專利名稱：輔助鑒定甲型h3n2流感病毒耐藥性的探針和引物對(duì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種輔助鑒定甲型H3N2流感病毒耐藥性的探針和引物對(duì)。
背景技術(shù)：
一、甲型流感病毒和人類疾病流感病毒屬于正黏病毒科，分甲、乙、丙三種型別，甲型和乙型流感對(duì)人類威脅較大，其中甲型流感抗原變異頻繁，可引起世界性大流行，對(duì)人類威脅最大。這類病毒所致疾病的臨床表現(xiàn)為起病急、高熱、肌痛、頭痛伴有嚴(yán)重不適、干咳、咽喉痛，嚴(yán)重時(shí)可能導(dǎo)致人死亡，嚴(yán)重威脅人類健康。二、甲型H3N2流感病毒的NA蛋白耐藥突變的檢測(cè)抗流感病毒藥物是治療和緩解流感癥狀的有效措施，但流感病毒易發(fā)生變異，伴隨抗流感病毒藥物的廣泛使用，耐藥病毒株不斷出現(xiàn)。我國(guó)上世紀(jì)末國(guó)內(nèi)流感病毒尚未產(chǎn)生對(duì)烷胺類藥物的耐藥性，但2009年的調(diào)查則顯示高達(dá)100% H3N2亞型已對(duì)烷胺類藥物具有耐藥性，Hmi亞型也接近50%。對(duì)于神經(jīng)氨酸酶抑制劑類的抗流感病毒藥物奧司他韋(商品名達(dá)菲 )，美歐等國(guó)的耐藥性甲型Hmi流感病毒已接近100%，我國(guó)也接近 70%。因此，雖然目前甲型H3N2流感病毒仍對(duì)奧司他韋敏感，但對(duì)甲型H3N2流感病毒的耐藥情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)顯得尤為重要。流感病毒突變的檢測(cè)方法主要有普通RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法等。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(Real-Time RT-PCR)法可通過實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)直接得到檢測(cè)結(jié)果，與普通RT-PCR方法相比，具有更為方便快捷，敏感性高、特異性強(qiáng)和線性檢測(cè)范圍廣等特點(diǎn)， 適用于對(duì)流感病毒進(jìn)行高通量篩選。三、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種PCR技術(shù)，它是在傳統(tǒng)RT-PCR反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上添加了熒光染料或具有熒光標(biāo)記的探針，將熒光信號(hào)強(qiáng)弱與PCR擴(kuò)增情況結(jié)合在一起，通過監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)的變化來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)進(jìn)行的情況。實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，解決了傳統(tǒng)PCR難以對(duì)擴(kuò)增起始模板進(jìn)行定量的難題，避免了傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)樣本消耗量大，實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，檢測(cè)靈敏度低等缺點(diǎn)，并具有快速、避免交叉污染等特點(diǎn)，可以在基因檢測(cè)、基因表達(dá)、SNP分析等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。Taqman _MGB探針是一類長(zhǎng)度更為短小的Taqman探針，可檢測(cè)單個(gè)核苷酸突變。 增加了檢測(cè)的特異性和結(jié)果的可靠性，是一種方便、快捷、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法，尤其適用于科研、臨床和病毒流行病學(xué)監(jiān)測(cè)等工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種輔助鑒定甲型H3N2流感病毒耐藥性的探針和引物對(duì)。本發(fā)明提供了一種輔助鑒定甲型H3N2流感病毒耐藥性(檢測(cè)針對(duì)甲型H3N2流感病毒的NA蛋白上自氨基末端第292位氨基酸突變)的試劑，由探針和特異引物對(duì)組成；探針的核苷酸序列如序列表的序列1所示(R^^K-P)；特異引物對(duì)為序列表的序列2所示 DNA(R292K-F)和序列表的序列3所示DNA 0^91-R)組成的引物對(duì)。