專(zhuān)利名稱(chēng)：一種低載量乙型肝炎病毒全基因組克隆的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種低載量乙型肝炎病毒全基因組克隆的方法，特別是涉及采用兩個(gè) 片段連接法進(jìn)行低載量乙型肝炎病毒全基因組的克隆。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(以下亦稱(chēng)HBV)全基因組克隆對(duì)于研究HBV病毒學(xué)特點(diǎn)及生物學(xué) 特性具有重要的臨床意義。由于HBV全基因組是一個(gè)雙鏈非閉合的松弛結(jié)構(gòu)，兩鏈不等長(zhǎng)，加上基因組長(zhǎng)度 為3. 2kb，增加了 HBV全基因組擴(kuò)增和克隆的困難，直到1995年美國(guó)學(xué)者Gimther等才成功 進(jìn)行HBV全基因擴(kuò)增。但該方法要求HBV病毒載量不能低于105COpieS/ml，而低載量很難 得到 PCR 產(chǎn)物Gunther S, Li B, Miska S, et al. J Virol, 1995,69 5437-44.。目前隨著抗HBV藥物的廣泛應(yīng)用，患者體內(nèi)HBV載量往往維持在較低水平復(fù)制，若 想研究這些藥物壓力下HBV的生物學(xué)特點(diǎn)，必須要有靈敏度高、特異性強(qiáng)的低載量HBV全基 因組克隆的方法。有學(xué)者建立了一種兩個(gè)片段分別克隆HBV序列分別測(cè)序獲得全序列信息 的方法(未獲得全基因組克隆)，低于IO5拷貝/mL載量也可檢出，但有可能不是同一病毒的 克隆序列，沒(méi)有生物學(xué)活性。盧建溪，李莉等廣東醫(yī)學(xué)2008，29 (7) 1095-7還有一些HBV 全基因擴(kuò)增方法是Gimther方法的改進(jìn)型方法李瑞，閆永平等第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)2002， 23 (6) :572-3，也不能有效提高低載量HBV全基因擴(kuò)增的檢出率。對(duì)于低載量HBV全基因組研究大多限于某一基因片段的研究，通過(guò)PCR擴(kuò)增個(gè)體 內(nèi)HBV基因群中的某些亞基因片段，然后直接測(cè)序，可在模板量較低的條件下得到亞基因 片段擴(kuò)增產(chǎn)物，但由于HBV基因內(nèi)部有調(diào)控基因，基因片段間又相互重疊，很可能形成HBV 不同基因群片段構(gòu)成一個(gè)可供分析的HBV基因片段，使出現(xiàn)在單個(gè)基因分子上的突變復(fù)雜 性及致病和傳播的關(guān)系無(wú)法精確和全面分析。有研究發(fā)現(xiàn)，由于病毒體內(nèi)存在不同變異株， 這種直接測(cè)部分序列的方法不能準(zhǔn)確的提示病毒基因結(jié)構(gòu)與病因及傳播的關(guān)系。采取普通的PCR方法擴(kuò)增兩個(gè)片段，對(duì)于低載量HBV DNA的擴(kuò)增效果并不理想，特 異性不強(qiáng)，且其采用兩次克隆步驟，增加了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜程度和成本預(yù)算。如果能夠研發(fā)一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)單方便的低載量HBV全基因組克隆的 方法，從患者低載量血清中擴(kuò)增并克隆HBV全基因組序列，將有助于體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)HBV復(fù)制 力、HBV基因突變特征和頻率、HBV體外感染力，對(duì)于監(jiān)控抗病毒療效及深入闡明HBV生物學(xué) 活性具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種在低載量乙型肝炎病毒情況下，對(duì)HBV全基因組克隆的 有效方法。本發(fā)明的主要手段和方法是一種低載量乙型肝炎病毒全基因組克隆的方法，采用特異性引物將血清中提取的HBVDNA進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出HBV病毒的CP-S區(qū)和RT-X區(qū)兩個(gè)片段，分別進(jìn)行酶切 后，將二者連接成完整的HBV全基因組，再以連接產(chǎn)物為模板用PCR方法擴(kuò)增HBV全基因組 后，進(jìn)行克?。