專(zhuān)利名稱(chēng)：一種微小rna及其反義核酸在診斷、預(yù)防、治療和/或預(yù)后評(píng)估心臟疾病中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥工程領(lǐng)域，涉及一種內(nèi)源性的非編碼小RNA及其反義核酸的 新用途，具體涉及一種微小RNA(micr0RNA，miRNA)及其反義核酸在診斷、預(yù)防和/或治療心 臟疾病中的用途。
背景技術(shù)：
心血管疾病主要包括高血壓、冠心病、充血性心力衰竭等。目前，心血管疾病仍然 是人類(lèi)健康的頭號(hào)殺手，全世界范圍內(nèi)每年有一千七百萬(wàn)人死于心血管疾病，其死亡率已 接近所有癌癥死亡率的總和。在我國(guó)，隨著人民生活水平日益提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，心血 管疾病死亡率呈明顯上升趨勢(shì)，已超過(guò)癌癥成為第一大致死原因。毫無(wú)疑問(wèn)，預(yù)防和治療心 血管疾病仍然是醫(yī)學(xué)與生物學(xué)的重大任務(wù)。心肌肥大是指組織水平上心肌組織的增厚和細(xì)胞水平上心肌細(xì)胞體積的增大的 總稱(chēng)。它是由于心肌細(xì)胞體積增大而導(dǎo)致心臟體積增大所發(fā)生的一種疾病。該病是由一些 生理和病理因素的共同刺激而發(fā)生的，它是許多心血管疾病的綜合性表現(xiàn)。心肌肥大是心 肌病的一種，是心肌細(xì)胞針對(duì)于血液動(dòng)力學(xué)增加的一種應(yīng)答反應(yīng)。多種情況可以引起人體 內(nèi)血液動(dòng)力的增加，比如高血壓，心臟瓣膜疾病。長(zhǎng)期的超負(fù)荷血液動(dòng)力刺激會(huì)引起以心肌 細(xì)胞體積增大為特征的心肌細(xì)胞重塑過(guò)程，也就是心肌肥大?，F(xiàn)在一般認(rèn)為存在兩種情況 的心肌肥大，一種是正常的生理性肥大，比如出生后伴隨者發(fā)育發(fā)生的心肌肥大，還有體育 鍛煉引起的心肌肥大；另外一種是病理性心肌肥大，其早期特征是室壁和室間隔增厚，心肌 收縮功能增強(qiáng)，因此被視為代償性肥大，如果病情一直未得到緩解，心肌肥大后期會(huì)發(fā)生心 室壁間質(zhì)纖維化、心肌細(xì)胞收縮功能失調(diào)以及能量代謝，基因表達(dá)和電生理特征的異常，最 終導(dǎo)致心臟功能衰竭。鑒于心肌肥大的發(fā)生是一個(gè)進(jìn)行性不可逆過(guò)程，而且最終會(huì)引起心 力衰竭，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)把它作為心臟發(fā)生臨床病變的一個(gè)里程碑式的心肌形態(tài)變化，認(rèn)為 它是導(dǎo)致心臟疾病和心臟猝死的一個(gè)危險(xiǎn)因素。隨著近來(lái)miRNA研究的熱潮，這種內(nèi)源性非編碼小RNAs已經(jīng)作為一個(gè)基因表達(dá)調(diào) 節(jié)的中心因子顯露，參加許多重要的生理過(guò)程。對(duì)于miRNA來(lái)說(shuō)，其調(diào)控方式的特點(diǎn)決定了 它的靶基因不會(huì)只有一個(gè)，而是一對(duì)多的方式，這就是使得miRNA的功能研究?jī)?nèi)容非常豐 富。許多研究表明，miRNA對(duì)于維持心臟正常生理功能具有重要作用，心臟中的miRNA異常 表達(dá)與許多心臟疾病的發(fā)生相關(guān)。因此，將miRNA作為心臟疾病治療的靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)相關(guān)藥物 具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。盡管越來(lái)越多的miRNA作為人類(lèi)疾病的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，但在心臟 肥厚和心肌纖維化等心臟疾病中的關(guān)鍵miRNA仍沒(méi)有確定，其所發(fā)揮的功能是對(duì)該領(lǐng)域科 研人員的挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是確定或發(fā)現(xiàn)調(diào)控心肌細(xì)胞肥大的在心臟中表達(dá)的微小 RNA(miRNA)，進(jìn)一步確定其在心肌肥大、冠心病、心肌纖維化等心臟疾病中的關(guān)鍵作用，將 其應(yīng)用到這些心臟疾病的診斷、防治中。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。一方面，本發(fā)明提供一種微小RNA及其反義核酸在制備用于診斷、預(yù)防、治療和/ 或預(yù)后評(píng)估心臟疾病的藥物或試劑盒中的用途，其中所述微小RNA為包含以下序列的核苷 酸或者其生物活性功能片段或變體5’ -UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA-3，(SEQ ID NO. 1)。優(yōu)選地，所述微小RNA反義核酸為包含以下序列的核苷酸或者其生物活性功能片 段或變體5，-UGGGGUAUUUGACAAACUGACA-3，(SEQ IDN0. 2)。優(yōu)選地，所述心臟疾病選自心肌肥大、心肌纖維化、冠心病、心肌炎、心瓣膜疾病、
