專利名稱：銀杏葉片完整葉綠體的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及木本植物銀杏葉片的完整葉綠體提取及分離技術(shù)，屬于生物化學(xué)技 術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
縣、GinkgobilobaL.),是現(xiàn)有種子植物中最古老的孑遺植物，也是起源于中 國的特有珍貴樹種，為我國二級(jí)保護(hù)植物，在學(xué)術(shù)界一向稱銀杏為“活化石”。我國 是銀杏的故鄉(xiāng)，現(xiàn)有資源占世界銀杏資源70%以上。銀杏葉片的藥用價(jià)值近年來一直 受到國內(nèi)外的高度重視，從銀杏葉片中提取的活性物質(zhì)具有軟化血管、防止動(dòng)脈硬化、 清除血液脂肪垃圾、抑制血小板凝聚、防止腦血栓形成的良好作用，并具有防止中老年 癡呆、視網(wǎng)膜距離改變，增強(qiáng)免疫力，延緩衰老等強(qiáng)大功能w。銀杏集食用、藥用、保 健、化妝、用材、綠化、觀賞于一體，是一種重要的經(jīng)濟(jì)樹種。由于銀杏具有許多原始 特性，正吸引科學(xué)家們從不同方面對(duì)其進(jìn)行研究。目前國內(nèi)外的研究方向主要分為系統(tǒng) 進(jìn)化和葉片的藥用價(jià)值。而葉綠體是植物通過光合作用還原和同化二氧化碳、形成碳水 化合物的場所，同時(shí)也是植物次生物質(zhì)代謝的場所，是植物葉片細(xì)胞中重要的細(xì)胞器。 而植物的葉綠體DNA是相對(duì)保守的序列，采用葉綠體DNA作為研究對(duì)象相對(duì)于細(xì)胞 DNA對(duì)于進(jìn)化和分類結(jié)果更為準(zhǔn)確。目前發(fā)現(xiàn)在銀杏葉綠體當(dāng)中含有與其次生代謝物合 成有關(guān)的酶類，因此對(duì)其葉綠體進(jìn)行研究將有助于我們揭示其次生代謝物的合成機(jī)理， 并進(jìn)一步從分子水平對(duì)其葉綠體進(jìn)行遺傳改良以提高其次生代謝物的產(chǎn)量提供基礎(chǔ)。目前植物葉綠體提取的方法多是離心的方法，但是不同材料所需要的離心條件 和提取介質(zhì)則各不相同[2_5]，因此，目前植物葉綠體提取的方法還沒有一個(gè)普遍通用的方 法。也就是一類材料要研制一種特定的提取方法，這個(gè)研制的周期至少在3個(gè)月或者更 長，而且目前提取植物葉綠體的成功報(bào)道也多是草本植物，而木本植物的并不多，特別 對(duì)于有較高次生代謝物質(zhì)含量的木本植物，在葉綠體提取過程中次生代謝物質(zhì)的外溢也 對(duì)葉綠體的完整性有較大的影響，因此，作為含有較多的次生代謝物質(zhì)藥用木本植物， 如銀杏葉綠體的提取一直是一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)，目前還沒有關(guān)于其完整葉綠體提取方法的報(bào) 道。該技術(shù)瓶頸一方面嚴(yán)重限制了進(jìn)一步揭示其葉綠體的生理生化和分子生物學(xué)的基 礎(chǔ)研究的發(fā)展，而且也阻礙了未來很多中國特有藥用木本植物活性物質(zhì)開發(fā)的產(chǎn)業(yè)化進(jìn) 程。參考文獻(xiàn)張富捐.銀杏葉活性成分的提取與研究進(jìn)展.許昌師專學(xué)報(bào),2002,21(5) :18-22葉濟(jì)宇，趙海英.完整葉綠體的快速制備及其完整率的測定.植物生理學(xué)通訊， 1982， 1:59-61MarionKugler, Lothar Jansch, Volker Kruft, Udo K. Schmitz, Hans-Peter Braun. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE)。Photosynthesis Research, 1997, 53: 35—44[4]李貝貝，郭進(jìn)魁,周云,張珠珠,張立新.一種分析葉綠體類囊體膜色素蛋白復(fù)合物 的藍(lán)綠溫和膠電泳系統(tǒng).