專利名稱：一種利用血清痕量基因組dna進行hla基因分型的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種以血清為樣本，利用血清痕量基因組DNA進行HLA基因分型的方 法，特別涉及應用序列特異性引物聚合酶鏈式反應(SSP-PCR)從血清痕量基因組DNA中進 行人類白細胞抗原I類分子(HLA-I)HLA-A2、All和A24基因分型的方法。
背景技術：
人類白細胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)基因是位于人類第6號染色體 短臂上的一組緊密連鎖的基因群。這些基因編碼產(chǎn)物不但決定著宿主的組織相容性，而且 參與宿主的免疫應答和免疫調(diào)節(jié)。如，直接影響乙型肝炎病毒(HBV)感染患者的感染類型寸。傳統(tǒng)HLA抗原分型方法是微量淋巴細胞毒試驗，其誤差率較高，而且成本昂貴，需 要昂貴的流式細胞儀等專門儀器和特異性抗體而限制其應用。因個體HLA遺傳學差異的本 質(zhì)是在編碼其抗原產(chǎn)物的基因水平上，所以HLA基因分型是HLA抗原分型最準確的方法。 目前常用的有3種(1)序列特異性引物(PCR-SSP)分型；(2)序列特異性寡核苷酸探針 (PCR-SSOP)分型；(3)測序分型。但是這三種基因分型方法均需要受試者新鮮抗凝全血作為檢測樣本，或者從受試 者分離出來的外周血單個核細胞(PBMC)中提取獲得，樣本較難獲得和保存。而相比而言， 血清是相對容易獲得的標本，但血清中基因組DNA含量非常低，作為檢測分型的樣本，有很 大的技術難度，對靈敏度和特異性要求相當高。如果能夠克服技術難點，從血清中殘存的痕量基因組DNA中進行PCR為基礎的分 型，將極大增加HLA抗原分型的便利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用血清為樣本，利用血清痕量基因組DNA進行HLA-A 分型的方法。本發(fā)明提供了一種從血清提取痕量DNA，運用巢式PCR方法進行HLA-A2，All, A24 基因型分型的方法。本發(fā)明的技術方案如下一種以血清為樣本進行HLA基因分型的方法，其特征是將血清裂解釋放DNA，乙 醇沉淀提取DNA，應用序列特異性引物巢式PCR方法擴增出HLA基因外顯子2和外顯子3的 DNA序列進行HLA基因分型；其中，外引物具有SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的核苷酸 序列，內(nèi)引物具有SEQ ID NO :3 NO :8所示的核苷酸序列；且在PCR反應時，加入Pfu DNA 聚合酶和普通Taq DNA聚合酶。所述裂解可采用少量血清用異硫氰酸胍/LiC12裂解釋放DNA ；所述擴增前，調(diào)整內(nèi)外引物的濃度，能夠克服低模板對擴增效率帶來的不利影響， 用少量血清(100 μ 1)中殘留的痕量基因組DNA就可以實現(xiàn)HLA-A分型的目的。第一輪內(nèi)外引物濃度5倍稀釋，終濃度為20nmol/L ；第二輪內(nèi)外引物濃度不稀釋，終濃度為IOOnmol/
L0為達到更好的效果，本發(fā)明在PCR反應液體系預先加入橙黃G，可免除常規(guī)電泳時 另外加上樣緩沖液的步驟，對PCR反應無任何干擾，使得對PCR產(chǎn)物的鑒定簡便省時。在PCR反應體系中以體積比1 10混合加入Pfu DNA聚合酶和普通Taq DNA聚 合酶，既提高了擴增的特異性，降低了錯配率，又顯著降低了成本(Pfu/Taq酶混合物的成 本約為進口高保真耐熱DNA耐合酶的1/10，而反應效率基本一致)。本發(fā)明在HLA-A基因內(nèi)含子區(qū)設計了通用的第一輪引物，然后利用HLA-A基因型 間不同單核苷酸多態(tài)性設計不同的3’末端特異性引物，不同的基因型設計不同長度的PCR 產(chǎn)物片段，并且把個別HLA-A基因型放在同一 PCR管中進行分型，然后利用瓊脂糖凝膠電泳 分析不同的基因型。本發(fā)明的有益效果是1、靈敏度高樣本用量少，僅100 μ 1血清便可獲得HLA-A型特異性的目的片段。2、準確率高體系中加入Pfu DNA聚合酶與普通Taq酶，既能達到校正功能，又可 減少成本，可進一步降低錯配率。1)經(jīng)與PCR產(chǎn)物直接測序法(金標準)比較，符合率達到98. (見實施例2)， 而傳統(tǒng)的血清學流式分型方法與PCR產(chǎn)物直接測序法(金標準)比較，符合率為91. 