高血壓和心衰。另一方面，本發(fā)明提供一種用于診斷和/或預(yù)后評(píng)估心臟疾病的試劑盒，所述試 劑盒包含用于特異性檢測(cè)微小RNA的探針或引物，其中所述微小RNA為包含以下序列的核 苷酸或者其生物活性功能片段或變體5，-UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA-3，(SEQ ID NO. 1)。優(yōu)選地，所述試劑盒中包含的探針或引物具有以下所示的序列5’ -UGUCAGUUUG UCAAAUACCCCA-3，(SEQ ID NO. 1)。本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防和/或治療心臟疾病的藥物組合物，其包含治療有 效量的微小RNA反義核酸和藥學(xué)上可接受的病毒、載體或輔料，其中所述微小RNA反義核酸 為包含以下序列的核苷酸或者其生物活性功能片段或變體5’-UGGGGUAUUUGACAAACUGACA-3，(SEQ ID NO. 2)。優(yōu)選地，所述藥物組合物中微小RNA反義核酸的含量為0. 5-1克。優(yōu)選地，所述藥學(xué)上可接受的載體或輔料選自殼聚糖、膽固醇、脂質(zhì)體、環(huán)糊精、微
球、微囊等。優(yōu)選地，所述藥物組合物以口服或注射的方式給藥；更優(yōu)選地，所述注射給藥方式 選自靜脈注射、肌肉注射、冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射和心肌注射。綜上所述，本發(fā)明人通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)miRNA-223在肥大的心肌細(xì)胞和心 臟肥厚中表達(dá)顯著上調(diào)。具體地，本發(fā)明人通過(guò)構(gòu)建miRNA-223過(guò)表達(dá)腺病毒或miRNA-223 轉(zhuǎn)基因小鼠加強(qiáng)miRNA-223的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miRNA-223過(guò)表達(dá)在細(xì)胞水平能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥 大的發(fā)生，此外，與對(duì)照組相比，miRNA-223轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟有明顯的肥大表型及纖維化 程度，同時(shí)一些肥大基因的表達(dá)也有明顯的增加。更具體而言，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組 相比，miRNA-223在肥大的心肌細(xì)胞中有明顯的提高，對(duì)其進(jìn)行肥大指標(biāo)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，心肌 肥大的指標(biāo)如細(xì)胞表面積、蛋白/DAN的比值及肌小節(jié)的重組也都有明顯的增加。此外， miRNA-223轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟表型、心臟體重比、邊緣區(qū)的心肌細(xì)胞橫截面積(wGA染色) 及心肌纖維化(Masson染色)都有了明顯的增加。以上說(shuō)明，miRNA-223能夠誘導(dǎo)心肌肥 大的發(fā)生，這意味著miRNA-223可作為一種早期診斷和早期預(yù)防心肌肥大，心肌纖維化等 心臟疾病的生物標(biāo)志物。因此，本發(fā)明提供了包含特異性檢測(cè)miRNA-223的探針或引物的 試劑盒，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、納米微球技術(shù)檢測(cè)患者外周血血漿中miRNA-223的表達(dá)水 平，用于對(duì)心肌肥厚、心肌纖維化、冠心病和心衰等心臟疾病的診斷和/或預(yù)后評(píng)估。
