專利名稱：高產(chǎn)甘氨酸菌株的篩選及其在腈類化合物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
甘氨酸高產(chǎn)菌株的篩選方法和其應(yīng)用，本發(fā)明涉及利用微生物轉(zhuǎn)化甘氨腈生產(chǎn)甘氨酸的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甘氨酸，又稱為氨基乙酸，白色無味晶體，無毒，溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。是常見的20種氨基酸中結(jié)構(gòu)最簡單的一種，是中性的脂肪族氨基酸，為人體非必需氨基酸。甘氨酸同時作為世界上用量最大的農(nóng)藥-草甘膦合成的主要原料，其需求量非常大；另外也可作為食品中的調(diào)味劑、增香劑以及高血壓、肝損傷等藥物制備的中間體，在食品、醫(yī)藥及化工等領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛。目前甘氨酸的生產(chǎn)全部采用化學(xué)法，如氯乙酸氨解法，Strecker法等。這些方法存在反應(yīng)時間長、需高溫高壓、產(chǎn)品收率較低、產(chǎn)品回收純化需加入大量酸或堿、工藝較復(fù)雜、 對環(huán)境不友好等特點。如采用氯乙酸氨解法雖然工藝簡單、對設(shè)備要求不高，但氯化銨等產(chǎn)品難分離，導(dǎo)致甘氨酸產(chǎn)率較低，精制則提高了生產(chǎn)成本，另外作為反應(yīng)催化劑的烏洛托品無法回收，資源浪費嚴(yán)重；日本MITSUI TOATSU化學(xué)公司的專利US5258550公開了以羥基乙腈為原料，在水的存在下與二氧化碳、氨首先于80-120°C預(yù)反應(yīng)0. 5-lh，然后在150-200°C 進(jìn)行主反應(yīng)的甘氨酸化學(xué)合成新方法，但該法需高溫高壓、能耗大、對設(shè)備要求較高、環(huán)境污染較嚴(yán)重。隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，采用生物轉(zhuǎn)化法制備有機(jī)酸或氨基酸正備受關(guān)注。因此，通過微生物轉(zhuǎn)化或微生物催化生產(chǎn)甘氨酸的高效、綠色環(huán)保工藝的開發(fā)顯得十分必要， 順應(yīng)了當(dāng)前的迫切形勢。生物轉(zhuǎn)化法主要是利用微生物游離細(xì)胞或純化酶等催化載體將底物甘氨腈轉(zhuǎn)化為甘氨酸。目前，國外關(guān)于生物轉(zhuǎn)化制備甘氨酸已申請了較多專利，但國內(nèi)尚無生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)甘氨酸的相關(guān)研究報道。國外，日本NITTO化工公司的專利US5238827 公開了采用紅球菌、節(jié)桿菌、乳酪桿菌、腸桿菌等菌屬的細(xì)菌菌株作為催化酶轉(zhuǎn)化甘氨腈為甘氨酸的方法，ASAHI化學(xué)公司的專利W00148234分別公開了采用不動桿菌、棒桿菌、 產(chǎn)堿桿菌、分枝桿菌、紅假單胞菌和假絲酵母等細(xì)菌及酵母菌屬的微生物水解甘氨腈制備甘氨酸的方法以及回收純化甘氨酸的方法，如，EP1243657，US20030040085, CN1433479, CN1840522。這些都為進(jìn)一步研究生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)甘氨酸奠定了基礎(chǔ)。雖然，國外報道了較多用于生產(chǎn)甘氨酸的菌株，然而未見霉菌，尤其是尖孢鐮孢Fusarium oxysporum生產(chǎn)甘氨酸的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人從土樣中分離篩選獲得一株產(chǎn)甘氨酸的尖孢鐮孢H3，并對這株菌進(jìn)行了發(fā)酵研究。本發(fā)明提供的菌株是從國內(nèi)某化工廠取得土樣分離篩選獲得一株霉菌， 根據(jù)生理形態(tài)特征，以及18S、ITS和^S rDNA基因序列測定，該菌株分類命名為尖孢鐮孢 (Fusarium oxysporum)，編號H3，于2010年5月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 3擬9。