專利名稱：脂肪酸衍生物的產(chǎn)生的制作方法
脂肪酸衍生物的產(chǎn)生相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求于2009年4月10日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/168，四3、于2009年7 月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1Λ66，749、于2009年7月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?61/227，025和于2009年11月19日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/262，544的權(quán)益，特此將每篇申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。
背景技術(shù)：
石油是地球上發(fā)現(xiàn)的、液體、氣體或固體形式的有限的天然資源。石油主要由碳?xì)浠衔锝M成，碳?xì)浠衔镏饕商己蜌浣M成。石油還含有大量的處于不同形式的其他元素， 例如氮、氧或硫。石油是寶貴資源，但是以相當(dāng)大的金融和環(huán)境代價(jià)對(duì)石油產(chǎn)品進(jìn)行開(kāi)發(fā)。首先，必須發(fā)現(xiàn)石油資源。石油勘探是耗資并有風(fēng)險(xiǎn)的投資。勘探深水井的費(fèi)用可以超過(guò)1億美元。 除經(jīng)濟(jì)費(fèi)用外，石油勘探帶來(lái)嚴(yán)重的環(huán)境代價(jià)。例如近?？碧綌_亂周圍海洋環(huán)境。發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)井后，必須以巨大代價(jià)從地球開(kāi)采石油。即使在最佳條件下，僅可以開(kāi)采 50%的井中石油。石油開(kāi)采還帶來(lái)環(huán)境代價(jià)。例如，石油開(kāi)采可以導(dǎo)致大量石油滲漏上升至表面。近海鉆井涉及挖掘河床，這擾亂或破壞周圍海洋環(huán)境。開(kāi)采后，必須將石油從石油產(chǎn)生區(qū)長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)绞拖膮^(qū)。除運(yùn)輸費(fèi)用外，還存在大規(guī)模油泄漏的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。從地球開(kāi)采的原油在天然形式時(shí)商業(yè)用途較少。其是具有不同長(zhǎng)度和復(fù)雜性的碳?xì)浠衔?例如，石蠟(或烷)、烯烴(或烯)、炔、環(huán)烷(napthenesM或環(huán)烷 (cylcoalkanes))、脂肪族化合物、芳香族化合物等)的混合物。此外，原油含有其他有機(jī)化合物(例如含有氮、氧、硫等的有機(jī)化合物)和雜質(zhì)(例如硫磺、鹽、酸、金屬等)。因此，在商業(yè)上可以使用前，必須提煉并純化原油。由于其高能量密度及其便利的可運(yùn)輸性，大部分石油被提煉為燃料，例如運(yùn)輸燃料(例如汽油、柴油、航空燃料等)、燃用油、液化石油氣等。原油還是用于產(chǎn)生石化產(chǎn)品的原材料的主要來(lái)源。兩類主要的來(lái)自石油的原材料是短鏈烯烴(例如乙烯和丙烯)和芳香族化合物(例如苯和二甲苯異構(gòu)體)。這些原材料來(lái)源于原油中較長(zhǎng)鏈的碳?xì)浠衔?，這是通過(guò)以相當(dāng)大的費(fèi)用使用各種方法裂化長(zhǎng)鏈碳?xì)浠衔飦?lái)產(chǎn)生的，例如催化裂化、蒸汽裂化或催化重整，裂化原油。這些原材料用于制造不能直接從原油提煉的石化產(chǎn)品，例如單體、溶劑、去垢劑或粘合劑。來(lái)源于原油的原材料的一個(gè)實(shí)例是乙烯。乙烯被用于生產(chǎn)石化產(chǎn)品，例如聚乙烯、 乙醇、氧化乙烯、乙二醇、聚酯、乙二醇醚、乙氧基化物、乙酸乙烯酯、1，2- 二氯乙烷、三氯乙烯、四氯乙烯、氯乙烯和聚氯乙烯。來(lái)源于原油的原材料的另一個(gè)實(shí)例是丙烯。丙烯用于生產(chǎn)異丙醇、丙烯腈、聚丙烯、氧化丙烯、丙烯二醇、乙二醇醚、丁烯、異丁烯、1，3_ 丁二烯、合成橡膠、聚烯烴、α -烯烴、脂肪醇、丙烯酸、丙烯聚合物、氯化丙烯、環(huán)氧氯丙烷和環(huán)氧樹(shù)脂。石化產(chǎn)品可以用于制造特種化學(xué)品，例如塑料、樹(shù)脂、纖維、橡膠、藥品、潤(rùn)滑劑或凝膠?？梢援a(chǎn)自石化原材料的特種化學(xué)品的實(shí)例為脂肪酸、碳?xì)浠衔?例如長(zhǎng)鏈碳?xì)浠衔铩⒅ф溙細(xì)浠衔?、飽和碳?xì)浠衔?、不飽和碳?xì)浠衔锏?、脂肪醇、酯、脂肪醛、酮、潤(rùn)
滑劑等。特種化學(xué)品有許多商業(yè)用途。脂肪酸在商業(yè)上被用作表面活性劑。特種化學(xué)品可見(jiàn)于去垢劑和肥皂中。脂肪酸也可以用作燃料、潤(rùn)滑油、涂料、油漆、蠟燭、色拉油、起酥油、 化妝品以及乳化劑中的添加劑。此外，脂肪酸在橡膠制品中被用作促進(jìn)活性劑。脂肪酸也可以用作給料，生產(chǎn)甲酯、酰胺、胺、?；?、酸酐、乙烯酮二聚體，以及過(guò)氧酸與酯。酯具有很多商業(yè)用途。例如，生物柴油，一種替換燃料，由酯(例如，脂肪酸甲酯、 脂肪酸乙酯等)組成。一些低分子量的酯是揮發(fā)性的，具有好聞的氣味，使得它們可以用作芳香劑或增味劑。此外，酯被用作漆、涂料和清漆的溶劑。而且，一些天然存在的物質(zhì)，例如蠟、脂肪和油由酯組成。酯還可以用作樹(shù)脂和塑料的軟化劑、增塑劑、阻燃劑以及汽油和油的添加劑。此外，酯可用于生產(chǎn)聚合物、薄膜、染料和藥物。此外，原油是潤(rùn)滑油的來(lái)源。石油來(lái)源的潤(rùn)滑油通常由烯烴，尤其是聚烯烴和 α-烯烴組成。潤(rùn)滑油可以從原油提煉或可以利用來(lái)自原油提煉的原材料生產(chǎn)。從原油獲得這些特種化學(xué)品需要大量的金融投資以及大量的能量。因?yàn)樵椭械拈L(zhǎng)鏈碳?xì)浠衔锍３１涣鸦援a(chǎn)生較小的單體，其也是低效的過(guò)程。這些單體然后被用作生產(chǎn)更復(fù)雜的特種化學(xué)品的原材料。除勘探、開(kāi)采、運(yùn)輸和提煉石油的問(wèn)題外，石油是有限并逐漸減少的資源。估計(jì)當(dāng)前世界石油消耗為每年300億桶。據(jù)估計(jì)，以現(xiàn)有生產(chǎn)水平，世界石油儲(chǔ)量預(yù)計(jì)在2050年前會(huì)耗竭。最后，基于石油的燃料的燃燒釋放溫室氣體(例如二氧化碳)和其他形式的空氣污染物(例如一氧化碳、二氧化硫等)。隨著世界對(duì)燃料需求的增加，溫室氣體和其他形式的空氣污染物的排放也增加。大氣中溫室氣體的累積導(dǎo)致全球變暖增速。因此，除局部破壞環(huán)境外(例如油泄漏、海洋環(huán)境的挖掘等)，燃燒石油還破壞全球環(huán)境。由于石油所引起的內(nèi)在挑戰(zhàn)，存在對(duì)于不需要像石油一樣被勘探、開(kāi)采、長(zhǎng)距離運(yùn)輸或大量提煉的可再生石油資源的需要。還存在對(duì)于可以經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)可再生石油資源的需要。此外，存在對(duì)于不會(huì)產(chǎn)生石油工業(yè)和基于石油的燃料的燃燒所產(chǎn)生的環(huán)境破壞類型的可再生石油資源的需要?；谙嗨圃?，還存在對(duì)于通常來(lái)自石油的化學(xué)品的可再生資源的需要。諸如日光、水、風(fēng)和生物質(zhì)(biomass)的可再生能源是石油燃料的潛在替代品。生物燃料是一種由生物質(zhì)產(chǎn)生的可生物降解的、清潔燃燒的燃料，其由烷烴和酯類構(gòu)成。生物柴油即是一種示例性的生物燃料。生物柴油可以采用純的形式(被稱為“純”生物柴油)， 或者以任何濃度與常規(guī)的石化柴油混合用于大部分內(nèi)燃柴油發(fā)動(dòng)機(jī)中。與基于石油的柴油相比，生物柴油提供了優(yōu)點(diǎn)，包括燃燒過(guò)程中的排放量(例如， 一氧化碳、硫、芳香烴、煙灰顆粒)降低。因其基于可再生的生物材料，生物柴油還能維持平衡的二氧化碳循環(huán)。生物柴油通常是可生物降解的，而且因?yàn)槿键c(diǎn)高，易燃性低因此非常安全。此外，生物柴油提供良好的潤(rùn)滑性能，從而減少發(fā)動(dòng)機(jī)的磨損。目前生產(chǎn)生物柴油的方法涉及將來(lái)自植物油原料的三酰甘油進(jìn)行酯交換，植物油原料，比如在歐洲是油菜，在北美是大豆，在東南亞是棕櫚油。因此工業(yè)規(guī)模的生物柴油生產(chǎn)在地理和季節(jié)上局限于植物油原料的產(chǎn)地。酯交換過(guò)程產(chǎn)生脂肪酯(fatty esters)混合物，其可以作為生物柴油。然而，甘油是酯交換過(guò)程中的一種不希望的副產(chǎn)品。要作為生物柴油使用，必須從上述異質(zhì)產(chǎn)物中進(jìn)一步純化脂肪酯。這最增加了脂肪酯生產(chǎn)的成本和所需能量，以及最終增加生物柴油生產(chǎn)的成本和所需能量。而且，植物油原料不是高效的能量來(lái)源，因?yàn)樗鼈冃枰獜V大的種植面積。例如，因?yàn)橹挥胁俗佑陀糜谏锊裼彤a(chǎn)生，而油菜生物質(zhì)的其他部分被棄掉，所以從油菜產(chǎn)生生物柴油的產(chǎn)量?jī)H有1300L/公頃。此外，某些植物油原料，比如油菜和大豆的種植需要經(jīng)常進(jìn)行農(nóng)作物輪種以防止土地養(yǎng)分耗盡。需要在經(jīng)濟(jì)和能量方面高效的生物燃料，以及由諸如生物質(zhì)的可再生能量來(lái)源生產(chǎn)所述生物柴油的方法。發(fā)明_既述本發(fā)明至少部分地基于從基因工程化微生物產(chǎn)生脂肪酯，包括例如脂肪酸甲酯 (“FAME”)和脂肪酸乙酯(“FAEE”)。因此，一方面，本發(fā)明的特征是產(chǎn)生脂肪酯的方法。 所述方法包括在碳源存在下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞經(jīng)基因工程改造，從而超表達(dá)編碼硫酯酶的基因、編碼?；o酶A合酶的基因和編碼酯合酶的基因。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括分離脂肪酯。在一些實(shí)施方案中，所述脂肪酯存在于細(xì)胞外環(huán)境中。在一些實(shí)施方案中，所述脂肪酯從宿主細(xì)胞的細(xì)胞外環(huán)境分離得到。在一些實(shí)施方案中，所述脂肪酯部分或完全地從宿主細(xì)胞自發(fā)分泌。在可選的實(shí)施方案中，任選地在一種或多種合適的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的輔助下， 所述脂肪酯被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外環(huán)境。在其他實(shí)施方案中，所述脂肪酯被動(dòng)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外環(huán)境。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括在醇的存在下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述醇是甲醇或乙醇。在一些實(shí)施方案中，所述甲醇或乙醇以約lmL/L至約100mL/L 的濃度存在。例如，所述甲醇或乙醇以約lmL/L或更高(例如，約lmL/L或更高、約5mL/L或更高、約10mL/L或更高)的濃度存在。在可選的實(shí)施方案中，所述甲醇或乙醇以約IOOmL/ L或更低(例如，約100mL/L或更低、約90mL/L或更低、約80mL/L或更低)的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，編碼硫酯酶的基因可以是例如，tesA、‘tesA、tesB、fatB、 fatB2、fatB3、fatAl或fatA。在一些實(shí)施方案中，編碼?；o酶A合酶的基因可以是例如，fadD、fadK、BH3103、pfl-4354、EAV15023、fadDl、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、 faa39、編碼GenBank登錄號(hào)ZP_01644857蛋白的基因或yhfL。在其他實(shí)施方案中，編碼酯合酶的基因可以是例如，編碼酶分類EC 2. 3. 1. 75或EC 2. 3. 1. 20的酶的基因。在其他實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞經(jīng)基因工程改造，相對(duì)于野生型宿主細(xì)胞表達(dá)降低水平的至少一種以下基因編碼?；o酶A脫氫酶的基因、編碼外膜蛋白受體的基因和編碼脂肪酸生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的基因。在一些實(shí)施方案中，編碼酰基輔酶A脫氫酶的基因是fadE。在一些實(shí)施方案中，編碼外膜蛋白受體的基因編碼外膜鐵色素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，例如，fhuA。在其他實(shí)施方案中，編碼脂肪酸生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的基因編碼DNA轉(zhuǎn)錄抑制子，例如，fabR。在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞在包含約2g/L至約100g/L起始濃度的碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在其他實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基包含約2g/L至約10g/L起始濃度的碳源、 約10g/L至約20g/L起始濃度的碳源、約20g/L至約30g/L起始濃度的碳源、約30g/L至約 40g/L起始濃度的碳源或約40g/L至約50g/L起始濃度的碳源。在示例性的實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基包含約2g/L或更高(例如，約2g/L或更高、約5g/L或更高、約10g/L或更高)起始濃度的碳源。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基中碳源水平的步驟。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括當(dāng)培養(yǎng)基中的碳源水平低于約0. 5g/L時(shí)，向所述培養(yǎng)基添加補(bǔ)充性碳源。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)培養(yǎng)基中的碳源水平低于約0. 4g/L、低于約0. 3g/L、低于約 0. 2g/L或低于約0. lg/L時(shí)，向所述培養(yǎng)基添加補(bǔ)充性碳源。在一些實(shí)施方案中，所述補(bǔ)充性碳源被添加以維持約2g/L至約5g/L的碳源水平。 在一些實(shí)施方案中，所述補(bǔ)充性碳源被添加以維持約2g/L或更高(例如，約2g/L或更高、 約3g/L或更高、約4g/L或更高)的碳源水平。在某些實(shí)施方案中，所述補(bǔ)充性碳源被添加以維持約5g/L或更低(例如，約5g/L或更低、約4g/L或更低、約3g/L或更低)的碳源水平。在一些實(shí)施方案中，所述補(bǔ)充性碳源被添加以維持約2g/L至約3g/L、約3g/L至約4g/ L或約4g/L至約5g/L的碳源水平。在一些實(shí)施方案中，所述碳源是葡萄糖。在一些實(shí)施方案中，以約lg/L至約200g/L的濃度產(chǎn)生脂肪酸甲酯。在一些實(shí)施方案中，以約lg/L更高(例如，約lg/L或更高、約5g/L或更高、約10g/L或更高、約20g/ L或更高、約30g/L或更高)的濃度產(chǎn)生脂肪酸甲酯。在一些實(shí)施方案中，以約lg/L至約 170g/L、約 lg/L 至約 10g/L、約 40g/L 至約 170g/L、約 100g/L 至約 170g/L、約 10g/L 至約 100g/L、約lg/L至約40g/L、約40g/L至約100g/L或約lg/L至約100g/L的濃度產(chǎn)生脂肪酸甲酯。