1%。2)和傳統(tǒng)血清型 HLA 低分辨率分型(Hurley CK, et al. The relationship betweenHLA-B45 and B*5002 in the five major U. S. population groups[J]. Tissue Antigens, 2000, 55 (4) =352-358)相比，本發(fā)明的分型方法錯配率小于2%。3、減少了操作步驟PCR反應液中直接加入橙黃G，PCR產(chǎn)物直接電泳即可，省去常 規(guī)電泳樣品另外加上樣緩沖液的步驟，省時。4、成本低病毒提取和PCR反應所需主要試劑可采用國產(chǎn)試劑，檢測成本降低，易 于在臨床及實驗室開展。


圖1是HLA_A2、A11、A24三種基因型擴增結果；圖2是不同診斷的乙型肝炎患者HLA-A純合與雜合比較。
具體實施例方式實施例1 巢式PCR技術擴增血清中HLA-A2、All和A24基因進行基因型分型擴增引物設計從GenBank中選取114條包含HLA-A基因外顯子2和外顯子3的 序列，主要包括中國人特有的HLA-Al 1，HLA-A2和HLA-A24基因序列，用Vector NTI軟件進 行比對分析HLA-A基因序列在內(nèi)含子1和內(nèi)含子3中設計第一輪PCR通用引物如下第一 輪產(chǎn)物片段長度為646bp，包含外顯子2和外顯子3的全部序列；第二輪根據(jù)外顯子中不同 基因型間不同的SNP設計特異性的上下游引物，引物擴增不同長度的PCR片段來區(qū)分HLA-A 的基因型，由于A2和A24PCR產(chǎn)物差別在IOObp以上能夠在瓊脂糖凝膠電泳上很好的分離 開，所以我們把A2和A24放在同一 PCR管中，更好的節(jié)約了成本和時間，大大提高了檢測效 率。
SEQ ID NO 1 8分別對應外弓|物上游、下游和內(nèi)弓丨物上游、下游，見表1。表1擴增HLA-A基因用于基因型分型所設計的內(nèi)外引物及位置 以下所用的實驗材料，如Pfu DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶均為北京天恩澤基因 科技有限公司產(chǎn)品。病毒DNA提取試劑盒北京天恩澤基因公司生產(chǎn)的病毒DNAout，從患 者血清中提取病毒DNA模板。第一輪PCR反應(總體系25 μ L)1、HLA-A基因擴增片段646bp
2 XMix Buffer (預加 0. 3%橙黃 G)12. 5μ L
1 5 稀釋的 TTup2(10ymol/L)0. 25 μ L
1 5 稀釋的 TTdown2(10ymol/L)0. 25 μ L
Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 50 μ L
Pfu DNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 05 μ L
14. 0μ L
模板DNAll.OyL
說明
1、巢式PCR第一輪反應時，25 μ L標準反應體系中，外引物濃度配置成IOymol/ L的儲存液，用水稀釋5倍后取0. 25 μ L加入25 μ L反應體系中，使引物終濃度調(diào)整至 20nmol/L。2、為提高反應特異性，體系中加入普通Taq DNA聚合酶(終濃度達到0. IU/μ L) 的同時按照10 1的比例加入Pfu DNA聚合酶(終濃度達到0. OlU/ μ L)。3、第一輪PCR反應參數(shù)94"C 5min 預變性，94"C 15s，62°C 15s，72°C 30s 30 個循環(huán)，72°C 5min，68°C 5min 最后降到 4°C。第二輪PCR反應(總體系25 μ L)將第一輪PCR產(chǎn)物分別分到兩管中進行HLA-A基因型分型管1 :HLA-A2 和 A24 基因擴增片段487bp 和 371bp2 X Mix Buffer (預加 0. 3% 橙黃 G)12. 5μ LH2O5. 5μ LA2up2+A24up2 (10 μ mol/L)各 0· 25 μ LA2down2+A24down3 (10 μ mol/L)各 0· 25 μ LTaqDNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 50 μ LPfu DNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 05 μ L_20. 