本發(fā)明提供的菌株尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum H3，CGMCC No. 3829)的生理形態(tài)及分子鑒定特征如下菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上采用打孔器接種法接種，孔徑0.5cm，在 30°C培養(yǎng)4d后菌落直徑為4. 9cm,平均生長直徑為12. 2mm/d ；培養(yǎng)7d后，菌落邊緣呈白色， 中間呈紫紅色，可產(chǎn)生紫紅色色素；在米飯培養(yǎng)基上生長后呈粉紅色；氣生菌絲生長良好， 為疏松的棉絮狀，氣生菌絲分枝，透明，直徑1. 6-4. 4 μ m,在氣生菌絲上有粘孢團(tuán)，粘孢團(tuán)無色，小型分生孢子生于氣生菌絲中，假頭狀著生，小型分生孢子近卵形，無隔，光滑，大型分生孢子鐮刀形、橢圓形彎曲。利用真菌通用引物尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum H3, CGMCC No. 3829)的 18S、ITS和^S rDNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到1768bp、558bp和925bp大小的片段。通過在NCBI網(wǎng)站應(yīng)用BLAST軟件與數(shù)據(jù)庫中的已有序列進(jìn)行相似性比較分析，得出該菌株的18S rDNA序列與鐮孢屬Fusarium(ABl 10910，GQ166777)，冬蟲夏草屬 Cordyceps (AB067700)和赤霉屬 Gibberella (AB237662，AB250414)有高度的同源性；根據(jù) 28S rDNA基因序列分析表明它與鐮孢屬Fusarium(EF590327)具有較高的類似性。因此，根據(jù)18S和^S rDNA基因序列分析得出該菌株屬于鐮孢屬Fusarium。由該菌株的ITS序列分析得出，它與尖孢鐮孢Fusarium oxysporum(DQ002550)具有100%的同源性。結(jié)合形態(tài)特征和生理生化特性，將其鑒定為尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum H3，CGMCC No. 3829) 本發(fā)明還提供了一種甘氨酸生產(chǎn)菌的篩選方法，其特征如下采集土樣，根據(jù)甘氨酸與溴百里香酚藍(lán)的顯色反應(yīng)，在平板上挑出具有變色圈的菌株；初篩，將純化好的菌株轉(zhuǎn)接至營養(yǎng)豐富的液體培養(yǎng)基中，通過紙層析法測定上清液中甘氨酸濃度；復(fù)篩，首先進(jìn)行種子培養(yǎng)，以的接種量接入液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)結(jié)束后采用高效液相色譜法檢測轉(zhuǎn)化后上清液中甘氨酸的濃度。所述土樣來源于生產(chǎn)腈類化合物的化工廠廠房周圍土壤中，采集5-15cm處的土樣。所述平板篩選方法如下取Ig 土樣，放入含有生理鹽水的錐形瓶(20mL/250mL)中，劇烈震蕩lOmin，靜置； 取ImL土壤懸浮液，注入無菌的平板上，往平板中傾注25mL經(jīng)滅菌并冷卻至40_50°C的固體篩選培養(yǎng)基；待培養(yǎng)基完全冷卻凝固后，將平板置于恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，30°C培養(yǎng)3d ；挑取產(chǎn)生藍(lán)色變色圈的的單菌落，轉(zhuǎn)接至新鮮的培養(yǎng)基劃線分離，轉(zhuǎn)接3-5代。所述固體篩選培養(yǎng)基的組成為葡萄糖5. 0g/L、磷酸二氫鉀1. 0g/L、硫酸鎂0. Ig/ L、硫酸亞鐵0. 02g/L、氯化鈣0. 02g/L、氯化鈉1. 0g/L、甘氨腈1. 0g/L、溴百里香酚藍(lán)0. 2g/ L、瓊脂 20. 0g/L、pH7. 0。所述初篩方法如下培養(yǎng)基組成為葡萄糖5.0g/L、磷酸二氫鉀1.0g/L、硫酸鎂0. lg/L、硫酸亞鐵 0. 02g/L、氯化鈣0. 02g/L、氯化鈉1. 0g/L、甘氨腈1. 0g/L、ρΗ7· 0 ；培養(yǎng)方法為:250mL三角瓶裝液量25mL，搖床轉(zhuǎn)速120rpm，3(TC培養(yǎng)4d ；發(fā)酵液處理方法為將發(fā)酵液12000rpm離心lOmin，取出菌體得到發(fā)酵上清液用于甘氨酸含量的測定。所述初篩過程中采用紙層析的方法測定上清液中甘氨酸濃度，紙層析方法如下
