專利名稱：大豆耐低磷基因GmAPt的分子標記方法
技術領域：
本發(fā)明提供了大豆耐低磷基因GmAPt的分子標記方法，屬于分子遺傳學領域，可 用于大豆耐低磷分子標記輔助選擇育種和種質的分型鑒定。
背景技術：
大豆是我國重要的糧食作物和油料作物。然而，三分之二的耕地缺磷是限制我國 大豆生產(chǎn)的主要因素。因此，發(fā)掘大豆自身潛力，高效利用土壤潛在磷素資源是解決大豆缺 磷的有效途徑。盡管大豆磷效率的研究也已取得了一些進展，但在磷高效基因型的篩選上存在很 大的困難，主要是因為篩選指標和篩選時期的難以確定。為了加快大豆耐低磷脅迫育種進 程，十分關鍵的問題是大豆種質耐低磷特性的準確鑒定，育種學家通常通過田間篩選的方 法來鑒定大豆種質的耐低磷特性，然而，這些方法在對大的群體進行選擇時，尤其對于磷效 率這樣數(shù)量性狀具有一定的局限性。例如，數(shù)量性狀受環(huán)境的影響很大，一兩次的鑒定結果 難以準確可靠，多年多點鑒定又費時費力。因此，如何準確、快速、簡單地對耐低磷性進行鑒 定一直是大豆耐低磷育種的難題之一。近年來，隨著分子標記技術的發(fā)展，許多的研究者利用與磷效率QTL連鎖的標記 對耐低磷種質進行輔助選擇，這種方法在一定的程度上提高了選擇的速度，且操作簡單，但 是這些標記都是大豆磷效率基因的連鎖標記，因此準確性一般較低?；诖蠖鼓偷土谆虮旧黹_發(fā)的功能分子標記可以克服以上缺點，Zhang等利用 連鎖分析和關聯(lián)分析相結合的方法對控制磷效率基因進行精細定位，發(fā)現(xiàn)并圖位克隆了存 在于第八染色體上的一個控制磷效率的主效基因(GmAPt)，將該基因在184分大豆材料中 進行測序分析，發(fā)現(xiàn)在GmAPt基因第一內含子存在等位基因，即與不耐低磷的材料相比，耐 低磷材料在第一內含子存在著IObp的缺失。

發(fā)明內容
技術問題本發(fā)明針對上述的情況，利用大豆GmAPt基因不同材料間在第一內含 子上存在著IObp的差異，獲得了 GmAPt基因的一個基因標記Indel_S170，利用這個標記進 行大豆耐低磷種質的分型鑒定可以保證92. 9%以上的準確率。技術方案鑒定大豆耐低磷基因GmAPt的基因標記引物為，InDel_S170 正向引物序列CTTGAGATCACTACAACACACCInDel_S170 反向引物序列GATAGAAGAAC AACACAAAAAC上述引物用于鑒定大豆耐低磷基因GmAPt的基因標記方法為1、大豆材料基因組DNA的提??；2、對大豆基因組DNA進行PCR擴增；PCR 擴增反應體系為EXTaqXMaster PCR Mix 5 μ L, Primer (3pmol/L) 2. 0 μ L,模板DNA (約15ng/y L)2y L，滅菌雙蒸水IyL ；反應總量10 μ L. PCR反應在MJResearch PTC-200熱循環(huán)儀上進行，反應程序包括94°C預變性5min，每個循環(huán)95°C變性30s，55°C退 火30s，72°C延伸30s，共30個循環(huán)，最后72°C延伸7min，12°C保存。3、反應產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，用硝酸銀染色。電泳結果如果有 302bp的單條譜帶，則為耐低磷材料；如果有312bp單條譜帶，則為不耐低磷大豆材料。有益效果本發(fā)明利用分子遺傳學及分子生物學的方法獲得一個大豆耐低磷基因 GmAPt的功能分子標記Indel_S170，該標記的優(yōu)點具體歸納如下(1)分型和鑒定新的大豆耐低磷材料，不僅可以進一步研究耐低磷的分子和遺傳 機制，同時也可以拓寬耐低磷育種的遺傳背景，選育出高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、耐逆性強的優(yōu)質大豆品 種。而傳統(tǒng)的鑒定方法不僅工作量大而且花費的周期長，利用本發(fā)明的標記可以簡單快速 的鑒定大豆材料的耐低磷特性。(2)本發(fā)明所獲得的基因標記是依據(jù)GmAPt基因內部產(chǎn)生的堿基缺失，因此不存 在遺傳的交換，也不需要表型的進一步驗證。(3)育種中一些耐低磷相關性狀的調查必須將植株收獲或對植株造成傷害才能進 行(例如，測定生物量、磷含量、酶活性等)，而利用本發(fā)明的標記可在任何時期通過SSR標 記判斷其耐低磷性，為有效選育耐低磷大豆品種提供了技術。
四

圖1大豆耐低磷基因GmAPt在不同磷效率特性材料中第一內含子的序列比對圖 2Indel_S170對供試14份材料的電泳檢測圖
五具體實施例方式(1)供試材料試驗材料包括14份材料(表1，均由國家大豆改良中心對外提供)來自不同文獻 報道過的大豆耐低磷特性種質(劉瑩等，2007 ；崔世友等，2007 ；丁玉川等，2006)，包括6份 耐低磷種質，7份不耐低磷種質和1份中等耐性種質。表1 14份不同耐低磷相關材料
