專利名稱：一株產(chǎn)具有細(xì)胞毒活性化合物黑麥酮酸f的深海來源青霉菌f11的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株產(chǎn)具有細(xì)胞毒活性化合物黑麥酮酸F的深海來源青霉菌Fll.
背景技術(shù)：
深海微生物由于其處于高壓、低溫(部分區(qū)域如熱液口為高溫)、厭氧、極端PH梯度、高鹽濃度、高金屬濃度、無光照、寡營(yíng)養(yǎng)、高鹵素等到特殊極端環(huán)境中，可產(chǎn)生許多結(jié)構(gòu)新穎、功能獨(dú)特及毒副作用較低的次生代謝產(chǎn)物，這類次生代謝產(chǎn)物是成為了開發(fā)的熱點(diǎn)。海洋真菌是海洋微生物的重要組成，真菌通過吸附于有機(jī)物質(zhì)上進(jìn)行滲透營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的異養(yǎng)真核生物，與細(xì)菌相比，真菌相對(duì)高等，代謝能力更強(qiáng)，生命活動(dòng)更復(fù)雜，并又與海洋中動(dòng)植物有著非常復(fù)雜的生態(tài)關(guān)系，而較之海洋放線菌，則具有生長(zhǎng)速度快，遺傳背景更為復(fù)雜等特性，其化學(xué)結(jié)構(gòu)豐富多樣，許多分子結(jié)構(gòu)新穎獨(dú)特。相對(duì)于海洋動(dòng)植物共附生真菌活性物的豐碩研究成果，國(guó)內(nèi)對(duì)海洋沉積物真菌的研究較少，迄今為止從海洋沉積物真菌中分離到的次生代謝產(chǎn)物及發(fā)現(xiàn)的新化合物分別只占已報(bào)道的海洋真菌次生代謝產(chǎn)物及新化合物的3%和4%。目前，與深海真菌相關(guān)的研究尚為不多。Raghukumar C等分離了來源于深海沉積物、貝類中的真菌，發(fā)現(xiàn)了 Aspergillus屬的耐嗜壓真菌。Turley C M等自4500米身深的西北大西洋分離到目前唯一的極端嗜壓真菌，屬于Bodo屬，鞭狀。2007年，Bass D等對(duì)11 個(gè)來自1500-4000米深海水體和沉積物樣本進(jìn)行了真菌的分子生態(tài)學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)與表層海水相比，深海真菌的含量及多樣性均較低，且以酵母為主。海洋來源真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究開始于1945年，Giuseppe Brothzu從意大利撒丁島海水中分離到具有抗菌活性的真菌Acremomum chrysogenum, Newton。GG等利用該真菌分離得到了具有抗菌活性的化合物cephalosporin C。其后直到20世紀(jì)90年代，海洋真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)入一個(gè)活躍時(shí)期，到2006年為止，共發(fā)現(xiàn)新天然產(chǎn)物500多種。其中一些具有良好的抗菌、抗腫瘤、抗病毒等生物活性。這些真菌大多數(shù)來源于海綿 (28% )和海藻(27% )，來自海洋沉積物的較少)，來之深海的更少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種產(chǎn)具有良好細(xì)胞毒活性化合物黑麥酮酸F的深海來源青霉菌(Penicillum sp. )F11。該青霉菌的菌種保藏號(hào)為CCTCC NO =M 2010246，保藏日期為2010年9月21日，保藏地點(diǎn)為湖北省武漢市武漢大學(xué)，保藏機(jī)構(gòu)為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。我們從西南太平洋深海沉積物中分離得到一株真菌。使用ITS4、ITS5引物擴(kuò)增得到ITS序列，經(jīng)BLAST鑒定該株菌為青霉菌(Penicillum sp.)。經(jīng)活性篩選發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液的KOAc萃取物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有良好細(xì)胞毒作用。通過對(duì)其代謝產(chǎn)物分離得到一個(gè)具有良好細(xì)胞毒活性的化合物黑麥酮酸F。
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Secalonic acid F黑麥酮酸F


圖1是青霉菌Fll在PDA平板上的菌落；圖2是青霉菌Fll在顯微鏡下形態(tài)。圖3為Fll ITS電泳圖；圖4. Fll菌株HPLC指紋圖譜；圖5化合物F1120菌株HPLC指紋圖譜；圖 6F1120 質(zhì)譜圖；圖7F1120 碳譜圖；圖 8F1120 氫譜圖；圖 9F1120DEPT 圖譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。實(shí)施例1A本發(fā)明所涉及菌株的分離鑒定從西南太平洋勞盆地17Mm深海沉積物中用PDA+氯霉素平板分離了 21株真菌， 以來自A549 (肺癌)、SW480 (結(jié)腸腺癌)，HL60 (急性早幼粒細(xì)胞白血病)腫瘤細(xì)胞株為模型，采用CCK8方法檢測(cè)了這21株深海來源真菌的細(xì)胞毒活性，其中1株絲狀真菌Fll表現(xiàn)出較好的腫瘤細(xì)胞毒性，其乙酸乙酯粗體物在100微克/毫升濃度下，對(duì)三種腫瘤細(xì)胞株的抑制率均達(dá)到99%以上。該菌株經(jīng)分類學(xué)研究和分子生物學(xué)研究鑒定為青霉菌(Penicillum sp.)