將轉(zhuǎn)化后的發(fā)酵液點樣于層析濾紙(點樣量0.2-1. 0 μ L)上，放置于層析缸中，上行展開。待層析液上行至距濾紙頂端1. Ocm左右時，取出置于115°C烘干后，均勻噴灑顯色劑，再次放于115°C烘箱中顯色5-lOmin，斑點顯出后，剪下甘氨酸顯色斑點于帶塞的玻璃試管中，用2-5mL的硫酸銅的乙醇溶液洗脫10-30min，然后在紫外分光光度計上測定其吸光值。所述復(fù)篩方法如下培養(yǎng)基組成種子培養(yǎng)基，牛肉膏10. Og/L、蛋白胨10. Og/L、酵母膏10. Og/L、葡萄糖 10. Og/L、氯化鈉 5. Og/L, pH 7. 0 ；篩選培養(yǎng)基，葡萄糖5. 0g/L、磷酸二氫鉀1. 0g/L、硫酸鎂0. lg/L、硫酸亞鐵0. 02g/ L、氯化鈣 0. 02g/L、氯化鈉 1. 0g/L、甘氨腈 1. 0g/L、pH7. 0 ；培養(yǎng)方法種子培養(yǎng)方法，250mL三角瓶裝液量25mL，搖床轉(zhuǎn)速120rpm，30°C培養(yǎng) 3d ；液體發(fā)酵培養(yǎng)，以的接種量將種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)方法，250mL三角瓶裝液量25mL，搖床轉(zhuǎn)速120rpm，30°C培養(yǎng)4d ；培養(yǎng)結(jié)束后，取該培養(yǎng)液12000rpm離心IOmin收集菌體用于生物轉(zhuǎn)化甘氨腈，采用高效液相色譜法檢測轉(zhuǎn)化后上清液中生成的甘氨酸濃度。轉(zhuǎn)化液處理方法為將轉(zhuǎn)化液HOOOrpm離心 15min，取出菌體得到發(fā)酵上清液用于甘氨酸含量的測定。所述過程中甘氨酸采用高效液相色譜法檢測，色譜條件為=Agilent 1100型高效液相色譜儀，采用柱前衍生化方式，衍生試劑為鄰苯二甲醛(OPA)和氯甲酸芴甲酯 (FM0C-C1)，色譜柱為 Hypersil AA-ODS C18 柱 Q50 X 4. 6mm，5 μ m)，柱溫 40°C，流速為 1. OmL/min,紫外檢測波長338nm，流動相A相為乙酸鈉-醋酸-三乙胺溶液，B相為乙酸鈉-醋酸-乙腈-甲醇溶液，洗脫方式采用梯度洗脫。本發(fā)明提供一種甘氨酸生產(chǎn)菌株的應(yīng)用方法，其特征如下將尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum H3)接入營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，獲得高活性高生物量的發(fā)酵液；將發(fā)酵液進(jìn)行處理，得到菌體，在一定條件下，利用菌體對甘氨腈進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。所述營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基組成為甘油10_20g/L，酵母膏1. 0-10g/L,蛋白胨 1. 0-10g/L,硫酸鎂 0. 1-0. 5g/L，磷酸二氫鉀 1. 0-5. 0g/L,氯化鈉 0. 5-1. 0g/L,硫酸亞鐵 0. 01-0. lg/L,己內(nèi)酰胺 0. 5-1. 0g/L, pH 5. 0-8. 0。所述發(fā)酵液的處理方法為6000-15000rpm離心5-20min，以收集經(jīng)培養(yǎng)得到的菌體，用0. 01-0. 5M的磷酸緩沖液(pH 5. 0-9. 0)，洗滌菌體2_4次，并將菌體重新懸浮于該緩沖液中。所述甘氨酸底物的制備方法為配制5-100g/L的甘氨腈溶液，用0. 5-5. OM的氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH至5. 0-9. 0。所述生物轉(zhuǎn)化條件為將菌懸液與底物溶液混勻，控制反應(yīng)pH保持在5. 0-9.0，反應(yīng)溫度保持在20-60°C，轉(zhuǎn)速50-250rpm，反應(yīng)時間6_48h。