另外，本發(fā)明人通過(guò)大量的試驗(yàn)證明miRNA-223的反義核酸對(duì)心肌肥厚及心肌纖 維化具有保護(hù)作用。具體地，本發(fā)明人在細(xì)胞水平通過(guò)轉(zhuǎn)染miRNA-223的反義核酸發(fā)現(xiàn)， 它能夠抑制肥大刺激因子所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，包括肥大指標(biāo)如細(xì)胞表面積，蛋白/DAN 的比值及肌小節(jié)的重組也與對(duì)刺激組相比都有了明顯的降低。在動(dòng)物水平通過(guò)注射外源 miRNA-223的反義核酸也能夠抑制肥大模型的肥大效應(yīng)包括心臟表型，心臟體重比，邊緣區(qū) 的心肌細(xì)胞橫截面積(WGA染色)及心肌纖維化(Masson染色)都有了明顯的降低，同時(shí)心 功能也有了明顯的改善。以上說(shuō)明，miRNA-223的反義核酸通過(guò)抑制心肌細(xì)胞肥大對(duì)心臟具 有保護(hù)作用，它對(duì)許多心臟疾病具有潛在的預(yù)防和治療價(jià)值，可成為一種治療心肌肥大，預(yù) 防心肌纖維化的藥物。因此，本發(fā)明提供了將miRNA-223反義核酸與適當(dāng)載體或輔料如殼 聚糖、膽固醇、脂質(zhì)體、納米顆粒等包裝形成藥物，通過(guò)口服、靜脈注射、肌肉注射、冠狀動(dòng)脈 內(nèi)注射或直接心肌注射的方式，用于預(yù)防和/或治療心肌肥大和心肌纖維化等心臟疾病。


以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中圖1為心臟肥大刺激及血管緊張素(Ang II)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大過(guò)程中 miRNA-223表達(dá)水平的變化；其中A為Ang II誘導(dǎo)小鼠心臟肥大刺激的miRNA-223表達(dá)水 平；B為原代心肌細(xì)胞Ang II處理的miRNA-223表達(dá)水平。圖2為miRNA-223過(guò)表達(dá)腺病毒的構(gòu)建；其中A為1. OCMV穿梭載體示意圖；B為 miRNA-223腺病毒感染原代心肌表達(dá)水平檢測(cè)。圖3為miRNA-223過(guò)表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞肥大的促進(jìn)作用；其中A為原代心肌細(xì)胞感 染miRNA-223腺病毒對(duì)心肌細(xì)胞表面積的影響；B為原代心肌細(xì)胞感染miRNA-223腺病毒 對(duì)蛋白/DAN的影響；C為原代心肌細(xì)胞感染miRNA-223腺病毒對(duì)肌小節(jié)的影響。圖4為miRNA-223轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建；其中A為miRNA-223心臟特異性轉(zhuǎn)基因打 靶載體圖譜；B為miRNA-223轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性克隆的鑒定；C為miRNA-223轉(zhuǎn)基因小鼠及野 生型小鼠個(gè)臟器中miRNA-223表達(dá)水平檢測(cè)。圖5為miRNA-223轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠的比較；其中A為心臟表型及心臟體 重比；B為邊緣區(qū)的心肌細(xì)胞橫截面積(WGA染色)；C為心肌纖維化(Masson染色)。圖6為miRNA-223反義核酸能夠抑制血管緊張素所誘導(dǎo)的肥大；其中A為原代心 肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-223反義核酸(antagomir)能夠抑制心肌細(xì)胞的表面積；B為蛋白/ DNA ；C為肌小節(jié)重組。圖7為小鼠靜脈注射miRNA-223反義核酸(antagomir)能抑制血管緊張素所誘導(dǎo) 的肥大模型；其中A為心臟表型；B為肥大標(biāo)記基因及心臟體重比；C為心肌細(xì)胞橫截面積 (WGA染色)。圖8為小鼠靜脈注射miRNA-223反義核酸(antagomir)與野生型小鼠的心功能 比較；其中A為室間隔厚度(LVSd) ；B為左心室后壁厚度(PWd)，C為左心室收縮期內(nèi)徑 (LVIDs) ；D為短軸縮短率(FS)。
具體實(shí)施例方式以下參照具體的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。除非特別指出，以下各實(shí)施例中涉及的各種實(shí)驗(yàn)方法和操作，包括細(xì)胞培養(yǎng)， RNA的提取，RCR擴(kuò)增，熒光定量PCR，載體的構(gòu)建、擴(kuò)增及轉(zhuǎn)染，細(xì)胞染色等等，均可參 見(jiàn)以下文獻(xiàn)W. -Q. Tan, etal, Foxo3a InhibitsCardiomyocyte Hypertrophy through Transactivating Catalase J Biol Chem. 20080ctober 31 ；283 (44) :29730-29739 ； Wang K, etal, miR_9and NFATc3regulate myocardin in cardiac hypertrophy, J Biol Chem. 2010 Aprl6 ；285 (16) :11903-12 ；Lin Ζ, etal, miR-23a functions downstream of NFATc3 toregulate cardiac hypertrophy, PNAS, 2009,106 (29) :12103-12108)。