在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞可以選自哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、 酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、絲狀真菌細(xì)胞以及細(xì)菌細(xì)胞。在具體的實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞選自以下屬埃希氏菌屬(Escherichia)、 芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、紅球菌屬(Rhodococcus)Jg 單胞菌屬(Pseudomonas)、曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、脈孢菌屬 (Neurospora)、鍵刀菌屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、根毛霉屬(Rhizomucor)、 克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、毛霉菌屬(Mucor)、蝕絲霉屬(Myceliophtora)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、 側(cè)耳屬(Pleurotus)、栓菌屬(Trametes)、金黃孢子菌屬(Chrysosporium) > 酵母屬(Saccharomyces)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophamonas)、裂殖酵母屬 (Schizosaccharomyces)、耳口氏酵母屬(Yarrowia)或鏈霉菌屬(Streptomyces)0在其他實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)細(xì)胞、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)細(xì)胞、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus) 細(xì)胞、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)細(xì)胞、嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)細(xì)胞、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)細(xì)胞、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)細(xì)胞、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilis)細(xì)胞、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis))細(xì)胞、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)細(xì)胞、巨大芽孢桿菌 (Bacillus megaterium)細(xì)胞、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is)細(xì)胞或解淀粉芽孢桿菌 (Bacillus amyIoliquefaciens)細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為康寧木霉(Trichoderma koningii)細(xì)胞、 綠色木霉(Trichoderma viride)細(xì)胞、里氏木霉(Trichoderma reesei)細(xì)胞、長(zhǎng)枝木 M (Trichoderma longibrachiatum) ^ ^^ ft β (Aspergillus awamori) _ |fi、 曲霉(Aspergillus fumigates)細(xì)胞、臭曲霉(Aspergillus foetidus)細(xì)胞、構(gòu)巢曲霉 (Aspergillus nidulans)(Aspergillus niger)(Aspergillus
oryzae)細(xì)胞、特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)細(xì)胞、棉毛狀腐質(zhì)霉(Humicola lanuginose)細(xì)胞、混濁紅球菌(Rhodococcus opacus)細(xì)胞、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)細(xì)胞或米黑毛霉(Mucor michei)細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是淺青紫鏈霉菌(Sti^ptomyces lividans)細(xì)胞或鼠灰鏈霉菌(Sti^ptomyces murinus)細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是放線菌(Actinomycetes)細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是來(lái)自真核植物、藻類、藍(lán)細(xì)菌、綠色硫細(xì)菌、綠色非硫細(xì)菌、紫色硫細(xì)菌、紫非硫細(xì)菌、嗜極生物、酵母、真菌、以上的基因工程化有機(jī)體或合成的有機(jī)體。在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是光依賴性的或固定碳。在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞具有自養(yǎng)活性。在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞具有光合自養(yǎng)活性，例如在存在光的情況下。在某些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是來(lái)自以下的細(xì)胞擬南芥(Avabidopsis thaliana)、柳枝稷(Panicum virgatums)、巨芒(Miscanthus giganteus) > ΞΕ (Zea mays)、葡萄■ (Botryococcuse braunii) > ^t 茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、杜氏鹽藻(Dunaliela salina)、細(xì)長(zhǎng)嗜熱聚球藍(lán)細(xì)菌(Thermosynechococcus elongatus)、綠硫菌(Chlorobium tepidum)、澄色綠屈撓菌(Chloroflexus auranticus)、酒色著色菌(Chromatiumm vino sum)、深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)、莢膜紅細(xì)菌(Rhodobacter capsulatus)、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palusris)、揚(yáng)氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、熱纖梭菌 (Clostridiuthermocellum)、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)。在某些其他實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞來(lái)自巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母、固定化解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)或運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)。在其他實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是來(lái)自聚球藍(lán)細(xì)菌(Synechococcus Sp.)PCC 7002、聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7942、集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis Sp.)PCC 6803 的細(xì)胞。 在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、VERO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、HeLa 細(xì)胞、Cvl細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、293細(xì)胞、3T3細(xì)胞或PC12細(xì)胞。在具體的實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述大腸桿菌細(xì)胞是菌株B、菌株C、菌株K或菌株W的大腸桿菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在允許產(chǎn)物產(chǎn)生的條件下能產(chǎn)生脂肪酯的基因工程微生物。在一些實(shí)施方案中，所述基因工程微生物包含編碼硫酯酶的基因、編碼?；o酶A合酶的基因和編碼酯合酶的基因中的至少一種的一個(gè)或多個(gè)。在某些實(shí)施方案中，所述基因工程微生物包含編碼硫酯酶的基因、編碼?；o酶A合酶的基因和編碼酯合酶的基因。在某些實(shí)施方案中，編碼硫酯酶的基因、編碼?；o酶A合酶的基因和編碼酯合酶的基因中的兩個(gè)或多個(gè)被連接在一個(gè)操縱子中。在某些其他實(shí)施方案中，編碼硫酯酶的基因、編碼酰基輔酶A合酶的基因和編碼酯合酶的基因所有三個(gè)被連接在一個(gè)操縱子中。在某些實(shí)施方案中，所述基因工程微生物包含穩(wěn)定并入所述微生物基因組DNA中的外源控制序列，所述外源控制序列位于編碼硫酯酶的基因、編碼?；o酶A合酶的基因和編碼酯合酶的基因中的至少一種的一個(gè)或多個(gè)的上游。在示例性的實(shí)施方案中，微生物經(jīng)工程改造，使其包含穩(wěn)定并入所述微生物基因組DNA中的外源控制序列，所述外源控制序列位于編碼硫酯酶的基因、編碼?；o酶A合酶的基因和編碼酯合酶的基因的上游。在某些實(shí)施方案中，微生物經(jīng)工程改造，使其相對(duì)于野生型微生物產(chǎn)生提高水平的脂肪酯。在某些實(shí)施方案中，所述外源控制序列是，例如，啟動(dòng)子。示例性的啟動(dòng)子包括但不限于，發(fā)育調(diào)控型啟動(dòng)子、細(xì)胞器特異型啟動(dòng)子、組織特異型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組成型啟動(dòng)子和細(xì)胞特異型啟動(dòng)子。在其他實(shí)施方案中，所述微生物經(jīng)基因工程改造，相對(duì)于野生型微生物表達(dá)降低水平的至少一種以下基因編碼?；o酶A脫氫酶的基因、編碼外膜蛋白受體的基因和編碼脂肪酸生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的基因。在某些實(shí)施方案中，所述微生物經(jīng)基因工程改造，使得編碼?；o酶A脫氫酶的基因、編碼外膜蛋白受體的基因和編碼脂肪酸生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的基因中的至少一種缺失。在某些實(shí)施方案中，編碼?；o酶A脫氫酶的基因是fadE。 在其他實(shí)施方案中，編碼外膜蛋白受體的基因編碼外膜鐵色素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，例如，fhuA。在其他實(shí)施方案中，編碼脂肪酸生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的基因編碼DNA轉(zhuǎn)錄抑制子，例如，fabR。在某些實(shí)施方案中，所述基因工程微生物可適合選自革蘭氏陰性細(xì)菌或革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，所述基因工程微生物選自大腸桿菌、分支桿菌 (mycrobacterium)、諾卡氏菌(Nocardia sp·)、皮疽諾卡氏菌(Nocardia farcinica)、 灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)、稀有海洋放線菌(Salinispora arenicola)、 密執(zhí)安棍狀桿菌(Clavibacter michiganenesis)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、食 '^iMM (Alcanivorax) > Zfe M ff ^ M (Alcaligenes) > it ^f (Arabidopsis) > ^ ff 菌屬(Fundibacter)、海桿菌屬(Marinobacter)、小家鼠(Mus musculus)、假單胞菌屬O^seudomonas)或希蒙得木屬(Simmodsia)、耶氏酵母屬(Yarrowia)、假絲酵母屬(Candida)、紅酵母屬(Rhodotorula)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、隱球菌屬 (Cryptococcus)、絲孢酵母屬(Trichosporon)或油脂酵母屬(Lipomyces)。在某些實(shí)施方案中，所述基因工程微生物選自大腸桿菌B菌株、C菌株、K菌株或W菌株。在其他實(shí)施方案中，所述基因工程微生物選自聚球藍(lán)細(xì)菌PCC 7002、細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌(Synechococcus elongatus)PCC 7942、集胞藍(lán)細(xì)菌 PCC 6803。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及產(chǎn)生脂肪酯的方法，所述方法包括在合適的醇底物存在下培養(yǎng)基因工程微生物。在某些實(shí)施方案中，所述醇底物可以選自乙醇或甲醇。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述醇底物是甲醇。在其他實(shí)施方案中，所述方法還包括在允許基因工程微生物產(chǎn)生脂肪酯產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)基因工程微生物。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酯的產(chǎn)率為每IOOg葡萄糖約0. 5g-約50g 脂肪酯。例如，產(chǎn)生脂肪酯的產(chǎn)率為每IOOg葡萄糖約0.5g脂肪酯或更多(例如，每IOOg 葡萄糖約0. 5g脂肪酯或更多、每IOOg葡萄糖約2g脂肪酯或更多、每IOOg葡萄糖約5g脂肪酯或更多、每IOOg葡萄糖約5g脂肪酯或更多、每IOOg葡萄糖約IOg脂肪酯或更多)。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酯的產(chǎn)率為每IOOg葡萄糖約0. 5g至約40g脂肪酯、 每IOOg葡萄糖約0. 5g至約30g脂肪酯、每IOOg葡萄糖約0. 5g至約20g脂肪酯、每IOOg 葡萄糖約0. 5g至約IOg脂肪酯、每IOOg葡萄糖約0. 5g至約5g脂肪酯或每IOOg葡萄糖約培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酯的產(chǎn)率為每IOOg葡萄糖至少0. 5g脂肪酯、至少4g脂肪酯、至少5g脂肪酯、至少IOg脂肪酯、至少20g脂肪酯、至少 30g脂肪酯、至少40g脂肪酯或至少50g脂肪酯。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酯的產(chǎn)率為每IOOg葡萄糖不超過(guò)50g脂肪酯。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酯的產(chǎn)率為葡萄糖重量的約0.5%至約 50%。