專利名稱：體細(xì)胞重編程的制作方法
體細(xì)胞重編程 相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2007年3月23日提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/919， 687、2007年9 月25日提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/974， 980以及2007年11月19日提交的美國臨時 專利申請?zhí)?0/989， 058的優(yōu)先權(quán)，并將每一申請整體納入本文作參考。
關(guān)于聯(lián)邦資助研究或開發(fā)的申明
無。

背景技術(shù)：
胚胎干細(xì)胞(ES)能夠保持多潛能性無限生長，并能分化為所有三種胚層的細(xì)胞 (Evans和Kaufman, Nature 292 :154-156 (1981))。人ES可用于治療多種疾病，如帕金森病、 脊髓損傷以及糖尿病(Thomson等，Science282 :1145-1147 (1998))?？茖W(xué)家尋找技術(shù)方案， 以避免目前從胚泡細(xì)胞中產(chǎn)生ES細(xì)胞的方法以及避免移植入病人后產(chǎn)生的可預(yù)期的組織 排斥。實(shí)現(xiàn)這些方案所期望的一種方法是從出生后個體的體細(xì)胞中直接產(chǎn)生多潛能細(xì)胞。
將體細(xì)胞核內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到卵細(xì)胞中(Wilmut等，Nature 385 :810-813(1997))或 將其與ES細(xì)胞融合(Cowan等，Science 309 :1369-1373(2005))可使其重編程，表明未受 精卵和ES細(xì)胞含有使體細(xì)胞具有全能性或多潛能性的因子。 同樣，Yu等證明體外分化自HI 0ct4基因敲入ES細(xì)胞的細(xì)胞不表達(dá)EGFP，但將其 與人ES細(xì)胞融合后EGFP的表達(dá)恢復(fù)(Yu等，Stem Cells24 :168-176 (2006)，整體納入本 文作參考)。因此，Yu等證明通過將分化細(xì)胞與ES細(xì)胞融合可使其具有多潛能性。不管 分化細(xì)胞類型， 一旦與未分化人ES細(xì)胞融合，便表達(dá)ES細(xì)胞特異性抗原和標(biāo)記物基因，而 在融合的雜交細(xì)胞中檢測不到分化特異性抗原。有利的是，EGFP表達(dá)在雜交細(xì)胞中重新確 立，這為多潛能干細(xì)胞狀態(tài)的再確立提供了便捷的標(biāo)記物。當(dāng)雜交細(xì)胞形成胚狀體(EB)，所 有三胚層和胚外組織的特征基因均上調(diào)，表明雜交細(xì)胞具有分化為多種譜系的潛能。盡管 尚不完全了解多潛能性的轉(zhuǎn)錄決定，但多種轉(zhuǎn)錄因子包括Oct 3/4(Nichols等，Cell 95: 379-391 (1998)) 、Sox2(Avilion等，Genes Dev. 77 :126-140(2003))和Nanog (Chambers等， Cell 113 :643-655(2003))參與維持ES細(xì)胞的多潛能性；然而，沒有一種因子能夠單獨(dú)確 定ES細(xì)胞特征。 Chambers和Smith (EP 1698639A2, 2002))在沒有飼細(xì)胞層或飼細(xì)胞提取物以及 gpl30細(xì)胞因子的存在下，通過引入編碼或激活分化抑制因子的載體從而維持鼠細(xì)胞的多 潛能性，但未能將分化細(xì)胞轉(zhuǎn)化為多潛能狀態(tài)。 最近，Takahashi和Yamanaka在培養(yǎng)于適合小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)的條件下的小鼠ES 細(xì)胞和成熟小鼠成纖維細(xì)胞中引入四種因子(即0ct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4)獲得誘導(dǎo)性 多潛能干細(xì)胞(iPS)，該誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞表現(xiàn)出小鼠ES細(xì)胞形態(tài)和生長特性，并表達(dá) 小鼠ES細(xì)胞標(biāo)記物基因(Takahashi和Yamanaka， Cell 126:663-676(2006))。值得注意 的是，引入小鼠成纖維細(xì)胞的外源性0ct-4僅引起少量的0ct-4表達(dá)。將iPS細(xì)胞皮下移 植入裸小鼠體內(nèi)得到含有來自所有三種胚層的多種組織的腫瘤。在注射入胚泡后，iPS參 與小鼠胚胎發(fā)育。然而，多潛能誘導(dǎo)必需的c-Myc是一個癌基因。同樣，Klf4是一個癌基因。這些數(shù)據(jù)表明，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)加入幾個明確的因子可從小鼠成纖維培養(yǎng)物中直 接產(chǎn)生多潛能細(xì)胞。然而，如下文所述，如果使用慢病毒載體時不引入其它變化，那么從分 化小鼠細(xì)胞中產(chǎn)生iPS細(xì)胞的某組因子不足以將人體細(xì)胞重編程為多潛能性。
