專利名稱：一種位點(diǎn)特異整合性慢病毒載體系統(tǒng)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種位點(diǎn)特異整合性慢病毒載體系統(tǒng)及其 制備方法。
背景技術(shù)：
慢病毒(Lentivirus)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒亞屬，以人類免疫缺陷病毒 (human i腿unodefficiency vims, HIV)為代表.慢病毒不僅具有感染分裂 靶細(xì)胞并整合其基因組中，尤其是具有感染包括神經(jīng)元細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、 心肌細(xì)胞和千細(xì)胞等在內(nèi)的多種非分裂細(xì)胞能力，因而，慢病毒載體已作為基因 轉(zhuǎn)移的有效工具，被廣泛應(yīng)用于基因功能尤其是基因治療的研究。
基于I型人類免疫缺陷型病毒(human i咖unodefficiency virus, type 1;HIV-1)的慢病毒載體目前已發(fā)展到第三代。第一代是復(fù)制缺陷型HIV-1的慢 病毒載體，僅獲得較低的重組滴度，且僅能感染CD4的靶細(xì)胞，并存在產(chǎn)生野生 性HIV的嚴(yán)重危險(xiǎn)。第二代慢病毒載體的一個(gè)重要改進(jìn)，是采用了其它病毒的包 膜蛋白基因代替HIV的包膜蛋白基因，構(gòu)建成假型慢病毒載體(pseudotype lentivirus vector)。該載體含有水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus: VSV) e/7r蛋白G糖蛋白，使病毒顆粒非特異性地結(jié)合于靶細(xì)胞的膜磷脂，而不 需要特異性膜受體。第三代慢病毒載體，缺失了與病毒包裝和感染無(wú)關(guān)的序列， 這些序列通常與病毒復(fù)制和致病性有關(guān)。第四代慢病毒載體，為自滅活性載體。 該類載體將3-LTR中所有參與病毒復(fù)制的非必需序列缺失，使其經(jīng)包裝產(chǎn)生的子 代重組病毒完全失去了復(fù)制能力，因而更安全。然而，同其它病毒如反轉(zhuǎn)錄病毒 一樣，慢病毒的整合是隨機(jī)的，因而常導(dǎo)致插入突變之風(fēng)險(xiǎn)，該風(fēng)險(xiǎn)巨大阻礙著 慢病毒載體系統(tǒng)在基因功能和基因治療上的廣泛地應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種位點(diǎn)特異整合性慢病毒載體系統(tǒng)，以克服慢病毒 載體系統(tǒng)隨機(jī)整合導(dǎo)致插入突變之風(fēng)險(xiǎn)，賦予該類載體系統(tǒng)位點(diǎn)特異整合功能； 同時(shí)，通過(guò)改造包裝載體，使該載體成為集有效性、安全性和操作簡(jiǎn)便性于一體 的新型慢病毒載體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述載體的制備方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種位點(diǎn)特異整合試劑盒，用于將基因位點(diǎn)特 異性整合在基因組中。
本發(fā)明提供了一種位點(diǎn)特異性整合慢病毒載體系統(tǒng)，由FattbC31UGW質(zhì)粒、 CMVA8. 9-D64N/D116N和包膜質(zhì)粒VSVG組成(其結(jié)構(gòu)示意圖分別如圖1、 2和3 所示)；FattbC31UGW質(zhì)粒是將attB位點(diǎn)序列和位點(diǎn)特異整合酶C31基因序列依 次連接并且克隆到FUGW載體的PACI酶切點(diǎn)而得；CMVA8. 9-D64N/D116N質(zhì)粒是 由CMVA8. 9質(zhì)粒中的pol基因D64N和D116N突變而得。