例如，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酯的產(chǎn)率為葡萄糖重量的約0.5%或更高(例如，約0.5% 或更高、約2%或更高、約5%或更高)。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酯的產(chǎn)率為葡萄糖重量的約0. 5%至約40%、約0. 5%至約30%、約0. 5%至約20%、約0. 5%至約 10 %、約0. 5%至約5%或約0. 5%至約4%。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酯的產(chǎn)率為葡萄糖重量的至少約0. 5%、至少約4%、至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%或至少約50%。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酯的產(chǎn)率為不超過(guò)葡萄糖重量的50%。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酯的產(chǎn)率為碳源中碳重量的約10%至約 95%。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酯的產(chǎn)率為碳源中碳重量的約15%至約 90%、約20%至約80%或約30%至約70%。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酯的產(chǎn)率為碳源中碳重量的至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、 至少約60 %、至少約70 %、至少約80 %、至少約90 %或至少約95 %。在具體的實(shí)施方案中， 培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酯的產(chǎn)率為不超過(guò)碳源中碳重量的95%。在一些實(shí)施方案中，所述脂肪酯是脂肪酸乙酯，并且其在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的產(chǎn)率為每IOOg葡萄糖約0. 5g至約50g脂肪酸乙酯。例如，所述脂肪酯是脂肪酸乙酯，并且其在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的產(chǎn)率為每IOOg葡萄糖約0. 5g或更多(例如，約0. 5g或更多、約2g或更多、 約5g或更多、約IOg或更多、約15g或更多)。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸乙酯的產(chǎn)率為每IOOg葡萄糖約0. 5g至約40g脂肪酸乙酯、每IOOg葡萄糖約0. 5g至約30g 脂肪酸乙酯、每IOOg葡萄糖約0. 5g至約20g脂肪酸乙酯、每IOOg葡萄糖約0. 5g至約IOg 脂肪酸乙酯、每IOOg葡萄糖約0. 5g至約5g脂肪酸乙酯或每IOOg葡萄糖約0. 5g至約4g 脂肪酸乙酯。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸乙酯的產(chǎn)率為每IOOg葡萄糖至少 0. 5g脂肪酸乙酯、至少4g脂肪酸乙酯、至少5g脂肪酸乙酯、至少IOg脂肪酸乙酯、至少20g 脂肪酸乙酯、至少30g脂肪酸乙酯、至少40g脂肪酸乙酯或至少50g脂肪酸乙酯。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸乙酯的產(chǎn)率為每IOOg葡萄糖不超過(guò)50g脂肪酸乙酯。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸乙酯的產(chǎn)率為葡萄糖重量的約0.5%至約50%。例如，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸乙酯的產(chǎn)率為葡萄糖重量的約0.5%或更多(例如， 約0. 5%或更多、約或更多、約2%或更多、約5%或更多、約10%或更多)。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸乙酯的產(chǎn)率為葡萄糖重量的約0. 5%至約40%、約0. 5%至約30%、約0. 5%至約20%、約0. 5%至約10%、約0. 5%至約5%或約0. 5%至約4%。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸乙酯的產(chǎn)率為葡萄糖重量的至少約0.5%、至少約 4 %、至少約5 %、至少約10 %、至少約20 %、至少約30 %、至少約40 %或至少約50 %。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸乙酯的產(chǎn)率為不超過(guò)葡萄糖重量的50%。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸乙酯的產(chǎn)率為碳源中碳重量的約10%至約95%。例如，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸乙酯的產(chǎn)率為碳源中碳重量的約10%或更多(例如，約
1410 %或更多、約15 %或更多、約20 %或更多、約25 %或更多)。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸乙酯的產(chǎn)率為碳源中碳重量的約15%至約90%、約20%至約80%或約30% 至約70%。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸乙酯的產(chǎn)率為碳源中碳重量的至少約10 %、至少約20 %、至少約30 %、至少約40 %、至少約50 %、至少約60 %、至少約70 %、至少約80%、至少約90%或至少約95%。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸乙酯的產(chǎn)率為不超過(guò)碳源中碳重量的95%。在一些實(shí)施方案中，所述脂肪酯是脂肪酸甲酯，并且其在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的產(chǎn)率為每IOOg葡萄糖約0. 5g至約50g脂肪酸甲酯。例如，所述脂肪酯是脂肪酸甲酯，并且其在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的產(chǎn)率為每IOOg葡萄糖約0. 5g或更多(例如，約0. 5g或更多、約Ig或更多、 約2g或更多、約5g或更多、約IOg或更多)脂肪酸甲酯。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸甲酯的產(chǎn)率為每IOOg葡萄糖約0. 5g至約40g脂肪酸甲酯、每IOOg葡萄糖約0. 5g 至約30g脂肪酸甲酯、每IOOg葡萄糖約0. 5g至約20g脂肪酸甲酯、每IOOg葡萄糖約0. 5g 至約IOg脂肪酸甲酯、每IOOg葡萄糖約0. 5g至約5g脂肪酸甲酯或每IOOg葡萄糖約0. 5g 至約4g脂肪酸甲酯。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸甲酯的產(chǎn)率為每IOOg葡萄糖至少0. 5g脂肪酸甲酯、至少4g脂肪酸甲酯、至少5g脂肪酸甲酯、至少IOg脂肪酸甲酯、 至少20g脂肪酸甲酯、至少30g脂肪酸甲酯、至少40g脂肪酸甲酯或至少50g脂肪酸甲酯。 在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸甲酯的產(chǎn)率為每IOOg葡萄糖不超過(guò)50g脂肪酸甲酯。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸甲酯的產(chǎn)率為葡萄糖重量的約0.5%至約50%。例如，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸甲酯的產(chǎn)率為葡萄糖重量的約0.5%或更多(例如， 約0. 5%或更多、約或更多、約2%或更多、約5%或更多、約10%或更多、約15%或更多)。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸甲酯的產(chǎn)率為葡萄糖重量的約0. 5%至約40%、約0. 5%至約30%、約0. 5%至約20%、約0. 5%至約10%、約0. 5%至約5%或約 0.5%至約4%。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸甲酯的產(chǎn)率為葡萄糖重量的至少約0. 5 %、至少約4 %、至少約5 %、至少約10 %、至少約20 %、至少約30 %、至少約40 %或至少約50%。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸甲酯的產(chǎn)率為不超過(guò)葡萄糖重量的 50%。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸甲酯的產(chǎn)率為碳源中碳重量的約10%至約95%。例如，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸甲酯的產(chǎn)率為碳源中碳重量的約10%或更多(例如， 約10%或更多、約20%或更多、約25%或更多、約30%或更多、約35%或更多、約40%或更多)。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸甲酯的產(chǎn)率為碳源中碳重量的約15%至約90%、約20%至約80%或約30%至約70%。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸甲酯的產(chǎn)率為碳源中碳重量的至少約10 %、至少約20 %、至少約30 %、至少約40 %、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約95%。在具體的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中產(chǎn)生脂肪酸甲酯的產(chǎn)率為不超過(guò)碳源中碳重量的95%。另一方面，本發(fā)明涉及通過(guò)本文所述的方法產(chǎn)生的脂肪酯，例如脂肪酸酯。在一些實(shí)施方案中，所述脂肪酸酯是脂肪酸甲酯。在一些實(shí)施方案中，所述脂肪酸甲酯的長(zhǎng)度為至少約 4、6、8、10、12、14、16 或 18 個(gè)碳。在一些實(shí)施方案中，所述脂肪酸甲酯包含A側(cè)和B側(cè)。在一些實(shí)施方案中，所述脂肪酸甲酯B側(cè)的長(zhǎng)度為至少約4、6、8、10、12、14、16或18個(gè)碳。在一些實(shí)施方案中，所述脂肪酸甲酯的B側(cè)包含直鏈。在其他實(shí)施方案中，所述脂肪酸甲酯的B側(cè)包含支鏈。在其他實(shí)施方案中，所述脂肪酸甲酯的B側(cè)包含至少一個(gè)環(huán)狀部分。在其他實(shí)施方案中，所述脂肪酸選自十二烷酸甲酯、5-十二烯酸甲酯、十四烷酸甲酯、7-十四烯酸甲酯、十六烷酸甲酯、 9-十六烯酸甲酯、十八烷酸甲酯、11-十八烯酸甲酯或以上的組合。在其他實(shí)施方案中，所述脂肪酯選自十二烷酸乙酯、5-十二烯酸乙酯、十四烷酸乙酯、7-十四烯酸乙酯、十六烷酸乙酯、9-十六烯酸乙酯、十八烷酸乙酯、11-十八烯酸乙酯或以上的組合。在一些實(shí)施方案中，所述脂肪酸甲酯是飽和的。在其他實(shí)施方案中，所述脂肪酸甲酯是不飽和的。在其他實(shí)施方案中，所述脂肪酸甲酯是單不飽和的。在某些實(shí)施方案中，所述脂肪酸乙酯是飽和的。在其他實(shí)施方案中，所述脂肪酸乙酯是不飽和的。在其他實(shí)施方案中，所述脂肪酸乙酯是單不飽和的。本文所提供的附圖和實(shí)施例僅意圖說(shuō)明本發(fā)明的特征。它們并非意圖是限制性的。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1是顯示用于產(chǎn)生質(zhì)粒pCLTFWcat的克隆方法的示意圖。圖2是顯示用于產(chǎn)生整合片段IacZ :tesA fadD atfAl的克隆方法的示意圖。圖3是整合片段IacZ: :tesA fadD atfAl的核苷酸序列。圖4列出pLacZ質(zhì)粒的核苷酸序列(SEQ ID NO 28)。發(fā)明的詳細(xì)描述除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義一樣。盡管在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)定中可以使用與本文所述相似或等同的方法和材料，但在下文中描述了合適的方法和材料。對(duì)于本文提及的包括GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)序列在內(nèi)的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利以及其他參考文獻(xiàn)，通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本文。在產(chǎn)生矛盾的情況下，以本說(shuō)明書(shū)(包括定義)為準(zhǔn)。此外，這些材料、方法以及實(shí)施例僅僅是說(shuō)明性的而并非意圖限制。根據(jù)以下詳細(xì)說(shuō)明以及權(quán)利要求書(shū)，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢(shì)將變得清楚。定義本文所用冠詞“a”和“an”是指一個(gè)或多于一個(gè)(即至少一個(gè))該冠詞的語(yǔ)法對(duì)象。作為實(shí)例，“元件(an element)”表示一個(gè)元件或多于一個(gè)元件。本文所用術(shù)語(yǔ)“約”表示給定數(shù)值的士20%的值。因此，“約60%”表示在60士(60 的20%)之間的值(即48至70)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“減弱”表示削弱、降低或縮小。例如，可以通過(guò)修飾多肽來(lái)減弱多肽以降低其活性(例如，通過(guò)修飾編碼所述多肽的核苷酸序列)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“生物原油”是指來(lái)源于生物質(zhì)、生物質(zhì)衍生物或其他生物來(lái)源的產(chǎn)品，生物原油生物原油和石油原油一樣，均可以轉(zhuǎn)化為其他燃料，例如生物原油可被轉(zhuǎn)化為汽油、柴油、噴氣燃料或燃用油(heating oil)。而且，生物原油與石油原油一樣，可以轉(zhuǎn)化為其他工業(yè)上有用的化學(xué)品，用于例如制藥、化妝品、消費(fèi)品、工業(yè)加工等。生物原油可以包括例如烴、烴產(chǎn)品、脂肪酯以及/或者脂肪族酮。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物原油由烴，例如脂肪(例如，烷烴、烯烴、炔)或芳香烴構(gòu)成。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“生物柴油”表示可以作為來(lái)源于石油的柴油的替代品的生物燃料。生物柴油可以以被稱為“純(neat)”生物柴油的純品形式或作為以任何濃度與基于石油的柴油的混合物用于內(nèi)燃柴油發(fā)動(dòng)機(jī)。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物柴油可以包括酯類或烴類，例如醛、烷或烯。本文所用的術(shù)語(yǔ)“生物燃料”是指來(lái)源于生物質(zhì)、生物質(zhì)衍生物或其他生物資源的任何燃料。生物燃料可以替代基于石油的燃料。例如，生物燃料包括運(yùn)輸工具燃料(例如汽油、柴油、噴氣燃料等)、燃用燃料和發(fā)電燃料。生物燃料是可再生能源。本文所用的術(shù)語(yǔ)“生物質(zhì)”是指來(lái)源于生物材料的碳源。生物質(zhì)可以被轉(zhuǎn)化為生物燃料。生物質(zhì)的一個(gè)示例性來(lái)源是植物物質(zhì)。例如，玉米、甘蔗或柳枝稷可以用作生物質(zhì)。 生物質(zhì)的另一非限制性實(shí)例是動(dòng)物物質(zhì)，例如牛糞。生物質(zhì)還包括來(lái)自工業(yè)、農(nóng)業(yè)、林業(yè)和家庭的廢品。