生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2003, 30 (4) :639-643陳云偉，張年輝，趙云，杜林方，MasatoNAKAI.油菜葉綠體被膜的制備和Toc33的 檢測.植物生理學(xué)通訊，2004,40 (2) :223-225。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高得率的富含次生代謝物的藥用木本植物的完整葉 綠體的提取方法，以克服該種植物葉綠體提取困難、得率不高和葉綠體完整度不高的缺 陷，從而建立一種得率高于80%的藥用木本植物完整葉綠體的提取方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
一種銀杏葉片完整葉綠體提取技術(shù)，包括以下步驟
1)選用發(fā)育成熟的銀杏葉片作為提取材料；
2)Percoll梯度液的制備將Percoll和2X葉綠體懸浮液按等體積混合均勻，并用 垂直轉(zhuǎn)子經(jīng)38000g，4°C離心45min制造其梯度，放于4°C備用；所說的葉綠體懸浮液的 組成為20mM Tricine-KOH,0.3M 山梨醇，5mM MgCl2 6H20, 2.5mM EDTA-Na2 ；
3)將葉片剪碎，在葉綠體粗提液中勻漿，勻漿后過濾；
4)濾液經(jīng)2070g，4°C離心2min，沉淀即葉綠體粗顆粒；
5)將葉綠體粗顆粒懸浮于葉綠體懸浮液中，并緩慢的加入步驟2)的Percoll梯度 上，用水平轉(zhuǎn)子經(jīng)13300g，4°C離心lOmin，離心后離心管下部得到墨綠色沉淀；
6)取出離心管中墨綠色沉淀用葉綠體懸浮液通過離心的方式對(duì)其進(jìn)行漂洗， 2070g, 4°C離心2min，重復(fù)3_4次，所得沉淀即為完整葉綠體；
以上步驟2) -6)的所有操作均需在0-4°C。一種優(yōu)選的方案是，上述方法是步驟4)為濾液經(jīng)200&在41離心2min，去 掉沉淀中富含的褐色雜質(zhì)，上清經(jīng)2070g，4°C離心2min，沉淀即葉綠體粗顆粒；
步驟5)為將葉綠體粗顆粒懸浮于葉綠體懸浮液中，并緩慢的將其加入到步驟2) 的Percoll梯度上，用水平轉(zhuǎn)子經(jīng)lOOOOg，4°C離心IOmin ；離心后離心管中下部得到墨綠 色沉淀。本發(fā)明方法中，步驟5)中離心時(shí)加速及下降的級(jí)別優(yōu)選2級(jí)。本發(fā)明方法中，步驟3)中葉片與葉綠體粗提液的質(zhì)量體積比為lg: 6ml。本發(fā)明方法中，步驟5)中含葉綠體粗顆粒的葉綠體懸浮液與Percoll梯度液的 體積比是1:5。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果
本研究以富含次生代謝物的藥用木本植物銀杏葉片為材料，采用離心的方式獲得一 個(gè)連續(xù)的Percoll梯度作為離心介質(zhì)，使得分離介質(zhì)的梯度變得更加均勻，減少更多的雜 質(zhì)停留在葉綠體顆粒中。使銀杏葉片細(xì)胞中大量的次生代謝物與葉綠體分離開來，提高 了葉綠體的分離純度。在提取過程中通過改變離心條件，從而大大提高了其分離純度和完整度。在獲 得葉綠體粗顆粒之前，以200&在41離心2min，以去掉大量的組織碎片和其他細(xì)胞器， 更進(jìn)一步提高了其分離的純度。在密度梯度離心過程中，通過減小轉(zhuǎn)速使完整葉綠體的分離條帶更清晰，從而也使葉綠體的完整度大大提高。通過電鏡結(jié)果顯示，我們提取的 葉綠體完整率達(dá)80%以上，適用于對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等的基 礎(chǔ)研究。


圖1被膜破裂的銀杏葉綠體電鏡圖。圖2被膜完整的銀杏葉綠體電鏡圖。圖3純度和完整率較高的銀杏葉綠體電鏡圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明中的術(shù)語說明如下
Percoll Percoll是經(jīng)過聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrolidone, PVP)處理的硅膠顆粒