0μ L模板DNA (第一輪 PCR 產(chǎn)物)5· 0 μ L管2 =HLA-All基因擴增片段414bp2 X Mix Buffer (預加 0· 3% 橙黃 G)12. 5μ LH2O5. 5μ LAllup2(10ymol/L)0. 25 μ LAlldown2(10ymol/L)0. 25 μ LTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 50 μ LPfu DNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 05 μ L_20. 0μ L模板DNA (第一輪 PCR 產(chǎn)物)5· 0 μ L說明1、巢式PCR第一輪25 μ L產(chǎn)物取5 μ L作為第二輪PCR的模板，第二輪PCR引物濃 度配置成 ο μ mol/L的儲存液，取0. 5 μ L加入25 μ L體系中，使終濃度為200nmol/L。2、第二輪 PCR 反應參數(shù)94°C 3min 預變性，94°C 10s，60°C 10s，72°C 20s 35 個循 環(huán)，72°C 5min，68°C 5min 最后降到 4°C。取5 μ L PCR終產(chǎn)物，用2 %瓊脂糖凝膠進行電泳。結果見圖1，經(jīng)兩輪巢式PCR可以成功利用PCR產(chǎn)物片段的大小經(jīng)電泳分辨出 HLA-A 的三種基因型HLA-A2、A11、A24。
實施例2巢式PCR檢測HBV感染患者血清中HLA-A基因分型對2005年-2007年到解放軍第302醫(yī)院就診的709例乙型肝炎患者血清樣本進 行血清痕量PCR分析HLA-A基因型，分析結果如下病例乙型肝炎診斷標準符合2000年西安病毒性肝炎診斷標準中華醫(yī)學會感染 病和寄生蟲病學會；中華肝臟并學會病毒性肝炎診斷和治療標準.中華肝臟病雜志2000 ； 6 =324-329.，709例患者中急性乙型肝炎患者(AHB) 294例，慢性肝炎患者(CHB) 286例，慢 性重型肝炎患者(ACLF) 129例；男女分別為240/54、252/34和106/23例，平均年齡分別為 36. 35士 12. 39,39. 92士 12. 69 和 45. 88士 12. 10 歲。HBeAg 陽性率分別為 25. 7%,59. 0%禾口 35. 4%，轉氨酶(ALT)水平分別為 1328(20,7932)、297. 0(13，2924)和 182. 5 (12，3773) IU/ L，HBV DNA 載量(10 為底對數(shù)值)3. 87士 1.39、6. 06士 1.44 和 5. 98士4. 811og 拷貝 /mL，此 項檢測獲得解放軍302醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準。操作方法過程實驗方法第一輪PCR反應(總體系25 μ L)1、HLA-A 基因擴增片段646bp2 X Mix Buffer (預加 0. 3% 橙黃 G)12. 5μ L1 5 稀釋的 TTup2(10ymol/L)0. 25 μ L1 5 稀釋的 TTdown2(10ymol/L)0. 25 μ LTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 50 μ LPfu DNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 05 μ L_14. 0μ L模板DNAll.OyL第一輪PCR反應參數(shù)94°C 5min 預變性，94"C 15s，62°C 15s，72°C 30s 30 個循環(huán)，72°C 5min，68°C 5min 最后降到 4°C。第二輪PCR反應(總體系25 μ L)將第一輪PCR產(chǎn)物分別分到兩管中進行HLA-A基因型分型管1 :HLA-A2 和 A24 基因擴增片段487bp 和 371bp2 X Mix Buffer (預加 0. 3% 橙黃 G)12. 5μ LΗ205· 5 μ LA2up2+A24up2 (10 μ mol/L)各 0· 25 μ LA2down2+A24down3 (10 μ mol/L)各 0· 25 μ LTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 50 μ LPfu DNA 聚合酶(5U/μ L)0. 05 μ L_20. 0μ L模板DNA (第一輪 PCR 產(chǎn)物)5· 0 μ L