可以用作生物質(zhì)的這些廢品的實(shí)例是發(fā)酵廢渣、秸稈、木材、污水、垃圾、和剩余食物。生物質(zhì)還包括例如碳水化合物(例如單糖、二糖或多糖)的碳源。本文所用的短語(yǔ)“碳源”是指適于用作原核或簡(jiǎn)單真核細(xì)胞生長(zhǎng)的碳源的底物或化合物。碳源可以是不同形式的，包括但不限于聚合物、碳水化合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、 肽和氣體(例如CO和CO2)。這些包括，例如各種單糖，例如葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖； 寡糖，例如低聚果糖和低聚半乳糖；多糖，例如木糖和阿拉伯糖；二糖，例如蔗糖、麥芽糖和松二糖；纖維素材料，例如甲基纖維素和羧甲基纖維素鈉；飽和或不飽和脂肪酸酯，例如琥珀酸酯、乳酸酯和醋酸酯；醇，例如甲醇、乙醇、丙醇或其混合物。碳源還可以是光合作用的產(chǎn)物，包括但不限于葡萄糖。優(yōu)選的碳源是生物質(zhì)。另一優(yōu)選的碳源是葡萄糖。本文所用的“降低濁點(diǎn)的添加劑，，是添加到組合物以減少或降低溶液的濁點(diǎn)的添加劑。本文所用的短語(yǔ)“液體的濁點(diǎn)”表示溶解的固體不再完全可溶的溫度。在該溫度以下，固體開(kāi)始作為第二相沉淀，給予液體渾濁的外觀。在石油工業(yè)中，濁點(diǎn)是指這樣的溫度在該溫度以下，固化物質(zhì)或其他重碳?xì)浠衔镌谠?、提煉油或燃料中結(jié)晶從而形成渾濁的外觀。固化物質(zhì)的存在影響該液體的流動(dòng)特性、該液體堵塞燃料過(guò)濾器、噴嘴等的傾向、固化物質(zhì)在冷表面(例如管道或熱交換器污垢)上的累積以及該液體與水的乳化特性。如果兩個(gè)序列的每個(gè)堿基都匹配(即能夠形成Watson Crick堿基對(duì))，則核苷酸序列與另一核苷酸序列是“互補(bǔ)的”。術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)鏈”在本文中與術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)序列”互換使用。 核酸鏈的互補(bǔ)序列可以是編碼鏈的互補(bǔ)序列或非編碼鏈的互補(bǔ)序列。術(shù)語(yǔ)“包含(comprising)”、“具有(having) ”、“包括(including)，，和“含有 (containing) ”應(yīng)被解釋為開(kāi)放式的術(shù)語(yǔ)(例如，表示“包括但不限于”)，除非指出并非如此。本文所用的術(shù)語(yǔ)“足以允許表達(dá)的條件”表示允許宿主細(xì)胞產(chǎn)生諸如本文所述的多肽、醛或烷的所需產(chǎn)物的任何條件。合適的條件包括，例如發(fā)酵條件。發(fā)酵條件可以包含很多參數(shù)，例如溫度范圍、通氣水平和培養(yǎng)基組分。這些條件中的每一個(gè)單獨(dú)地并聯(lián)合地允許宿主細(xì)胞生長(zhǎng)。示例性的培養(yǎng)基包括培養(yǎng)液或凝膠。通常，所述培養(yǎng)基包含諸如葡萄糖、 果糖、纖維素等的碳源，該碳源可以直接被宿主細(xì)胞代謝。此外，培養(yǎng)基中可以使用酶以便于碳源的動(dòng)員(例如淀粉或纖維素解聚為可發(fā)酵的糖)和隨后的代謝。為了確定條件是否足以允許表達(dá)，可以將宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)例如約4、8、12、24、36或48小時(shí)。培養(yǎng)中和/或培養(yǎng)后，可以獲取樣品并分析樣品以確定該條件是否允許表達(dá)。 例如，可以測(cè)試樣品中的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞所生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中所需產(chǎn)物的存在。當(dāng)測(cè)試產(chǎn)物的存在時(shí)，可以使用諸如但不限于TLC、HPLC、GC/FID、GC/MS、LC/MS、MS的檢測(cè)。應(yīng)當(dāng)理解，本文所述的多肽可以具有另外的對(duì)多肽功能沒(méi)有本質(zhì)影響的保守型或非必需氨基酸取代?？梢园凑誃owie et al. , Science (1990) 247 :1306 1310中所述確定特定取代是否會(huì)被允許(例如不會(huì)不利地影響所需的生物學(xué)性質(zhì)，例如脫羧酶活性)?！氨Ｊ匦桶被崛〈笔前被釟埢痪哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基所替代的取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族在本領(lǐng)域中已有定義。這些家族包括具有以下側(cè)鏈的氨基酸堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈 (例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β -分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。如本文所用，“允許產(chǎn)物產(chǎn)生的條件”是指允許生產(chǎn)宿主產(chǎn)生所需產(chǎn)物的任何發(fā)酵條件，所需產(chǎn)物例如?；o酶A或脂肪酸衍生物(例如，脂肪酸、烴、脂肪醇、蠟或脂肪酯)。 發(fā)酵條件通常包括很多參數(shù)。示例性的條件包括但不限于，溫度范圍、通氣水平和培養(yǎng)基組分。這些條件中的每一種，單獨(dú)和/或聯(lián)合允許生產(chǎn)宿主生長(zhǎng)。示例性的培養(yǎng)基包括培養(yǎng)液和/或凝膠。通常，合適的培養(yǎng)基包含碳源(例如葡萄糖、果糖、纖維素等)，該碳源可以直接被微生物代謝。此外，培養(yǎng)基中可以使用酶以便于碳源的動(dòng)員(例如淀粉或纖維素解聚為可發(fā)酵的糖)和隨后的代謝。為了確定發(fā)酵條件是否允許產(chǎn)物產(chǎn)生，可以將生產(chǎn)宿主培養(yǎng)約4、8、12、24、36或 48小時(shí)。在培養(yǎng)期間或培養(yǎng)后，獲得樣品并分析確定發(fā)酵條件是否已允許產(chǎn)物產(chǎn)生。例如， 可以檢測(cè)樣品的生產(chǎn)宿主中或生產(chǎn)宿主所生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中所需產(chǎn)物的存在。示例性的測(cè)定，例如TLC、HPLC、GC/FID、GC/MS、LC/MS、MS以及本文提供的那些，可用于鑒定產(chǎn)物的存在并對(duì)其進(jìn)行定量。本文所用的“控制元件”表示轉(zhuǎn)錄控制元件?？刂圃▎?dòng)子和增強(qiáng)子。術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子元件”、“啟動(dòng)子”或“啟動(dòng)子序列”是指發(fā)揮激活基因表達(dá)開(kāi)關(guān)功能的DNA序列。 如果基因被激活，認(rèn)為其被轉(zhuǎn)錄或參與轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄涉及由基因合成mRNA。因此，啟動(dòng)子作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件并且還提供基因轉(zhuǎn)錄為mRNA的起始位點(diǎn)。控制元件與參與轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞蛋白特異性地相互作用(Maniatis et al, Science 236:1237,1987)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“缺失”或“敲除”表示修飾或鈍化編碼靶蛋白的多核苷酸序列， 以便降低或消除所述靶蛋白的功能?？梢岳帽绢I(lǐng)域內(nèi)公知的方法實(shí)現(xiàn)多核苷酸缺失(參見(jiàn)例如，Datsenko et al.，Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 97 :6640-45,2000 或國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)?PCT/US2007/011923 和 PCT/US2008/058788)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源的”是指位于細(xì)胞內(nèi)的且不是利用重組基因工程技術(shù)導(dǎo)入細(xì)胞的多核苷酸。例如，當(dāng)細(xì)胞最初從自然界分離時(shí)，已經(jīng)存在于所述細(xì)胞中的基因。即使調(diào)控序列，諸如能夠激活轉(zhuǎn)錄或者翻譯的啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子序列已經(jīng)通過(guò)重組技術(shù)被改變，多核苷酸仍被認(rèn)為是內(nèi)源的。本文所用的術(shù)語(yǔ)“酯合酶”表示能夠產(chǎn)生脂肪酯的肽。更具體地說(shuō)，酯合酶是能夠?qū)⒘蝓マD(zhuǎn)化為脂肪酯的肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，酯合酶將硫酯(酰基輔酶A)轉(zhuǎn)化為脂肪酯。在可選的實(shí)施方案中，酯合酶利用硫酯和醇作為底物產(chǎn)生脂肪酯。酯合酶能夠利用短鏈和長(zhǎng)鏈硫酯作為底物。此外，酯合酶能夠利用短鏈和長(zhǎng)鏈醇作為底物。酯合酶的非限制性實(shí)例是蠟合酶、蠟-酯合酶、?；o酶A:醇轉(zhuǎn)?；?、?；D(zhuǎn)移酶和脂酰輔酶A:脂肪醇酰基轉(zhuǎn)移酶。示例性的酯合酶分類到酶分類號(hào)EC2. 3. 1. 75中。 很多這類酶以及用于制備本文所述產(chǎn)物的其他有用的酶已經(jīng)在例如國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/ US2007/011923和PCT/US2008/058788中披露，通過(guò)引用將上述國(guó)際申請(qǐng)并入本文。本文使用的術(shù)語(yǔ)“脂肪酸”表示具有式RCOOH的羧酸。R表示脂肪族基團(tuán)，優(yōu)選地表示烷基。R可以包含約4到約22個(gè)碳原子。脂肪酸可以為飽和的、單不飽和的或多不飽和的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述脂肪酸由脂肪酸生物合成途徑產(chǎn)生。本文所用的術(shù)語(yǔ)“脂肪酸生物合成途徑”表示產(chǎn)生脂肪酸的生物合成途徑。所述脂肪酸生物合成途徑包括脂肪酸酶，可以按照本文所述將所述脂肪酸酶進(jìn)行工程改造來(lái)產(chǎn)生脂肪酸，并且在一些實(shí)施方案中脂肪酸酶可以與其他酶一起表達(dá)來(lái)產(chǎn)生具有所需碳鏈特征的脂肪酸。本文所用的術(shù)語(yǔ)“脂肪酸降解酶”表示參與脂肪酸或脂肪酸衍生物分解或轉(zhuǎn)化成另一產(chǎn)物的酶。脂肪酸降解酶的非限制性實(shí)例是?；o酶A合酶。很多這類酶以及用于制備本文所述產(chǎn)物的其他有用的酶已經(jīng)在例如國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2007/011923和PCT/ US2008/058788中披露，通過(guò)引用將上述國(guó)際申請(qǐng)并入本文。脂肪酸降解酶的其他實(shí)例如本文所述。本文所用的術(shù)語(yǔ)“脂肪酸衍生物”表示部分地產(chǎn)生于生產(chǎn)宿主生物體的脂肪酸生物合成途徑的產(chǎn)物。“脂肪酸衍生物”還包括部分地產(chǎn)生于?；?ACP或酰基-ACP衍生物的產(chǎn)物。所述脂肪酸生物合成途徑包括脂肪酸合酶，可以按照本文所述將所述脂肪酸合酶進(jìn)行工程改造來(lái)產(chǎn)生脂肪酸衍生物，并且在一些實(shí)例中，脂肪酸合酶可以與其他酶一起表達(dá)以產(chǎn)生具有所需碳鏈特征的脂肪酸衍生物。示例性的脂肪酸衍生物包括，例如脂肪酸、?；o酶A、脂肪醛、短和長(zhǎng)鏈醇、烴類、脂肪醇、酮和酯(例如蠟、脂肪酸酯或脂肪酯)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“脂肪酸衍生酶”表示在脂肪酸衍生物的產(chǎn)生中可以被表達(dá)或超表達(dá)的所有酶。這些酶在本文統(tǒng)稱為脂肪酸衍生酶。這些酶可以是脂肪酸生物合成途徑的一部分。脂肪酸衍生酶的非限制性實(shí)例包括脂肪酸合酶、硫酯酶、?；o酶A合酶、?；o酶A還原酶、醇脫氫酶、醇酰基轉(zhuǎn)移酶、羧酸還原酶、脂肪醇形成?；o酶A還原酶、酯合酶、 醛生物合成多肽以及烷生物合成多肽。脂肪酸衍生物酶可以將底物轉(zhuǎn)化成脂肪酸衍生物。 在一些實(shí)施例中，所述底物可以是脂肪酸衍生物，該衍生物被脂肪酸衍生酶轉(zhuǎn)化為不同的脂肪酸衍生物。很多這類酶以及用于制備本文所述產(chǎn)物的其他有用的酶已經(jīng)在例如國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2007/011923和PCT/US2008/058788中披露，通過(guò)引用將上述國(guó)際申請(qǐng)并入本文。本文所用的“脂肪酸酶”表示參與脂肪酸生物合成的任何酶。脂肪酸酶可以在宿主細(xì)胞中被表達(dá)或超表達(dá)以產(chǎn)生脂肪酸。脂肪酸酶的非限制性實(shí)例包括脂肪酸合酶和硫酯酶。很多這類酶以及用于制備本文所述產(chǎn)物的其他有用的酶已經(jīng)在例如國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)?PCT/US2007/011923和PCT/US2008/058788中披露，通過(guò)引用將上述國(guó)際申請(qǐng)并入本文。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“脂肪酯”表示酯類。在優(yōu)選實(shí)施方案中，脂肪酯是由脂肪酸制備產(chǎn)生的任何酯，例如脂肪酸酯。在一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪酯含有A側(cè)(即連接在羧酸氧上的碳鏈)和B側(cè)(即包含親本羧酸酯的碳鏈)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)脂肪酯來(lái)源于脂肪酸生物合成途徑時(shí)，A側(cè)來(lái)自醇，B側(cè)來(lái)自脂肪酸。任何醇都可以用于形成脂肪酯的A側(cè)。例如， 醇可以來(lái)源于脂肪酸生物合成途徑?？蛇x地，可以通過(guò)非脂肪酸生物合成途徑來(lái)產(chǎn)生醇。此夕卜，醇可以是外源提供的。例如在脂肪酯是由還能產(chǎn)生脂肪酸的生物產(chǎn)生的情況下，醇可以在發(fā)酵液中提供。可選地，在脂肪酯是由還能產(chǎn)生醇的生物產(chǎn)生的情況下，可以提供外源的羧酸，諸如脂肪酸或乙酸。包含A側(cè)或B側(cè)的碳鏈可以是任意長(zhǎng)度。在一個(gè)實(shí)施方案中，酯的A側(cè)長(zhǎng)度為至少約 1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16 或 18 個(gè)碳。酯的 B 側(cè)長(zhǎng)度為至少約 4、6、8、10、12、14、 16、18、20、22、對(duì)或沈個(gè)碳。A側(cè)和/或B側(cè)可以是直鏈或支鏈。支鏈可以有一或多個(gè)分支點(diǎn)。此外，支鏈可以包括環(huán)形分支。再者，A側(cè)和/或B側(cè)可以是飽和或不飽和的。如果是不飽和的，A側(cè)和/或B側(cè)可以有一或多個(gè)不飽和位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪酯是通過(guò)生物合成產(chǎn)生的。在這個(gè)實(shí)施方案中，首先脂肪酸被“激活”?！凹せ畹摹敝舅岬姆窍拗菩詫?shí)例是酰基輔酶A、酰基-ACP和酰基磷酸酯。?；o酶A可以是脂肪酸生物合成或降解的直接產(chǎn)物。此外，可以由游離脂肪酸、輔酶A或腺苷核苷酸三磷酸(ATP)合成?；o酶A。產(chǎn)生?；o酶A的酶的實(shí)例是?；o酶A合酶。脂肪酸被激活后，可以容易地轉(zhuǎn)移到受體親核分子上。示例性的親核分子是醇、巰醇或磷酸酯。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述脂肪酯是蠟。蠟可以來(lái)源于長(zhǎng)鏈醇和長(zhǎng)鏈脂肪酸。在另一實(shí)施方案中，脂肪酯可以來(lái)源于脂肪酰基硫酯和醇。另一實(shí)施方案中，脂肪酯是脂肪酸硫酯，例如脂酰輔酶A(CoA)。在其他實(shí)施方案中，所述脂肪酸酯是脂肪?；核狨?、?；d體蛋白(ACP)或者脂肪磷酸酯。脂肪酯有很多用途。例如，脂肪酯可以用作生物燃料、表面活性劑或配制成添加劑，該添加劑可以為燃料和工業(yè)化學(xué)品提供潤(rùn)滑和其他作用。本文所用的“現(xiàn)代碳分?jǐn)?shù)(fraction of modern carbon) ”或“fM”與分別由稱為草酸標(biāo)準(zhǔn)品HOxI和HOxII的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究院(National Institute of Standards and Technology (NIST))標(biāo)準(zhǔn)參考物(SRM)4990B和4990C所定義的具有相同意義?；径x涉及14Cz^C同位素比例HOxI (參考AD 1950)的0.95倍。這大概等同于經(jīng)衰變修正的前工業(yè)革命時(shí)代的木頭(decay-corrected pre-Industrial Revolution wood)。對(duì)于現(xiàn)今有生命生物圈(例如植物物質(zhì))而言，f 為約1. 1。本文的基因“fhuA”和“tonA”可交替使用。本文所用的“基因敲除”是指這樣的操作通過(guò)該操作，編碼靶蛋白的基因被修飾或失活從而降低或消除完整蛋白的功能?？梢酝ㄟ^(guò)一般方法進(jìn)行基因的失活，例如通過(guò)UV 照射或用N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍處理的誘變、定點(diǎn)誘變、同源重組、插入-缺失誘