FUGW、 pCMVA8. 9 (即CMVA8. 9質(zhì)粒)及VSVG來(lái)源于美國(guó)Carlos Lois博 士惠贈(zèng)。本發(fā)明的FUGW慢病毒載體來(lái)源于文章Lois C， et al. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science, 2002,295:868-72。 FUGW以除去有害基因后的 HIV作為骨架，表達(dá)由泛素(Ubiquitin-C，UBC)調(diào)控的綠色熒光蛋白基因(EGFP); pCMVA8.9為包裝結(jié)構(gòu)質(zhì)粒，主要起病毒包裝功能，表達(dá)酶蛋白形成病毒衣殼結(jié) 構(gòu)及整合酶(IN); VSVG為包膜質(zhì)粒。
一方面，包裝載體CMVA8. 9-D64N/D116N是由CMVA8. 9中pol基因(其NCBI 登陸號(hào)AAC54634 )編碼的HIV整合酶D64N和D116N雙突變而成，使其僅有包 裝功能而未整合作用。另一方面，F(xiàn)attbC31UGW質(zhì)粒是由attB位點(diǎn)序列和位點(diǎn) 特異整合酶基因C31 (即phi C31,其NCBI登陸號(hào)AX816372)序列克隆到FUGW 載體的pad酶切點(diǎn)而得到，賦予了該載體位點(diǎn)特異整合的功能。
新型慢病毒載體FattbC31UGW設(shè)計(jì)策略FUGW載體與attB位點(diǎn)序列和位點(diǎn) 特異整合酶基因phi C31的融合序列Attb-C31經(jīng)PACI酶切，回收，連接而得到. 如下圖所示。5LTRy3LTRyAttB-C31一
ea^酶切回收，T4連接龍連^
，
5LTRatffi-C31UbiEGFP3LTRw
新型慢病毒包裝載體CMVA8. 9-D64N/D116N設(shè)計(jì)策略編碼HIV整合酶基 因位于pol基因內(nèi)，與整合有關(guān)殘基被定向突變D64N/D116N,以此獲得新型未整 合活性低的慢病毒包裝載體CMVA8. 9-D64N/D116N如下圖所示
pCMV
Bata-globin intron
Glg/po1
RRE
定向突變編碼HIV整合酶殘基 D64N/D1顧
pCMV
Bata-globin intron —
Glg/po卜D64/D116N
RRE
另一方面，本發(fā)明還提供了位點(diǎn)特異整合性慢病毒載體系統(tǒng)的制備方法， 該方法包括以下步驟
(1) 獲得Attb-C31編碼序列；
(2) 將(1)獲得的序列克隆至FUGW載體pacl酶切位點(diǎn)獲得質(zhì)粒 FattbC31UGW;
(3) 以質(zhì)粒CMVA8. 9為模版，將pol基因中的D64N和D116N突變后得 到CMVA8. 9-D64N/D116N;
(4) 將FattbC31UGW質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒VSVG和包裝結(jié)構(gòu)質(zhì)粒CMVA 8.9-D64N/D116N質(zhì)粒混合，混合比例為1.5-10: 1-5: 1;即形成如權(quán)利要求1 所述慢病毒載體系統(tǒng)。
本發(fā)明的制備方法中，(1)用PCR方法或者人工合成方法得到Attb-C31整 合酶編碼序列。
本發(fā)明的制備方法中，克隆序列可以采用PCR，人工合成，酶切等方法實(shí)現(xiàn)，拼接序列則可能采用酶切、退火、連接粘性末端等方法實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的制備方法(1)中，可以首先將attb序列插入CMV-c31質(zhì)粒獲得 重組CMV-Attb-C31質(zhì)粒，然后用PCR方法或者人工合成方法得到AUb-C31整合 酶編碼序列。
例 如， 合 成 帶 有 Kpnl
/spel 酶 切 點(diǎn) 的 ATTB 寡 核 甘 酸 序 列
經(jīng)退火酶切回收后克隆到CMVC31質(zhì)粒，得到重組CMV-ATTB-C31質(zhì)粒.擴(kuò)增 Attb-C31整合酶編碼序列，所用引物含有pacl的酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后回 收。CMV C31質(zhì)粒來(lái)自美國(guó)Stanford University的Michele P. Calos教授，文 章出自"A phage integrase directs efficient site-specif ic integration in human cells, PNAS, 2000 ,97 ，5995 - 6000."