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果在甘氨酸生產(chǎn)菌株的篩選過程中首次提出以甘氨腈為唯一氮源、以溴百里香酚藍(lán)作為指示劑的甘氨腈-溴百里香酚藍(lán)固體篩選培養(yǎng)基，建立了快速篩選能轉(zhuǎn)化甘氨腈生產(chǎn)甘氨酸的菌株培養(yǎng)體系和對目的菌株的檢測方法；經(jīng)過初篩、復(fù)篩得到一株生產(chǎn)甘氨酸的菌株——尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum H3，CGMCCNo. 38 )，該菌株具有生長周期短，轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)化周期短等特點，大大降低了甘氨酸的生產(chǎn)成本，特別適合甘氨酸的大規(guī)模生產(chǎn)；本工藝還具有反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)率高，生產(chǎn)成本低，對環(huán)境友好等特點，而且后處理過程無需加入大量酸或堿，產(chǎn)品分離及應(yīng)用方便快捷。


圖1是本發(fā)明提供的菌株Fusarium oxysporum H3發(fā)酵過程中生物量和酶活的變化過程。
具體實施例方式實施例1 尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum H3)的分離鑒定以及菌株的保存(1)尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum H3)的富集篩選過程。采集腈類化合物生產(chǎn)廠房周圍的土樣，采樣時先用小鏟子去除表層土，采集 5-15cm處的土樣。取Ig 土樣，放入含有生理鹽水的錐形瓶(20mL/250mL)中，劇烈震蕩 lOmin，靜置。取ImL 土壤懸浮液，注入無菌的平板上，往平板中傾注25mL經(jīng)滅菌并冷卻至 40-50°C的固體篩選培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基完全冷卻凝固后，將平板置于恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)， 30°C培養(yǎng)3d。固體篩選培養(yǎng)基的組成為葡萄糖5. 0g/L、磷酸二氫鉀1. 0g/L、硫酸鎂0. Ig/ L、硫酸亞鐵0. 02g/L、氯化鈣0. 02g/L、氯化鈉1. 0g/L、甘氨腈1. 0g/L、溴百里香酚藍(lán)0. 2g/ L、瓊脂20.0g/L、pH 7.0，產(chǎn)生藍(lán)色變色圈的單菌落為甘氨酸產(chǎn)生菌。挑取產(chǎn)生藍(lán)色變色圈的的單菌落，轉(zhuǎn)接至新鮮的培養(yǎng)基劃線分離，轉(zhuǎn)接3-5代。挑取25株純化好的菌株轉(zhuǎn)接至營養(yǎng)豐富的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。液體篩選培養(yǎng)基的組成為葡萄糖5. 0g/L、磷酸二氫鉀1. 0g/L、硫酸鎂0. lg/L、硫酸亞鐵0. 02g/L、氯化鈣 0. 02g/L、氯化鈉 1. 0g/L、甘氨腈 1. 0g/L、pH 7. 0，裝液量 25mL/250mL，搖床轉(zhuǎn)速 120rpm, 30°C培養(yǎng)4d。培養(yǎng)結(jié)束后離心去除菌體，采用紙層析法測定上清液中的甘氨酸濃度。再進(jìn)行復(fù)篩，首先進(jìn)行種子培養(yǎng)，以1 %的接種量接入液體培養(yǎng)基，每株3瓶，培養(yǎng)結(jié)束后，取該培養(yǎng)液12000rpm離心IOmin收集菌體用于生物轉(zhuǎn)化甘氨腈，采用高效液相色譜法檢測轉(zhuǎn)化后上清液中生成的甘氨酸濃度。得到產(chǎn)量最高的一株菌株，命名為尖孢鐮孢 (Fusarium oxysporum H3, CGMCC No. 3829)。種子培養(yǎng)基牛肉膏10. 0g/L、蛋白胨10. 0g/L、酵母膏10. 0g/L、葡萄糖10. 0g/L、 氯化鈉5. 0g/L, pH 7. 0。裝液量25mL/250mL，培養(yǎng)條件為30°C,120rpm培養(yǎng)3d。(2)尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum H3)的形態(tài)尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum H3)菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上采用打孔器接種法接種，孔徑0. 