因?yàn)閬碜孕∈蠛腿说腅S細(xì)胞需要截然不同的因子保持未分化狀態(tài)，因此可推測 能將人體細(xì)胞重編程的因子不同于能將模式生物(包括小鼠)體細(xì)胞重編程的因子，這 表明種間差異的顯著性，即便是在哺乳動物中。例如，小鼠ES細(xì)胞增殖的關(guān)鍵通路白血病 抑制因子(LIF)/Stat3通路并不支持人ES細(xì)胞增殖，并似乎在支持人ES細(xì)胞的條件下 無活性(Daheron L等，Stem Cells 22:774-778(2004) ;H卿hrey R等，Stem Cells 22: 522-530(2004)以及Matsuda T等，EMBOJ. 18 :4261-4269 (1999))。 類似地，盡管在無血清培養(yǎng)基中骨形成蛋白(BMP)和LIF—起支持小鼠ES細(xì)胞在 克隆密度下自我更新(Ying Q等，Cell 115 :281-292 (2003)，但在其它支持自我更新的條 件下，如在成纖維細(xì)胞上培養(yǎng)或在成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基中，它們引起人ES細(xì)胞的快速分 化(Xu R等，Nat. Biotechnol. 20 :1261-1264(2002))。事實(shí)上，抑制BMP信號通路在人ES 細(xì)胞中是有益的(Xu R等，Nat. Methods 2:185-190(2005))。 此外，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)信號傳導(dǎo)對于人ES細(xì)胞自我更新重要，但對于 小鼠顯然并非如此(如Xu等(2005)，同上以及Xu C等，Stem Cells23 :315-323 (2005)。
相應(yīng)的，本領(lǐng)域仍在尋找至少能用于重編程靈長類(包括人和非人)體細(xì)胞以產(chǎn) 生多潛能細(xì)胞的一系列潛能決定因子。此類不依賴胚胎組織獲得的細(xì)胞適用于已有的靈長 類多潛能ES細(xì)胞的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明寬泛的概述為涉及將分化的靈長類體細(xì)胞重編程為多潛能細(xì)胞，具體說是 iPS細(xì)胞的方法。本文所用"iPS細(xì)胞"指與其各自來源的分化體細(xì)胞在遺傳學(xué)上基本相同 并表現(xiàn)出與更高潛能細(xì)胞如本文所述ES細(xì)胞特征相似的細(xì)胞?？蓮亩喾N分化(即非多潛 能和多能)體細(xì)胞獲得這種細(xì)胞。 iPS細(xì)胞表現(xiàn)出與ES細(xì)胞類似的形態(tài)(即圓形、大核仁并少細(xì)胞質(zhì))以及生長特 性(即倍增時間；ES細(xì)胞的倍增時間約為17 18小時)。此外，iPS細(xì)胞表達(dá)多潛能細(xì)胞 特異性標(biāo)記物(如Qct-4、SSEA-3、SSEA-4、Tra-l-60和Tra-1-81，但是沒有SSEA-1)。然而 iPS細(xì)胞并不直接源于胚胎，并且至少到該細(xì)胞變成多潛能細(xì)胞，它能瞬時或穩(wěn)定表達(dá)一個 或多個拷貝的所選潛能決定因子。如本文所用術(shù)語"不直接源于胚胎"指產(chǎn)生iPS細(xì)胞的起 始細(xì)胞類型是非多潛能細(xì)胞，例如多能細(xì)胞或終末分化細(xì)胞，如獲自出生后個體的體細(xì)胞。
如本文所述方法，可將至少兩種潛能決定因子引入分化體細(xì)胞并表達(dá)，于是在 培養(yǎng)物中將體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有多潛能細(xì)胞如ES細(xì)胞特征(即表達(dá)至少0ct-4、 SSEA-3、 SSEA-4、 TRA-1-60或TRA_1_81，但不表達(dá)SSEA-1，表現(xiàn)出具有高核質(zhì)比和明顯核仁的致密 集落)、能分化為所有三胚層的特征性細(xì)胞并具有出生后個體體細(xì)胞的遺傳互補(bǔ)性的細(xì)胞。 除了引入編碼潛能決定因子的遺傳材料，重編程(即轉(zhuǎn)化)細(xì)胞與其起源的體細(xì)胞在遺傳 上基本相同。 如本文所用"潛能決定因子"指用于增加體細(xì)胞潛能，使體細(xì)胞變成多潛能性的因 子，如基因或其它核酸、或其功能片段以及編碼因子或其功能性片段。任選地，潛能決定因
5子可在重編程細(xì)胞中僅僅瞬時出現(xiàn)或在重編程細(xì)胞的基因組中維持轉(zhuǎn)錄激活或失活狀態(tài)。 同樣，在重編程細(xì)胞中可出現(xiàn)不止一個拷貝的潛能決定因子，其中潛能決定因子可整合入 細(xì)胞基因組或在染色體外或出現(xiàn)在兩處。潛能決定因子包括但不限于Stella(SEQ ID NO: l)、P0U5Fl(0ct-4 ;SEQID NO :2) 、 Sox2 (SEQ ID NO :3) 、 FoxD3、 UTF1、 Rexl、 ZNF206、 Soxl5、 Mybl2、Lir28(SEQ ID NO :4) 、 Nanog (SEQ ID NO :5) 、 DPPA2、 ESG1、 0tx2及其子集。在一些 實(shí)施方式中，少至兩種潛能決定因子如0ct-4和Sox2就足夠。然而可通過加入其它潛能決 定因子如Lin28、 Nanog或兩者提高獲得重編程細(xì)胞的效率。 在第一個方面，本發(fā)明涉及從出生后個體，特指活體但任選死亡個體中獲得的可 補(bǔ)充的、富集的多潛能細(xì)胞群。富集細(xì)胞群中的細(xì)胞表達(dá)至少一種細(xì)胞類型特異性標(biāo)記物， 包括但不限于0ct-4、SSEA3、SSEA4、Tra-l-60、Tra-l-81或其組合，并具有多潛能細(xì)胞如ES 細(xì)胞的其它特點(diǎn)。