專利名稱：人乳頭瘤病毒(hpv)型檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及臨床樣品中人乳頭瘤病毒(HPV)的檢測、分型及定量。更具體地說，它涉及能夠用于擴增反應(yīng)并用于多個HPV基因組的同步檢測、分型和定量的寡核苷酸序列及其診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
20世紀80年代人乳頭瘤病毒(HPV)感染就被報道為宮頸癌的成因。癌癥惡性腫瘤與HPV基因型之間的關(guān)系被認為是有意義的。自此已鑒定出多于120種的HPV型。在粘膜上皮中已識別出13種HPV型具有致瘤性。這些型包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、 52、56、58、59 和 66。人乳頭瘤病毒感染局限于上皮，限制了其與免疫器官的接觸并且其具有不良的免疫原性。因此，對于HPV來說血清學(xué)并不是有效的測試手段。同樣地，培養(yǎng)也不是有效的診斷技術(shù)。雖然在體外復(fù)制病毒生命周期是可能的，但這是需要體外分化上皮細胞培養(yǎng)的高度精細的組織培養(yǎng)技術(shù)。此外，重度的宮頸腫瘤和癌癥不產(chǎn)生病毒。因此，HPV測試依賴于病毒核酸的檢測。已顯示對于重度宮頸增生(cervical dysplasia)來說HPV測試比PAP測試(帕帕尼科拉烏測試，Papanicolaou test)具有更高的靈敏度，雖然由于良性的、短暫的HPV感染的高患病率其特異性較低。許多國家已采用HPV測試作為輕度和可疑增生的二級篩選(分類)測試并且也已建議其用于初步篩選中。目前主要的HPV測試是Digene HCII測試，它的效用得到大部分科技文獻的支持。 在該測試中樣品中的HPV DNA與互補的RNA雜交，并且所生成的DNA-RNA雜交體被固體表面上的抗體捕獲，隨后在固體表面與抗體-酶軛合物結(jié)合，由酶催化的化學(xué)發(fā)光檢測。LCII 測試不區(qū)分不同的致瘤的HPV型。也可以利用原位雜交用標記有熒光部分的探針(熒光原位雜交，F(xiàn)ISH)或標記有可以與酶軛合物結(jié)合在原位產(chǎn)生不溶性有色沉淀的半抗原的探針檢測固定細胞中的HPV。 原位雜交能夠提供有關(guān)HPV定位和物理狀態(tài)的有價值的信息，但是不能做到同一樣品中多重HPV型的型特異性檢測。很多篩選權(quán)威機構(gòu)表達了對二級篩選中基因分型測試的偏愛，因為該測試允許將呈良性的系列短暫感染與呈非良性的型特異性持續(xù)感染區(qū)分開。此外，一些HPV型，特別是 HPV16，呈更顯著的病毒致癌性。最后，基因分型測試的使用提供了有效的流行病學(xué)信息，該信息在監(jiān)測針對HPV16 和HPV18的疫苗接種的群體效應(yīng)方面具有特別的價值?？捎玫腍PV基因分型測試主要基于PCR及隨后某些形式的反向雜交。PCR步驟靶向Ll或El基因。PCR擴增子在擴增過程中被標記并與微陣列上、膜條帶上或微量滴定板孔中的固定探針雜交。結(jié)合的標記擴增子隨后被檢測，如果擴增子被熒光部分標記則直接通
5過熒光檢測法檢測，或使用與標記物結(jié)合的酶軛合物并且使用比色或發(fā)光檢測技術(shù)檢測。 此類測試包括在需要嚴格衛(wèi)生措施的開放的實驗室中處理PCR擴增子。這一點，結(jié)合這種測試的高價格，使可用的測試超出了大多數(shù)大規(guī)模篩選程序能力所及。
使用SDA (序列依賴性擴增)檢測來自病毒腫瘤基因E6和E7的mRNA的基因分型測試也是可行的。然而，該方法只檢測13種致瘤型中的5種且僅在存在活性腫瘤基因表達時檢測。WO 2007115582A1描述了用于通過實時PCR檢測多重HPV型的PCR引物和探針的集合。這些集合包括引物的復(fù)雜的組合。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，只需要一種正向引物和四種反向引物。這簡化了質(zhì)量控制和生產(chǎn)并節(jié)約了成本。而且，WO 2007115582A1中靶向的基因經(jīng)受型內(nèi)序列變異(intratypic sequence variation)。這種變異不在考慮范圍之內(nèi)。因此在含有HPV序列變異而非原型序列的臨床樣品中可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明，在引物和探針設(shè)計之前已將Ll基因靶區(qū)域內(nèi)的已知的序列變異納入考慮范圍，并避免或通過引物序列的修飾負責(zé)所有變異位置。進一步地，WO 2007115582A1中聲明獲得所有靶向HPV型的低達100個拷貝的靈敏度。然而，所描述的實驗并不包括載體DNA的使用。這給出對靈敏度的不切實際的樂觀估計，因為臨床樣品中存在的人類DNA抑制PCR靈敏度。根據(jù)本發(fā)明的方法的靈敏度在500ng 人類DNA存在下測量，500ng人類DNA相當于7. 5 X IO4個人類細胞，從而準確模擬了富含細胞的臨床樣品中的條件。因此本發(fā)明提供了現(xiàn)實條件下增強的靈敏度。此外，WO 2007115582A1描述了單管13-重(13-plex)多重PCR測試的使用。