不同微孔內(nèi)分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品(可選)，或待測血清樣品；(ii)酶聯(lián)反應(yīng)將第二抗體(其上設(shè)置有標(biāo)記物或可與攜帶標(biāo)記物的抗體結(jié)合)溶液加入各孔，振蕩、孵育、洗滌；(m)顯色反應(yīng)每孔加入對應(yīng)于標(biāo)記物的底物、顯色劑，孵育，每孔加入反應(yīng)終止液，結(jié)束反應(yīng)；(iv)酶標(biāo)儀測定OD值；(V)結(jié)果計(jì)算A)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品測定OD值為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線；B)評判質(zhì)控品濃度(可選)根據(jù)質(zhì)控品的OD值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出相應(yīng)的濃度值；質(zhì)控品測定濃度值處于給定范圍時(shí)，該次測定有效；C)計(jì)算待測樣品濃度當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控品(可選)被判定有效時(shí)，根據(jù)待測樣本的OD值從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測血清樣品的HA蛋白濃度。作為本發(fā)明的另一種方式，定量檢測HA蛋白的方法具體如下(1)分別以不同濃度HA標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品包被固相載體；(2)在經(jīng)包被的固相載體上加入本發(fā)明的單克隆抗體，該單克隆抗體上連接有標(biāo)記物或可與標(biāo)記物相連接(還包括加入標(biāo)記物使之連接于該單克隆抗體)；(3)加入對應(yīng)于標(biāo)記物的底物、顯色；(4)結(jié)果計(jì)算(同前述)。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)提供一類新的針對禽流感病毒HA的特異性單克隆抗體，是結(jié)合HA的線性表位的單克隆抗體。(2)所述的單克隆抗體的檢測范圍達(dá)10ng/ml-10yg/ml，具有敏感、特異、制備成本低的特點(diǎn)，當(dāng)用于檢測時(shí)，無需對待測樣品進(jìn)行過多的處理即可方便地檢測出樣品中HA的含量，且與樣品中的其它蛋白無交叉反應(yīng)。所述單克隆抗體在細(xì)胞生物學(xué)、生物大分子檢測和醫(yī)學(xué)臨床診斷等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用前學(xué)(3)提供一種基于所述單克隆抗體的試劑盒，所述的試劑盒靈敏度和準(zhǔn)確性非常高。且所述的試劑盒在操作時(shí)不需要加熱等處理步驟，可以準(zhǔn)確快速地測定。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。實(shí)施例l抗原的制備擴(kuò)增表達(dá)的基因HA來自InfluenzaAvirus(A/Goose/Guangdong/3/97(H5Nl))這株病毒，該病毒購自上海英沐生物科技有限公司。制備含有HA-l基因第75-1049位序列(975bp，編碼含有325個(gè)氨基酸的蛋白)的抗原。正向引物CGCGGATCCATTTGCATTGGTTACC;反向引物CCGCTCGAGTAATTCTTCTTCTCTCTCT。以前述病毒株基因序列為模版，PCR擴(kuò)增如下94°C5min;(94°C45s，60°C45s，72°Clmin，進(jìn)行33個(gè)循環(huán))；72°C7min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，雙酶切，連接進(jìn)入表達(dá)載體PET28a(Novagen公司)多克隆位點(diǎn)(該表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)上游含有編碼6個(gè)His組氨酸t(yī)ag的基因，因此重組載體翻譯得到的融合蛋白N段為His-tag，該tag能特異性地與Ni-NTA親和填料(Qiagen公司)結(jié)合，從而對該融合蛋白進(jìn)行親和純化)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ROSSETA(Novagen公司購買)，PCR驗(yàn)證，測序驗(yàn)證均為陽性。