此外，多潛能細(xì)胞可表達(dá)堿性磷酸酶(ALP)。此外，多潛能細(xì)胞的基因組 與來自個體的預(yù)先存在的分化細(xì)胞的基因組在遺傳上基本相同。同樣，多潛能細(xì)胞可具有 編碼至少一種潛能決定因子的基因組，其在重編程后提有轉(zhuǎn)錄活性或無轉(zhuǎn)錄活性。此外，潛 能決定因子可為重編程序列的形式，其中編碼潛能決定因子的多核苷酸可操作地連接于異 源啟動子。如本文所用"異源啟動子"指可操作地連接于通常該啟動子不啟動轉(zhuǎn)錄的多核 苷酸的啟動子。 在第二方面，本發(fā)明涉及鑒定將體細(xì)胞重編程為多潛能細(xì)胞所需潛能決定因子的 方法和組合物。 除非另有定義，本文所用所有科技術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員通常所 理解的意思。盡管下文描述了實(shí)踐或檢測本發(fā)明的合適方法和材料，但也可使用其它本領(lǐng) 域所熟知的相似或等同的方法和材料。 聯(lián)系下文說明書詳述及附圖時，能更明顯看出本發(fā)明的其它目的、優(yōu)勢和特點(diǎn)。
附圖簡述

圖1顯示人0ct4啟動子下游的一個位點(diǎn)，可將敲入構(gòu)建物引入該位點(diǎn)。在含有敲 入構(gòu)建物的細(xì)胞中，當(dāng)0ct4啟動子有活性時，表達(dá)增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)和新霉素磷 酸轉(zhuǎn)移酶(NEO)?？墒褂眠@些細(xì)胞評價哪種因子可將體細(xì)胞重編程為多潛能細(xì)胞。
圖2A-B顯示人H1 ES細(xì)胞的分化。圖2A是從人ES細(xì)胞中衍生并純化骨髓前體 細(xì)胞的圖解。圖2B顯示Percoll⑧分離后所獲分化細(xì)胞的表型分析?；疑€同種型對 照；黑色線抗體染色。縮略詞hESC，人胚胎干細(xì)胞；MPO，髓過氧化物酶；pHEMA，聚甲基丙 烯酸-2-羥乙酯。 圖3顯示含圖1敲入構(gòu)建物的Oct區(qū)域。 圖4A-C顯示體細(xì)胞的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。圖4A顯示了慢病毒構(gòu)建物的示意圖。圖4B 顯示以不同MOI用EGFP慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)Percoll⑧純化細(xì)胞。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后三天(未進(jìn) 行藥物篩選)，用流式細(xì)胞術(shù)分析EGFP表達(dá)。圖4C顯示在基質(zhì)膠⑧上繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)天后用慢 病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)Percoll⑧純化細(xì)胞。在慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后兩天分析EGFP表達(dá)。 圖5顯示在基質(zhì)膠⑧上分化7天后細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因的過表達(dá)。在過表達(dá)Nanog或 EGFP(對照)的細(xì)胞中未觀察到顯著的形態(tài)學(xué)變化。0ct4表達(dá)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生顯著變化， 許多這類細(xì)胞在新霉素篩選中存活，但這類細(xì)胞均不顯示典型的人ES細(xì)胞形態(tài)，表明表達(dá) 0ct4的ES細(xì)胞的藥物可選擇群體未能渡過骨髓分化所需的培養(yǎng)期。
圖6A-B顯示通過引入14種潛能決定因子使0ct4KICD45+A細(xì)胞重編程。圖6A顯 示建立的克隆，表現(xiàn)出未分化人ES細(xì)胞形態(tài)并在內(nèi)源性0ct4啟動子的作用下表達(dá)EGFP。 圖6B顯示在建立克隆中人ES細(xì)胞特異性細(xì)胞表面抗原表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析。灰色線 同種型對照；黑色線抗體染色。 圖7A-C顯示以引入不同潛能決定因子集合后的集落形成表示的重編程效率。圖 7A顯示將標(biāo)明的14種潛能決定因子的集合以組合形式引入細(xì)胞，其中每一組合不包括14 種因子中的一種。通過評價潛能決定因子將受試細(xì)胞重編程為ES樣狀態(tài)的能力，發(fā)明人確 定被排除的潛能決定因子是否是重編程所必需。例如，缺少0ct-4的名為Ml的潛能決定因 子集合(記為Ml-0ct-4)不能形成顯著數(shù)目的ES樣集落。因此結(jié)論是0ct-4對于體細(xì)胞重 編程很重要。圖7B顯示為進(jìn)一步測試評價的潛能決定因子集合(比圖7A范圍小)范圍從 14種縮小到4種(M4，為0ct-4、 Sox2、 Lin28和Nanog)。通過依次從組合中排除四種中的 一種測試這四種潛能決定因子。當(dāng)三種潛能決定因子組合(如M4-0ct-4)無法重編程受試 細(xì)胞形成顯著數(shù)目的ES樣克隆，發(fā)明人得出略去的基因?qū)τ隗w細(xì)胞重編程很重要的結(jié)論。 在圖7B中，淺灰色柱表示最小分化大克隆的數(shù)目。圖7C顯示為進(jìn)一步測試評價的潛能決 定因子集合(比圖7B范圍縮小)范圍從4種縮小到2種(即0ct-4和Sox2)。通過依次從 組合中排除0ct-4、 Sox2、 Lin28和Nanog中的兩種測試這四種潛能決定因子。