上述文獻(xiàn) 在此全文引入作為參考。實(shí)施例1心臟吧大刺激及血管緊張素(Ang II)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大過(guò)程中 miRNA-223表達(dá)水平變化的檢測(cè)本實(shí)施例采用對(duì)C57/BL6小鼠(購(gòu)自北京醫(yī)科大學(xué))進(jìn)行腹腔注射0. 6mg/kg/day 血管緊張素(購(gòu)自sigma公司)連續(xù)兩周的方法對(duì)心臟進(jìn)行肥大刺激，檢測(cè)miRNA-223在 心臟中不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平。提取心臟的總RNA(用TIZOL試劑盒)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)miRNA-223的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，肥大刺激M小時(shí)之內(nèi)miRNA-223的表達(dá)水平有了顯著的升高，如圖IA 所示。對(duì)于心肌細(xì)胞肥大模型，采用本實(shí)驗(yàn)室已建立的方法培養(yǎng)大鼠乳鼠原代心肌細(xì) 胞，對(duì)心肌細(xì)胞用150nM Ang II進(jìn)行處理，在培養(yǎng)的不同時(shí)間，提取細(xì)胞的總RNA，實(shí)時(shí)熒 光定量PCR技術(shù)檢測(cè)miRNA-223的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，miRNA-223表達(dá)水平在Ang II處理1小時(shí)之內(nèi)有了顯著的上升，如圖 IB所示。實(shí)施例2miRNA_223腺病毒的構(gòu)建采用Ambion公司的pSilencer Adeno 1. 0-CMV系統(tǒng)構(gòu)建miRNA-223過(guò)表達(dá)載體 或腺病毒。按照公司說(shuō)明書(shū)構(gòu)建相應(yīng)載體及腺病毒，具體方法如下。提取大鼠心臟的基因組，以其為模板，PCR擴(kuò)增miRNA-223及其上下游兩端各將近 200bp 的序列(PCR 體系 50ul，PCR 條件如下95°C 3min —個(gè)循環(huán)；95°C 30sec，56°C 30sec, 72°C Imin共28個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min)，PCR引物設(shè)計(jì)如下，擴(kuò)增片段約400bp 上游引物5'-GCCAGTCATGTTAGTGTCTGCCATT-3‘ (SEQ ID NO. 3),下游引物5'-TGATGCATACTAGGCTTAGAGGCCC-3‘ (SEQ ID N0. 4) 將該片段用spel和xhol進(jìn)行雙酶切，再將腺病毒載體pSilencer AdenoCMVl. Oshuttle vector載體(載體圖譜見(jiàn)圖2A)進(jìn)行雙酶切后與上述酶切后的 片段進(jìn)行連接，即將片段克隆入腺病毒載體中。Pac I酶切線性化該載體及腺病毒骨架 (Adenovirus LacZ Baclibone)，共轉(zhuǎn)染HEK493細(xì)胞，包裝腺病毒，擴(kuò)增收集病毒，測(cè)定病毒 滴度。Real-time PCR鑒定miRNA-223是否表達(dá)。 將miRNA-223腺病毒感染原代心肌細(xì)胞，24小時(shí)后，收集細(xì)胞，提取RNA， Real-time PCR 檢測(cè) miRNA-223 表達(dá)水平。 結(jié)果顯示，感染miRNA-223腺病毒的細(xì)胞miRNA-223表達(dá)量明顯升高，而感染對(duì)照 組β -gal腺病毒的細(xì)胞miRNA-223表達(dá)沒(méi)有變化(圖2B)。
實(shí)施例3miRNA_223促心肌細(xì)胞肥大的實(shí)驗(yàn)本實(shí)施例中，以原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞為模型，檢測(cè)miRNA-223是否能夠促心肌細(xì) 胞肥大。用實(shí)施例2構(gòu)建的miRNA-223腺病毒感染心肌細(xì)胞以過(guò)表達(dá)miRNA_223，并以 β-gal腺病毒作為對(duì)照，病毒感染48小時(shí)后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行表面積的測(cè)量，結(jié)果見(jiàn)圖3A。提 取細(xì)胞的蛋白并測(cè)定細(xì)胞DNA的量來(lái)進(jìn)行蛋白DNA比值的檢測(cè)(圖:3B)，同時(shí)，通過(guò)對(duì)心肌 細(xì)胞進(jìn)行肌小節(jié)結(jié)構(gòu)的染色來(lái)觀察其變化(圖3C)。