本發(fā)明的制備方法(3)中，用定向突變方法獲得了HIV整合酶突變的表達(dá) 載體CMVA8. 9-D64N/D116N。
例如，以質(zhì)粒CMV △ 8. 9為模版，合成寡核甘酸序列D64N， F-5-TATGGCAGCTAAATTGTACACATT-3 ; D64N， R-5-AATGTGTACAATTTAGCTGCCATA ; Dl16NF-5-ACAGTACATACAAACAATGGCAGC-3 和 DU6NR-5-GCTGCCATTGTTTGTATGTACTGT。用定向突變?cè)噭┖羞M(jìn)行定向突變，克隆 經(jīng)測(cè)序證實(shí)后得到CMVA8. 9-D64N/D116N。
本發(fā)明的制備方法中，(4)中采用混合質(zhì)量比可以是5: 4: 3或者4: 3: 2。
質(zhì)粒FattbC31UGW， pCMVA8. 9- D64N/D116N及VSVG三部分共轉(zhuǎn)染時(shí)，三者質(zhì) 量比可以為2: 1.5: 1; 如三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染100CM培養(yǎng)皿，F(xiàn)attbC31UGW， pCMV. △8. 9-D64/D116N及VSVG所需量可以是10ug, 7. 5ug和5ug。共轉(zhuǎn)染方法可以通 過(guò)脂質(zhì)體，磷酸鈣，PEI等。
本發(fā)明中，所適用宿主包括各種真核生物。
本發(fā)明中，位點(diǎn)特異整合性慢病毒載體系統(tǒng)應(yīng)用的宿主細(xì)胞可以是靜止細(xì) 胞或者分裂細(xì)胞。其中，靜止細(xì)胞可以是神經(jīng)元細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞或者成體干細(xì)胞 和胚胎干細(xì)胞。本發(fā)明中，靜止期細(xì)胞也可以是原代細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了一種位點(diǎn)特異性整合試劑盒，該載體試劑盒中含有上述慢 病毒包裝載體系統(tǒng)。本發(fā)明的載體系統(tǒng)可將所攜帶核酸片段穩(wěn)定整合于宿主基因組假attP位點(diǎn)。
該載體試劑盒中除了含有上述FattbC31UGW質(zhì)粒、CMVA8. 9-D64N/D116N 和包膜質(zhì)粒VSVG，還可以含有常見(jiàn)的緩沖液，使用說(shuō)明等。
本發(fā)明的位點(diǎn)特異整合性慢病毒載體系統(tǒng)，不僅在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中證實(shí)了 該載體系統(tǒng)具有感染神經(jīng)元細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞和各 種干細(xì)胞等在內(nèi)的多種非分裂或靜止期細(xì)胞能力，而且，病毒載體攜帶的轉(zhuǎn)基因 在C31整合酶介導(dǎo)下可穩(wěn)定整合在基因組假attP位點(diǎn)上；但由于C31整合酶基 因整合使其失去LTR的調(diào)控作用而失活，因而，可避免C31整合酶過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞 的毒性。本發(fā)明的位點(diǎn)特異整合性慢病毒感染細(xì)胞后進(jìn)行整合分析，其結(jié)果顯示 本發(fā)明的位點(diǎn)特異整合性慢病毒載體可插入在基因組假a P位點(diǎn)上。
本發(fā)明對(duì)現(xiàn)有慢病毒載體系統(tǒng)進(jìn)行了改造，獲得了位點(diǎn)特異整合性慢病毒 載體。經(jīng)該病毒載體攜帶的轉(zhuǎn)基因可穩(wěn)定整合在宿主基因組特定位點(diǎn)上，克服了 慢病毒載體系統(tǒng)隨機(jī)整合導(dǎo)致插入突變之風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明一方面可用于鑒定外源基 因的功能，尤其是在原代細(xì)胞等非分裂細(xì)胞中的作用；另一方面本發(fā)明為抑制腫 瘤和抗病毒等領(lǐng)域的基因治療提供了新的更安全更高效的途徑。


圖1. FattbC31UGW載體結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2. VSVG載體結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3. pCMVA8. 9-D64N/D116N結(jié)構(gòu)示意圖。
圖4 FattbC31UGW感染細(xì)胞結(jié)果示意圖。顯示綠色熒光處(高亮顯示處) 為感染成功的細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 新型慢病毒包裝載體CMVA8. 9-D64N/D64N制備方法 合成寡核甘酸序列D64N, F-5-TATGGCAGCTAAATTGTACACATT-3, D64N， R-5-AATGTGTACAATTTAGCTGCCATA;D116NF-5-ACAGTACATACAAACAATGGCAGC-3和 D116NR-5-GCTGCCATTGTTTGTATGTACTGT-3 ，以質(zhì)粒CMVA8. 9為模版，用定向突變 試劑盒進(jìn)行定向突變，酶切鑒定，并序列分析正確.獲得CMV厶8.9-D64N/D116N。
實(shí)施例2位點(diǎn)特異整合性慢病毒載體的制備合 成 帶 有 Kpnl
/spel 酶 切 點(diǎn) 的 ATTB 寡 核 甘 酸 序 列
經(jīng)退火酶切回收后克隆到CMVC31質(zhì)粒，得到CMV-ATTB-C31質(zhì)粒.擴(kuò)增Attb_C31 整合酶編碼序列，所用引物含有pacl的酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后回收.