圖8A-B顯示成年人皮膚成纖維細(xì)胞重編程。圖8A顯示成年人皮膚細(xì)胞(p5)(左) 以及重編程細(xì)胞(右)的明視場圖像。圖8B顯示成年人皮膚細(xì)胞(p5)(下)和重編程細(xì)
胞(上)中人ES細(xì)胞特異性標(biāo)記物的流式細(xì)胞術(shù)分析?；疑€同種型對照；黑色線抗
體染色。 圖9A-B顯示0ct4和Sox2的相對表達(dá)對于重編程的影響。圖9A顯示 293FT細(xì)胞中0ct-4和Sox 2的Western印跡分析；泳道1， pSin4-EF2-0ct4-IR ESl-Sox2(0S-IRESl); 泳道2， pSin4-EF2-0ct4-IRES2-Sox2(0S-IRES2); 泳道3， pSin4-EF2-0ct4-F2A-Sox2(0S-F2A);泳道4， pSin4-EF2-0ct4-IRESl-puro (0);泳道5， pSin4-EF2-Sox2-IRESl-puro(S);泳道6，無質(zhì)粒(對照)。圖9B顯示使用連接的(linked) 潛能決定因子使衍生自敲入0CT4的人ES細(xì)胞的間充質(zhì)細(xì)胞重編程；基因組合與圖9A相 同，另外還有pSin4-EF2-Nanog-IRES l-puro (N)和pSin4-EF2-Lin28-IRES I-puro (L)。
優(yōu)選實(shí)施方式詳述 本發(fā)明假設(shè)靈長類ES細(xì)胞中的潛能決定因子在維持多潛能性中扮有重要角色， 并且通過表達(dá)潛能決定因子可使分化的體細(xì)胞重編程為多潛能狀態(tài)。 分化過程中細(xì)胞經(jīng)歷不同的潛能水平，如全能、多潛能和多能。本文尤感興趣的是 多潛能細(xì)胞。如本文所用"多潛能細(xì)胞"指能分化成所有三胚層(如內(nèi)胚層、中胚層和外胚 層)的細(xì)胞群體。多潛能細(xì)胞表達(dá)多種多潛能細(xì)胞特異性標(biāo)記物，并具有以未分化細(xì)胞為 特征的形態(tài)(即致密集落、高核質(zhì)比以及明顯核仁)，在引入免疫缺陷型動物如SCID小鼠 上能形成畸胎瘤?；チ鐾ǔ：芯哂腥邔犹卣鞯募?xì)胞或組織。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員能 使用本領(lǐng)域常用技術(shù)評定這些特征。參見Thomson等，同上。多潛能細(xì)胞既能在細(xì)胞培養(yǎng) 中增殖，也能分化為表現(xiàn)多能特性的多種種系限制細(xì)胞群。多能體細(xì)胞相對于多潛能細(xì)胞 進(jìn)一步分化，但并非終末分化。因此多潛能細(xì)胞比多能細(xì)胞具有更高的潛能。如本文所用 "重編程多潛能靈長類干細(xì)胞"(以及相似表述)指體細(xì)胞重編程方法的多潛能產(chǎn)物。此類細(xì)胞可用于目前考慮使用人ES細(xì)胞的研究和治療應(yīng)用中。 本發(fā)明廣泛涉及將分化體細(xì)胞重編程為具有更高潛能的細(xì)胞如多潛能細(xì)胞的新 方法，這些方法通過將至少兩種潛能決定因子給予體細(xì)胞，而在重編程細(xì)胞中得到比體細(xì) 胞水平更高的潛能。本發(fā)明可方便從體細(xì)胞中產(chǎn)生多潛能細(xì)胞，如iPS細(xì)胞，而無需加入 用于將潛能決定因子引入體細(xì)胞的細(xì)胞表面受體。如本文所用"重編程"指一種遺傳學(xué)過 程，其將分化體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為去分化的多潛能細(xì)胞，因此比其起源的細(xì)胞具有更高的潛能。即 重編程細(xì)胞表達(dá)至少一種下列多潛能細(xì)胞特異性標(biāo)記物SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60或TRA 1-81。重編程細(xì)胞優(yōu)選表達(dá)所有這些標(biāo)記物。 能重編程體細(xì)胞的潛能決定因子包括但不限于0ct-4、 Sox2、 FoxD3、 UTFl、 Stella、Rexl、ZNF206、Soxl5、Mybl2、Lin28、Nanog、DPPA2、ESGl、0tx2或其組合。在實(shí)施例 中，含有14種因子中少至2種的集合就足以重編程受試細(xì)胞；該集合包括0ct-4和Sox2。 然而除0ct-4和Sox2外加入其它潛能決定因子能提高獲得重編程細(xì)胞的效率。然而，c-Myc 和Klf4不是必需的潛能決定因子。潛能決定因子優(yōu)選為轉(zhuǎn)錄因子。 任意體細(xì)胞均可為合適的體細(xì)胞，雖然當(dāng)起始體細(xì)胞倍增時間約為24小時時，觀 察到更高的重編程頻率。用于本發(fā)明的體細(xì)胞是獲自胎兒、新生兒、青少年或成年靈長動物 包括人的非胚胎細(xì)胞?？捎糜诒疚乃龇椒ǖ捏w細(xì)胞的例子包括但不限于骨髓細(xì)胞、上皮 細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、造血細(xì)胞、肝細(xì)胞、腸細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、骨髓前體細(xì)胞和脾細(xì)胞。體細(xì)胞 的另一類型是貼于基板的CD29+CD44+CD166+CD105+CD73+和CD31—間充質(zhì)細(xì)胞。此外，體細(xì)胞 可為能自我增殖并分化為其它類型細(xì)胞的細(xì)胞，包括血液干細(xì)胞、肌肉/骨骼干細(xì)胞、腦干 細(xì)胞和肝臟干細(xì)胞。多能造血細(xì)胞、合適的骨髓前體或間充質(zhì)細(xì)胞特別適用于本發(fā)明方法。