5cm,在30°C培養(yǎng)4d后菌落直徑為4. 9cm,平均生長直徑為12. 2mm/d ；培養(yǎng)7d后，菌落邊緣呈白色，中間呈紫紅色，可產(chǎn)生紫紅色色素；在米飯培養(yǎng)基上生長后呈粉紅色；氣生菌絲生長良好，為疏松的棉絮狀，氣生菌絲分枝，透明，直徑 1. 6-4. 4 μ m,在氣生菌絲上有粘孢團(tuán)，粘孢團(tuán)無色，小型分生孢子生于氣生菌絲中，假頭狀著生，小型分生孢子近卵形，無隔，光滑，大型分生孢子鐮刀形、橢圓形彎曲。(3)尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum H3)的分子鑒定收集在馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基平板上生長的菌絲體，用真菌基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。擴(kuò)增引物分別為18S的通用引物、ITS序列的通用引物及^S rDNA序列擴(kuò)增的通用引物。PCR反應(yīng)采用50 μ L反應(yīng)體系，IOXbuffer (Mg2+)dNTPs (2. 5mM)正向引物QO μ Μ)反向引物OO μ Μ)ExTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L)模板 DNAddH20
5. 0μ L 4. Ομ L 2. Ομ L 2. Ομ L LOyL 2. Ομ L 34 μ LPCR擴(kuò)增條件94°C預(yù)變性 ^iin ；94°C變性 60s，55°C退火 60s，72°C延伸 90s，共 30 個循環(huán)，最后72°C終延伸lOmin。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化按上海生工生物技術(shù)公司的小量膠回收PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明進(jìn)行，測序由上海華大基因完成。經(jīng)測序后獲得的18S、ITS和^S rDNA基因序列，在Genbank中進(jìn)行BLAST比對確定其種屬。實施例2尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum H3)發(fā)酵生產(chǎn)甘氨酸的方法本實例說明對尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum H3)接入營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基進(jìn)行了培養(yǎng)獲得高活性高生物量的菌體，以及生物轉(zhuǎn)化甘氨腈生成甘氨酸的方法。培養(yǎng)基的組成甘油10. 0g/L，酵母膏1. 0g/L，蛋白胨1. 0g/L，硫酸鎂0. lg/L，磷酸二氫鉀1. 0g/L，氯化鈉0. 5g/L，硫酸亞鐵0. 01g/L,己內(nèi)酰胺0. 5g/L，pH 7. 5 ；將尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum H3)以1 %的接種量接入培養(yǎng)基中，30°C， 120rpm好養(yǎng)培養(yǎng)3d，即培養(yǎng)結(jié)束，12000rpm離心IOmin收集培養(yǎng)好的菌體，用0. 5M的磷酸緩沖液洗滌菌體2次，并將菌體重新懸浮于該緩沖液中制成菌懸液。配制7. 8g/L的甘氨腈溶液，用2. OM的氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至5. 0，以此作為催化反應(yīng)的底物。將該底物溶液與菌懸液混勻，使最終菌體量為1%，并控制混合體系 PH為7. 2，在溫度30°C，轉(zhuǎn)速120rpm的條件下反應(yīng)48h，反應(yīng)液中甘氨酸濃度為6. 6g/L，產(chǎn)率達(dá)到了 60%以上。實施例3改變發(fā)酵條件，尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum H3)發(fā)酵生產(chǎn)甘氨酸本實施例采用與實施例2相同的方法，改變反應(yīng)時間。