。該菌的微生物學(xué)特征為在PDA平板上培養(yǎng)三天后，菌落呈現(xiàn)白色，多為營(yíng)養(yǎng)菌絲。其營(yíng)養(yǎng)體為無色或淡色的菌絲體，菌絲各細(xì)胞之間有橫隔膜.整個(gè)菌絲體分為伸入營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中吸取營(yíng)養(yǎng)的基質(zhì)菌絲和伸向空氣中的氣生菌絲。5天后可見氣生菌絲上產(chǎn)生簡(jiǎn)單的長(zhǎng)而直立的分生孢子梗，頂端以特殊的對(duì)稱的掃帚狀的方式分支，分支為多極的分生孢子梗最后產(chǎn)生許多瓶梗，在瓶梗上著生分生孢子鏈.分生孢子為球形至卵形，呈綠色，同時(shí)菌落呈現(xiàn)墨綠色，顯微鏡檢可見成團(tuán)菌絲體。(圖1，圖2)。在PDA液體培養(yǎng)中，按1 50接種，28°C、180RPM搖培3天可見白色菌絲球出現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌絲球從黃色最終變成黑色，液體培養(yǎng)基顏色也相應(yīng)地從黃色變成黑色。7天后培養(yǎng)基完全變成黑色。B青霉菌Fll的基因組DNA提取1)菌株在25°C搖床(120r/min)培養(yǎng)5天；2)取冷凍干燥后的菌絲0. 15g，加適量的液氮研磨充分；3)在研缽中加入 2ml 提取緩沖液(50mmol/L Tris-HCl pH 7. 2,50mmol/L EDTA, 3% SDS,1% β-巰基乙醇，充分混合均勻，轉(zhuǎn)移至5mL離心管中，加入2mL苯酚氯仿 異戊醇 05 24 1)抽提，12000171^11，離心101^11;上清液加入2(^1^ RNase (5mg/mL)， 55°C, Ih ;再加入201^蛋白酶1((51^/1^)(酶解時(shí)間可延長(zhǎng))，551，111 ；加入2mL苯酚氯仿異戊醇05 24 1)再抽提一次，12000r/min，離心lOmin，上清液加入1/10體積的 NaAc(3mol/L),0. 7 體積異丙醇，_20°C 沉淀 20min, 12000rpm 離心 15min，棄上清，用 70% 冷乙醇洗兩次，用干凈濾紙吸去離心管壁的液體，室溫干燥15min，加入150 μ L.純水溶解沉淀，-20°C保存?zhèn)溆?。? μ LDNA與1 μ L溴酚藍(lán)；在0. 8%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)其純度和濃度。C菌株鑒定通過引物ITS45，-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3，禾口 ITS55，-GGAAGTAAAAGT CGTAAC AAG G-3，對(duì) FllDNA 進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 為 94°C預(yù)變性 3min 94°C變性 lmin，53°C復(fù)性 45s，72°C延伸4 :35個(gè)循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保溫。將擴(kuò)增片段用T載克隆轉(zhuǎn)化到 DH5a0跑膠驗(yàn)證得到陽(yáng)性克隆(如圖3)。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得青霉菌Fll的ITS序列如下ggaagtaaaagtcgtaacaaggtttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattaccgagt60
gagggccctctgggtccaacctcccacccgtgtttattttaccttgttgcttcggcgggc120
ccgccttaactggccgccggggggcttacgCCCCCgggCCCgCgCCCgCCgaagacaccc180
tcgaactctgtctgaagattgtagtctgagtgaaaatata3.3. 3. 3.3.aactttcaac240
aacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgatacgtaatgtga300
attgcaaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgcccccaggtattccgg360
ggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggccccg420
tcctccgatcccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgag480
cgtatggggctttgtcacccgctctgtaggCCCggCCggCgcttgccgatcaacccaaat540
ttttatccaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcasta600