編號材料耐磷特性編號材料耐磷特性11138-2耐8波高不耐2句容大扁豆不耐9汶上滾龍珠中等3夏邑太平紫花耐1094-156耐4渦陽黑豆不耐11科豐耐5寧海晚黃豆不耐12晉_& 4號不耐6新昌六月豆耐13滿倉金不耐7蘇協(xié)1號不耐14惠民鐵竹竿耐(2) Indel S170 標記的獲得根據(jù)GmAPt基因序列內部一個的IObp缺失位點，設計了一對Indel標記引物，上 游引物為 5，-CTTGAGATCACTACAACACACC-3，，下游引物為 5，-GATAGAAGAAC AACACAAAAAC-3，
(3) DNA 的提取以苗期新鮮葉片為材料，采用CTAB法提取DNA，詳細步驟如下1)取大豆嫩葉3-5克左右，在液氮中研成粉末，倒入保溫的CTAB提取緩沖液中，65°C水浴30_60min，其間輕搖3_5次；2)加等體積的氯仿異戊醇(24 1)溶液，并充分搖勻，放在搖床上輕搖Ih ；3)經(jīng)5000rpm離心15min，將上清夜轉入一個新的離心管中；4)加入IOml冰凍的異丙醇，上下?lián)u勻；5)離心倒掉液體，加入1. 5-3mlHS-TE緩沖液，待完全溶解后，等體積氯仿異戊醇 再抽提一次；6)經(jīng)8000rpm離心5min，吸取上清液轉到另一個新的離心管中；7)用三倍體積的冰凍無水乙醇，在_20°C下靜置20min以沉淀DNA ；8) IOOOOrpm 離心 5min，棄去上清夜；9) 70%乙醇清洗兩次，真空干燥機上吹干；10)將DNA溶于TE中，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。置于_20°C待用。(4) PCR反應及電泳檢測PCR 擴增反應體系為EXTaqXMaster PCR Mix 5 μ L, Primer (3pmol/L) 2. 0 μ L, 模板DNA (約15ng/yL)2yL，滅菌雙蒸水IyL ；反應總量IOyL. PCR反應在MJResearch PTC-200熱循環(huán)儀上進行，反應程序包括94°C預變性5min，每個循環(huán)95°C變性30s，55°C退 火30s，72°C延伸30s，共30個循環(huán)，最后72°C延伸7min，12°C保存。反應產(chǎn)物在8%非變性 聚丙烯酰胺凝膠上電泳，用硝酸銀染色。(5)電泳結果分析利用Indel_S170對14份供試材料進行基因型檢測。第一內含子缺失的耐低磷材 料能擴增出302bp的DNA條帶，而第一內含子不缺失的不耐低磷材料能擴增出312bp的DNA 條帶，在供試材料中中等耐性的一個材料擴出312bp的DNA條帶(圖2)。圖2中泳道編號 與表2材料編號對應。從結果可以得出，Indel_S170標記可用于分型和鑒定新的大豆耐低磷材料，并 且用于對前人通過常規(guī)方法篩選的不同磷效率特性的大豆種質進行驗證，正確率達到了 92.9%。這較之常規(guī)的篩選方法省時，省力，節(jié)省成本，并具有很高的可靠性。這為以后大 豆磷高效基因型種質鑒定和大豆磷高效育種分子標記輔助選擇提供了新的材料和技術。
權利要求
大豆耐低磷基因GmAPt的分子標記引物，其序列為，Indel SSR正向引物序列CTTGAGATCACTACAACACACCIndel SSR正向引物序列GATAGAAGAACAACACAAAAAC；
2.權利要求1所述引物用于鑒定大豆耐低磷基因GmAPt的分子標記方法，包括(1)大豆材料基因組DNA的提取；(2)對大豆基因組DNA進行PCR擴增；PCR 擴增反應體系為EXTaqXMaster PCR Mix 5μ L,3pmol/L Primer2. 0 μ L, 15ng/ μ L模板DNA2 μ L，滅菌雙蒸水1 μ L ；反應總量10 μ L. PCR反應在MJ ResearchPTC-200熱循 環(huán)儀上進行，反應程序包括94°C預變性5min，每個循環(huán)95°C變性30s，55°C退火30s，72°C 延伸30s，共30個循環(huán)，最后72°C延伸7min，12°C保存；(3)反應產(chǎn)物在質量比8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，用硝酸銀染色，電泳結果如 果有302bp的單條譜帶，則為含大豆耐低磷基因GmAPt的耐低磷材料；如果有312bp單條譜 帶，則為不含大豆耐低磷基因GmAPt的大豆材料。
全文摘要
本發(fā)明涉及大豆耐低磷基因GmAPt的分子標記方法，屬于分子遺傳學領域。利用大豆耐低磷基因GmAPt在大豆耐低磷材料中與不耐低磷材料中在第一內含子存在10bp的缺失，設計合成了標記Indel_S170，由于這個標記為基因本身的標記，因此和耐低磷基因GmAPt及其等位基因表現(xiàn)為共分離。利用該標記能夠準確快速的鑒定大豆種質資源的耐低磷性，大大提高大豆耐低磷材料的選擇效率和分型鑒定效率，加速大豆耐低磷分子標記輔助選擇育種進程。
文檔編號C12N15/11GK101921758SQ20101025852
公開日2010年12月22日 申請日期2010年8月20日 優(yōu)先權日2010年8月20日
發(fā)明者喻德躍, 張丹, 程浩 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學