甲型H3N2流感病毒的 NA 蛋白見 GENBANK ACCESS IONG NO. ABY25771. 1 (GI :162956720)。所述探針可為TaqMan探針。所述探針可通過在所述DNA的5’末端連接熒光基團(tuán)， 3’末端連接淬滅劑得到。所述探針具體可通過在序列1所示DNA的5’末端連接FAM熒光基團(tuán)，3’末端依次連接MGB淬滅劑和NFQ非熒光猝滅劑得到。其它熒光基團(tuán)、淬滅劑及非熒光猝滅劑也可采用。本發(fā)明還保護(hù)序列1、序列2和序列3所示DNA組成的DNA組合物。本發(fā)明還保護(hù)序列1所示DNA的反向互補(bǔ)DNA、序列2所示DNA的反向互補(bǔ)DNA和序列3所示DNA的反向互補(bǔ)DNA組成的DNA組合物。所述DNA組合物可用于制備用于輔助檢測(cè)針對(duì)甲型H3N2流感病毒的NA蛋白上第 292位氨基酸突變的試劑盒。所述DNA組合物可用于制備用于輔助鑒定甲型H3N2流感病毒耐藥性的試劑盒。本發(fā)明還保護(hù)序列表的序列1所示的DNA。本發(fā)明還保護(hù)序列表的序列2所示的DNA和序列3所示的DNA組成的引物對(duì)。用本發(fā)明的試劑(或DNA組合物)對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行RT-PCR，如果得到S型擴(kuò)增曲線(結(jié)果為陽性)，即甲型H3N2流感病毒的NA蛋白上第292位氨基酸為耐藥突變，為耐藥毒株，如果沒有得到S型擴(kuò)增曲線(結(jié)果為陰性)，即甲型H3N2流感病毒的NA蛋白上第292 位氨基酸為野生型，為野生不耐藥的毒株。應(yīng)用本發(fā)明的試劑，運(yùn)用一步法實(shí)時(shí)RT-PCR并結(jié)合Taqman -MGB探針技術(shù)，適用于檢測(cè)多種不同制備方法得到的甲型H3N2流感病毒RNA樣本(如總RNA、mRNA、病毒粒等)， 對(duì)甲型H3N2流感病毒的NA蛋白上第292位氨基酸突變進(jìn)行特異性檢測(cè)和定量分析。應(yīng)用本發(fā)明的試劑具有如下優(yōu)點(diǎn)反應(yīng)過程無須開蓋，反應(yīng)結(jié)束無須電泳，檢測(cè)快速，并極大減少了 PCR產(chǎn)物污染所產(chǎn)生的假陽性結(jié)果。本發(fā)明解決了傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)樣本消耗量大、實(shí)驗(yàn)操作繁瑣、檢測(cè)靈敏度低等缺點(diǎn)，T^aciMan -MGB探針的應(yīng)用更增加了檢測(cè)的特異性和結(jié)果的可靠性，本發(fā)明的檢測(cè)敏感性可達(dá)500cOpies/ul。本發(fā)明尤其適用于科研、臨床和病毒流行病學(xué)監(jiān)測(cè)等工作。


圖1為用序列6所示DNA制作的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2為對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品RNA甲-1的擴(kuò)增曲線。圖3為對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品RNA甲-2的擴(kuò)增曲線。圖4為對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品RNA甲-2的靈敏度檢測(cè)。圖5為對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品RNA乙-2的擴(kuò)增曲線。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。下述實(shí)施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。引物和探針由上?；瞪锛夹g(shù)公司合成。pGEM -Teasy載體系統(tǒng)和 RiboMAX Large Scale RNA Production Systems_SP6 and T7 體外 RNA 轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)普林麥格(ftOmega)公司。LA Taq DNA聚合酶和一步法實(shí)時(shí)RT-PCR試劑盒(One StepPrimeScript RT-PCR Kit)購(gòu)自大連寶生物(TAKARA)公司。