蛋白誘導(dǎo)表達(dá)如下1.挑陽性單克隆菌落于7ml含有卡那抗生素LB培養(yǎng)液的50m聘養(yǎng)管中，37C振蕩培養(yǎng)過夜(8-16h)。2.37°C，lmMIPTG終濃度誘導(dǎo)蛋白。取700ul過夜搖菌加入7ml含有相應(yīng)抗生素LB培養(yǎng)液的50ml離心管中，于OD6。o二0.4-0.6時(shí)加入終濃度為lmM的IPTG。3.誘導(dǎo)3-4h后收集菌液，4°C，7000rpm離心15min，去上清得到菌體。蛋白純化如下1.菌體超聲破碎，4'C，12000rpm離心15min，去上清得到蛋白包涵體；2.8M尿素的磷酸鹽緩沖液溶解包涵體，4'C混勻過夜；3.4°C,12000rpm離心15min，留上清；4.取50。/bNi-NTA親和填料裝柱，Beads與菌液體積比為lml:1000ml;5.將上清勻速流過Beads，使上清中蛋白與Ni-NTABeads結(jié)合；6.PBS將無關(guān)蛋白洗脫；7.用含500mM咪唑的8M尿素的磷酸鹽緩沖液將目的蛋白洗脫，獲得純化的蛋白(稱為His-HA或His-HAl)。實(shí)施例2動物免疫選擇與所用骨髓瘤細(xì)胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠齡在812周，雌雄不限。采用實(shí)施例l制備的His-HAl為抗原，抗原原液濃度1.84mg/mL，Balb/c小鼠免疫劑量100ug血凝素蛋白HA(H5Nl來源)每只每次。注射方式為肌肉多點(diǎn)注射。使用時(shí)用PBS或生理鹽水稀釋。免疫程序0，3，6周三次免疫。融合前3天取100叱血凝素蛋白HA加PBS稀釋至0.5mL腹腔注射，進(jìn)行回憶刺激。末次免疫3天后，分離脾細(xì)胞融合。第三次用HA免疫之后W小鼠血清中的抗體滴度見表l。表1小鼠抗體滴度#1>64，000正常小鼠(陰性對照)<1,000實(shí)施例3雜交瘤細(xì)胞株的構(gòu)建及單克隆抗體的制備1.骨髓瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)選擇瘤細(xì)胞株的最重要的一點(diǎn)是與待融合的B細(xì)胞同源。如待融合的是脾細(xì)胞，各種骨髓瘤細(xì)胞株均可應(yīng)用，本發(fā)明人采用的是SP2/0細(xì)胞株(購自上海第二醫(yī)科大學(xué)的)。該細(xì)胞株生長及融合效率均佳，此外，該細(xì)胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈。細(xì)胞的最高生長刻度為9X10VmL，倍增時(shí)間通常為1015h。融合細(xì)胞選擇在處于對數(shù)生長期、細(xì)胞形態(tài)和活性佳的細(xì)胞(活性大于95%)。骨髓瘤細(xì)胞株在融合前應(yīng)先用含8-氮鳥嘌呤的培養(yǎng)基作適應(yīng)培養(yǎng)，在細(xì)胞融合的前一天用新鮮培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為2X105/mL,次日一般即為對數(shù)生長期細(xì)胞。2.飼養(yǎng)細(xì)胞的制備在體外培養(yǎng)條件下，細(xì)胞的生長依賴適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度，因而，在培養(yǎng)融合細(xì)胞或細(xì)胞克隆化培養(yǎng)時(shí)，還需加入其他飼養(yǎng)細(xì)胞(feedercell)。本發(fā)明人所有的飼養(yǎng)細(xì)胞為小鼠的腹腔細(xì)胞，制備方法為用常規(guī)的冷凍培養(yǎng)液注入小鼠腹腔，輕揉腹部數(shù)次，吸出后的液體中即含小鼠腹腔細(xì)胞，其中有巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞調(diào)至lX10VmL,提前一天置板孔中培養(yǎng)。3.細(xì)胞融合17回憶刺激后3天進(jìn)行融合。