混懸液，對(duì)細(xì)胞無毒性和刺激性。Percoll混懸液的硅膠顆粒大小不一，經(jīng)過高速離心 后，可形成一個(gè)連續(xù)密度梯度，將比重不同的細(xì)胞分離純化。本發(fā)明中使用的為購自 Sigma 公司的 Percoll。2X葉綠體懸浮液是指在上述葉綠體懸浮液的基礎(chǔ)上濃度增加一倍，即40mM Tricine-KOH,0.6M 山梨醇，IOmM MgCl2 6H20, 5mMEDTA_Na2。1.材料與方法 1.1材料
發(fā)育成熟銀杏葉片，采自江蘇南京師范大學(xué)仙林校區(qū)。提取溶液和介質(zhì)
葉綠體粗提液20mM Tricine-KOH CpH 8.4)，0.45 M 山梨醇，IOmM NaHCO3, 1 OmM EDTA-Na2，0.1% BSA ；
葉綠體懸浮液20mM Tricine-KOH CpH 7.6) ,0.3M 山梨醇，5mM MgCl26H20, 2.5mM EDTA-Na2;
Percoll梯度液將Percoll和2X葉綠體懸浮液按等體積混合均勻。提取方法
取100-200g葉片在4°C暗處放置1天，耗盡淀粉粒，用去離子水洗凈后擦干，放于 4°C備用。實(shí)驗(yàn)前先配制Percoll梯度液，并用垂直轉(zhuǎn)子經(jīng)38000g，4°C離心45min制造其 梯度，放于4°C備用。將葉片剪碎，在600-1200ml預(yù)冷的葉綠體粗提液中勻漿，勻漿2 次每次2秒，時(shí)間要盡量的短以保證葉綠體的完整率。勻漿后四層紗布加一層尼龍網(wǎng)過 濾。此后分2種方法離心
(1)濾液經(jīng)2070g，4°C離心2min，沉淀即葉綠體粗顆粒。將沉淀懸浮于適量的葉 綠體懸浮液中，以備于Percoll梯度離心。將含葉綠體粗顆粒的葉綠體懸浮液緩慢的加入 到準(zhǔn)備好的Percoll梯度上(體積比為1 5)，用水平轉(zhuǎn)子經(jīng)13300g，4°C離心IOmin (緩 慢加速及下降)，取出離心管下部墨綠色區(qū)域用葉綠體懸浮液通過離心的方式對(duì)上述顆 粒進(jìn)行漂洗，2070g，4°C離心2min，重復(fù)3_4次，所得沉淀即為完整葉綠體。以上所有 操作均需在0-4°C。(2)濾液經(jīng)200&在41離心2min，去掉沉淀，上清經(jīng)2070g，4°C離心2min，沉淀即葉綠體粗顆粒。將沉淀懸浮于適量的葉綠體懸浮液中，以備于Percoll梯度離心。 將含葉綠體粗顆粒的葉綠體懸浮液緩慢的加入到準(zhǔn)備好的Percoll梯度上(體積比為1 : 5)，用水平轉(zhuǎn)子經(jīng)lOOOOg，4°C離心IOmin (緩慢加速及下降)，取出離心管下部墨綠 色區(qū)域用葉綠體懸浮液通過離心的方式對(duì)上述顆粒進(jìn)行漂洗，2070g，4°C離心2min，重 復(fù)3-4次，所得沉淀即為完整葉綠體。以上所有操作均需在0-4°C。完整率的檢測
1.4.1 Hill反應(yīng)速率測定葉綠體完整率
先測定提取的葉綠體的Hill反應(yīng)速率將Hill反應(yīng)液(0.05mol/L Tris 一 HCI (pH7.6), 5mmol/L MgCI2, 10mmol/L NaCI, 10mmol/L K3Fe (CN) 2，10mmol/L NH4CI., 0.66mol/L山梨醇溶液，0.5 mol/LKCI溶液)以1:1的體積與0.66mol/L山梨醇 溶液混合，使之保持0.33mol/L山梨醇濃度，再加入葉綠體(每毫升提取液含葉綠素約 50 μ g)，用氧電極測定放氧速率。再測定漲破葉綠體的Hill反應(yīng)速率將葉綠體溶液與Hill反應(yīng)液混合使葉綠體被 膜在低滲介質(zhì)下漲破，再以1:1的體積比與0.66mol/L山梨醇溶液混合，使測定是同樣保 持0.33mol/L的山梨醇濃度。在相同條件下測定放氧速率。葉綠體完整率按照如下公式計(jì)算
葉綠體完整率(％)=[(漲破葉綠體的放氧速率_完整葉綠體的放氧速率)/漲破的葉綠 體的放氧速率]X 100
1.4.2電子顯微鏡檢測葉綠體純度及完整率