實(shí)施例3被質(zhì)粒CMVA8. 9-D64N/D64N包裝的位點(diǎn)特異整合性慢病毒制備 將FattbC31UGW載體，與包裝結(jié)構(gòu)質(zhì)粒CMVA8. 9-D64N/D64N和包膜質(zhì)粒 (VSVG)以2 : 1 : 1質(zhì)量比例混合。利用脂質(zhì)體LipofectamineTM在293T細(xì)胞 上進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24—48 h后在熒光顯微鏡下觀察，出現(xiàn)大量熒光后收集病毒上清， 收集的病毒上清濃縮后分裝備用或立即使用.重組慢病毒活性測(cè)定時(shí)，將濃縮后 的病毒貯存液作不同比例稀釋，感染細(xì)胞48 h后在熒光顯微鏡下進(jìn)行熒光計(jì)數(shù)， 確定滴度。FUGW載體作為對(duì)照。結(jié)果顯示，位點(diǎn)特異整合性慢病毒滴度為6. 8*10—7 TU/ml。
實(shí)施例4位點(diǎn)特異整合性慢病毒系統(tǒng)感染細(xì)胞分析
將上述lul整合性慢病毒FattbC31UGW感染6孔板上293細(xì)胞系.72h后在 熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，293系細(xì)胞可見(jiàn)綠色熒光；感染效率為82. 1%. 細(xì)胞經(jīng)傳代后6天，發(fā)現(xiàn)293系細(xì)胞熒光計(jì)數(shù)百分比未有改變。該結(jié)果說(shuō)明了位 點(diǎn)特異整合性慢病毒FattbC31UGW,在phiC31整合酶介導(dǎo)下可整合到細(xì)胞基因組 中。
實(shí)施例5 FattbC31UGW慢病毒感染細(xì)胞后位點(diǎn)特異整合分析 抽提上述被感染細(xì)胞基因組DNA,用PCR和序列分析方法鑒定是否病毒基 因組位點(diǎn)特異整合假attP位點(diǎn)，引物psaF:5' -GATATGGGAGGCCACAGTTG-3'(見(jiàn) SEQ ID NO 1); C31R: 5， -ATGCCCGACGAACCTGAACCGGC-3，(見(jiàn)SEQ ID NO 2)。 結(jié)果顯示，F(xiàn)attbC31UGW慢病毒感染293系細(xì)胞，能擴(kuò)增出287bp的條帶。序列 分析見(jiàn)SEQ ID NO 3， 其中包括宿主基因組假attP位點(diǎn)序列(見(jiàn)SEQ ID NO 3 中ntl-97)、 attB序列(見(jiàn)SEQ ID NO 3中nt98-127)和C31序列(見(jiàn)SEQ ID NO 3中自ntl27以后序列)的一部分。這說(shuō)明FattbC31UGW慢病毒感染細(xì)胞后 特異整合在假attP位點(diǎn)上。序列表
<210> 1 <211> 20 <212> DNA <213〉 Artificial
<400> 1
gatatgggag gccacagttg 20
<210> 2
<211〉 23
<212> DNA
<213〉 Artificial
<400〉 2
atgcccgacg aacctgaacc ggc 23
<210> 3
<211〉 287
<212〉 DNA
<213〉 Artificial
<220〉
〈221〉 attp
<222>
〈223〉
<220>
<221〉 attb
<222> (98).. (127)
<223>
<220>
<221〉 c31
〈222〉 (128)…(287)
<223>
<400〉 3
gatatgggag gccacagttg ag3tgccttc caatcagagg cttggtgaga ttccaagagg 60
tggtttcaaa tacagcaata gtacttgggt ttcccttggg ctccccgggc gcgtactcca 120
tactagtatg acacaagggg ttgtgaccgg ggtggacacg tacgcgggtg cttacgaccg 180
tcagtcgcgc gagcgcgaga attcgagcgc agcaagccca gcgacacagc gtagcgccaa 240
cgaagacaag gcggccgacc ttcagcgcga agtcgagcgc gacgggg 287〈210> 4
<211> 24
<212〉 蘭
<213〉 Artificial
<400〉 4
tatggcagct aaattgtaca catt 24
<210〉 5
<211> 24
〈212> DNA
<213〉 Artificial
<400> 5
aatgtgtaca atttagctgc cata 24
<210> 6
<211〉 24
<212〉 DNA
〈213〉 Artificial