細(xì)胞融合是雜交瘤技術(shù)的中心環(huán)節(jié)，基本步驟是將兩種細(xì)胞混合后加入PEG使細(xì)胞彼此融合。其后把培養(yǎng)液稀釋PEG，消除PEG的作用。將融合后的細(xì)胞適當(dāng)稀釋，分置培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)。骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的比值可從1:2到1:10不等，本發(fā)明人用1:4的比例，保證了兩種細(xì)胞在融合前都具有較高活性。4.有限稀釋法篩選陽性株選用的骨髓瘤細(xì)胞為HAT敏感細(xì)胞株，所以只有融合的細(xì)胞才能持續(xù)存活一周以上。融合細(xì)胞呈克隆生長，經(jīng)有限稀釋后(一般稀釋至0.8個(gè)細(xì)胞/孔)，按Poisson法計(jì)算，應(yīng)有36%的孔為1個(gè)細(xì)胞/孔。細(xì)胞培養(yǎng)至覆蓋020%孔底時(shí)，吸取培養(yǎng)上清用ELISA檢測抗體分泌量，所用篩選用免疫所用抗原。首先把抗體的分泌含量按照OD450〉1劃分為陽性和陰性孔，對陽性孔進(jìn)行克隆化；連續(xù)三次克隆化均為100%陽性的克隆，再選做擴(kuò)大培養(yǎng)或凍存。經(jīng)過有限稀釋法克隆化，從眾多的抗體株中篩選得到三株抗體，分別命名為S-98-10，S-145-9，S-157-6(見表2)。經(jīng)亞型鑒定，S-98-10，S-145-9，S-157-6均為IgGI、k型(亞型檢測釆用BIO-RAD公司小鼠亞型檢測試劑盒CatalogNo.l72-2055)，見表3。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>5.間接ELISA檢測各單抗對天然蛋白的識別包被的HA抗原，無關(guān)蛋白和滅活病毒總蛋白濃度均為0.005mg/ml，50ul/孔；一抗為含單克隆抗體的腹水，稀釋l:3000倍，二抗用羊抗鼠-HRP檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示6株單抗株(S-98-10，S-145-9，S-157-6，S-315-12，S-337-7，S-445-l1;后三株抗體株獲自上海英沐生物科技有限公司)腹水對于特異性抗原HA均有良好的識別作用，但其中只有S-98-10，S-145-9，S-157-6三株單抗對天然滅活病毒(H5N2來源)有較好的識別作用。結(jié)果見圖6。三株單抗從原核表達(dá)的His-HAl抗原制備而來，且既可良好識別天然滅活病毒，又可良好識別HA抗原，因此其是結(jié)合禽流感病毒血凝素蛋白的線性表位的單克隆抗體。6.單克隆抗體的大量制備取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5mL液體石蠟或降植烷進(jìn)行預(yù)處理。l-2周后，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。約l-2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。ELISA檢測抗HA單抗的腹水效價(jià)結(jié)果見表4。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>*抗體滴度由腹水稀釋度的倒數(shù)表示，腹水第一次稀釋度數(shù)為l:l，OOO。實(shí)施例4單克隆抗體的應(yīng)用1.抗原包被量梯度曲線包被的HA抗原量從10ug到lng/mL變化，一抗為3個(gè)克隆株的純化抗體，稀釋l:3000倍，二抗用羊抗鼠-HRP檢測。通過曲線斜率可看出抗原包被在10ng/mL時(shí)，檢測OD值接近本底值了。在IOPg到10ng/mL區(qū)間，檢測OD值與包被抗原濃度呈線性關(guān)系，說明這一區(qū)間為HA抗原較好的檢測范圍。其中無關(guān)蛋白為重組人源谷氨酸脫羧酶GAD(GenBank登錄號NM—000818)。HA包被濃度摸索曲線如圖1所示。2.間接ELISA實(shí)驗(yàn)三株單抗對滅活病毒(H5N2來源)的識別包被抗原分別為HA抗原，無關(guān)蛋白(為重組人源谷氨酸脫羧酶GAD)，和H5N2型禽流感滅活病毒(購自上海英沐生物科技有限公司)，總蛋白濃度均為IOug/ml，一抗為3個(gè)克隆株的純化抗體，稀釋l:3000倍，然后用羊抗鼠-HRP檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示三株單抗對天然滅活病毒(H5N2來源)有較好的識別作用，識別特異性高于H5N1疫苗免疫多抗。