馬區(qū)云力白勺(Red-driven integration) " (Datsenko et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 :6640-45, 2000)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，將構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞中，使得能夠選擇所述宿主細(xì)胞中的同源重組事件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地設(shè)計(jì)包含陽(yáng)性和陰性選擇基因的敲除構(gòu)建體，所述陽(yáng)性和陰性選擇基因用于有效選擇經(jīng)歷與所述構(gòu)建體的同源重組事件的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。例如，通過(guò)單交叉重組或雙交叉重組，用含有改變的DNA序列替換野生型DNA序列可以獲得所述宿主細(xì)胞中的改變。為了便于轉(zhuǎn)化體的選擇，所述改變可以是， 例如編碼抗生素抗性標(biāo)記的DNA序列或彌補(bǔ)了所述宿主細(xì)胞可能的營(yíng)養(yǎng)缺陷型的基因。突變包括但不限于缺失-插入突變。此類改變的實(shí)例包括基因破壞，即基因擾動(dòng)，使得從該基因正常產(chǎn)生的產(chǎn)物不能以功能形式產(chǎn)生的。這可以歸因于完全缺失、選擇標(biāo)記的缺失和插入、選擇標(biāo)記的插入、移碼突變、框內(nèi)缺失或?qū)е绿崆敖K止的點(diǎn)突變。在一些情況下，所述基因的全部mRNA是不存在的。在其它的情形下，所產(chǎn)生的mRNA的量改變?？梢园凑找韵掠?jì)算兩個(gè)序列之間的“同源性”。序列以最佳比較目的進(jìn)行比對(duì)(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列之一或兩者中引入空位用于最佳比對(duì)，并且為了比較目的可以忽略非同源序列)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，為比較目的而比對(duì)的參考序列的長(zhǎng)度為參考序列長(zhǎng)度的至少約30%、優(yōu)選地至少約40%、更優(yōu)選地至少約50%、更優(yōu)選地至少約60%并且更優(yōu)選地至少約70%、至少約80%、至少約90%或約100%。然后比較位于對(duì)應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械奈恢帽慌c第二序列中對(duì)應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，則分子在該位置是相同的(本文所用的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。兩個(gè)序列之間的百分比同一性是序列所共享的相同位置數(shù)的函數(shù)，這考慮到了為了兩個(gè)序列的最佳比對(duì)而需要引入的空位的數(shù)量和每個(gè)空位的長(zhǎng)度?？梢允褂脭?shù)學(xué)算法完成序列的比較和兩個(gè)序列之間百分比同源性的測(cè)定。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用以下算法測(cè)定兩個(gè)氨基酸序列之間的百分比同源性=Needleman and Wunsch (1970)、J. Mol. Biol. 48 :444 453的算法，該算法被并入GCG軟件包中的GAP程序中，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，以及16、14、12、10、8、6或4的空位權(quán)重和1、2、3、 4、5或6的長(zhǎng)度權(quán)重。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用以下程序測(cè)定兩個(gè)核苷酸序列之間的同源性百分比GCG軟件包中的GAP程序，使用NWSgapdna. CMP矩陣以及約40、50、60、70或 80的空位權(quán)重和約1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度權(quán)重。特別優(yōu)選的參數(shù)組(和如果操作者不確定應(yīng)當(dāng)應(yīng)用哪些參數(shù)確定分子是否在要求的同源性限制內(nèi)而應(yīng)該使用的參數(shù)組)是具有12 的空位罰分、4的空位延伸罰分和5的移碼空位罰分的Blossum 62評(píng)分矩陣。比對(duì)用于比較的序列的其他方法是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。多種程序和比對(duì)算法描述于例如，Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2 :482,1981 ;Pearson & Lipman, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 85 :2444,1988 ；Higgins & Sharp, Gene 73 :237244,1988 ；Higgins & Sharp, CABIOS 5 :151-153, 1989 ；Corpet et al. , Nucleic Acids Research 16: 10881-10890,1988 ；Huang et al.，CABIOS 8 :155-165,1992 ；禾口 Pearson et al.，Methods in Molecular Biology (分子生物學(xué)方法)24 :307-331,1994.以及 Altschul et al.， J. Mol. Biol. 215 :403-410,1990 中。本文所用的“宿主細(xì)胞”是用于產(chǎn)生本文所述的產(chǎn)物(例如醛類或烷類)的細(xì)胞。 可以修飾宿主細(xì)胞，使其表達(dá)或超表達(dá)所選擇的基因或具有所選擇的基因的減弱的表達(dá)。 宿主細(xì)胞的非限制性實(shí)例包括植物、動(dòng)物、人、細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、酵母或絲狀真菌細(xì)胞。本文所用的術(shù)語(yǔ)“在低嚴(yán)緊性、中等嚴(yán)緊性、高嚴(yán)緊性或極高嚴(yán)緊性條件下雜交”描述雜交和洗滌的條件。進(jìn)行雜交反應(yīng)的指導(dǎo)可以見(jiàn)于例如Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù))，John Wiley & Sons, N. Y. (1989)， 6.3.1-6.3.6。該參考資料中描述了水性和非水性方法并且可以使用任一方法。本文涉及
21的具體雜交條件如下1)低嚴(yán)緊性雜交條件在約45°C下、在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC) 中，然后是在至少50°C下、在0. 2XSSC、0. 1% SDS中洗滌兩次(對(duì)于低嚴(yán)緊性條件，洗滌溫度可以升至55°C) ；2)中等嚴(yán)緊性雜交條件在約45°C下、在6XSSC中，然后是在60°C下、 0. 2XSSC、0. 1% SDS中洗滌一次或多次；幻高嚴(yán)緊性雜交條件在約45°C下、6XSSC中，然后是在65°C下、在0. 2XSSC、0. SDS中洗滌一次或多次；以及優(yōu)選地4)極高嚴(yán)緊性雜交條件為65°C下、0. 5M磷酸鈉、7% SDS中，然后是在65°C下、在0. 2XSSCU% SDS中洗滌一次或多次。除非另作規(guī)定，極高嚴(yán)緊性條件(4)是優(yōu)選的條件。本文中涉及諸如DNA或RNA的核酸時(shí)，所用的術(shù)語(yǔ)“分離的”是指分別從所述核酸的天然來(lái)源中存在的其他DNA或RNA分離的分子。此外，“分離的核酸”包括核酸片段，例如不是天然存在的片段。本文所用的術(shù)語(yǔ)“分離的”還指從其他細(xì)胞蛋白分離的多肽，并且包括純化的內(nèi)源多肽和重組多肽兩者。當(dāng)核酸或多肽是通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生時(shí)，本文使用的術(shù)語(yǔ)“分離的”還指基本上游離于細(xì)胞物質(zhì)、病毒物質(zhì)或培養(yǎng)基的核酸或多肽。當(dāng)核酸或多肽是化學(xué)合成時(shí)，本文所用的術(shù)語(yǔ)“分離的”還指基本上游離于化學(xué)前體或其他化學(xué)品的核酸或多肽。本文所用的“細(xì)胞中基因的表達(dá)水平”是指由所述細(xì)胞中的基因編碼的mRNA、前體 mRNA新生轉(zhuǎn)錄物、轉(zhuǎn)錄加工中間體、成熟mRNA和/或降解產(chǎn)物的水平。本文所用的術(shù)語(yǔ)“微生物”表示來(lái)自古菌域、細(xì)菌域和真核域的原核和真核微生物種類，后者包括酵母和絲狀真菌、原生動(dòng)物、藻類或高等原生生物。本文所用的術(shù)語(yǔ)“微生物細(xì)胞”表示來(lái)源于微生物的細(xì)胞。本文所用的術(shù)語(yǔ)“核酸”是指多核苷酸，例如脫氧核糖核酸(DNA)以及適當(dāng)情況下，指核糖核酸(RNA)。該術(shù)語(yǔ)還包括產(chǎn)生自核苷酸類似物的RNA或DNA的類似物，以及適用于所描述的實(shí)施方案的單鏈(有義或反義)和雙鏈多核苷酸、EST、染色體、cDNA、mRNA和 rRNA。術(shù)語(yǔ)“核酸”和“多核苷酸”、“DNA”、“核酸分子”、“核苷酸序列”和/或“基因”可互換地使用，除非本文指出并非如此或上下文明確指出相反。本文所用的術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”表示所選擇的核苷酸序列(例如編碼本文所述的多肽)與啟動(dòng)子接近，從而允許所述啟動(dòng)子調(diào)節(jié)該選擇的核苷酸序列的表達(dá)。此外，按照轉(zhuǎn)錄和翻譯的方向，啟動(dòng)子位于所述選擇的核苷酸序列的上游。“可操作地連接”表示將核苷酸序列和調(diào)節(jié)序列連接，以便當(dāng)合適的分子(例如轉(zhuǎn)錄激活蛋白)與調(diào)節(jié)序列結(jié)合時(shí)允許基因表達(dá)。本文所用術(shù)語(yǔ)“或”表示術(shù)語(yǔ)“和/或”并且與術(shù)語(yǔ)“和/或”可交換地使用，除非上下文明確表示并非如此。本文所用的“超表達(dá)”表示在細(xì)胞中以高于對(duì)應(yīng)野生型細(xì)胞中正常表達(dá)濃度的濃度表達(dá)或產(chǎn)生的核酸、多肽或烴類。例如，當(dāng)在重組宿主細(xì)胞中多肽存在的濃度比其在相同物種的非重組宿主細(xì)胞中的濃度更高時(shí)，所述多肽在所述重組宿主細(xì)胞中可以是“超表達(dá)” 的。本文所用的“分配系數(shù)”或“P”定義為化合物在有機(jī)相中的平衡濃度除以在水相中(例如發(fā)酵液)平衡時(shí)的濃度。在本文所述的兩相系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方案中，在生產(chǎn)過(guò)程中所述有機(jī)相是由醛類或烷類形成的。但是，在一些實(shí)施例中，可以例如通過(guò)提供辛烷層來(lái)提供有機(jī)相以便于產(chǎn)物分離。當(dāng)描述兩相系統(tǒng)時(shí)，化合物的分配特性可以描述為logP。例如，IogP為1的化合物會(huì)10 1分配到有機(jī)相。IogP為-1的化合物會(huì)1 10分配到有機(jī)相。通過(guò)選擇合適的發(fā)酵液和有機(jī)相，在發(fā)酵容器中具有高IogP值的有機(jī)脂肪酸衍生物或產(chǎn)物可以分離到有機(jī)相中，即使處于很低的濃度。本文所用的術(shù)語(yǔ)“多肽”可以與“蛋白”、“肽”和/或“酶”交換使用，除非本文指出并非如此或上下文明確指出相反。本文所用的術(shù)語(yǔ)“生產(chǎn)宿主”表示用于產(chǎn)生本文所述產(chǎn)品的細(xì)胞。生產(chǎn)宿主經(jīng)修飾從而表達(dá)或超表達(dá)、減弱或缺失所選多核苷酸的表達(dá)。生產(chǎn)宿主的非限制性實(shí)例包括植物、藻類、動(dòng)物、人、細(xì)菌、酵母或絲狀真菌細(xì)胞。本文所用的術(shù)語(yǔ)“純化(purify)”、“純化的(purified)”或“純化 (purification) ”表示通過(guò)例如分離或隔離從分子的環(huán)境中移出或分離所述分子。“基本上純化的”分子為至少約60%、優(yōu)選地至少約75%以及更優(yōu)選地至少約90%游離于與其相關(guān)的其他組分。本文所用的這些術(shù)語(yǔ)還指從樣品中去除污染物。例如，污染物的去除可以導(dǎo)致樣品中脂肪酸衍生物或產(chǎn)物的百分比增加。例如，當(dāng)在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生脂肪酸衍生物或產(chǎn)物時(shí)，可以通過(guò)去除宿主細(xì)胞蛋白純化脂肪酸衍生物或產(chǎn)物。純化后，樣品中脂肪酸衍生物或產(chǎn)物的百分比增加。術(shù)語(yǔ)“純化(purify)”、“純化的(purified) ”或“純化(purification) ”不需要絕對(duì)純。它們是相對(duì)的術(shù)語(yǔ)。因此，例如當(dāng)在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生脂肪酸衍生物或產(chǎn)物時(shí)，純化的脂肪酸衍生物或產(chǎn)物是基本與其他細(xì)胞組分(例如核酸、多肽、脂質(zhì)、碳水化合物或其他脂肪酸衍生物或產(chǎn)物)分離的脂肪酸衍生物或產(chǎn)物。在另一實(shí)例中，純化的脂肪酸衍生物或產(chǎn)物制劑是這樣的在該制劑中，所述脂肪酸衍生物或產(chǎn)物基本不含污染物，例如發(fā)酵后可能存在的那些污染物。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)樣品重量的至少約50%是由脂肪酸衍生物或產(chǎn)物組成時(shí)，所述脂肪酸衍生物或產(chǎn)物是純化的。在其他實(shí)施方案中，當(dāng)樣品重量的至少約 60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%或99%或更多是由脂肪酸衍生物或產(chǎn)物組成時(shí)，所述脂肪酸衍生物或產(chǎn)物是純化的。本文所用的術(shù)語(yǔ)“重組多肽”是指通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的多肽，其中通常將編碼所表達(dá)的多肽或RNA的DNA插入合適的表達(dá)載體，并且所述表達(dá)載體接下來(lái)用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以產(chǎn)生多肽或RNA。本文所用的術(shù)語(yǔ)“基本相同”(或“基本同源”)是用于指第一氨基酸或核苷酸序列含有足夠數(shù)量的與第二氨基酸或核苷酸序列相同或等同的(例如具有相似側(cè)鏈)氨基酸殘基(例如保守型氨基酸取代)或核苷酸，使得所述第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有相似活性。本文所用的術(shù)語(yǔ)“合酶”表示催化合成過(guò)程的酶。本文所用的術(shù)語(yǔ)合酶包括合酶、 合成酶和連接酶。本文所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”表示將核酸通過(guò)核酸介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移而引入(例如通過(guò)表達(dá)載體)到接受體細(xì)胞。本文所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”是指這樣的過(guò)程，在該過(guò)程中，細(xì)胞的基因型由于細(xì)胞攝入外源核酸而改變。這可以導(dǎo)致表達(dá)重組形式的RNA或多肽的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在由轉(zhuǎn)移的基因反義表達(dá)的情況下，天然存在形式的多肽的表達(dá)被干擾。本文所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白”表示便于一種或多種化合物移入和/或移出細(xì)胞器