<400> 6
acagtacata caaacaatgg cage 24
<210> 7
<211> 24
<212〉 DNA
<213〉 Artificial
〈400〉 7
gctgccattg tttgtatgta ctgt 24
<210〉 8
<211> 64
<212> 隱
<213〉 Artificial
〈400〉 8
ataatcggta ccgggtgcca gggcgtgccc ttgggctccc cgggcgcgta ctccatacta 60 gttt 6權(quán)利要求
1.一種位點(diǎn)特異整合性慢病毒載體系統(tǒng)，其特征在于，該載體系統(tǒng)由FattbC31UGW質(zhì)粒、CMVΔ8.9-D64N/D116N和包膜質(zhì)粒VSVG組成；FattbC31UGW質(zhì)粒是將attB位點(diǎn)序列和位點(diǎn)特異整合酶C31基因序列依次連接并且克隆到FUGW載體的pacI酶切點(diǎn)而得；CMVΔ8.9-D64N/D116N質(zhì)粒是由CMVΔ8.9質(zhì)粒中的pol基因D64N和D116N突變而得。
2. 如權(quán)利要求1所述慢病毒載體系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，該制備方 法包括以下步驟(1) 獲得Attb-C31編碼序列；(2) 將(1)獲得的序列克隆至FUGW載體pacl酶切位點(diǎn)獲得質(zhì)粒 FattbC31UGW;(3) 以質(zhì)粒CMVA8. 9為模版，將pol基因中的D64N和D116N突變后得 到CMVA8. 9-D64N/D116N;(4) 將FattbC31UGW質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒VSVG和包裝結(jié)構(gòu)質(zhì)粒CMVA 8.9-D64N/D116N質(zhì)?；旌?混合比例為1.5-10: 1-5: 1;即形成如權(quán)利要求1 所述慢病毒載體系統(tǒng)。
3. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，該制備方法中(1)用PCR 方法或者人工合成方法得到Attb-C31整合酶編碼序列。
4. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，該制備方法中(1)中， 首先將attb序列插入CMV-c31質(zhì)粒獲得重組CMV-Attb-C31質(zhì)粒，然后用PCR 方法或者人工合成方法得到Attb-C31整合酶編碼序列。
5. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，該制備方法(3)用定向 突變方法，獲得了 HIV整合酶突變的表達(dá)載體CMVA8. 9-D64N/D116N。
6. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，(4)中采用混合比例為5:4:3 或者4:3:2。
7. —種位點(diǎn)特異性整合試劑盒，其特征在于，該載體試劑盒中含有權(quán)利要 求1所述的慢病毒包裝載體系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種位點(diǎn)特異整合性慢病毒載體及其制備方法。該載體系統(tǒng)由FattbC31UGW質(zhì)粒、CMVΔ8.9-D64N/D116N和包膜質(zhì)粒VSVG組成。為了克服慢病毒載體系統(tǒng)隨機(jī)整合導(dǎo)致插入突變之風(fēng)險(xiǎn)，本發(fā)明對(duì)現(xiàn)有慢病毒載體系統(tǒng)進(jìn)行了改造，并通過(guò)與phiC31整合酶系統(tǒng)結(jié)合，獲得了位點(diǎn)特異整合性慢病毒載體系統(tǒng)。該病毒載體攜帶的轉(zhuǎn)基因可穩(wěn)定整合在宿主基因組特定位點(diǎn)上。作為集有效性、安全性、操作簡(jiǎn)便性于一體的新型慢病毒載體，本發(fā)明一方面可用于鑒定外源基因的功能，尤其是在基因修飾的細(xì)胞工程中的作用；另一方面本發(fā)明為抑制腫瘤和抗病毒等領(lǐng)域的基因治療提供了新的更安全更高效的途徑。
文檔編號(hào)C12N15/867GK101302537SQ200810037440
公開(kāi)日2008年11月12日 申請(qǐng)日期2008年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月15日
發(fā)明者龍 余, 劉紹輝, 朱煥章, 辛清婷 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)