同樣，合適的體細(xì)胞可接受，或使用科學(xué)文獻(xiàn)中通常所知的方法使其可接受以攝 取潛能決定因子，包括編碼這些因子的遺傳材料。攝取增強(qiáng)方法根據(jù)細(xì)胞類型和表達(dá)系統(tǒng) 有所不同。本領(lǐng)域了解制備具有合適轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的接受性體細(xì)胞所用的示例性條件，并在下 文實(shí)施例中進(jìn)行描述。下文描述的一種使細(xì)胞接受潛能決定因子的方法與電穿孔方法有 關(guān)。 可將潛能決定因子作為重編程序列引入，其中潛能決定因子的編碼多核苷酸序列 可操作地連接于異源啟動子，該序列可能在體細(xì)胞重編程后無活性。異源性啟動子為在體 細(xì)胞中驅(qū)動潛能決定因子編碼多核苷酸序列表達(dá)的任何啟動子序列，如0ct4啟動子。
可調(diào)整潛能決定因子的相對比例以提高重編程效率。例如，與向細(xì)胞提供獨(dú)立的 構(gòu)建物和載體形式的潛能決定因子的重編程效率(這時無法控制每個潛能決定因子進(jìn)入 單一細(xì)胞的攝取比例)相比，將0ct-4和Sox2以1 : 1比例連接在單一載體上使細(xì)胞的重 編程效率提高四倍(圖9A-B)。盡管根據(jù)所用潛能決定因子集合的不同，潛能決定因子的比 例可能不同，但掌握本公開內(nèi)容的一般技術(shù)人員易于決定潛能決定因子的最優(yōu)比例。
可在任意支持多潛能細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多潛能細(xì)胞。典型的培養(yǎng)基包 括但不限于成分確定的培養(yǎng)基，如TeSRTM(加拿大溫哥華，干細(xì)胞技術(shù)公司)(StemCell Technologies, Inc. ;Vancouver， Canada) 、mTeSR (干細(xì)胞技術(shù)公司)禾口StemLine⑧無血清 培養(yǎng)基(密蘇里州圣路易斯，西格瑪公司)(Sigma ;St. Louis，M0)，以及條件培養(yǎng)基，如小鼠 胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)條件培養(yǎng)基。如本文所用"成分確定的培養(yǎng)基"指僅含生化明確組 分的生化明確的制劑。成分確定的培養(yǎng)基也僅包括具有已知化學(xué)組成的組分。成分確定的培養(yǎng)基還可包含源于已知來源的組分。如本文所用"條件培養(yǎng)基"指還補(bǔ)充有來自培養(yǎng)基 中培養(yǎng)細(xì)胞的可溶性因子的生長培養(yǎng)基。此外，細(xì)胞可維持于培養(yǎng)基中的MEF上。
發(fā)明人使用基因表達(dá)連續(xù)分析(SAGE)文庫獲取ES細(xì)胞中富集基因的轉(zhuǎn)錄組概 況。具體說，使用SAGE文庫鑒定調(diào)節(jié)ES細(xì)胞多能性和自我更新的潛能決定因子。SAGE文 庫為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所知，可從公開渠道獲得或可由某些公司，如馬薩諸塞州貝弗利 的安進(jìn)科生物科技公司(Agencourt Bioscience Corp. ， Beverly, MA)具體構(gòu)建。
另一方面，本發(fā)明提供了遺傳學(xué)上與出生后個體細(xì)胞基本一致的多潛能細(xì)胞的富 集群體，?？赏ㄟ^將分離自出生后個體的體細(xì)胞重編程獲得這種細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中， 細(xì)胞群是純化的群體，占群體細(xì)胞的至少60%、70%、80%甚至多于95%，或介于其間的任 意和所有整數(shù)或分?jǐn)?shù)。重編程細(xì)胞是整倍體，表現(xiàn)出多潛能細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征并表達(dá)多潛 能細(xì)胞特異性標(biāo)記物，如0ct-4、 SSEA-3、 SSEA-4、 Tra-l-60、 Tra-1-81或其組合，并在引入 免疫缺陷動物時形成畸胎瘤。 另一方面還提供了鑒定并使用足以將體細(xì)胞重編程為多潛能細(xì)胞的潛能決定因 子的方法和組合物。如本文所注明的，重編程的多潛能細(xì)胞包含與獲自出生后個體的體細(xì) 胞在遺傳學(xué)上基本相同的遺傳補(bǔ)充物。通常，鑒定潛能決定因子的方法包括以下步驟將編 碼一種或多種推定的潛能決定因子的遺傳材料引入體細(xì)胞，該體細(xì)胞能在有效表達(dá)引入遺 傳材料編碼因子的條件下接受攝取遺傳材料，其表達(dá)水平足以將該細(xì)胞重編程為低分化、 高潛能狀態(tài)；以及在引入遺傳材料后觀察多潛能細(xì)胞群體。多潛能細(xì)胞可通過細(xì)胞形態(tài)、多 潛能細(xì)胞特異性標(biāo)記物或兩者進(jìn)行表征。多潛能細(xì)胞可方便地通過細(xì)胞中提供的標(biāo)記物在 處理細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行鑒定，以便僅當(dāng)將細(xì)胞重編程為多潛能狀態(tài)時才表達(dá)。通過這個方 法可鑒定能將體細(xì)胞重編程為多潛能細(xì)胞的潛能決定因子，如下面實(shí)施例所述。