23和/或細(xì)胞的多肽。多種這些蛋白以及用于制備本文所述產(chǎn)物的其他有用的蛋白在例如國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2007/011923和PCT/US2008/058788中披露，通過(guò)引用將上述國(guó)際申請(qǐng)并入本文。本文所用的多肽X的“變體”是指具有改變了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的多肽X的氨基酸序列的多肽。所述變體可以具有保守型改變或非保守型改變。使用本領(lǐng)域公知的計(jì)算機(jī)程序，例如LASERGENE軟件(DNASTAR)，可以確定哪些氨基酸殘基可以被取代、插入或缺失而不影響生物活性。在用于多核苷酸序列的情況下，術(shù)語(yǔ)“變體”可以包括與基因或其編碼序列的多核苷酸序列相關(guān)的多核苷酸序列。該定義還可以包括，例如“等位基因”變體、“剪接”變體、 “物種”變體或“多態(tài)性”變體。剪接變體可以與參考多核苷酸具有顯著的一致性，但是由于在mRNA加工中的外顯子備選剪接而通常會(huì)具有更多或更少的多核苷酸數(shù)。對(duì)應(yīng)的多肽可以具有另外的功能結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域缺失。物種變體是在物種之間彼此不同的多核苷酸序列。得到的多肽通常會(huì)具有相對(duì)于彼此的顯著的氨基酸一致性。多態(tài)性變體是在給定物種的個(gè)體之間特定基因的多核苷酸序列中的變異。本文所用的術(shù)語(yǔ)“載體”是指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)另一核酸的核酸分子，所述核酸分子連接到所述另一核酸。一種有用的載體是附加體(即能夠進(jìn)行染色體外復(fù)制的核酸)。有用的載體是能夠自主復(fù)制和/或表達(dá)與其連接的核酸的那些載體。能夠指導(dǎo)與其可操作地連接的基因的表達(dá)的載體在本文被稱為“表達(dá)載體”。通常，在重組DNA技術(shù)中，有用的表達(dá)載體通常是“質(zhì)?！钡男问剑觥百|(zhì)?！蓖ǔＪ侵冈谄漭d體形式時(shí)不與染色體結(jié)合的環(huán)狀雙鏈DNA 環(huán)。在本說(shuō)明書(shū)中，因?yàn)橘|(zhì)粒是最通常使用的載體形式，所以“質(zhì)?！焙汀拜d體”是可交換地使用的。但是，還包括發(fā)揮等同功能并隨后至今成為本領(lǐng)域已知的表達(dá)載體的其他形式。本文所用的術(shù)語(yǔ)“蠟”表示蠟由脂肪酯構(gòu)成的組合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，蠟中的脂肪酯由中到長(zhǎng)碳鏈構(gòu)成。除了脂肪酯以外，蠟可以包含其他成分(例如，烴、留醇酯、脂肪醛、醇、酮、β - 二酮、三酰甘油等)。貫穿整個(gè)說(shuō)明書(shū)，使用縮寫(xiě)的基因名稱或多肽名稱進(jìn)行參考，但是用當(dāng)理解，這種縮寫(xiě)的基因或多肽名稱代表基因或多肽的種類。這類基因名稱包括編碼相同多肽和具有相同生理功能的同源多肽的所有基因。多肽名稱包括具有相同活性(例如，催化相同的基本化學(xué)反應(yīng))的所有多肽。除非另有所指，本文引用的登錄號(hào)均來(lái)自美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生維護(hù)的研究院NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information))。 除非另有所指，所述登錄號(hào)如該數(shù)據(jù)庫(kù)在2009年10月提供的。EC編號(hào)由國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)命名委員會(huì)(NC-IUBMB) (Shttp:// www, chem. qmul. ac. uk/iubmb/enzyme/獲得)建立。本文引用的EC編號(hào)來(lái)自京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics)維護(hù)的 KEGG Ligand 數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)由東京大學(xué)部分資助。除非另有所指，所述EC編號(hào)如該數(shù)據(jù)庫(kù)在2009年10 月提供的。除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義一樣。盡管在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)定中可以使用與本文所述相似或等同的方法和材料，但在下文中描述了合適的方法和材料。可以以任何合適的順序?qū)嵤┍疚乃龅乃蟹椒?，除非本文指出并非如此或上下文明確指出相反。除非另有所指，以百分比(％ )列出的量是基于組合物總重量的重量百分比。本文提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利以及其他參考文獻(xiàn)，通過(guò)引用整體并入。 在產(chǎn)生矛盾的情況下，以本說(shuō)明書(shū)(包括定義)為準(zhǔn)。此外，這些材料、方法以及實(shí)施例僅僅是說(shuō)明性的而并非意圖限制。本文所記載的數(shù)值范圍僅僅是意圖作為單獨(dú)提及落入本范圍內(nèi)的每個(gè)個(gè)別數(shù)值的速記方法，除非本文指出并非如此，并且每個(gè)個(gè)別的數(shù)值被并入說(shuō)明書(shū)，如同本文單獨(dú)引
用一樣。本文提供的任何和所有實(shí)施例或示例性語(yǔ)言(例如，“諸如”)的用途僅僅為更好地說(shuō)明本發(fā)明，而并非是限制本發(fā)明的范圍，除非所要求的并非如此。說(shuō)明書(shū)中的語(yǔ)言不應(yīng)該被解釋為指示實(shí)施本發(fā)明所必需的任何未要求的語(yǔ)言。根據(jù)以下詳細(xì)說(shuō)明以及權(quán)利要求書(shū)，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢(shì)將變得清楚。脂肪酯本公開(kāi)涉及宿主細(xì)胞中脂肪酯，例如脂肪酸酯的產(chǎn)生，所述脂肪酸酯包括例如脂肪酸甲酯(“FAME”)和脂肪酸乙酯(“FAEE”)。在具體的實(shí)施方案中，本文所述的方法用于產(chǎn)生脂肪酸甲酯，脂肪酸甲酯可用于生物柴油中。通過(guò)本文所述的方法產(chǎn)生的脂肪酯并非限制于任何具有特定長(zhǎng)度或其他特性的酯。例如，利用本文所提供的啟示可以將微生物進(jìn)行基因工程改造，以產(chǎn)生Knothe，F(xiàn)uel Processing Technology 86 :1059-1070(2005)中所述的任何一種脂肪酯。這種脂肪酯可以如Knothe所述用以下特征表征，例如，十六烷值(CN)、粘度、熔點(diǎn)和燃燒熱。按照本文的方法、細(xì)胞或微生物產(chǎn)生的脂肪酯包括以下式、基本由以下式組成或由以下式組成具有A側(cè)和B側(cè)的BC00A，其中“A側(cè)”是指連接在酯的羧酸氧上的碳鏈，而 “B側(cè)”是指包含酯的親本羧酸酯的碳鏈。A側(cè)由諸如脂肪醇的醇提供，且B側(cè)由諸如脂肪酸的酸提供。B是脂肪族基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，B是碳鏈。在一些實(shí)施方案中，B包含長(zhǎng)度至少為 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或30個(gè)碳的碳鏈。A包含至少一個(gè)碳原子。在一些實(shí)施方案中，A是脂肪族基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，A是烷基。在一些實(shí)施方案中，所述烷基包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19或 20 個(gè)碳原子，或基本由或由 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19或20個(gè)碳原子組成。在一些實(shí)施方案中，任何一種上述B基團(tuán)可以與任何一種上述A基團(tuán)組合。在一些實(shí)施方案中，A包含具有選自1、2、3、4和5個(gè)碳原子數(shù)的碳鏈，或基本由或由1、2、3、4和5個(gè)碳原子數(shù)的碳鏈組成，而B(niǎo)包含至少12、13、14、15、16、 17、18、19或20個(gè)碳原子，或基本由或由至少12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)碳原子組成。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的脂肪酯包含多種單獨(dú)的脂肪酯。在一些實(shí)施方案中， 本文所述的方法允許產(chǎn)生多種不同長(zhǎng)度的脂肪酯。在一些實(shí)施方案中，脂肪酯產(chǎn)物包含碳原子含量限于5-25個(gè)碳原子的飽和或不飽和的脂肪酯產(chǎn)物。換句話而言，本發(fā)明提供了含有C5-C25脂肪酯(例如，C10-C20脂肪酯或C12-C18脂肪酯)的組合物。在一些實(shí)施方案中，脂肪酯包含一種或多種在碳鏈的一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)具有雙鍵的脂
25肪酯。因此，在一些實(shí)施方案中，6-、7-、8-、9_、10-、11-、12-、13-、14-、15-、16-、17-、18-、 19-、20-、21-、22-、23-、24-、25-、26-、27-、28-、29_ 或 30-碳鏈可以具有 1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 或 24 個(gè)雙鍵，并且 1-24 個(gè)上述雙鍵可以位于以下碳位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28或29。在一些實(shí)施方案中，A的1_、2-、3-、4_或5-碳鏈可以具有1、2、3或 4個(gè)雙鍵，且1-4個(gè)所述雙鍵可以位于以下碳位置1、2、3或4。在一些實(shí)施方案中，任何一種上述A基團(tuán)可以與任何一種上述B基團(tuán)組合。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，B基團(tuán)的碳鏈中可以具有12、13、14、15、16、17、18個(gè)碳
原子。在其他實(shí)施方案中，A基團(tuán)具有一個(gè)或兩個(gè)碳原子。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，B基團(tuán)在碳鏈的一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)具有一個(gè)雙鍵。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，B基團(tuán)在碳鏈的第7位(從碳鏈的還原末端編號(hào))具有一個(gè)雙鍵。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，B基團(tuán)的一末端具有甲基，則B基團(tuán)的另一末端具有羧基(C( = 0) 0-)。B基團(tuán)的具有甲基的末端是包含B基團(tuán)的碳鏈的還原末端，因此，雙鍵位于從B基團(tuán)的甲基末端開(kāi)始計(jì)算的第7位(例如，在B基團(tuán)的第7個(gè)和第8個(gè)碳之間)。雙鍵可以具有任何幾何形狀，因此，B基團(tuán)中的雙鍵可以是順式的或反式的。在一些實(shí)施方案中，脂肪酯包含直鏈脂肪酯。在一些實(shí)施方案中，脂肪酯包含支鏈脂肪酯。在一些實(shí)施方案中，脂肪酯包含環(huán)狀部分。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂肪酯可以選自十二烷酸甲酯、5-十二烯酸甲酯、十四烷酸甲酯、7-十四烯酸甲酯、十六烷酸甲酯、9-十六烯酸甲酯、十八烷酸甲酯、11-十八烯酸甲酯及以上的組合。在一些實(shí)施方案中，脂肪酯組合物包含約5wt. %或更多的十二烷酸甲酯。在一些實(shí)施方案中，脂肪酯組合物包含約25%或更多的十二烷酸甲酯。在一些實(shí)施方案中，脂肪酯組合物包含約5wt. %至約25wt. %的十二烷酸甲酯。在一些實(shí)施方案中，脂肪酯組合物包含約IOwt. %或更少的7-十二烯酸甲酯。在一些實(shí)施方案中，脂肪酯組合物包含約Owt. %至約IOwt. %的7-十二烯酸甲酯。在一些實(shí)施方案中，脂肪酯組合物包含約30wt. %或更多的十四烷酸甲酯。在一些實(shí)施方案中，脂肪酯組合物包含約50wt. %或更少的十四烷酸甲酯。在一些實(shí)施方案中，月旨肪酯組合物包含約30wt. %至約50wt. %得十四烷酸甲酯。在一些實(shí)施方案中，脂肪酯組合物包含約IOwt. %或更少的7-十四烯酸甲酯。在一些實(shí)施方案中，脂肪酯組合物包含約Owt. %至約IOwt. %的7-十四烯酸甲酯。在一些實(shí)施方案中，脂肪酯組合物包含約15wt. %或更少的十六烷酸甲酯。在一些實(shí)施方案中，脂肪酯組合物包含約Owt. %至約15wt. %的十六烷酸甲酯。在一些實(shí)施方案中，脂肪酯組合物包含約IOwt. %或更多的7-十六烯酸甲酯。在一些實(shí)施方案中，脂肪酯組合物包含約40wt. %或更少的9-十六烯酸甲酯。在一些實(shí)施方案中，脂肪酯組合物包含約IOwt. %至約40wt. %的9-十六烯酸甲酯。在一些實(shí)施方案中，脂肪酯組合物包含約15wt. %或更少的7-十八烯酸甲酯。在一些實(shí)施方案中，脂肪酯組合物包含約Owt. %至約15wt. %的7-十八烯酸甲酯?？梢岳镁哂邢嗨苹蛳嗤卣鞯牡孜镏苽洳a(chǎn)生這些具有A側(cè)和/或B側(cè)典型特征的的示例性的脂肪酯產(chǎn)物。