核酸定量?jī)x為美國(guó) NanoDrop公司產(chǎn)品。熒光定量PCR儀(LightCycle System 2.0)為德國(guó)羅氏(Roche)公司廣品。實(shí)施例1、引物和探針的設(shè)計(jì)根據(jù)GeneBank公布的2005年至2010年的甲型H3N2流感病毒的NA基因設(shè)計(jì)引物和探針。引物和探針針對(duì)甲型H3N2流感病毒的NA蛋白(GENBANK ACCESS IONG NO. ABY25771)上第292位氨基酸突變(R292K)。探針中，F(xiàn)AM為熒光報(bào)告基團(tuán)， TAQMAN _MGB為熒光淬滅基團(tuán)。R292K-P (探針):5，-FAM-CTGCAAAGACAAYTGG-MGB-NFQ-3，(Y 為 T 或 C ；序列 1)；R292K-F (上游引物):5，-TCGATATCCTGRTGTCAGATGTG-3’ (R 為 A 或 G ；序列 2)；R292K-R(下游引物)5，-TTATATCTACKATGGGCCTATTGGA-3，(K 為 G 或 T ；序列 3)。實(shí)施例2、試劑盒甲的制備和應(yīng)用一、試劑盒甲的制備試劑盒甲由如下引物和探針組成R292K-F(上游引物)5，-TCGATATCCTGGTGTCAGATGTG-3‘；R292K-R(下游引物)5，-TTATATCTACGATGGGCCTATTGGA-3，。R292K-P (探針)5，-FAM-CTGCAAAGACAACTGG-MGB-NFQ-3，。二、標(biāo)準(zhǔn)品的制備標(biāo)準(zhǔn)品 RNA 甲-1 和標(biāo)準(zhǔn)品 RNA 甲 _2 對(duì)應(yīng) NA 蛋白 cDNA (GENBANK ACCESS IONG NO. ABY25771自5，末端第838至1255位核苷酸，第875位為引起R292K的突變位點(diǎn))。標(biāo)準(zhǔn)品RNA甲-1和標(biāo)準(zhǔn)品RNA甲-2僅在突變位點(diǎn)存在一個(gè)核苷酸的差異，標(biāo)準(zhǔn)品RNA甲-1 為野生型(自5’末端第38位核苷酸是G)，標(biāo)準(zhǔn)品RNA甲-2為耐藥型(自5’末端第38位核苷酸是A)。1、標(biāo)準(zhǔn)品RNA甲-1的制備(1)合成序列表的序列4所示DNA。(2)標(biāo)準(zhǔn)品RNA甲_1的制備將序列4所示DNA與pGEM -l^asy載體連接，測(cè)序正確后線性化載體，使用 RiboMAX 體外RNA轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，所得到產(chǎn)物用DNase I消化后使用RNA純化試劑盒純化，即為標(biāo)準(zhǔn)品RNA甲-1。標(biāo)準(zhǔn)品RNA甲-1的核苷酸序列如序列表的序列5所示。 加入適量無RNA酶水，-80°C冰箱備用。使用核酸定量?jī)x將標(biāo)準(zhǔn)品RNA定量，并換算成拷貝數(shù) Ail。2、標(biāo)準(zhǔn)品RNA甲_2的制備(1)合成序列表的序列6所示DNA。(2)標(biāo)準(zhǔn)品RNA甲_2的制備
將序列6所示DNA與PGEM -T^asy載體連接，測(cè)序正確后線性化載體，使用 RiboMAX 體外RNA轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，所得到產(chǎn)物用DNase I消化后使用RNA純化試劑盒純化，即為標(biāo)準(zhǔn)品RNA甲-2。標(biāo)準(zhǔn)品RNA甲-2的核苷酸序列如序列表的序列7所示。 加入適量無RNA酶水，-80°C冰箱備用。使用核酸定量?jī)x將標(biāo)準(zhǔn)品RNA定量，并換算成拷貝數(shù) Ail。三、試劑盒甲的應(yīng)用1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線制作序列6所示DNA的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。2、試劑盒甲的應(yīng)用采用一步法實(shí)時(shí)RT-PCR試劑盒和試劑盒甲分別對(duì)步驟一制備的兩種標(biāo)準(zhǔn)品RNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR。反應(yīng)體系QOul)體積(μ )終濃度
2X —步 RT-PCR Buffer III10/
TaKaRa Ex Taq HS(5U/μ 1)0. 40. IU/μ 1