使用載體如整合或非整合載體通過轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)將編碼潛能決定因子的遺傳材料 引入體細(xì)胞。本文尤感興趣的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。在接觸細(xì)胞前將載體包裝到病毒體中， 以便轉(zhuǎn)導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，尤其是慢病毒載體。在引入后，編碼潛能決定因子的DNA片段可 位于染色體外(如附加型質(zhì)粒)或穩(wěn)定整合入細(xì)胞的染色體。 基于病毒的基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)載體是一種遺傳構(gòu)建物，該構(gòu)建物能夠體外或體內(nèi)高 效和強(qiáng)效地將遺傳材料遞送到多數(shù)細(xì)胞類型中，包括非分裂以及難轉(zhuǎn)染細(xì)胞(原代、血液、 干細(xì)胞)。整合入基因組DNA的基于病毒的構(gòu)建物引起高水平表達(dá)。除了編碼感興趣潛 能決定因子的DNA片段，載體還包含分別可操作地連接于DNA片段上游和下游的轉(zhuǎn)錄啟動 子和多聚腺苷酸化信號。該載體可包含編碼單一潛能決定因子的單一DNA片段，或編碼多 種潛能決定因子的DNA片段?？蓪⒍喾N載體引入單個體細(xì)胞。該載體可任選編碼用于鑒 定攝取并表達(dá)該載體的細(xì)胞的選擇性標(biāo)記物。如，當(dāng)載體使細(xì)胞具有抗生素抗性時，可在 培養(yǎng)基中加入抗生素以鑒定成功引入載體的細(xì)胞。如在實(shí)施例中，可使用整合載體以驗(yàn)證 概念。逆轉(zhuǎn)錄病毒(如慢病毒)載體是整合載體；然而也可以使用非整合載體。根據(jù)需 要，此類載體在重編程后可通過稀釋從細(xì)胞中丟失。EB病毒(EBV)是一種合適的非整合載 體。Ren C等，Acta. Biochim. Biophys. Sin. 37 :68-73(2005);和Ren C等，Stem Cells 24: 1338-1347 (2006)，通過引用每一文獻(xiàn)的全文納入本文。 使用本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)可構(gòu)建并工程改造本文所述載體，以增加其用于治療的安 全性以及使其包含合適的表達(dá)元件和治療基因。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員了解適用于本發(fā)明的
9構(gòu)建表達(dá)載體的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，并能參考如Sambrook J等，"分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊"(第三版)， 紐約冷泉港市冷泉港出版社，2001(" Molecular cloning :a laboratory manual, 〃 (3rd ed. Cold SpringHarbor Press, Cold Spring Harbor,N. Y. 2001)，通過弓l用將其全文纟內(nèi)入本文。 在體細(xì)胞中提供處于僅在體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為多潛能狀態(tài)后有活性的啟動子控制下的 非致死性標(biāo)記物有利于鑒定和富集多潛能細(xì)胞的能力，這些標(biāo)記物包括例如綠色熒光蛋白 (GFP)、增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)或螢光素酶。通過可見細(xì)胞選擇技術(shù)，如熒光細(xì)胞分選技 術(shù)，使用選擇性標(biāo)記物基因鑒定表達(dá)該標(biāo)記物的重編程細(xì)胞。此外，可生產(chǎn)不含選擇性標(biāo)記 物的重編程細(xì)胞。在下面的實(shí)施例中，在體細(xì)胞的基因組中調(diào)節(jié)0ct-4表達(dá)的啟動子下游 提供了一個標(biāo)記物。在未分化的多潛能ES細(xì)胞中內(nèi)源性的0ct4啟動子有活性。表達(dá)0ct-4 的藥物選擇性ES細(xì)胞群未能渡過骨髓細(xì)胞分化所需的培養(yǎng)時期。但是，因?yàn)橐恍?ct-4表 達(dá)能夠持續(xù)至早期分化階段，所以適合通過選擇具有特征性ES細(xì)胞形態(tài)的集落并在ES細(xì) 胞維持培養(yǎng)條件下維持以富集多潛能細(xì)胞群。并無意于使重編程細(xì)胞培養(yǎng)物中所有細(xì)胞均 具有所需潛能水平?？紤]到細(xì)胞分選技術(shù)的效率低下，以及基因表達(dá)水平和其它生物學(xué)效 應(yīng)的不同，富集群體里面的一些細(xì)胞并非多潛能性細(xì)胞。然而，在實(shí)踐水平上，來源于體細(xì) 胞的重編程細(xì)胞群中富含多潛能細(xì)胞。 利用本領(lǐng)域公認(rèn)的多種技術(shù)，如通過Cre-介導(dǎo)的定點(diǎn)基因剪切移除，可構(gòu)建非致 死性標(biāo)記物使其能夠后續(xù)移除。例如，也許需要在獲得多潛能細(xì)胞群后刪除標(biāo)記物基因以 避免標(biāo)記物基因產(chǎn)物對細(xì)胞實(shí)驗(yàn)或操作的干擾。靶向刪除可通過在標(biāo)記物基因附近提供易 于剪切的結(jié)構(gòu)完成。即可使用Cre/Lox遺傳元件?？蓪ox位點(diǎn)構(gòu)建到細(xì)胞中。如果需 要從多潛能細(xì)胞中移除標(biāo)記物，可在細(xì)胞中加入Cre試劑。也可使用其它相似體系。因?yàn)?Cre/Lox剪切可引入不需要的染色體重排并可能在剪切后留下殘余遺傳材料，發(fā)明人意識 到需使用非整合的附加型基因載體將潛能決定因子引入體細(xì)胞中，并獲得在隨后撤去重編 程步驟中用于維持載體的藥物選擇后附加型載體會丟失(如以每代5%的速度)的細(xì)胞。