以上結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miRNA-223可以顯著促進(jìn)心肌細(xì)胞的肥大。實(shí)施例4miRNA_223心臟過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建通過(guò)PCR的方法從小鼠基因組擴(kuò)增含有miRNA-223前體序列的DNA片段，將其克 隆到ρ α MHC-clone26載體(從北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院獲得，通過(guò)Kpnl和HindIII雙酶切后 進(jìn)行連接)。miRNA-223的表達(dá)受載體上的心臟特異性啟動(dòng)子CMV調(diào)控，載體圖譜見(jiàn)圖4A。 應(yīng)用常規(guī)的顯微注射方法將該載體導(dǎo)入受精卵，篩選、繁育miRNA-223轉(zhuǎn)基因小鼠(委托沈 陽(yáng)醫(yī)學(xué)院構(gòu)建)。通過(guò)PCR的方法鑒定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠(PCR體系50ul，PCR條件如下95°C 3min -個(gè)循環(huán)；95°C 30sec,56°C 30sec,72°C Imin共沘個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min)，結(jié)果見(jiàn)圖 4B。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了 miRNA-223轉(zhuǎn)基因小鼠各臟器中miRNA-223的表 達(dá)量，結(jié)果見(jiàn)圖4C。在野生型小鼠各個(gè)臟器中miRNA-223在心臟中特異表達(dá)，其它臟器中 miRNA-223表達(dá)量低或不表達(dá)。miRNA-223轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠與野生型(WT)小鼠相比，心臟 中miRNA-223表達(dá)量升高至少6倍，而其它臟器中miRNA-223的表達(dá)沒(méi)有變化。實(shí)施例5miRNA_223轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠的比較對(duì)實(shí)施例4所構(gòu)建的miRNA-223轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠的心臟進(jìn)行表型分析， 通過(guò)石蠟切片鑒定整體外形，通過(guò)HE染色來(lái)對(duì)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核進(jìn)行著色(圖5A)及WGA染 色(圖5B)確定細(xì)胞的橫截面積大小，通過(guò)Masson染色來(lái)區(qū)分纖維化程度(圖5C)；同時(shí) 檢測(cè)了心臟體重比(圖5A)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生型(WT)小鼠相比，miRNA-223轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠的心臟表型 有了明顯的增大，心臟體重比及纖維化程度也都有顯著的提高，說(shuō)明miRNA-223可以促進(jìn) 心臟結(jié)構(gòu)重塑、心肌纖維化。實(shí)施例6miRNA_223反義核酸對(duì)血管緊張素所誘導(dǎo)肥大的抑制作用對(duì)原代心肌細(xì)胞通過(guò)脂質(zhì)體(lipfectin2000)轉(zhuǎn)染miRNA-223反義核酸 (Antagomir，AN，其序列為 5' -UGGGGUAUUUGACAAACUGACA-3 ‘ (SEQ ID NO. 2)，委托上海吉 瑪制藥技術(shù)有限公司合成)后，能有效的抑制miRNA-223的表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞用150nMAng II 進(jìn)行處理，經(jīng)過(guò)對(duì)小時(shí)之后，進(jìn)行心肌肥大指標(biāo)的檢測(cè)，例如肌小節(jié)的重組(圖6A)、細(xì)胞表 面積(圖6B)及蛋白/DNA(圖6C)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，miRNA-223反義核酸能夠有效的抑制Ang II所誘導(dǎo)的心肌細(xì) 胞肥大。實(shí)施例7小鼠靜脈注射miRNA-223反義核酸能夠抑制血管緊張素所誘導(dǎo)的肥大模 型對(duì)小鼠用血管緊張素(Ang II)靜脈注射(0. 6mg/kg/day)，兩周后，小鼠的心臟有明顯的肥大，而同時(shí)加入實(shí)施例6中的miRNA-223反義核酸(25mg/kg/day)可以明顯 減弱Ang II所誘導(dǎo)的肥大效應(yīng)。