PrimeScript RT Enzyme MixII0. 4/
上游引物(R292K-F) (10 μ Μ)0. 4200ηΜ
下游引物(R292K-R) (10 μ Μ)0. 4200ηΜ
探針(Ι^92Κ-Ρ) (10 μ Μ)0. 4200ηΜ無核酸酶水 6 /標(biāo)準(zhǔn)品RNA 2 5 X 107copies/ul在LightCycle System 2. 0實(shí)時(shí)定量PCR儀上，按下列條件進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄:42°C、5分鐘；PCR擴(kuò)增:95°C、5秒，55°C、20秒，共40個(gè)循環(huán)。標(biāo)準(zhǔn)品RNA甲-1的擴(kuò)增曲線見圖2。標(biāo)準(zhǔn)品RNA甲_2的擴(kuò)增曲線見圖3。以含有耐藥性突變的RNA片段(標(biāo)準(zhǔn)品RNA甲-2)作為模板的實(shí)時(shí)RT-PCR擴(kuò)增可觀察到擴(kuò)增曲線。不含有耐藥性突變的RNA片段(標(biāo)準(zhǔn)品RNA甲-1)作為模板的RT-PCR擴(kuò)增無法獲得擴(kuò)增曲線或者低熒光信號(hào)的非S型擴(kuò)增曲線。四、試劑盒靈敏度的測(cè)定將標(biāo)準(zhǔn)品RNA甲-2進(jìn)行梯度稀釋，使?jié)舛确謩e為5X 107copies/ul、5X IO6Copies/ ul、5X105copies/ul、5X104copies/ul、5X103copies/ul，各個(gè)稀釋液分別作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR，方法同步驟三。結(jié)果見圖4。結(jié)果表明模板的最低濃度為5X103COpies/ul， 即該濃度以上的樣本量均可以采用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)出來。實(shí)驗(yàn)證明采用兼并引物序列的其它具體上游引物和下游引物與上述探針形成的試劑盒，可以達(dá)到同樣的檢測(cè)效果。實(shí)施例3、試劑盒乙的制備和應(yīng)用一、試劑盒乙的制備試劑盒乙由如下引物和探針組成R292K-F(上游引物)5，-TCGATATCCTGGTGTCAGATGTG-3‘；R292K-R(下游引物)5，-TTATATCTACTATGGGCCTATTGGA-3，。
R292K-P (探針)5，-FAM-CTGCAAAGACAATTGG-MGB-NFQ-3，。二、標(biāo)準(zhǔn)品的制備標(biāo)準(zhǔn)品RNA 乙-1 和標(biāo)準(zhǔn)品 RNA 乙 _2 對(duì)應(yīng) NA 蛋白 cDNA (GENBANK ACCESS IONG NO. ABY25771自5，末端第838至1255位核苷酸，第875位為引起R292K的突變位點(diǎn))。標(biāo)準(zhǔn)品RNA乙-1和標(biāo)準(zhǔn)品RNA乙-2僅在突變位點(diǎn)存在一個(gè)核苷酸的差異，標(biāo)準(zhǔn)品RNA乙-1 為野生型(自5’末端第38位核苷酸是G)，標(biāo)準(zhǔn)品RNA乙-2為耐藥型(自5’末端第38位核苷酸是A)。1、標(biāo)準(zhǔn)品RNA乙-1的制備(1)合成序列表的序列8所示DNA。(2)標(biāo)準(zhǔn)品RNA乙-1的制備將序列8所示DNA與PGEM _Teasy載體連接，測(cè)序正確后線性化載體，使用 RiboMAX 體外RNA轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，所得到產(chǎn)物用DNase I消化后使用RNA純化試劑盒純化，即為標(biāo)準(zhǔn)品RNA乙-1。標(biāo)準(zhǔn)品RNA乙-1的核苷酸序列如序列表的序列9所示。 加入適量無RNA酶水，-80°C冰箱備用。使用核酸定量?jī)x將標(biāo)準(zhǔn)品RNA定量，并換算成拷貝數(shù) Ail。2、標(biāo)準(zhǔn)品RNA乙_2的制備(1)合成序列表的序列10所示DNA。(2)標(biāo)準(zhǔn)品RNA乙_2的制備將序列10所示DNA與pGEM -kasy載體連接，測(cè)序正確后線性化載體，使用 RiboMAX 體外RNA轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，所得到產(chǎn)物用DNaseI消化后使用RNA純化試劑盒純化，即為標(biāo)準(zhǔn)品RNA乙-2。