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管2 =HLA-All基因擴增片段414bp2 X Mix Buffer (預加 0. 3% 橙黃 G)12. 5μ LΗ205. 5μ LAllup2(10ymol/L)0. 25 μ LAlldown2(10ymol/L)0. 25 μ LTaq DNA 聚合酶(5U/μ L)0. 50 μ LPfu DNA 聚合酶(5U/μ L)0. 05 μ L_20. 0μ L模板DNA (第一輪 PCR 產(chǎn)物)5· 0 μ L第二輪PCR 反應參數(shù)94°C 3min 預變性，94°C 10s，60°C 10s，72°C 20s35 個循環(huán)， 72°C 5min，68°C 5min 最后降到 4°C。結果不同診斷HLA-A基因分型及其基因型純合雜合分析按照臨床不同的診斷 標準將709例乙型肝炎患者分為3組急性肝炎(AHB)、慢性肝炎(CHB)和慢性重型肝炎 (ACLF)。對應每組HLA-A02、All和A24以及其雜合/純和檢出率如表2。表2 709例乙型肝炎患者HLA-A基因分型以及雜合/純和分析 結果提示該方法靈敏度高，檢出陽性率為91. 4%;所得樣品PCR產(chǎn)物中有260例 (占總樣本的36%)進行測序驗證，其中有5例和電泳分型不一致，準確率達98. 1%。統(tǒng) 計結果顯示①隨著病毒性乙型肝炎診斷的加重，患者中HLA-All等位基因的比率不斷降 低且有統(tǒng)計學意義(P = 0.001)；②同時我們發(fā)現(xiàn)急性乙型肝炎(AHB)患者中HLA-A2、A11 和A243個等位基因雜合的比率要高于乙型肝炎慢性化(CHB和ACLF)的患者，而且有統(tǒng)計 學意義(P = O. 009)(如圖2)。
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總之，本發(fā)明從血清中提取殘存的痕量人類基因組DNA運用改良的SSP-PCR方法 進行HLA-A基因型分型，具有靈敏度高，準確性好，成本低等特點，對目前的HLA-A基因分型 技術提供新的補充和選擇。
權利要求
一種以血清為樣本進行HLA基因分型的方法，其特征是將血清裂解釋放DNA，乙醇沉淀提取DNA，應用序列特異性引物巢式PCR方法擴增出HLA基因外顯子2和外顯子3的DNA序列進行HLA基因分型；其中，外引物具有SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列，內(nèi)引物具有SEQ ID NO3～NO8所示的核苷酸序列；且在PCR反應時，加入Pfu DNA聚合酶和普通Taq DNA聚合酶。
2.權利要求1所述的方法，所述裂解是少量血清用異硫氰酸胍/LiC12裂解釋放DNA。
3.權利要求1所述的方法，所述基因擴增前，調(diào)整內(nèi)外引物的濃度，第一輪內(nèi)外引物濃 度5倍稀釋，終濃度為20nmol/L ；第二輪內(nèi)外引物濃度不稀釋，終濃度為lOOnmol/L。
4.權利要求1所述的方法，所用的PfuDNA聚合酶與普通Taq DNA聚合酶的體積比是 1 10。
5.權利要求1所述的方法，在PCR反應之前，在反應體系中預先加入橙黃G。全文摘要
一種以血清為樣本，利用血清痕量基因組DNA進行HLA基因分型的方法。采用少量血清裂解提取DNA，設計特異性引物運用巢式PCR技術，經(jīng)兩輪巢式PCR可以成功利用PCR產(chǎn)物片段的大小經(jīng)電泳分辨出HLA-A的三種基因型。本發(fā)明以血清為分析樣本，極大增加了HLA抗原分型的便利。
文檔編號C12Q1/68GK101914622SQ20101025876
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月19日 優(yōu)先權日2010年8月19日
發(fā)明者劉妍, 徐東平, 戴久增, 李曉東, 王琳, 王耀, 許智慧, 鐘彥偉 申請人:中國人民解放軍第三〇二醫(yī)院