專利名稱：一種腸球菌屬及毒力基因多重pcr檢測(cè)引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多重PCR檢測(cè)引物及方法，具體涉及一種腸球菌屬及毒力基因多 重PCR檢測(cè)引物及方法。
背景技術(shù)：
腸球菌院內(nèi)感染在世界范圍內(nèi)發(fā)生。美國(guó)每年大約有200萬人感染腸球菌，主要 是住院病人感染，每年大約有88000人死于腸球菌感染，因腸球菌感染的花費(fèi)大約在4. 5億 美元；2005年英國(guó)就有7066人發(fā)生腸球菌菌血癥，2004年增加了 8 %。與醫(yī)院內(nèi)感染不同， 感染動(dòng)物的腸球菌報(bào)道較少，但腸球菌可引起包括家畜、家禽、狗、貓和鳥廣范圍的感染，造 成較大的經(jīng)濟(jì)損失。AS (聚集物質(zhì))是質(zhì)粒編碼的能夠介導(dǎo)供體菌和受體菌有效結(jié)合、有利于質(zhì)粒轉(zhuǎn) 換的細(xì)菌黏附素，可增加細(xì)菌在腎小管上皮細(xì)胞和心內(nèi)膜細(xì)胞的粘附，能增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞 的內(nèi)化，并已被證明在心內(nèi)膜炎的動(dòng)物模型中增加心臟瓣膜贅生物的數(shù)量。cylA(溶細(xì)胞素 A)編碼激活因子A，該激活因子是溶血素cyl發(fā)揮致病作用所必須的。cyl能溶解真核細(xì)胞 和原核細(xì)胞，在動(dòng)物模型中已經(jīng)證實(shí)溶細(xì)胞素可以顯著促進(jìn)心內(nèi)膜炎和眼內(nèi)炎的惡化，加 強(qiáng)其感染的嚴(yán)重程度，同時(shí)也會(huì)加重人類腸球菌疾病的嚴(yán)重程度。Esp(腸球菌表面蛋白) 有助于腸球菌的免疫逃逸，從而增強(qiáng)其致病力。在動(dòng)物模型中，esp有助于糞腸球菌在泌尿 生殖道感染中的集聚和繁殖生長(zhǎng)。而腸球菌感染人和各種動(dòng)物與這三種腸球菌主要的毒力 因子有重要的關(guān)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種腸球菌屬及毒力基因多重PCR檢測(cè)引物及 方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種腸球菌屬及毒力基因多重PCR檢測(cè)引物，它的序列如 下腸球菌屬引物的序列如下上游引物E1 5 ‘ -GTGTCGCTGATGGATGG-3 ‘；下游引物E2 5 ‘ -GCAAGCCGAACTGAGAGA-3 ‘；聚集物質(zhì)引物的序列如下上游引物ASA 1:5' -GCTCGCTATTACGAACTATGA-3 ‘；下游弓丨物ASA2 5 ‘ -TATGAAAGAACATCACCACGA-3 ‘；溶血素引物的序列如下上游引物cylAl:5' -ACACGGGGATTGATAGGC-3‘；下游引物cylA2:5' -GCAGCTAAAGCTGCGCTT-3‘；腸球菌表面蛋白引物的序列如下上游引物Espl:5' -AGTTTTCATCTTTGATTCTTGG-3‘；
下游引物Esp2:5' -AAATGATTCTTTAGCATCTGG-3 ‘。利用腸球菌屬及毒力基因多重PCR檢測(cè)引物檢測(cè)腸球菌屬的方法，包括提取樣品 的DNA后，用PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序?qū)悠愤M(jìn)行檢測(cè)，所述PCR反應(yīng)體系，在25 μ 1體系中加入以下成份2 X PCR TaqMix10 μ 1引物 El/ASAl/cylAl/Espl4μ 1引物 El/ASAl/cylAl/Espl4μ 1模板 DNA2 μ 1dd H2O5 μ 1_總體積25 μ 1所述PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性 5min ；94°C變性 30s，56°C退火 lmin，72°C延伸 Imin 10s，共 30 個(gè)循 環(huán)；72°C 終止 IOmin。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明建立了一種快速準(zhǔn)確鑒定腸球菌屬及其主要毒力基 因的多重PCR方法。本方法特異性高；敏感性實(shí)驗(yàn)表明該方法最低能檢測(cè)到IOOpg DNA0為 腸球菌感染的分子流行病學(xué)調(diào)查，研究腸球菌致病機(jī)制機(jī)制、早期預(yù)防提供了一種新的快 速檢測(cè)方法，同時(shí)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒也為未來建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明的檢測(cè)結(jié)果，將190株疑似菌株，其中，70株分離自患病豬組織病料；60株 分離自健康豬糞便；60株分離自零售鮮豬肉分別進(jìn)行多重PCR，結(jié)果顯示cylA (溶血素A 基因)檢出率分別為83.9%、65.9%、38.8%，AS(聚集物質(zhì)基因)檢出率分別為26.4%、 14. 2%U6. 7%, esp(腸球菌表面蛋白基因)檢出率分別為55. 4%U4. 3%U5. 7%。