然而，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)似乎并不存在能夠進行這樣的測試的儀器。根據(jù)本發(fā)明的方法可以在現(xiàn)有可獲得的儀器上以所提議的規(guī)格或其變型或類似條件操作。WO 2009011472A1中用于PCR測試的靶基因是E1。然而，在癌癥發(fā)展過程中該基因是缺失和插入的熱點。因此假陰性結(jié)果的可能性隨疾病的嚴重程度而增加。根據(jù)本發(fā)明的方法以Ll基因為靶標，其具有低得多的缺失傾向。此外，在WO 2009011472A1中HPV的檢測和分型方法包括在開放的實驗室中處理 PCR產(chǎn)物。這包括攜帶污染(carry-over contamination)的風(fēng)險。根據(jù)本發(fā)明的方法在封閉系統(tǒng)中操作，消除了這一風(fēng)險，從而保證更可靠的結(jié)果并消除開放實驗室PCR后續(xù)工作之后凈化裝備和設(shè)施所需的額外的勞動。根據(jù)上述內(nèi)容，本領(lǐng)域因此需要用于HPV檢測和分型的新的方法、引物、探針和試劑盒，其高度靈敏、可再現(xiàn)且比現(xiàn)有測試方法更便宜，并且因此適于大規(guī)模篩選程序。發(fā)明概述本發(fā)明表述實時定量PCR(quantitative realtime PCR)方法的開發(fā)，所述方法使用通用引物(consensus primer)和多重的型特異的TaqMan探針，允許13種致瘤的HPV型 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和66的靈敏的且特異性的檢測和分型。而且， 根據(jù)本發(fā)明的方法檢測 HPV 型 HPV6、1U6、40、42、43、44、53J4、61、68、70、72、73、82。更具體地，本發(fā)明涉及在生物樣品中檢測和/或分型和/或定量人乳頭瘤病毒 (HPV)型的存在的方法，所述測試包括以下步驟(i)HPV的核酸片段在以下的存在下的擴增DNA聚合酶，具有SEQ ID NO 1或其類似物的寡核苷酸序列的正向PCR引物，具有選自由SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ IDNO :4、SEQ IDNO :5或SEQ ID NO 6或其類似物組成的組的寡核苷酸序列的反向PCR引物， 具有選自由 SEQ ID NO 7, SEQ ID NO :8、SEQID NO :9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO :12,SEQID NO :13,SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO :15,SEQ ID NO :16,SEQ ID NO :17,SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、 SEQ ID NO :25,SEQ ID NO :26,SEQ ID NO :27,SEQ ID NO :30,SEQ ID N0:31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :49, SEQ ID NO :50, SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :56、 SEQ ID NO :57, SEQ ID NO :58, SEQ ID NO :59, SEQ ID N0:61、SEQ ID NO :62, SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :68、SEQ ID NO :70、SEQ ID NO :71、SEQ ID NO :72、SEQ ID NO :73、SEQ ID NO :74、SEQ ID NO :75、SEQ ID NO -JrJ、SEQ ID NO :78,SEQ ID NO :79和SEQ ID NO :80或其類似物組成的組的寡核苷酸序列、標記有熒光染料和猝滅分子的探針，和內(nèi)部對照(internal control)；(ii)檢測熒光變化并確定HPV型。進一步地，根據(jù)本發(fā)明的方法涉及在生物樣品中同時檢測和/或分型/和/或定量HPV 18、52、59、39、51、56、66、16、45、58、31、33和35的存在，所述方法包括以下4個平行