凰鎏禺愋砸锏男蛄腥缦耂EQ ID NO :1 SEQ ID NO 2 是 CP-S 區(qū)的外引物序列；SEQ ID NO :3 SEQ ID NO 4 是 RT-X 區(qū)的外引物序列；SEQ ID NO :5 SEQ ID NO 6 是 CP-S 區(qū)的內(nèi)引物序列；SEQ ID NO :7 SEQ ID NO :8 是 RT-X 的內(nèi)引物序列。以3215個(gè)核苷酸長(zhǎng)的環(huán)狀HBV基因組的EcoRI酶切位點(diǎn)計(jì)為第1位核苷酸(nt 1)，從核心啟動(dòng)子區(qū)起始到S區(qū)終止即CP-S區(qū)(nt 1777-nt 274)，另一條是從逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū) 起始到X區(qū)終止即RT-X區(qū)(nt 3194-nt 1797)。調(diào)整巢式PCR時(shí)的內(nèi)外引物的濃度，可提高反應(yīng)的靈敏度，使其能夠進(jìn)行一管式 巢式PCR擴(kuò)增。最佳的引物濃度為外引物終濃度為lOnmol/L ；內(nèi)引物終濃度為200nmol/ L0所述酶切，是擴(kuò)增兩個(gè)片段后，將產(chǎn)物純化后分別使用內(nèi)切酶進(jìn)行酶切；內(nèi)切酶優(yōu) 選使用XbaI。所述連接，是使用連接酶進(jìn)行，優(yōu)選使用T4DNA連接酶。本方法還可采用以下一種或幾種手段進(jìn)行優(yōu)化，可使發(fā)明效果更好或達(dá)到最佳在引物SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :7序列中加入BspQ I酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增全長(zhǎng)以后 便于從載體上獲得完全不含外源序列的HBV全長(zhǎng)基因組。若在PCR反應(yīng)體系中以1 10混合加入Pfu DNA聚合酶和普通Taq DNA聚合酶， 既能提高擴(kuò)增的特異性，又可顯著降低成本。便于在實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。所述用PCR方法擴(kuò)增出兩個(gè)片段時(shí)，采用一管式巢式PCR技術(shù)，可減少污染，提高 產(chǎn)量；且只需經(jīng)過(guò)一次克隆，簡(jiǎn)化了操作步驟。采用本發(fā)明的方法達(dá)到了發(fā)明目的實(shí)驗(yàn)證明，擴(kuò)增出的病毒具有復(fù)制力(見(jiàn)實(shí) 施例2)。本發(fā)明的有益效果是1、靈敏度高可以擴(kuò)增得到初始DNA模板濃度IO3 IO4拷貝/mL樣本。通過(guò)調(diào)整 巢式PCR時(shí)的內(nèi)外引物的濃度和全基因組擴(kuò)增的反應(yīng)條件，可提高反應(yīng)的靈敏度，達(dá)到IO3 拷貝/mL(比國(guó)際公認(rèn)的Gimther方法提高2個(gè)數(shù)量級(jí))。2、特異性強(qiáng)通過(guò)對(duì)引物的選擇和反應(yīng)體系的優(yōu)化，使特異性顯著提高，PCR反應(yīng) 的假突變發(fā)生機(jī)率控制在1/10萬(wàn)以下。3、操作簡(jiǎn)便使用一管式巢式PCR技術(shù)擴(kuò)增兩個(gè)片段，可減少污染，提高產(chǎn)量；并 只經(jīng)過(guò)一次克隆，簡(jiǎn)化了操作步驟。4、成本低主要試劑可采用國(guó)產(chǎn)試劑，價(jià)格便宜，易于在實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。如Pfu/Taq 酶混合物的成本約為進(jìn)口高保真耐熱DNA耐合酶的1/10，而反應(yīng)效果相同。


圖1是HBV DNA CP-S區(qū)的擴(kuò)增結(jié)果1772bp ；
圖2是HBV DNA RT-X區(qū)的擴(kuò)增結(jié)果1814bp ；圖3是兩個(gè)片段連接后全基因組擴(kuò)增結(jié)果3215bp ；圖4是兩片段法擴(kuò)增得到的全序列克隆轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞72小時(shí)后培養(yǎng)上清乙肝 表面抗原結(jié)果比較；圖5是兩片段法擴(kuò)增得到的全序列克隆轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞72小時(shí)后細(xì)胞裂解液中 HBVDNA定量結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下所用的主要實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源如下Pfu和Taq DNA聚合酶及病毒DNA提取試劑盒為北京天恩澤基因科技有限公司 產(chǎn)品。