標(biāo)準(zhǔn)品RNA乙-2的核苷酸序列如序列表的序列11所示。 加入適量無RNA酶水，-80°C冰箱備用。使用核酸定量?jī)x將標(biāo)準(zhǔn)品RNA定量，并換算成拷貝數(shù) Ail。三、試劑盒乙的應(yīng)用1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線制作序列10所示DNA的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、試劑盒乙的應(yīng)用采用一步法實(shí)時(shí)RT-PCR試劑盒和試劑盒乙分別對(duì)步驟一制備的兩種標(biāo)準(zhǔn)品RNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR，方法同實(shí)施例2。標(biāo)準(zhǔn)品RNA乙-2的擴(kuò)增曲線見圖5。以含有耐藥性突變的RNA片段(標(biāo)準(zhǔn)品RNA 乙-2)作為模板的實(shí)時(shí)RT-PCR擴(kuò)增可觀察到擴(kuò)增曲線。不含有耐藥性突變的RNA片段(標(biāo)準(zhǔn)品RNA乙-1)作為模板的RT-PCR擴(kuò)增無法獲得擴(kuò)增曲線或者低熒光信號(hào)的非S型擴(kuò)增曲線。四、試劑盒靈敏度的測(cè)定將標(biāo)準(zhǔn)品RNA乙-2進(jìn)行梯度稀釋，使?jié)舛确謩e為5X 107、5X 105、5X 103，各個(gè)稀釋液分別作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR，方法同步驟三。結(jié)果表明模板的最低濃度為 5X103COpies/ul，即該濃度以上的樣本量均可以采用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)出來。實(shí)驗(yàn)證明采用兼并引物序列的其它具體上游引物和下游引物與上述探針形成的試劑盒，可以達(dá)到同樣的檢測(cè)效果。
實(shí)施例4、試劑盒丙的制備和應(yīng)用一、試劑盒丙的制備試劑盒丙由如下引物和探針組成R292K-F(上游引物)5，-TCGATATCCTGATGTCAGATGTG-3‘；R292K-R(下游引物)5，-TTATATCTACTATGGGCCTATTGGA-3，。R292K-P (探針)5，-FAM-CTGCAAAGACAACTGG-MGB-NFQ-3，。二、標(biāo)準(zhǔn)品的制備標(biāo)準(zhǔn)品RNA 丙-1 和標(biāo)準(zhǔn)品 RNA 丙 _2 對(duì)應(yīng) NA 蛋白 cDNA (GENBANK ACCESS IONG NO. ABY25771自5，末端第838至1255位核苷酸，第875位為引起R292K的突變位點(diǎn))。標(biāo)準(zhǔn)品RNA丙-1和標(biāo)準(zhǔn)品RNA丙-2僅在突變位點(diǎn)存在一個(gè)核苷酸的差異，標(biāo)準(zhǔn)品RNA丙-1 為野生型(自5’末端第38位核苷酸是G)，標(biāo)準(zhǔn)品RNA丙-2為耐藥型(自5’末端第38位核苷酸是A)。1、標(biāo)準(zhǔn)品RNA丙-1的制備(1)合成序列表的序列12所示DNA。(2)標(biāo)準(zhǔn)品RNA丙-1的制備將序列12所示DNA與pGEM -Teasy載體連接，測(cè)序正確后線性化載體，使用 RiboMAX 體外RNA轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，所得到產(chǎn)物用DNase I消化后使用RNA純化試劑盒純化，即為標(biāo)準(zhǔn)品RNA丙-1。標(biāo)準(zhǔn)品RNA丙-1的核苷酸序列如序列表的序列13所示。 加入適量無RNA酶水，-80°C冰箱備用。使用核酸定量?jī)x將標(biāo)準(zhǔn)品RNA定量，并換算成拷貝數(shù) Ail。2、標(biāo)準(zhǔn)品RNA丙-2的制備(1)合成序列表的序列14所示DNA。(2)標(biāo)準(zhǔn)品RNA丙-2的制備將序列14所示DNA與pGEM -l^asy載體連接，測(cè)序正確后線性化載體，使用 RiboMAX 體外RNA轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，所得到產(chǎn)物用DNase I消化后使用RNA純化試劑盒純化，即為標(biāo)準(zhǔn)品RNA丙-2。標(biāo)準(zhǔn)品RNA丙-2的核苷酸序列如序列表的序列15所示。 加入適量無RNA酶水，-80°C冰箱備用。