反應(yīng)反應(yīng)l-a)HPV18、52和59的核酸片段在以下的存在下的擴增(i)核酸聚合酶(ii)具有SEQ ID NO 1或其類似物的寡核苷酸序列的正向PCR引物，(iii)具有SEQ ID NO 2或其類似物的寡核苷酸序列的反向PCR引物，(iv)具有SEQ ID NO :7、8和9或其類似物的寡核苷酸序列、標記有熒光團和猝滅分子的探針，和b)檢測熒光變化，熒光的波長確定HPV型18、52和59 ；反應(yīng)2_a)HPV39、51、56和66的核酸片段在以下的存在下的擴增⑴核酸聚合酶(ii)具有SEQ ID NO=I或其類似物的寡核苷酸序列的正向PCR引物，(iii)具有SEQ ID NO 3或其類似物的寡核苷酸序列的反向PCR引物，(iv)具有SEQ ID NO 10、11、12、和13或其類似物的寡核苷酸序列、標記有熒光團和猝滅分子的探針，和b)檢測熒光變化，熒光的波長確定HPV型39、51、56和66 ；反應(yīng)3-a)HPV16、45和 58的核酸片段在以下的存在下的擴增(i)核酸聚合酶(ii)具有SEQ ID NO=I或其類似物的寡核苷酸序列的正向PCR引物，(iii)具有SEQ ID NO 4或其類似物的寡核苷酸序列的反向PCR引物，(iv)具有SEQ ID NO :14,15和16或其類似物的寡核苷酸序列、標記熒光團和猝滅分子的探針，和b)檢測熒光變化，熒光的波長確定HPV型16、45和58 ；反應(yīng)4_a)HPV31、33、35和內(nèi)部對照的核酸片段在以下的存在下的擴增
(i)核酸聚合酶(ii)具有SEQ ID NO 1或其類似物的寡核苷酸序列的正向PCR引物，(iii)具有SEQ ID NO 5或其類似物的寡核苷酸序列的反向PCR引物，(iv)具有SEQ ID NO :17、18、19和20或其類似物的寡核苷酸序列、標記有熒光團和猝滅分子的探針，和(ν)內(nèi)部對照，和b)檢測熒光變化，熒光的波長確定HPV型31、33、35和內(nèi)部對照。本發(fā)明還涉及用于HPV擴增的引物，所述引物選自由SEQ ID NO=USEQ ID NO :2、 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 6 組成的組。進一步地，本發(fā)明還涉及用于HPV檢測和/或分型和/或定量的探針，所述探針選自由 SEQ ID NO 7, SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ IDNO 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18,SEQ IDNO :19,SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :25,SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :30、SEQ IDNO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :34, SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :44, SEQ IDNO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :49、 SEQ ID NO :50, SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :55、SEQ IDNO :56、SEQ ID NO 57、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO :64,SEQ ID NO :65、SEQ IDNO :66、SEQ ID NO :68、SEQ ID NO :70、SEQ ID NO :71、SEQ ID NO :72,SEQ ID NO :73、SEQ ID NO :74、SEQ ID NO :75、SEQ ID NO :77、SEQ IDNO :78、SEQ ID NO 79和SEQ ID NO :80或其類似物組成的組。本發(fā)明還涉及用于在生物樣品中檢測和/或分型和/或定量HPV的診斷試劑盒， 所述試劑盒包括正向引物和反向引物，HPV11、16、18J6、31、33、35、39、40、42、43、44、45、 51、52、53、54、56、59、59、61、66、68、70、72、73 和 82 的探針，內(nèi)部陽性對照和 DNA 聚合酶。附圖和表格簡述圖 1-13 表示特異性檢測 HPV 型 16、18、31、33、；35、39、45、51、52、56、58、59 和 66 的通用多重實時PCR類型的樣品分析和擴增曲線，其中

圖1 表示多重組1中HPV18的擴增。圖2 表示多重組1中HPV52的擴增。圖3 表示多重組1中HPV59的擴增。圖4 表示多重組2中HPV39的擴增。圖5 表示多重組2中HPV51的擴增。圖6 表示多重組2中HPV56的擴增。圖7 表示多重組2中HPV66的擴增。圖8 表示多重組3中HPV16的擴增。圖9 表示多重組3中HPV45的擴增。圖10 表示多重組3中HPV58的擴增。圖11 表示多重組4中HPV31的擴增。圖12 表示多重組4中HPV33的擴增。