通過離心從培養(yǎng)液中收集菌體，并用0. 5M的磷酸緩沖液洗滌2次，重新懸浮制成菌懸液，與7. 8g/L的甘氨腈溶液混勻，在30°C，120rpm的條件下反應(yīng)12h，反應(yīng)液中甘氨酸濃度為8. 5g/L，產(chǎn)率達(dá)到了 80%。實施例4改變發(fā)酵條件，尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum H3)發(fā)酵生產(chǎn)甘氨酸本實施例的方法與實施例2相同，改變所用方法參數(shù)。培養(yǎng)基組成甘油10. 0g/L，酵母膏5. 0g/L，蛋白胨10. 0g/L，硫酸鎂0. lg/L，磷酸二氫鉀4. 0g/L，氯化鈉1. 0g/L，硫酸亞鐵0. 02g/L，己內(nèi)酰胺1. 0g/L，pH 7. 5 ；將尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum H3)以2 %的接種量接入培養(yǎng)基中，30°C， 120rpm好養(yǎng)培養(yǎng)3d，即培養(yǎng)結(jié)束，12000rpm離心IOmin收集培養(yǎng)好的菌體，用0. 5M的磷酸緩沖液洗滌菌體2次，并將菌體重新懸浮于該緩沖液中制成菌懸液。配制23. 4g/L的甘氨腈溶液，作為催化反應(yīng)底物。將該底物溶液與菌懸液混勻，并控制pH為7. 2，在溫度30°C，轉(zhuǎn)速120rpm的條件下反應(yīng)12h，反應(yīng)混合物中的甘氨腈幾乎全部轉(zhuǎn)化，甘氨酸的產(chǎn)量達(dá)到了 24. 6g/L。實施例5 改變發(fā)酵條件，尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum H3)發(fā)酵生產(chǎn)甘氨酸本實施例的方法與實施例2相同，改變所用方法參數(shù)。配制46. 8g/L的甘氨腈溶液，作為催化反應(yīng)底物。將該底物溶液與菌懸液混勻，接種量為1 %，并控制PH為7. 2，在溫度30°C，轉(zhuǎn)速120rpm的條件下反應(yīng)12h，底物甘氨腈幾乎全部轉(zhuǎn)化，甘氨酸的產(chǎn)量達(dá)到了 39. 8g/L。
權(quán)利要求
1.高產(chǎn)甘氨酸菌株的篩選及其在腈類化合物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，其特征在于采集生產(chǎn)腈類化合物的化工廠廠房周圍的土壤樣品，在甘氨腈為唯一氮源并添加溴百里香酚藍(lán)的固體初篩培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，獲得一株高產(chǎn)甘氨酸菌株尖孢鐮孢H3 (Fusarium oxysporum)。對該菌株進(jìn)行培養(yǎng)，并以甘氨腈為底物進(jìn)行甘氨酸轉(zhuǎn)化。該菌株還可將其它腈類化合物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)甘氨酸菌株的篩選，其特征在于使用的篩選土樣為腈類化合物的化工廠廠房周圍的土壤樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)甘氨酸菌株的篩選，其特征在于使用的固體初篩培養(yǎng)基是以甘氨腈為唯一氮源并添加了溴百里香酚藍(lán)，其甘氨腈添加量為0. lg/L 2. Og/L、溴百里香酚藍(lán)0. 05 0. 5g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)甘氨酸菌株的篩選，其特征在于使用的固體初篩培養(yǎng)基是以甘氨腈為唯一氮源并添加了溴百里香酚藍(lán)，還包括了適量的葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯化鈣、氯化鈉、瓊脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)甘氨酸菌株的篩選，其特征在于將權(quán)利要求2所述的土樣制成土壤懸液，取適量懸液傾注于權(quán)利要求3所述的固體初篩培養(yǎng)基，混勻并培養(yǎng)3-5d， 挑取產(chǎn)生藍(lán)色變色圈的的單菌落，轉(zhuǎn)接至新鮮的培養(yǎng)基劃線分離，轉(zhuǎn)接3-5代，獲得純培養(yǎng)菌株。