使用核酸定量?jī)x將標(biāo)準(zhǔn)品RNA定量，并換算成拷貝數(shù) Ail。三、試劑盒丙的應(yīng)用1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線制作序列14所示DNA的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、試劑盒丙的應(yīng)用采用一步法實(shí)時(shí)RT-PCR試劑盒和試劑盒丙分別對(duì)步驟一制備的兩種標(biāo)準(zhǔn)品RNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR，方法同實(shí)施例2。以含有耐藥性突變的RNA片段(標(biāo)準(zhǔn)品RNA丙-2)作為模板的實(shí)時(shí)RT-PCR擴(kuò)增可觀察到擴(kuò)增曲線。不含有耐藥性突變的RNA片段(標(biāo)準(zhǔn)品RNA丙-1)作為模板的RT-PCR 擴(kuò)增無法獲得擴(kuò)增曲線或者低熒光信號(hào)的非S型擴(kuò)增曲線。實(shí)驗(yàn)證明采用兼并引物序列的其它具體上游引物和下游引物與上述探針形成的試劑盒，可以達(dá)到同樣的檢測(cè)效果。
權(quán)利要求
1.一種輔助檢測(cè)針對(duì)甲型H3N2流感病毒的NA蛋白上第292位氨基酸突變的試劑，由探針和特異引物對(duì)組成；所示探針的核苷酸序列如序列表的序列1所示；所述特異引物對(duì)為序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對(duì)。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于所述探針為TaqMan探針。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑，其特征在于所述探針是在序列1所示DNA的5’末端連接熒光基團(tuán)，3’末端連接淬滅劑得到的。
4.如權(quán)利要求2所述的試劑，其特征在于所述探針是在序列1所示DNA的5’末端連接FAM熒光基團(tuán)，3’末端依次連接MGB淬滅劑和NFQ非熒光猝滅劑得到的。
5.序列1所示DNA、序列2所示DNA和序列3所示DNA組成的DNA組合物。
6.序列1所示DNA的反向互補(bǔ)DNA、序列2所示DNA的反向互補(bǔ)DNA和序列3所示DNA 的反向互補(bǔ)DNA組成的DNA組合物。
7.權(quán)利要求5或6所述DNA組合物在制備用于輔助檢測(cè)針對(duì)甲型H3N2流感病毒的NA 蛋白上第292位氨基酸突變的試劑盒中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求5或6所述DNA組合物在制備用于輔助鑒定甲型H3N2流感病毒耐藥性的試劑盒中的應(yīng)用。
9.序列表的序列1所示的DNA。
10.序列表的序列2所示的DNA和序列表的序列3所示的DNA組成的引物對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種輔助鑒定甲型H3N2流感病毒耐藥性的探針和引物對(duì)。所述探針的核苷酸序列如序列表的序列1所示。所述特異引物對(duì)由序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成。所述探針和引物對(duì)可用于輔助檢測(cè)針對(duì)甲型H3N2流感病毒的NA蛋白上第292位氨基酸突變，進(jìn)而輔助鑒定甲型H3N2流感病毒耐藥性。本發(fā)明解決了傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)樣本消耗量大、實(shí)驗(yàn)操作繁瑣、檢測(cè)靈敏度低等缺點(diǎn)，探針的應(yīng)用更增加了檢測(cè)的特異性和結(jié)果的可靠性，本發(fā)明的檢測(cè)敏感性可達(dá)500copies/ul。本發(fā)明尤其適用于科研、臨床和病毒流行病學(xué)監(jiān)測(cè)等工作。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102344969SQ201010240108
公開日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2010年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月28日
發(fā)明者劉娟, 姜濤, 秦成峰, 秦鄂德, 韓劍峰 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所