取提取的葉綠體顆粒用4%戊二醛固定結(jié)束后于4°C下保存?zhèn)溆谩９潭╨_2h (4°C) 后用磷酸緩沖液浸洗3次，每次15min,最后裝入磷酸緩沖液中4°C備用。用1%溶化的 瓊脂預(yù)包埋材料，再經(jīng)脫水、樹脂包埋、聚合、切片、染色，最后進(jìn)行電鏡觀察。被膜 破裂的銀杏葉綠體電鏡圖如圖1所示，被膜完整的銀杏葉綠體電鏡圖如圖2所示，純度和 完整率較高的銀杏葉綠體電鏡圖如圖3所示。每次觀察選定20個(gè)視野，每個(gè)視野含葉綠 體大概30個(gè)，記錄完整和破損的葉綠體的數(shù)目，統(tǒng)計(jì)計(jì)算平均值。2結(jié)果與分析 2.1 Hill反應(yīng)測定結(jié)果
用Hill反應(yīng)測定不同的離心方法得到的完整率如表1所示，采用改進(jìn)的方法2得到 葉綠體的完整率達(dá)到83%。表1不同離心方法Hill反應(yīng)測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種銀杏葉片完整葉綠體提取方法，其特征在于，包括以下步驟1)選用發(fā)育成熟的銀杏葉片作為提取材料；2)Percoll梯度液的制備將Percoll和2X葉綠體懸浮液按等體積混合均勻，并用 垂直轉(zhuǎn)子經(jīng)38000g，4°C離心45min制造其梯度，放于4°C備用；所說的葉綠體懸浮液的 組成為20mM Tricine-KOH,0.3M 山梨醇，5mM MgCl2 6H20, 2.5mM EDTA-Na2;3)將葉片剪碎，在葉綠體粗提液中勻漿，勻漿后過濾；4)濾液經(jīng)2070g，4°C離心2min，沉淀即葉綠體粗顆粒；5)將葉綠體粗顆粒懸浮于葉綠體懸浮液中，并緩慢的加入步驟2)的Percoll梯度 上，用水平轉(zhuǎn)子經(jīng)13300g，4°C離心lOmin，離心后離心管下部有墨綠色沉淀；6)取出離心管中墨綠色沉淀用葉綠體懸浮液通過離心的方式對(duì)其進(jìn)行漂洗， 2070g, 4°C離心2min，重復(fù)3_4次，所得沉淀即為完整葉綠體；以上步驟2)-6)的操作均需在0-4°C進(jìn)行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的銀杏葉片完整葉綠體提取方法，其特征在于，步驟4)為 濾液經(jīng)200&在41離心2min，去掉沉淀中富含的褐色雜質(zhì)，上清經(jīng)2070g，4°C離心 2min,沉淀即葉綠體粗顆粒；步驟5)為將葉綠體粗顆粒懸浮于葉綠體懸浮液中，并緩慢的將其加入到步驟2) 的Percoll梯度上，用水平轉(zhuǎn)子經(jīng)lOOOOg，4°C離心IOmin ；離心后離心管下部得到墨綠色 沉淀。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的銀杏葉片完整葉綠體提取方法，其特征在于，步驟3)中葉 片與葉綠體粗提液的質(zhì)量體積比為Ig 6ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的銀杏葉片完整葉綠體提取方法，其特征在于，步驟5)中含 葉綠體粗顆粒的葉綠體懸浮液與Percoll梯度液的體積比是1 5。
全文摘要
本發(fā)明為一種高得率的富含次生代謝物質(zhì)的藥用木本植物銀杏完整葉綠體提取技術(shù)，屬于生物化學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明方法是采用特定生育期的銀杏葉片，先制得葉綠體粗顆粒，再通過對(duì)Percoll梯度離心，用特定的離心力，獲得葉綠體。本發(fā)明可以有效的增加葉綠體提取的純度和完整度。采用本方法獲得的銀杏葉綠體完整率達(dá)80%以上，且提取的葉綠體當(dāng)中沒有其他雜質(zhì)。該葉綠體顆粒適用于進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等方面的基礎(chǔ)研究。
文檔編號(hào)C12N9/00GK102021150SQ20101055772
公開日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月24日
發(fā)明者陳國祥, 魏曉東 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)