內(nèi)切酶XbaI，T4DNA連接酶為NEB公司產(chǎn)品。實(shí)施例1低載量乙型肝炎病毒全基因組克隆擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)從GenBank中選取729條HBV全長(zhǎng)基因組序列，其中中國(guó)人特有的 B和C基因型序列209條，用NTI軟件進(jìn)行比對(duì)分析HBV CP-S區(qū)和RT-X區(qū)保守區(qū)設(shè)計(jì)引 物，全長(zhǎng)引物參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)，并加入酶切位點(diǎn)，有助于下一步的復(fù)制力的分析。表IPCR反應(yīng)使用的引物序列
權(quán)利要求
一種低載量乙型肝炎病毒全基因組克隆的方法，采用特異性引物將血清中提取的乙型肝炎病毒DNA進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)；將擴(kuò)增出乙型肝炎病毒的CP S區(qū)和RT X區(qū)兩個(gè)片段分別進(jìn)行酶切后，將二者連接成完整的病毒全基因組，再以連接產(chǎn)物為模板用PCR方法擴(kuò)增該全基因組后，進(jìn)行克??；所述CP S區(qū)為nt 1777～nt 274，RT X區(qū)為nt 3194～nt 1797；所述特異性引物的序列如下SEQ ID NO1～SEQ ID NO2是CP S區(qū)的外引物序列；SEQ ID NO3～SEQ ID NO4是RT X區(qū)的外引物序列；SEQ ID NO5～SEQ ID NO6是CP S區(qū)的內(nèi)引物序列；SEQ ID NO7～SEQ ID NO8是RT X的內(nèi)引物序列。
2.權(quán)利要求1或2所述的方法，進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)時(shí)，調(diào)整內(nèi)外引物的濃度至外引物 終濃度為lOnmol/L，內(nèi)引物終濃度為200nmol/L。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，所述酶切，是擴(kuò)增兩個(gè)片段后，將產(chǎn)物純化后分別使用 內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。
4.權(quán)利要求3所述的方法，所述內(nèi)切酶是Xbal。
5.權(quán)利要求1或2所述的方法，所述連接，是使用連接酶進(jìn)行。
6.權(quán)利要求5所述的方法，所述連接酶是T4DNA。
7.權(quán)利要求1或2所述的方法，在引物SEQID NO :5和SEQ ID NO :7序列中加入BspQ I酶切位點(diǎn)。
8.權(quán)利要求1或2所述的方法，在PCR反應(yīng)體系中以1 10的體積比混合加入Pfu DNA聚合酶和普通Taq DNA聚合酶。
9.權(quán)利要求1或2所述的方法，用PCR方法擴(kuò)增出兩個(gè)片段時(shí)，采用一管式巢式PCR方法。
全文摘要
一種低載量乙型肝炎病毒全基因組克隆的方法，從患者血清內(nèi)提取HBV DNA，采用巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出HBV的CP-S區(qū)和RT-X區(qū)，使用內(nèi)切酶酶切后連接，再以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增及克隆。該方法用于低載量HBV全基因組的擴(kuò)增、克隆和序列分析，可為進(jìn)一步分析低載量HBV的基礎(chǔ)和臨床研究提供有效幫助。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101948827SQ20101025876
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月19日
發(fā)明者劉妍, 徐東平, 戴久增, 李曉東, 王琳, 王耀, 許智慧, 鐘彥偉 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三〇二醫(yī)院