因此，導(dǎo)致產(chǎn)生脂肪酸衍生物的生物合成途徑中的每一步驟都可以被改進(jìn)，以便產(chǎn)生或超量產(chǎn)生通向脂肪醇和/或脂肪酸的底物。例如，宿主細(xì)胞中參與脂肪酸生物合成途徑或參與脂肪醇途徑的已知基因可以被表達(dá)、超表達(dá)或減弱，從而產(chǎn)生所需的底物(參見(jiàn)例如，W02008/119082，通過(guò)引用將其公開(kāi)內(nèi)容并入本文)。底物的合成脂肪酸合酶(FAQ是催化酰基鏈的起始和延長(zhǎng)的一組多肽(Marrakchi et al.， Biochemical Society，30 1050-1055，2002)。?；d體蛋白(ACP)連同 FAS 途徑中的酶控制所產(chǎn)生的脂肪酸衍生物的長(zhǎng)度、飽和度以及分支情況。脂肪酸生物合成途徑涉及前體乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A。這個(gè)途徑中的步驟是由脂肪酸生物合成的酶類(fab)和乙酰輔酶A羧化酶(acc)基因家族催化的(參見(jiàn)例如Heath et al.，Prog. Lipid Res. 40 (6) 467-97(2001))?？梢酝ㄟ^(guò)重組表達(dá)或超表達(dá)一種或多種脂肪酸合酶基因，例如乙酰輔酶A和/或丙二酰輔酶A合酶基因，將宿主細(xì)胞進(jìn)行基因工程改造，使其表達(dá)脂肪酸衍生物底物。例如，為了增加乙酰輔酶A產(chǎn)生，可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)一種或多種以下基因pdh (包含 aceEF(編碼丙酮酸和2_酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物的Elp脫氫酶組分和E2p 二氫硫辛酰胺?；D(zhuǎn)移酶組分)和Ipd的多酶復(fù)合物)、panK、fabH、fabB、fabD、fabG、acpP和fabF。 這些基因的示例性 GenBank 登錄號(hào)為pdh(BAB34380、AAC73227、AAC73226)、panK(也稱為輔酶 A、AAC76952)、aceEF (AAC73227、AAC73226)、fabH(AAC74175)、fabB (P0A953)、 fabD (AAC74176)、fabG (AAC74177)、acpP (AAC74178)、fabF (AAC74179)。此外，可以通過(guò)用含有相應(yīng)基因的無(wú)效或缺失突變的條件復(fù)制或非復(fù)制質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化或通過(guò)取代啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列，在工程化的宿主細(xì)胞中減弱或敲除fadE、gpsA、ldhA、pflb、adhE、pta、poxB、 ackA和/或ackB的表達(dá)水平。這些基因的示例性GenBank登錄號(hào)為fadE(AAC73325)、 gspA (AAC76632)、IdhA (AAC74462)、pflb (AAC73989)、adhE (AAC74323)、pta (AAC75357)、 poxB (AAC73958)、ackA(AAC75356)和ackB (BAB81430)。得到的宿主細(xì)胞當(dāng)在合適的環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)，會(huì)具有增加的乙酰輔酶A產(chǎn)生水平。例如，可以通過(guò)將四亞基蛋白accABCD(例如登錄號(hào)AAC73296、EC6. 4. 1. 2)的一個(gè)或多個(gè)或所有亞基引入宿主細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)丙二酰輔酶A超表達(dá)?？梢酝ㄟ^(guò)將編碼脂肪酶(例如，登錄號(hào)CAA89087、CAA98876)的DNA序列引入宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中進(jìn)一步產(chǎn)生脂肪酸。此外，抑制PlsB可以導(dǎo)致長(zhǎng)鏈?；鵄CP水平的增加，這會(huì)抑制途徑中的早期步驟 (例如，accABCD、fabH或fabI的表達(dá))。plsB (例如，登錄號(hào)AAC77011)D311E突變可以用于增加可用脂肪酸的量。此外，可以將宿主細(xì)胞進(jìn)行基因工程改造，使其超表達(dá)Sfa基因(fabA的抑制基因，例如，登錄號(hào)AAN7959》，從而增加單不飽和脂肪酸的產(chǎn)生(Rock et al., J.Bacteriology 178 :5382-5387,1996)?？梢酝ㄟ^(guò)修飾硫酯酶的表達(dá)來(lái)選擇脂肪酸衍生物底物的鏈長(zhǎng)度，硫酯酶影響所產(chǎn)生的脂肪酸的鏈長(zhǎng)度。因此，可以將宿主細(xì)胞進(jìn)行工程化改造，使其表達(dá)、超表達(dá)、減弱表達(dá)、或不表達(dá)一種或多種所選擇的硫酯酶，從而增加優(yōu)選的脂肪酸衍生物底物的產(chǎn)生。例如，可以通超表達(dá)具有產(chǎn)生Cltl脂肪酸偏好的硫酯酶并且減弱具有產(chǎn)生除Cltl脂肪酸外的脂肪酸偏好的硫酯酶(例如，偏好產(chǎn)生C14脂肪酸的硫酯酶)來(lái)產(chǎn)生Cltl脂肪酸。這將導(dǎo)致碳鏈長(zhǎng)度例如為10的脂肪酸的相對(duì)同種的群體。在其他的情形下，可以通過(guò)減弱產(chǎn)生非C14 脂肪酸的內(nèi)源性硫酯酶并且表達(dá)利用C14-ACP的硫酯酶來(lái)產(chǎn)生C14脂肪酸。在一些情形下， 可以通超表達(dá)利用C12-ACP的硫酯酶并同時(shí)減弱產(chǎn)生非C12脂肪酸的硫酯酶來(lái)產(chǎn)生C12脂肪酸?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的方法來(lái)核實(shí)乙酰輔酶A、丙二酰輔酶A、以及脂肪酸的過(guò)量產(chǎn)生， 例如通過(guò)在細(xì)胞溶解后使用放射性前體、HPLC或GC-MS。在本文所述方法中可以使用的硫酯酶的非限制性實(shí)例列于表1中。表1:硫酯酶
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生脂肪酸衍生物的方法，所述方法包括在碳源存在下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞經(jīng)基因工程改造，從而超表達(dá)編碼硫酯酶的基因、編碼?；o酶A合酶的基因和編碼酯合酶的基因。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括分離所述脂肪酸衍生物。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括在醇的存在下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述編碼硫酯酶的基因是tesA、‘teSA、fatB、fatB2、 fatB3、fatAl 或 fat A。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述編碼?；o酶A合酶的基因是fadD、fadK、 BH3103、pf 1-4354、EAV15023、fadDl、fadD2、RPC_4074、fadDD faa39、編碼 GenBank 登錄號(hào) ΖΡ_01644875蛋白的基因或yhfL。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述編碼酯合酶的基因獲自不動(dòng)桿菌 (Acinetobacter sp.)、泊庫(kù)島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)、真養(yǎng)產(chǎn)喊桿胃(Alcaligenes eutrophus)、冑山辛皮 3 β (Mortierella alpina)、胃 ffi Kt it Sl # (Cryptococcus curvatus)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、亞德海床桿菌(Fundibacter jadensis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、混池紅球菌(Rhodococcus opacus) > P^jSiiIlf lif (Marinobacter hydrocarbonoclastics)(Saccharomyces cerevisiae)、智人(Homo sapiens)或希蒙得木(Simmondis chinensis)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述編碼酯合酶的基因是wax/dgat、編碼蠟合酶的基因或編碼雙功能的酯合酶/?；o酶A:甘油二酯?；D(zhuǎn)移酶的基因。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞經(jīng)基因工程改造，從而相對(duì)于野生型宿主細(xì)胞表達(dá)降低水平的至少一種以下基因編碼?；o酶A脫氫酶的基因、編碼外膜蛋白受體的基因和編碼脂肪酸生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的基因。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞經(jīng)基因工程改造，使得編碼?；o酶A 脫氫酶的基因、編碼外膜蛋白受體的基因和編碼脂肪酸生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的基因中的至少一種缺失。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其中所述編碼?；o酶A合酶的基因是fadE。
11.如權(quán)利要求8-9所述的方法，其中所述編碼外膜蛋白受體的基因是編碼外膜鐵色素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述編碼外膜鐵色素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因是fhuA。
13.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其中所述編碼脂肪酸生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的基因編碼DNA轉(zhuǎn)錄抑制子。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述編碼DNA轉(zhuǎn)錄抑制子的基因是fadR。
15.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述脂肪酸衍生物是脂肪酯。
16.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞在包含約2g/L或更高起始濃度的碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞在包含約5g/L或更高起始濃度的碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
18.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞在包含約100g/L或更低起始濃度的碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞在包含約50g/L或更低起始濃度的碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
20.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞在包含約2g/L至約 100g/L起始濃度的碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞在包含約10g/L至約20g/L起始濃度的碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
22.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的方法，還包括監(jiān)測(cè)所述培養(yǎng)基中的碳源水平。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中添加補(bǔ)充性碳源以維持約2g/L或更高濃度的碳源。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中添加所述補(bǔ)充性碳源以維持約3g/L或更高濃度的碳源。
25.如權(quán)利要求22所述的方法，其中添加補(bǔ)充性碳源以維持約5g/L或更低濃度的碳源。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中添加補(bǔ)充性碳源以維持約4g/L或更低濃度的碳源。
27.如權(quán)利要求22所述的方法，其中添加補(bǔ)充性碳源以維持約2g/L至約5g/L的碳源濃度。
28.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述碳源是葡萄糖。
29.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述醇是甲醇或乙醇。
30.如權(quán)利要求四所述的方法，其中所述甲醇或乙醇以約lmL/L或更高的濃度存在。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述甲醇或乙醇以約10mL/L或更高的濃度存在。
32.如權(quán)利要求四所述的方法，其中所述甲醇或乙醇以約100mL/L或更低的濃度存在。
33.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述甲醇或乙醇以約80mL/L或更低的濃度存在。
34.如權(quán)利要求四所述的方法，其中所述甲醇或乙醇以約lmL/L至約100mL/L的濃度存在。
35.如權(quán)利要求1-34中任一項(xiàng)所述的方法，其中以約lg/L或更高的濃度產(chǎn)生所述脂肪酸衍生物。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中以約10g/L或更高的濃度產(chǎn)生所述脂肪酸衍生物。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中以約20g/L或更高的濃度產(chǎn)生所述脂肪酸衍生物。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中以約30g/L或更高的濃度產(chǎn)生所述脂肪酸衍生物。
39.如權(quán)利要求1-34中任一項(xiàng)所述的方法，其中以約lg/L至約200g/L的濃度產(chǎn)生所述脂肪酸衍生物。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中以約10g/L至約50g/L的濃度產(chǎn)生所述脂肪酸衍生物。
41.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述脂肪酯是脂肪酸甲酯。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中以約lg/L或更高的濃度產(chǎn)生所述脂肪酸甲酯。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中以約10g/L或更高的濃度產(chǎn)生所述脂肪酸甲酯。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中以約20g/L或更高的濃度產(chǎn)生所述脂肪酸甲酯。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中以約30g/L或更高的濃度產(chǎn)生所述脂肪酸甲酯。
46.如權(quán)利要求41所述的方法，其中以約lg/L至約200g/L的濃度產(chǎn)生所述脂肪酸甲酯。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其中以約10g/L至約50g/L的濃度產(chǎn)生所述脂肪酸甲酯。