圖13 表示多重組4中HPV35的擴增。圖14 表示內(nèi)部對照的擴增曲線。圖 15-20 表示用引物 PTf 和 Ρ 2 對 HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35 和 HPV56 的稀釋系列的擴增。表1 指所設(shè)計的引物的列表。表2 指所設(shè)計的探針的列表。表3 指多重組1、多重組2、多重組3和多重組4的多重PCR的組成。表4 指在臨床樣品上對通用實時方法的評估。表5 指 HPV 組 1，mastermix 配方。表6 指 HPV 組 2，mastermix 配方。表7 指 HPV 組 3，mastermix 配方。表8 指 HPV 組 4，mastermix 配方。表9 指靶HPV型的分析靈敏度。發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明的實時定量PCR方法檢測所有已識別的致瘤性粘膜HPV型低至每個樣品400GU或更少的水平。所述方法本質(zhì)上為半定量，因為結(jié)果以與靶DNA的起始濃度成比例的CT值讀出。也可以通過包括用以建立標準曲線的靶類型的稀釋系列在完全定量模式 (fully-quantitative mode)運行反應(yīng)。所述方法的定量性質(zhì)具有若干優(yōu)勢。在流行病學(xué)研究中可以建立所有型的常數(shù)臨界值，從而消除由分析靈敏度上的型特異性差異造成的偏差的患病率估計。已經(jīng)表明只有較高的每樣品50 000⑶的高水平HPV感染才是臨床顯著的，盡管這還留有爭議。所述通用多重方法中可以將臨界值校準到所需的任何定量值。最后，定量方法的使用可以在跟蹤感染進程和治療效果中起作用。在500ng人類DNA的存在下所述方法的分析靈敏度對所有型為4-400⑶，500ng人類DNA相當于0.75X 105細胞。因此0. 5 %的細胞中單病毒拷貝的存在會給出陽性結(jié)果。 在較低人類DNA濃度(50ng)，相當于0.75X 104細胞，靈敏度增加10倍。這說明低細胞 (cell-poor)樣品造成的假陽性結(jié)果并不會成為問題。然而，也說明在完全定量模式下進行所述測試需要細胞DNA濃度的標準化。正如所預(yù)期的，考慮到根據(jù)本發(fā)明的通用多重方法的檢測靈敏度至少高出一個數(shù)量級，與雜交捕獲(HCII)測試相比，HPV在更多的臨床樣品中被檢測。根據(jù)本發(fā)明的方法因而在一次測試中覆蓋所有已證實的致瘤性HPV型。所述方法已被特別設(shè)計給出四管規(guī)格。這給出了最優(yōu)使用8 X 12 (96孔)和16 X M (384孔)規(guī)格的方法，所述規(guī)格在多數(shù)實時PCR儀器中是標準的。然而，很明確根據(jù)本發(fā)明的方法可以用于不同規(guī)格而不背離本發(fā)明的范圍。進一步地，根據(jù)本發(fā)明的方法中，只需要1種正向引物和4種反向引物。這簡化了質(zhì)量控制和生產(chǎn)并節(jié)約了成本。根據(jù)本發(fā)明，在引物和探針設(shè)計之前，已將Ll基因靶區(qū)域內(nèi)的已知的序列變異納入考慮范圍并避免或通過引物序列的修飾負責(zé)所有變異位置。根據(jù)本發(fā)明的方法的靈敏度在500ng人類DNA存在下測量，500ng人類DNA相當于7，5X IO4人類細胞，從而準確模擬了富含細胞的臨床樣品中的條件。這對于所有靶向HPV 型提供了增強的靈敏度。根據(jù)本發(fā)明的方法靶向Ll基因，其具有低得多的缺失傾向。根據(jù)本發(fā)明的引物能夠進一步修飾而用于相關(guān)HPV型比如尤其是HPV11J6、40、 42、43、44、53、54、61、68、70、72、73、82 的檢測。在根據(jù)本發(fā)明的方法使用的實時PCR儀器中具有兩個空置的顏色通道，這允許在測試中添加另外的致瘤性HPV型的可能。本申請描述的多重分組(multiplex grouping)是許多可能分組之一。例如組3 使用的引物已知能夠擴增HPV型18、31、33、39、51、58、59和66及內(nèi)部對照HPV6，從而這些型中的任何型都可以被分配到該組。本發(fā)明中使用的實時PCR儀器具有4個顏色通道。然而對于具有5、6、7個或更多個顏色通道的實時PCR儀器來說，測試的替代性變型是可以的。于是，為檢測同樣的HPV型， 所述引物和探針可以以3或2個平行反應(yīng)組合。本測試規(guī)格能在一個工作日內(nèi)分析20個樣品，使得該測試非常適于低通量到中等通量實驗室。更大批次的樣品可以采用384孔規(guī)格的實時PCR儀器分析，盡管在現(xiàn)階段可用的自動DNA提取儀的容量是比PCR分析時間更重要的對通量的限制。實時PCR是封閉系統(tǒng)測試。因此不需要在開放實驗室中處理擴增樣品。從而極大地減少了 PCR攜帶污染的問題，并繼而減少了必須另外投入到有關(guān)開放實驗室PCR后分析的嚴格污染控制的資源。根據(jù)本發(fā)明的方法在優(yōu)選HPV基因分型的篩選程序中尤其有價值。已描述本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。然而應(yīng)理解本發(fā)明并不局限于那些精確的實施方案，并理解可由本領(lǐng)域技術(shù)人員在其中做出各種變化和修改而不背離如所附的權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍或精神。以下實施例闡明但并未限制本發(fā)明。
實施例實施例1-質(zhì)粒將包含HPV6、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59 和 66 的 Ll 基因的靶區(qū)