間接ELISA實(shí)驗(yàn)識別滅活病毒(H5N2來源)如圖2所示。3.抗體配對ELISA實(shí)驗(yàn)決定三株單抗是否由一個(gè)抗原決定簇決定HA免疫多抗-HRP的制備免疫動物為新西蘭白兔，雄性，體重為2-2.5kg。免疫流程用前述制備的His-HAl與Freund's佐劑hl混合，乳化后，皮下和皮內(nèi)多點(diǎn)注射進(jìn)行免疫。HAl-His的劑量為0.9mg/次/兔。首次免疫用完全Freund's佐劑，再次免疫用不完全Freund's佐劑。免疫的間隔時(shí)間為3周。第三次免疫后1周，兔放血，收集抗血清，獲得H5N1疫苗免疫多抗。常規(guī)戊二醛二步法進(jìn)行HRP標(biāo)記抗體，獲得H5N1疫苗免疫多抗-HRP。3株單抗和多抗進(jìn)行純化標(biāo)記以后，兩兩夾心ELISA實(shí)驗(yàn)，各抗體包被濃度為10ug/ml，抗原為前述制備的His-HAl(50ul/孔，終濃度為l"g/mL)，然后分別用不同于包被抗體的另一抗體-HRP進(jìn)行檢測；同時(shí)也用與包被抗體相同的抗體-HRP進(jìn)行檢測，作為陰性對照值。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得知，S-98-10，S-145-9，S-157-6相互之間不能夾心，說明三株抗體由相同或相近的抗原決定簇決定。而采用三株單抗或多抗包被，多抗檢測則可行。抗體配對實(shí)驗(yàn)如圖3所示。實(shí)施例5雙抗體夾心ELISA實(shí)驗(yàn)檢測抗原量的范圍抗體包被濃度為10"g/ml，抗原為前述制備的His-HAl(50ul/孔，終濃度從1ug到lng/mL)，然后用HA免疫多抗-HRP檢測。結(jié)果均顯示了抗體在lyg到lng/mLHA范圍內(nèi)，OD450讀數(shù)與被檢測的HA濃度具有良好的線性關(guān)系。夾心法檢測HA濃度梯度實(shí)驗(yàn)如圖4所示。實(shí)施例6雙抗體夾心ELISA實(shí)驗(yàn)檢測滅活病毒(H5N2來源)H5N1疫苗免疫多抗-HRP的制備H5N1疫苗(哈爾濱微科生物技術(shù)開發(fā)公司H5N1亞型，RE-1株)免疫新西蘭白兔，雄性，體重為2-2.5kg。免疫流程如下皮下和皮內(nèi)多點(diǎn)注射進(jìn)行免疫。H5Nl疫苗注射劑量為1.5ml/次/兔。免疫的間隔時(shí)間為3周。第三次免疫后l周，兔放血，收集抗血清，獲得H5N1疫苗免疫多抗。釆用常規(guī)戊二醛二步法進(jìn)行冊P標(biāo)記抗體，從而獲得H5N1疫苗免疫多抗-HRP。H5N1疫苗免疫多抗、各單抗包被濃度為10ug/ml，一抗為H5N2滅活病毒(滅活病毒總蛋白濃度為0.5mg/ml，1:50稀釋，50ul/孔)，然后用H5N1疫苗免疫多抗-HRP檢測。結(jié)果顯示了抗體通過夾心法對H5N2滅活病毒有良好的識別作用。并且，本發(fā)明的單抗的識別效果顯著優(yōu)于多抗。雙抗體夾心ELISA實(shí)驗(yàn)檢測滅活病毒實(shí)驗(yàn)如圖5所示。實(shí)施例7試劑盒將S-98-10抗體以10pg/ml的濃度(溶于PBS中)包被酶標(biāo)板，4'C過夜。用ELISA洗滌液(配方為Tris1M2Tween200.5ml，調(diào)pH值為7.0左右，加水定容至1L)洗板；每孔加入200|al的Oml，lMHC116.8ml，1%BSA，于37°C封閉2h。用ELISA洗滌液洗板。將上述處理的酶標(biāo)板晾干，裝于合適的包裝中，同時(shí)還在其中裝入前述制備的HA免疫多抗-HRP，以及四甲基聯(lián)苯胺和TMB-H2Ch顯色劑，從而獲得所述的試劑盒。生物材料保藏本發(fā)明制備的雜交瘤細(xì)胞保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國武漢)，分別為雜交瘤細(xì)胞株S-98-10:保藏號CCTCCNO:C200807;保藏日2008年3月27曰；雜交瘤細(xì)胞株S-145-9:保藏號CCTCCNO:C200808;保藏日2008年3月27曰；雜交瘤細(xì)胞株S-157-6:保藏號CCTCCNO:C200809;保藏日2008年3月27曰。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求1.一種特異性抗禽流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體，其特征在于，所述的單克隆抗體由選自下組的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生保藏號為CCTCCNOC200807的雜交瘤細(xì)胞株；保藏號為CCTCCNOC200808的雜交瘤細(xì)胞株；或保藏號為CCTCCNOC200809的雜交瘤細(xì)胞株。2.如權(quán)利要求l所述的單克隆抗體，其特征在于，所述的單克隆抗體對于禽流感病毒血凝素蛋白的檢測范圍是10ng/ml-10ng/ml。3.如權(quán)利要求l所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體是結(jié)合禽流感病毒血凝素蛋白的線性表位的單克隆抗體。4.權(quán)利要求l所述的單克隆抗體的用途，其特征在于，用于制備檢測禽流感病毒的試劑或試劑盒。5.—種雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于，所述的雜交瘤細(xì)胞株選自保藏號為CCTCCNO:C200807的雜交瘤細(xì)胞株；保藏號為CCTCCNO:C200808的雜交瘤細(xì)胞株；或保藏號為CCTCCNO:C200809的雜交瘤細(xì)胞株。6.—種檢測禽流感病毒的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒含有權(quán)利要求l所述的一個(gè)或多個(gè)單克隆抗體。7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒含有固相載體，所述的固相載體上包被有第一抗體，該第一抗體是權(quán)利要求l所述的單克隆抗體。8.如權(quán)利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還含有第二抗體，該第二抗體是抗禽流感病毒血凝素蛋白的多克隆抗體。9.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還含有酶聯(lián)免疫檢測試劑。10.體外檢測禽流感病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟-(a)將待測樣品加樣于包被有第一抗體的固相載體，從而使待測樣品中的禽流感病毒血凝素蛋白與固相載體上的第一抗體結(jié)合，形成帶有"血凝素蛋白-第一抗體"二元復(fù)合物的固相載體；所述的第一抗體選自權(quán)利要求l所述的單克隆抗體；(b)將第二抗體加樣于(a)獲得的固相載體，從而形成帶有"第二抗體-血凝素蛋白-第一抗體"三元復(fù)合物的固相載體；所述的第二抗體是抗禽流感病毒血凝素蛋白的多克隆抗體；且所述的第二抗體攜帶一標(biāo)記物；(C)檢測三元復(fù)合物中的標(biāo)記物，確定待檢測樣品中禽流感病毒血凝素蛋白的存在與否以或存在的量，從而確定禽流感病毒的存在與否；或者，包括以下步驟(al)將待測樣品包被于固相載體；(a2)將檢測抗體加樣于(al)的固相載體，從而使待測樣品中的禽流感病毒血凝素蛋白與固相載體上的檢測抗體結(jié)合，形成帶有"血凝素蛋白-檢測抗體"二元復(fù)合物的固相載體"；所述的檢測抗體選自權(quán)利要求l所述的單克隆抗體，且所述的檢測抗體攜帶一標(biāo)記物；(a3)檢測二元復(fù)合物中的標(biāo)記物，確定待檢測樣品中禽流感病毒血凝素蛋白的存在與否以或存在的量，從而確定禽流感病毒的存在與否。全文摘要本發(fā)明公開了特異性抗禽流感病毒血凝素蛋白(HA)的單克隆抗體，所述抗體來源于保藏號為CCTCCNOC200807、CCTCCNOC200808或CCTCCNOC200809的雜交瘤細(xì)胞株。所述單克隆抗體特異性和靈敏度高，抗原檢出范圍寬。本發(fā)明還公開了檢測禽流感病毒的試劑盒。文檔編號C12N5/12GK101580545SQ20081003736公開日2009年11月18日申請日期2008年5月14日優(yōu)先權(quán)日2008年5月14日發(fā)明者兵孫,季永鏞,莊筱筱申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院