提供下列實(shí)施例以便進(jìn)一步非限制性地說明鑒定將體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為多潛能細(xì)胞的 潛能決定基因或因子的方法。在一些實(shí)施例中，敲入H1 0ct4的人ES細(xì)胞在與基質(zhì)細(xì)胞共 培養(yǎng)時分化并產(chǎn)生合適用作可重編程的體細(xì)胞的細(xì)胞。這些細(xì)胞作為分離自出生后個體的 細(xì)胞的模型用于體細(xì)胞重編程方法。 用其它分化的細(xì)胞類型重復(fù)這些方法。 一種細(xì)胞類型是人胚肺成纖維細(xì)胞 IMR-90。參見Nichols W等，Science 196 :60-63 (1977)，通過引用全文納入本文。ENCODE 協(xié)會(ENCODE Consortium)已對IMR-90細(xì)胞進(jìn)行詳細(xì)表征，該細(xì)胞可從美國典型培養(yǎng)物保 藏中心(American Type CultureCollection) (ATCC ;弗吉尼亞洲馬納薩斯(Manassas, VA); 目錄號CCL-186)，并具有公開DNA指紋可用于獨(dú)立確認(rèn)重編程克隆的起源。此外，這些細(xì)胞 在伊格爾極限必需培養(yǎng)基(Eagle' s Minimal Essential Medium)-10% FBS中生長旺盛， 在衰老前可進(jìn)行多于20次傳代，但在人ES細(xì)胞培養(yǎng)條件下生長緩慢，這種差異為重編程克 隆提供了增殖優(yōu)勢并有助于僅通過形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行選擇。其它適用于本方法的分化細(xì)胞類 型包括人出生后包皮成纖維細(xì)胞(ATCC ;目錄號CRL-2097)和成年人皮膚細(xì)胞(ATCC ;目錄 號CRL-2106)。 使細(xì)胞接受下述病毒表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。用被認(rèn)為與多潛能性相關(guān)的潛能決定因子
10的編碼多核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)體細(xì)胞，從而將體細(xì)胞重編程為多潛能細(xì)胞。尚未測定在轉(zhuǎn)導(dǎo)載體中 提供的所有14種潛能決定因子是否均被攝取并在體細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明已鑒定足以重編 程體細(xì)胞的14種潛能決定因子的集合以及這14種因子中至少2種的子集后，本發(fā)明使本 領(lǐng)域一般技術(shù)人員具有鑒定也能夠進(jìn)行體細(xì)胞重編程的潛能決定因子的一種或多種特定 子集的能力，從而利于鑒定此類潛能決定因子的其它子集。因此，下文所述方法利于鑒定參 與體細(xì)胞重編程為多潛能細(xì)胞的潛能決定因子。 可明確預(yù)知足以重編程體細(xì)胞的潛能決定因子集合根據(jù)體細(xì)胞類型有所不同。值 得注意的是，接觸14種潛能決定因子的集合導(dǎo)致在所示體細(xì)胞培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)變成多潛能狀 態(tài)。如下所示，可通過利用不同潛能決定因子的組合重復(fù)下文所示方法來鑒定足以對其它 細(xì)胞重編程的潛能決定因子集合，可包含14種因子種的一些或全部以及其它潛能決定因 子。因此，可產(chǎn)生與已存在的分化體細(xì)胞遺傳學(xué)基本相同的多潛能細(xì)胞系/群。
實(shí)施例 在下列實(shí)施例中，分化細(xì)胞接收編碼不同潛能決定因子的載體。 一些細(xì)胞的基因 組中含有編碼EGFP的標(biāo)記物基因，其位于受調(diào)節(jié)的0ct4啟動子下游，其只在在多潛能細(xì)胞 中有活性。Yu等，同上描述了這種有用工具的產(chǎn)生，表明將分化細(xì)胞和人ES細(xì)胞融合可使 分化細(xì)胞具有多潛能性。 實(shí)施例1 :慢病毒載體的包裝和產(chǎn)生 在293FT細(xì)胞系(英杰公司(Invitrogen))中產(chǎn)生表達(dá)轉(zhuǎn)基因的慢病毒載體。 293T是一種源于轉(zhuǎn)化的293胚腎細(xì)胞的快速生長易于轉(zhuǎn)染的克隆變體，它包含大T抗原用 于高水平表達(dá)包裝蛋白，得到更高的病毒滴度。對于日常維持和擴(kuò)增，將這些細(xì)胞培養(yǎng)于含 500 ii g/ml遺傳霉素的293FT培養(yǎng)基中(DMEM/10% FBS， 2mM L-谷氨酰胺和0. ImM MEM非 必需氨基酸)。包裝時，通過胰酶消化收集293FT細(xì)胞。