域的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(Escherichia coli)DH5-a中，并通過氯化銫密度梯度離心 (Fritsch 等人)或 Qiagen HiSpeed Midi 試劑盒(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)分離。 DNA濃度采用紫外分光光度法測定。實施例2~臨床樣品臨床樣品是送到本實驗室的用于二級篩選低度增生(LSIL)或可疑細胞學(xué)(AS⑶S 或不適當?shù)?inadequate)樣品)的常規(guī)HPV分析的宮頸細胞刷樣品。根據(jù)制造商的建議在 CYTYC新柏氏(thin prep)轉(zhuǎn)移劑(介質(zhì)CYTYC，Crawley，UK)中收集并轉(zhuǎn)移樣品。IOml樣品在3000rpm離心10分鐘并在100 μ 1磷酸鹽緩沖鹽水中重懸顆粒，之后使用MagNAPure自動 DNA 提取儀和 MagNAPure LC DNA 提取試劑盒(Roche Diagnostics, Penzberg, Germany) 提取DNA。100 μ 1洗脫DNA。使用預(yù)先用HCII測試法進行測試并使用通用PCR和反向線性雜交(reverse line blot)進行分型的臨床樣本評估本測試。實施例3-雜交捕獲測試
根據(jù)制造商的使用說明使用25ml樣品進行Digene雜交捕獲測試(Digene， Gaithersburg, MD)。實施例4-引物設(shè)計為鑒定通用PCR弓丨物的適當靶標，使用CLUSTALW比對HPV型16、18、31、33、；35、39、 45、51、52、56、58、59和66以及HPV6的Ll基因的序列。為生成用于CLUSTAL比對的輸入序列，在BLAST搜索中使用每個HPV型的原型序列以鑒定型內(nèi)變異序列。接下來通過合適的 IUPAC模糊代碼(IUPAC ambiguity code)的替換在變異位置對所述序列進行編輯。對應(yīng)于HPV16基因組上nt 6348-6374和6579-6557的區(qū)域經(jīng)鑒定為高度保守的并分別被選擇用于放置正向引物和反向引物。這導(dǎo)致了引物PTf和PTr的構(gòu)建。因為這一引物對不能令人滿意地擴增所有靶型，該現(xiàn)象可能由與PTr形成的雙鏈體的低穩(wěn)定性造成，所以尋求PTr 的較低簡并性的版本。基于 CLUSTALW 中(http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/index. html)構(gòu)建的級聯(lián)的(contatenated)正向和反向引物靶序列的距離樹(distancetree)將序列分組為四個同源性組。所述分組為HPV18、HPV52和HPV59 (組1)，HPV39、HPV51、HPV56和HPV66 (組 2)，HPV16、HPV45 和 HPV58 (組 3)，以及 HPV31、HPV33 和 HPV35 加上內(nèi)部對照 HPV6 (組 4)。 為每組建立新的CLUSTAL比對，并設(shè)計組特異性反向引物以減少引物簡并度并提高靈敏度。使用次黃嘌呤核苷作為通配堿基，胸腺嘧啶作為通用嘧啶，鳥嘌呤作為通用嘌呤(利用非經(jīng)典的G:T堿基對的穩(wěn)定性)或摻入混合的核苷酸來調(diào)節(jié)可變位置。這導(dǎo)致了引物 PTrGrU PTrGr2和PTrGr4的設(shè)計。組3保留初始PiTr序列。為放置反向引物還對與HPV16上位置6644-6620相對應(yīng)的替代性靶區(qū)域進行研究。引物PTr2被設(shè)計為靶向這一區(qū)域。PTr2適于HPV型16、18、31、33、35、45、52、56、58、 58和59的擴增。表1.引物列表
權(quán)利要求
1.一種在生物樣品中檢測和/或分型和/或定量人乳頭瘤病毒(HPV)型的存在的方法，所述測試包括以下步驟(i)HPV的核酸片段在以下的存在下的擴增DNA聚合酶，具有SEQ ID NO :1或其類似物的寡核苷酸序列的正向PCR引物，具有選自由SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、 SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6或其類似物組成的組的寡核苷酸序列的反向PCR引物，具有選自由 SEQ ID NO :7、SEQ IDNO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ IDNO 12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO 18,SEQ ID NO 19,SEQ ID NO 20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ IDNO :23、SEQ ID NO :25,SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQID NO :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :34,SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ IDNO :39、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :44,SEQ ID NO :45,SEQID NO :46、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50,SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :52、SEQ IDNO :55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :57、SEQ ID NO :58,SEQID NO :59、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :65, SEQ ID NO :66, SEQ IDNO :68, SEQ ID NO :70, SEQ ID NO :71、SEQ ID NO :72, SEQID NO :73,SEQ ID NO :74,SEQ ID NO :75,SEQ ID NO :77,SEQ ID NO :78,SEQ ID NO :79 和 SEQ ID NO 80或其類似物組成的組的寡核苷酸序列、標記有熒光染料和猝滅分子的探針，和內(nèi)部對照；( )檢測熒光變化并確定HPV型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸與HPV擴增子特異性雜交，其中所述 HPV 型選自 HPV6、11、16、18、26、31、33、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、56、59、59、 61、66、68、70、72、73 和 82。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的方法，其中所述HPV型選自HPV16、18、31、33、35、39、45、 51、52、56、58、59 和 66。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的方法，其中所述探針選自由SEQID NO :7、SEQ ID NO :8、 SEQ ID NO 9,SEQ ID NO 10、SEQ ID NO =IUSEQ IDNO 12,SEQ ID NO 13,SEQ ID NO :14、 SEQ ID NO 15,SEQ ID NO 16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19禾口SEQ ID N0: 20或其類似物組成的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的方法，其中根據(jù)權(quán)利要求1運行兩個或更多個平行反應(yīng)以同時檢測所述HPV型。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的方法，為在生物樣品中同時檢測和/或分型和/或定量HPV 18、52、59、39、51、56、66、16、45、58、31、33和35的存在，所述方法包括以下四個平行反應(yīng)反應(yīng)l-a)HPV 18,52和59的核酸片段在以下的存在下的擴增(i)核酸聚合酶( )具有SEQ ID NO :1或其類似物的寡核苷酸序列的正向PCR引物，(iii)具有SEQID NO :2或其類似物的寡核苷酸序列的反向PCR引物，(iv)具有SEQID NO :7、8和9及其類似物的寡核苷酸序列、標記有熒光團和猝滅分子的探針，和b)檢測熒光變化，熒光的波長確定HPV型18、52和59 ；反應(yīng)2-a)HPV 39、51、56和66的核酸片段在以下的存在下的擴增(i)核酸聚合酶( )具有SEQ ID NO :1或其類似物的寡核苷酸序列的正向PCR引物，(iii)具有SEQID NO :3或其類似物的寡核苷酸序列的反向PCR引物，(iv)具有SEQID N0:10、ll、12和13或其類似物的寡核苷酸序列、標記有熒光團和猝滅分子的探針，和b)檢測熒光變化，熒光的波長確定HPV型39、51、56和66 ；反應(yīng)3-a)HPV 16、45和58 的核酸片段在以下的存在下的擴增 (i)核酸聚合酶( )具有SEQ ID NO :1或其類似物的寡核苷酸序列的正向PCR引物，(iii)具有SEQID NO :4或其類似物的寡核苷酸序列的反向PCR引物，(iv)具有SEQID NO :14、15和16或其類似物的寡核苷酸序列、標記有熒光團和猝滅分子的探針，和b)檢測熒光變化，熒光的波長確定HPV型16、45和58 ；反應(yīng)4-a)HPV 31、33、35和內(nèi)部對照的核酸片段在以下的存在下的擴增(i)核酸聚合酶(i)具有SEQ ID NO :1或其類似物的寡核苷酸序列的正向PCR引物， ( )具有SEQ ID NO :5或其類似物的寡核苷酸序列的反向PCR引物，(iii)具有SEQID NO :17、18、19、和20或其類似物的寡核苷酸序列、標記有熒光團和猝滅分子的探針，和(iv)內(nèi)部對照和b)檢測熒光變化，熒光的波長確定HPV型31、33、35和內(nèi)部對照。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述反應(yīng)平行并且在獨立的管中實施。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的方法，其中所述4種熒光團為FAM、VIC、NED和R0X。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的方法，其中所述內(nèi)部對照為HPV6。