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株高產(chǎn)甘氨酸菌株，其特征在于該菌株為尖孢鐮孢 H3 (Fusarium oxysporum)，現(xiàn)保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏編號為CGMCC No. 3829.但權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)甘氨酸菌株，不限于尖孢鐮孢 H3 (Fusarium oxysporum)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum H3)的培養(yǎng)，其特征在于(1)培養(yǎng)基甘油10-20g/L，酵母膏1.0-10g/L，蛋白胨1.0-10g/L，硫酸鎂0. 1-0. 5g/ L，磷酸二氫鉀1. 0-5. 0g/L,氯化鈉0. 5-1. 0g/L,硫酸亞鐵0. 01-0. lg/L,己內(nèi)酰胺 0. 5-1. 0g/L, pH 5. 0-8. 0 ；(2)培養(yǎng)溫度25-45°C，培養(yǎng)時間2-6d。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以甘氨腈為底物進(jìn)行甘氨酸轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于(1)底物溶液配制5-100g/L的甘氨腈溶液，用0.5-5. OM的氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié) pH 至 5. 0-9. 0 ；(2)菌體收集根據(jù)權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法進(jìn)行菌體培養(yǎng)，以 6000-15000rpm離心5_20min，以收集經(jīng)培養(yǎng)得到的菌體，用0. 01-0. 5M，pH 6. 0-8. 0的磷酸緩沖液洗滌菌體2-4次。(3)轉(zhuǎn)化將菌體重新懸浮于上述緩沖液中，并與底物溶液混勻，反應(yīng)pH保持在 6. 0-8. 0，反應(yīng)溫度保持在20-60°C，攪拌轉(zhuǎn)速為50-250rpm，反應(yīng)時間6_48h。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum H3)還可將其它腈類化合物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及高產(chǎn)甘氨酸霉菌的篩選及其在腈類化合物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。甘氨酸廣泛應(yīng)用于食品化工醫(yī)藥等領(lǐng)域，采用生物轉(zhuǎn)化方法替代合成法進(jìn)行甘氨酸生產(chǎn)是國內(nèi)外發(fā)展趨勢。本發(fā)明提供了一種高產(chǎn)甘氨酸菌株的篩選方法，并首次篩選到了一株高產(chǎn)甘氨酸的霉菌菌株H3，結(jié)合形態(tài)、生理生化特性以及18S、ITS和28S rDNA基因測序，將其鑒定為尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)。該菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(保藏編號CGMCC No.3829)。本發(fā)明篩選獲得的尖孢鐮孢H3具有生長快，轉(zhuǎn)化效率高，生產(chǎn)周期短，應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)甘氨酸，具有反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)率高，生產(chǎn)成本低，環(huán)境友好等特點，且產(chǎn)品后處理過程方便快捷，無需使用大量酸或堿。
文檔編號C12P7/40GK102161972SQ201010567150
公開日2011年8月24日 申請日期2010年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月1日
發(fā)明者史勁松, 張曉梅, 竇文芳, 許正宏, 許泓瑜, 陸震鳴, 陳敬華, 龔勁松 申請人:江南大學(xué)