離心去除胰酶后，將這些細(xì)胞分裝 于裝有不含遺傳霉素的293FT培養(yǎng)基的T75培養(yǎng)瓶中(15x106個細(xì)胞/瓶，每一構(gòu)建物6 瓶)。 在細(xì)胞分裝后立即使用Superfect 轉(zhuǎn)染試劑(凱杰公司)(Qiagen)進(jìn) 行慢病毒載體和兩種輔助質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染(每瓶中慢病毒MD. G :pCMVdeltaR8. 9 : Superfect = 5 ng : 5 ng : 10 pg : 40 pl，混合于400 y 1 Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基 中(Iscove' s Modified Dulbecco' s Medium) (IMDM) (IX)，室溫下孵育10分鐘)。第二 天用含ImM丙酮酸鈉的新鮮293FT培養(yǎng)基替換含有轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基(8毫升/瓶)。轉(zhuǎn) 導(dǎo)后約48-72小時收集含慢病毒的上清液(每一構(gòu)建物 48ml) 。 4°C 3000rpm(1750g)離 心15分鐘去除上清中的293FT細(xì)胞碎片。為了濃縮慢病毒，用0.4iiM醋酸纖維素(CA)膜 過濾上清液(康寧頓公司(Cornington) ，115ml低蛋白結(jié)合)，并且在70ml無菌瓶(貝克曼 公司(Beckman)，貨號355622，聚碳酸酯，僅用于45Ti轉(zhuǎn)頭)中，4。C 33， 000rpm(50， 000g) 超速離心2.5小時。慢病毒及剩余細(xì)胞碎片在離心管底部形成可見團(tuán)塊。去除上清后， 加入PBS (每一構(gòu)建物 300 ill)在4t:振蕩離心管8-12小時，或在室溫下振蕩2小時以 重懸團(tuán)塊。5000rpm(2700g)離心5分鐘去除剩余細(xì)胞碎片，將重懸的慢病毒分裝并儲存 于-8(TC。濃縮后獲得的滴度范圍通常是107-108病毒顆粒(vp)/ml。序列表中提供了含有 Stella(SEQ IDN0:1)的慢病毒序列(pSIN4-EF2-Stella-puro ;SEQ ID NO :6，含有Stella序列3604-4083)。所有其它潛能決定因子(如SEQ ID NO :2_5)使用相同序列，但用其它 潛能決定因子序列替代Stella序列(SEQ ID NO:l)。 為了有效地將潛能決定因子引入骨髓細(xì)胞，發(fā)明人改造了慢病毒表達(dá)系統(tǒng)(圖 4A)。發(fā)明人通過連續(xù)刪除分析去除5'和3' LTR相鄰序列，降低了原始慢病毒構(gòu)建物(> llkb)的大小。這些改造盡量減少了對于包裝效率的負(fù)面影響。常規(guī)獲得的滴度范圍在 105-106vp/ml上清，濃縮后為107-108vp/ml (通過超速離心)。在骨架中引入限制性位點(diǎn)以 便于交換特定轉(zhuǎn)基因的編碼區(qū)。 輔你l 2 :'瞎自離斜瞎肯P匕船附表汰后麯禾罕擺餘麵
為了鑒定能使分化細(xì)胞重編程回到多潛能狀態(tài)的基因，需要有效的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。首 先，發(fā)明人在Percol產(chǎn)純化敲入Hl 0ct4的人ES細(xì)胞后立即檢測慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率(圖2)。
將HI. 1人ES細(xì)胞(WiCell研究所，威斯康星麥迪遜；WiCell Researchlnstitute ;Madison， WI)維持于DEME/F12培養(yǎng)基中經(jīng)輻射的小鼠胚胎成纖維細(xì) 胞(MEF)上，所述DEME/F12培養(yǎng)基含80% Dulbecco改良的伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco' s modified Eagle' s medium)(無丙酮酸鹽，高葡萄糖配方；英杰公司；加州卡爾斯巴德 (Invitrogen ;Carlsbad， CA)) 、20 %敲除血清替代物、1 %非必需氨基酸(吉布科公司) (Gibco)、lmM L-谷氨酰胺、0. lmMI3-巰基乙醇(西格瑪公司)(Sigma)以及4ng/ml堿性成 纖維細(xì)胞生長因子(除非另有所述，所有試劑來自于英杰公司)，如前所述(參見Amit等， Dev Biol. 227 :271-278(2000) ;Thomson等，Science 282 :1145-1147 (1998)，通過引用將 每一參考文獻(xiàn)全文納入本文)。如Ludwig等所述在基質(zhì)膠⑧(BD生物科學(xué)公司，馬薩諸塞貝 爾福德)(BD Biosciences, Bedford, MA)上用化學(xué)成分確定的TeSR 培養(yǎng)基(干細(xì)胞技術(shù) 公司)(StemCell Technologies, Inc.)進(jìn)行無飼細(xì)胞培養(yǎng)。Ludwig T等Nat. Methods. 3 : 637-646(2006) ;Ludwig T等，Nat. Biotechnol. 24 :185-187 (2006)，通過引用將每一參考 文獻(xiàn)全文納入本文。 根據(jù)Zwaka和Thomson所述的方法，從HI. 1人ES細(xì)胞產(chǎn)生敲入H10ct4的ES細(xì) 胞系。美國專利
發(fā)明者J·托馬森, 俞君英 申請人:威斯康星校友研究基金會