10.一種用于HPV擴增的引物，所述引物選自由SEQ ID NO =USEQ IDNO :2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 6 組成的組。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的引物，其中所述引物特別適用于實時多重HPV擴增。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-6、10和11所述的引物，用于檢測和/或分型和/或定量生物樣品中存在的HPV型。
13.一種用于HPV檢測和/或分型和/或定量的探針，所述探針選自由SEQ ID NO :7、 SEQ ID NO 8,SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 12,SEQ ID NO :13、 SEQ ID NO 14,SEQ ID NO :15、SEQ IDNO 16,SEQ ID NO :17、SEQ ID NO 18、SEQ ID N0:19、 SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :25、SEQ IDNO 26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO 35,SEQ ID NO 37、SEQ ID NO 38、SEQ IDNO 39、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45, SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ IDNO 51,SEQ ID NO 52、SEQ ID NO 55、SEQ ID NO 56、SEQ ID NO 57、SEQ ID NO 58、SEQ ID NO 59,SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、SEQ IDNO :63、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :68、SEQ ID NO :70、SEQ ID NO :71、SEQ ID NO :72、SEQ ID NO :73、SEQ IDNO :74,SEQ ID NO :75、SEQ ID NO :77、SEQ ID NO :78、SEQ ID NO :79 禾口 SEQ ID NO: 80或其類似物組成的組。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用于HPV檢測和/或分型和/或定量的探針，所述探針選自由 SEQ ID NO 7, SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ IDNO 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ IDNO :19 和 SEQ ID NO :20 組成的組。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-6和13所述的探針，用于檢測和/或分型和/或定量生物樣品中存在的HPV。
16.根據(jù)權(quán)利要求1和10所述的引物用于檢測和/或分型和/或定量HPV的存在的用途。
17.根據(jù)權(quán)利要求1和13所述的探針用于檢測和/或分型和/或定量HPV的存在的用途。
18.一種用于檢測和/或分型和/或定量生物樣品中的HPV的診斷試劑盒，所述診斷試劑盒包括正向引物和反向引物，HPV6、11、16、18J6、31、33、35、39、40、42、43、44、45、51、52、 53、54、56、59、59、61、66、68、70、72、73和82的探針，內(nèi)部陽性對照和DNA聚合酶。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的診斷試劑盒，其中所述引物為根據(jù)權(quán)利要求10所述的引物且所述探針為根據(jù)權(quán)利要求13所述的探針。
20.根據(jù)權(quán)利要求18和19所述的診斷試劑盒，其中所述探針為用于朋￥16、18、31、33、 35、39、45、51、52、56、58、59 和 66 的探針。
全文摘要
本發(fā)明描述了檢測人乳頭瘤病毒(HPV)型的方法以及檢測所述HPV型的試劑盒。
文檔編號C12N15/11GK102459631SQ201080024379
公開日2012年5月16日 申請日期2010年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月30日
發(fā)明者安妮-格瑞·阿勒姆, 安德魯·詹金斯, 琳達·斯特蘭德 申請人:阿勒姆-詹金斯有限公司