agcggagga609對(duì)青霉菌Fll的ITS序列(GENE Bank ID :EU497948)進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果顯示該序列和 Penicillium chrysogenum strain ATCC 10106 (GENE Bank ID :HQ026745. 1)相似度最高，達(dá)到99%。故可鑒定該株菌屬于青霉屬(Penicillum sp.).實(shí)施例2發(fā)酵產(chǎn)物中分離鑒定黑麥酮酸F對(duì)真菌Penicillium sp. Fll進(jìn)行80升規(guī)模的發(fā)酵，并通過乙酸乙酯等量萃取3 次，萃取液減壓蒸干，獲得12. 5克浸膏。浸膏取小樣通過環(huán)己烷與甲醇萃取，取甲醇相進(jìn)行 HPLC檢測(cè)(圖4)。根據(jù)指紋圖譜，將浸膏用環(huán)己烷與甲醇萃取，取甲醇相用上減壓硅膠柱，依次用環(huán)己烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇洗脫。收集乙酸乙酯相上硅膠柱，用不同比例的環(huán)己烷二氯甲烷丙酮洗脫，收集洗脫液，減壓蒸干，共收集40份樣品。通脫TLC及HPLC檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)20號(hào)樣品純度好，為亮黃色粉末，285. 9mg。對(duì)20號(hào)樣品進(jìn)行HPLC檢測(cè)，顯示20號(hào)樣品為主代謝峰。通過核磁及質(zhì)譜對(duì)F1120化合物進(jìn)行鑒定，最終確定該化合物為黑麥酮酸(5 圖 9)實(shí)施例3本發(fā)明所產(chǎn)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。CCK-8 測(cè)定方法=Cell Counting Kit-8 (CCK-8)利用了 Dojindo 開發(fā)的四唑鹽_WST -8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-O，4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)，它在電子載體I-Methoxy PMS存在的情況下能夠被還原成水溶性的甲臌染料。 CCK-8溶液可以直接加入到細(xì)胞樣品中；不需要預(yù)配各種成分。CCK-8法是用于測(cè)定細(xì)胞增殖或毒性試驗(yàn)中活細(xì)胞數(shù)目的一種高靈敏度，無放射性的比色檢測(cè)法。WST -8被細(xì)胞內(nèi)脫氫酶生物還原后生成的橙色甲臌染料能夠溶解在組織培養(yǎng)基中，生成的甲臌量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。由于CCK-8溶液相當(dāng)穩(wěn)定，并且對(duì)細(xì)胞沒有毒性，因此可以長(zhǎng)時(shí)間孵育。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腫瘤細(xì)胞0. 25%胰酶消化后，接種至96孔板，接種量10000/孔。37°C、 5% CO2條件下培養(yǎng)過夜后加入受試化合物黑麥酮酸F，取三個(gè)濃度梯度，分別為IOOyg/ ml、50y g/ml、25y g/ml，以紫衫醇為陽(yáng)性對(duì)照，DMSO為陰性對(duì)照，每個(gè)樣品濃度做三個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48小時(shí)后，加入10 μ g CCK-8試劑，培養(yǎng)2小時(shí)，測(cè)定450nm吸光度，參比波長(zhǎng)為 600nm，并計(jì)算抑制率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物黑麥酮酸F對(duì)腫瘤細(xì)胞株A549、HL60、SW480的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用(結(jié)果如下表)。
權(quán)利要求
1.一種青霉菌Fll(Penicillum sp. Fll)，其特征在于，其保藏號(hào)為CCTCC NO =M 2010246。
2.如權(quán)利要求1所述的青霉菌FlKPeniciIlumsp. Fll)，其特征在于能夠產(chǎn)生一種具有良好細(xì)胞毒活性的化合物黑麥酮酸F。
3.—種生產(chǎn)黑麥酮酸F的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的青霉菌F11， 獲得含有該黑麥酮酸F的發(fā)酵物，從該發(fā)酵物中分離麥黑麥酮酸F。
全文摘要
本發(fā)明一株產(chǎn)具有細(xì)胞毒活性化合物黑麥酮酸F的深海來源青霉菌F11。該菌從海洋沉積物中分離得到，使用ITS4、ITS5引物擴(kuò)增得到ITS序列，經(jīng)BLAST鑒定該株菌為青霉菌(Penicillum sp.)，該菌種的保藏號(hào)為CCTCC NOM 2010246。經(jīng)活性篩選發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液的EtOAc萃取物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有良好細(xì)胞毒作用，通過對(duì)其代謝產(chǎn)物分離得到一個(gè)具有良好細(xì)胞毒活性的化合物黑麥酮酸F。本發(fā)明提供的菌株可產(chǎn)具細(xì)胞毒活性的化合物黑麥酮酸F，為發(fā)酵生產(chǎn)該化合物提供一種新的可能。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102408997SQ20101056699
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2010年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月29日
發(fā)明者易志偉, 李寧, 湯熙翔 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第三海洋研究所