但是，同時(shí)向小鼠注射miRNA-223反義核酸的負(fù)對(duì)照 (antagomir negative control, NC 其序列為 5，-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3，(SEQ ID NO. 5)，25mg/kg/day)和Ang II，并不能減弱Ang II的肥大表型(圖7A)，同時(shí)也檢測(cè)了肥 大標(biāo)記基因及心臟體重比(圖7B)，細(xì)胞的橫截面積大小(WGA染色)(圖7C)。以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，miRNA-223反義核酸能夠在整體水平抑制心臟肥大的發(fā)生。實(shí)施例8小鼠靜脈注射miRNA-223反義核酸與野生型小鼠的心功能比較向小鼠靜脈注射血管緊張素(Ang 11,0. 6mg/kg/day)及實(shí)施例6中的miRNA-223 反義核酸(25mg/kg/day)可以改善單獨(dú)注射血管緊張素(AngII)所誘導(dǎo)的心功能的失調(diào)。 心功能的指標(biāo)包括室間隔厚度(LVSd，圖8A)，左心室后壁厚度(PWd，圖8B)，左心室收縮期 內(nèi)徑(LVIDs，圖8C)以及短軸縮短率(FS，圖8D)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miRNA-2M反義核酸能夠明顯改善肥大模型所引起的心功能失調(diào)。
權(quán)利要求
1.一種微小RNA及其反義核酸在制備用于診斷、預(yù)防、治療和/或預(yù)后評(píng)估心臟疾病的 藥物或試劑盒中的用途，其中所述微小RNA為包含以下序列的核苷酸或者其生物活性功能 片段或變體5' -U⑶CA⑶UU⑶CAAAUACCCCA-3‘ (SEQ ID NO. 1)
2.根據(jù)要求1所述的用途，其特征在于，所述微小RNA反義核酸為包含以下序列的核苷 酸或者其生物活性功能片段或變體5 ‘ -UGGGGUAUUUGACAAACUGACA-3‘ (SEQ ID NO. 2)。
3.根據(jù)要求1或2所述的用途，其特征在于，所述心臟疾病選自心肌肥大、心肌纖維化、 冠心病、心肌炎、心瓣膜疾病、高血壓和心衰。
4.一種用于診斷和/或預(yù)后評(píng)估心臟疾病的試劑盒，所述試劑盒包含用于特異性檢測(cè) 微小RNA的探針或引物，其中所述微小RNA為包含以下序列的核苷酸或者其生物活性功能 片段或變體5' -U⑶CA⑶UU⑶CAAAUACCCCA-3‘ (SEQ ID NO. 1)
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包含的探針或引物具有 以下所示的序列5’ -U⑶CAGUUUGUCAAAUACCCCA-3’ (SEQ ID NO. 1)。
6.一種用于預(yù)防和/或治療心臟疾病的藥物組合物，其包含治療有效量的微小RNA反 義核酸和藥學(xué)上可接受的病毒、載體或輔料，其中所述微小RNA反義核酸為包含以下序列 的核苷酸或者其生物活性功能片段或變體5' -UGGGGUAUUUGACAAACUGACA-3 ‘ (SEQ ID NO. 2)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物中包含的單鏈非 編碼小RNA反義核酸的含量為0. 5 lg。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥學(xué)上可接受的載體或輔 料選自殼聚糖、膽固醇、脂質(zhì)體、環(huán)糊精、微球和微囊。
9.根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物以口 服或注射的方式給藥；優(yōu)選地，所述注射給藥方式選自靜脈注射、肌肉注射、冠狀動(dòng)脈內(nèi)注 射和心肌注射。
全文摘要
本發(fā)明提供一種微小RNA及其反義核酸在診斷、預(yù)防、治療和/或預(yù)后評(píng)估心臟疾病中的用途。本發(fā)明提供的微小RNA為包含以下序列的核苷酸或者其生物活性功能片段或變體5′-UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA-3′。該微小RNA可以作為一種新的生物標(biāo)志物應(yīng)用于心臟病病的診斷和/或預(yù)后評(píng)估。此外，該微小RNA的反義核酸可以作為一種新型的藥物用于心臟疾病的預(yù)防和/或治療。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102115787SQ20101055801
公開(kāi)日2011年7月6日 申請(qǐng)日期2010年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月22日
發(fā)明者李培峰, 王昆, 龍波 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所