48.如權(quán)利要求1-47中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞選自哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、絲狀真菌細(xì)胞、藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞以及細(xì)菌細(xì)胞。
49.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞選自以下屬埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、脈孢菌屬(Neurospora)、鐮刀菌屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬 (Humicola)、根毛霉屬(Iihizomucor)、克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、毛霉菌屬(Mucor)、蝕絲霉屬(Myceliophtora)、青霉屬(Penicillium)、 平革菌屬(Phanerochaete)、側(cè)耳屬(Pleurotus)、栓菌屬(Trametes)、金黃孢子菌屬 (Chrysosporium)、酵母屬(Saccharomyces)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophamonas)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、耳口氏酵母屬(Yarrowia)或鏈霉菌屬(Streptomyces)0
50.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞為遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)細(xì)胞、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)細(xì)胞、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)細(xì)胞、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)細(xì)胞、嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)細(xì)胞、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)細(xì)胞、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)細(xì)胞、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilis)細(xì)胞、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)細(xì)胞、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)細(xì)胞、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)細(xì)胞、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)細(xì)胞、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)細(xì)胞、康寧木霉(Trichoderma koningii)細(xì)胞、綠色木霉(Trichoderma viride)細(xì)胞、里氏木霉(Trichoderma reesei)細(xì)胞、長(zhǎng)枝 7^ (Trichoderma longibrachiatum)(Aspergillus awamori) _·、 曲霉(Aspergillus fumigates)細(xì)胞、臭曲霉(Aspergillus foetidus)細(xì)胞、構(gòu)巢曲霉 (Aspergillus nidulans) (Aspergillus niger)(Aspergillus oryzae)細(xì)胞、特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)細(xì)胞、棉毛狀腐質(zhì)霉(Humicola lanuginose)細(xì)胞、混濁紅球菌(Rhodococcus opacus)細(xì)胞、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)細(xì)胞、米黑毛霉(Mucor michei)細(xì)胞、淺青紫鏈霉菌(Sti^ptomyces lividans)細(xì)胞或鼠灰鏈霉菌(Sti^ptomyces murinus)細(xì)胞、放線菌(Actinomycetes)細(xì)胞、釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)細(xì)胞、CHO 細(xì)胞、COS 細(xì)胞、VERO 細(xì)胞、BHK 細(xì)胞、HeLa 細(xì)胞、 Cvl細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、293細(xì)胞、3T3細(xì)胞或PC12細(xì)胞。
51.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述大腸桿菌細(xì)胞是B菌株、C菌株、K菌株或W 菌株大腸桿菌細(xì)胞。
53.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是聚球藍(lán)細(xì)菌(Synechococcus Sp.)PCC 7002細(xì)胞、細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌(Synechococcus elongatus)PCC7942細(xì)胞、集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis Sp.)PCC 6803 細(xì)胞。
54.通過(guò)權(quán)利要求1-53中任一項(xiàng)所述的方法所產(chǎn)生的脂肪酸衍生物。
55.通過(guò)權(quán)利要求1-53中任一項(xiàng)所述的方法所產(chǎn)生的脂肪酯。
56.如權(quán)利要求55所述的脂肪酯，其中所述脂肪酯包含A側(cè)和B側(cè)。
57.如權(quán)利要求56所述的脂肪酯，其中所述脂肪酯的B側(cè)的長(zhǎng)度為至少約4個(gè)碳。
58.如權(quán)利要求56所述的脂肪酯，其中所述脂肪酯的B側(cè)的長(zhǎng)度為至少約6個(gè)碳。
59.如權(quán)利要求56所述的脂肪酯，其中所述脂肪酯的B側(cè)的長(zhǎng)度為至少約8個(gè)碳。
60.如權(quán)利要求56所述的脂肪酯，其中所述脂肪酯的B側(cè)的長(zhǎng)度為至少約10個(gè)碳。
61.如權(quán)利要求56所述的脂肪酯，其中所述脂肪酯的B側(cè)的長(zhǎng)度為至少約12個(gè)碳。
62.如權(quán)利要求56所述的脂肪酯，其中所述脂肪酯的B側(cè)的長(zhǎng)度為至少約14個(gè)碳。
63.如權(quán)利要求56所述的脂肪酯，其中所述脂肪酯的B側(cè)的長(zhǎng)度為至少約16個(gè)碳。
64.如權(quán)利要求56所述的脂肪酯，其中所述脂肪酯的B側(cè)的長(zhǎng)度為至少約18個(gè)碳。
65.如權(quán)利要求55所述的脂肪酯，其選自十二烷酸甲酯、5-十二烯酸甲酯、十四烷酸甲酯、7-十四烯酸甲酯、十六烷酸甲酯、9-十六烯酸甲酯、十八烷酸甲酯、11-十八烯酸甲酯或以上的組合。
66.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述脂肪酯是脂肪酸乙酯。
67.如權(quán)利要求觀所述的方法，其中培養(yǎng)基中產(chǎn)生所述脂肪酸衍生物的產(chǎn)率為每IOOg 葡萄糖約0. 5g或更多。
68.如權(quán)利要求67所述的方法，其中培養(yǎng)基中產(chǎn)生所述脂肪酸衍生物的產(chǎn)率為每IOOg 葡萄糖約2g或更多。
69.如權(quán)利要求68所述的方法，其中培養(yǎng)基中產(chǎn)生所述脂肪酸衍生物的產(chǎn)率為每IOOg 葡萄糖約5g或更多。
70.如權(quán)利要求69所述的方法，其中培養(yǎng)基中產(chǎn)生所述脂肪酸衍生物的產(chǎn)率為每IOOg 葡萄糖約IOg或更多。
71.如權(quán)利要求觀所述的方法，其中培養(yǎng)基中產(chǎn)生所述脂肪酸衍生物的產(chǎn)率為每IOOg 葡萄糖約0. 5g至約30g。
72.如權(quán)利要求71所述的方法，其中培養(yǎng)基中產(chǎn)生所述脂肪酸衍生物的產(chǎn)率為每IOOg 葡萄糖約0. 5g至約IOgo
73.如權(quán)利要求1所述的方法，其中產(chǎn)生所述脂肪酸衍生物的產(chǎn)率為碳源中碳重量的約10%或更多。
74.如權(quán)利要求73所述的方法，其中產(chǎn)生所述脂肪酸衍生物的產(chǎn)率為碳源中碳重量的約20%或更多。
75.如權(quán)利要求74所述的方法，其中產(chǎn)生所述脂肪酸衍生物的產(chǎn)率為碳源中碳重量的約35%或更多。
76.如權(quán)利要求1所述的方法，其中產(chǎn)生所述脂肪酸衍生物的產(chǎn)率為碳源中碳重量的約10%至約95%。
77.如權(quán)利要求76所述的方法，其中產(chǎn)生所述脂肪酸衍生物的產(chǎn)率為碳源中碳重量的約20%至約65%。
78.如權(quán)利要求28所述的方法，其中培養(yǎng)基中產(chǎn)生所述脂肪酸衍生物的產(chǎn)率為葡萄糖重量的約0.5%或更多。
79.如權(quán)利要求78所述的方法，其中培養(yǎng)基中產(chǎn)生所述脂肪酸衍生物的產(chǎn)率為葡萄糖重量的約5%或更多。
80.如權(quán)利要求觀所述的方法，其中培養(yǎng)基中產(chǎn)生所述脂肪酸衍生物的產(chǎn)率為葡萄糖重量的約0.5%至約50%。
81.如權(quán)利要求81所述的方法，其中培養(yǎng)基中產(chǎn)生所述脂肪酸衍生物的產(chǎn)率為葡萄糖重量的約5%至約40%。
82.基因工程微生物，其包含編碼硫酯酶的基因、編碼?；o酶A合酶的基因和編碼酯合酶的基因中的至少一種，其中相對(duì)于野生型微生物，所述微生物產(chǎn)生提高水平的脂肪酯。
83.基因工程微生物，其包含穩(wěn)定并入所述微生物基因組DNA中的外源控制序列，所述外源控制序列位于編碼硫酯酶的基因、編碼酰基輔酶A合酶的基因和編碼酯合酶的基因中的至少一種的一個(gè)或多個(gè)基因的上游，其中相對(duì)于野生型微生物，所述微生物產(chǎn)生提高水平的脂肪酯。
84.如權(quán)利要求83所述的基因工程微生物，其中所述外源控制序列是啟動(dòng)子。
85.如權(quán)利要求84所述的基因工程微生物，其中所述啟動(dòng)子是發(fā)育調(diào)控型啟動(dòng)子、細(xì)胞器特異型啟動(dòng)子、組織特異型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組成型啟動(dòng)子和細(xì)胞特異型啟動(dòng)子。
86.如權(quán)利要求82或83所述的基因工程微生物，其中所述微生物經(jīng)基因工程改造， 從而相對(duì)于野生型微生物表達(dá)降低水平的至少一種以下基因編碼酰基輔酶A脫氫酶的基因、編碼外膜蛋白受體的基因和編碼脂肪酸生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的基因。
87.如權(quán)利要求82或83所述的基因工程微生物，其中所述微生物經(jīng)基因工程改造，缺失編碼?；o酶A脫氫酶的基因、編碼外膜蛋白受體的基因和編碼脂肪酸生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的基因中的至少一種。
88.如權(quán)利要求86或87所述的基因工程微生物，其中所述編碼?；o酶A脫氫酶的基因是fadE。
89.如權(quán)利要求86或87所述的基因工程微生物，其中所述編碼外膜蛋白受體的基因編碼鐵色素外膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
90.如權(quán)利要求89所述的基因工程微生物，其中所述編碼鐵色素外膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因是 fhuA。
91.如權(quán)利要求86或87所述的基因工程微生物，其中所述編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的基因編碼 DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制子。
92.如權(quán)利要求91所述的基因工程微生物，其中所述編碼DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制子的基因是 fabR0
93.如權(quán)利要求82-92中任一項(xiàng)所述的基因工程微生物，其選自革蘭氏陰性細(xì)菌或革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。
94.如權(quán)利要求93所述的基因工程微生物，其選自大腸桿菌、分支桿菌 (mycrobacterium)、諾卡氏菌(Nocardia sp·)、皮疽諾卡氏菌(Nocardia farcinica)、 灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)、稀有海洋放線菌(Salinispora arenicola)、 密執(zhí)安棍狀桿菌(Clavibacter michiganenesis)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、食 '^iMM (Alcanivorax)、/^ 石_ 木干胃 (Alcaligenes) λ it ^f (Arabidopsis) λ ^ ^ff菌屬(Fundibacter)、海桿菌屬(Marinobacter)、小家鼠(Mus musculus)、假單胞菌屬O^seudomonas)或希蒙得木屬(Simmodsia)、耶氏酵母屬(Yarrowia)、假絲酵母屬(Candida)、紅酵母屬(Rhodotorula)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、隱球菌屬 (Cryptococcus)、絲抱酵母屬(Trichosporon)或油月旨酵母屬(Lipomyces)。
95.如權(quán)利要求94所述的基因工程微生物，其選自大腸桿菌B菌株、C菌株、K菌株或 W菌株。
96.如權(quán)利要求82-92中任一項(xiàng)所述的基因工程微生物，其選自聚球藍(lán)細(xì)菌 (Synechococcus Sp. ) PCC 7002、細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌(Synechococcus elongatus) PCC7942、集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis Sp.)PCC 6803。
97.產(chǎn)生脂肪酸衍生物的方法，包括在醇存在下培養(yǎng)權(quán)利要求82-96中任一項(xiàng)所述的基因工程微生物。
98.通過(guò)權(quán)利要求97所述方法所產(chǎn)生的脂肪酸衍生物。
99.如權(quán)利要求98所述的脂肪酸衍生物，其中所述脂肪酸衍生物是脂肪酯。
100.包含權(quán)利要求M-65和98-99中任一項(xiàng)所述的脂肪酸衍生物的生物燃料組合物。
全文摘要
描述了用于產(chǎn)生諸如脂肪酯的脂肪酸衍生物的方法和組合物。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102459569SQ201080024722
公開(kāi)日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月10日
發(fā)明者安德里亞斯·席爾默, 斯蒂芬·德?tīng)枴たǖ乱? 費(fèi)爾南科·瓦勒, 阿爾弗雷德·蓋爾特納 申請(qǐng)人:Ls9公司