圖 1 為 PCR 方法初步建立，其中，M:DL2000DNAMarker，l-5 :N9 株，16S rRNA, CylA, esp，AS，空白對(duì)照；圖2為16S rRNA及毒力因子四重PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果，其中，M DL2000DNAMarker ；1-7 :50ng/ul, 5ng/ul, 500pg/ul, 50pg/ul, 5pg/ul, 0. 5pg/ul,0. 05pg/ ul.8 空白對(duì)照；圖 3 為 PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果，其中，M:DL2000DNA Marker 1-9 :N9 株、N30、N10、N5、 N25、N7、N1、N42和空白對(duì)照；圖4為腸球菌16S rRNA、cylA、esp和AS重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果，其中，Ml λ -EcoT14 I digest Marker, 1-4 腸球菌 16S、cylA、esp 和 AS 基因酶切，M2 DL2000DNAMarkero
具體實(shí)施例方式實(shí)施例本發(fā)明的技術(shù)方案是一種腸球菌屬及毒力基因多重PCR檢測(cè)引物，它的序列如 下
腸球菌屬引物的序列如下上游引物E1 5 ‘ -GTGTCGCTGATGGATGG-3 ‘；下游引物E2 5 ‘ -GCAAGCCGAACTGAGAGA-3 ‘；聚集物質(zhì)引物的序列如下上游引物ASA1:5' -GCTCGCTATTACGAACTATGA-3 ‘；下游引物ASA2 5 ‘ -TATGAAAGAACATCACCACGA-3 ‘；溶血素引物的序列如下上游引物cylAl:5' -ACACGGGGATTGATAGGC-3‘；下游引物cylA2:5' -GCAGCTAAAGCTGCGCTT-3‘；腸球菌表面蛋白引物的序列如下上游引物Espl:5' -AGTTTTCATCTTTGATTCTTGG-3 ‘；下游引物Esp2:5' -AAATGATTCTTTAGCATCTGG-3 ‘。利用腸球菌屬及毒力基因多重PCR檢測(cè)引物檢測(cè)腸球菌屬的方法，包括提取樣品 的DNA后，用PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序?qū)悠愤M(jìn)行檢測(cè)，
所述PCR反應(yīng)體系，在25 μ 1體系中加入以下成份 2 X PCR TaqMix10 μ 1
引物 El/ASAl/cylAl/Espl4μ 1
引物 El/ASAl/cylAl/Espl4μ 1
模板DNA2 μ 1
dd H9O5 μ 1
總體積25 μ 1
所述PCR反應(yīng)程序?yàn)?br> 95°C預(yù)變性 5min ；94°C變性 30s，56°C退火 lmin，72°C延伸 Imin 10s，共 30 個(gè)循 環(huán)；72°C 終止 IOmin。本發(fā)明的詳細(xì)步驟如下1 材料1. 1試驗(yàn)菌株腸球菌Nl、N7、N5、N9、m0、N25、N30 和 N42。單重 PCR 鑒定毒力基因 esp、cylA 和 AS，其中 N9-esp、cylA 和 AS (+)、N5_AS 和 cylA(+) ,NlO-AS 和 esp (+)、N30_esp 和 cylA(+)、 Nl-AS (+)、N7-esp (+)、N25_cylA (+)、N42_esp、cylA 和 AS (-)。用以上菌株做毒力基因陽(yáng)性 和陰性參考菌株。這些菌株均于50%甘油中在-70°C下由本實(shí)驗(yàn)室保存，使用時(shí)用兔鮮血 平板活化。1. 2主要儀器微量加樣器EppendorfPTC-200 型 PCR 儀MJ RESEARCH3K30型冷凍離心機(jī)德國(guó)sigmaS2-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器上海亞榮生化儀器廠DYCP-31B型電泳槽北京六一儀器廠
DYY-111-6B 型電泳儀sp-D垂直凈化工作臺(tái)SIM-F124 制冰機(jī)Alphalmager 2200 型凝膠成像儀水浴恒溫振蕩器 有限公司，SHA-C型78-1磁力加熱攪拌器 有限公司1. 3主要試劑瓊脂糖Proteinase K溶菌酶
公司苯酚/氯仿/異戊醇25 24 1 限公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 有限公司X-gal、限制性內(nèi)切酶BamH I 連)有限公司IPTG、DNA Marker 連)有限公司2 X PCR TaqMix
有限公司pTG19-T 載體 限公司GoldView 公司腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基(BHI) 有限公司其他試劑基因工程菌E. co 1 i DH5 α1. 4主要溶液和培養(yǎng)基的配制(1)腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基(BHI)取9g狀培養(yǎng)基，加入250ml單蒸水，使用磁力攪拌器加熱攪拌至完全溶解，121°C 高壓滅菌20min。(2)溶菌酶用滅菌10mmol/L Tris-Cl (pH8. 0)立即溶解溶菌酶，配制成50mg/mL濃度的貯存 液，-20°C保存?zhèn)溆谩?3)蛋白酶 K:
北京六一儀器廠 蛘埠凈化設(shè)備廠 日本三洋 Alpha Innotech 公司 金壇市榮華儀器制造
金壇市榮華儀器制造
西班牙進(jìn)口分裝 美國(guó) Amresco 北京索萊寶科技有限
北京索萊寶科技有 北京百泰克生物技術(shù) Takara生物工程(大 Takara生物工程(大 北京美萊博醫(yī)學(xué)科技 上海捷瑞生物工程有 北京賽百盛生物工程 廣東環(huán)凱微生物科技
國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品
河南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室
用高壓滅菌的50mmol/L Tris (pH8. 0)和1. 5mmol/L乙酸鈣溶液配制成濃度為 20mg/mL的溶液。-20°C保存?zhèn)溆谩?4)2mol/LNaCl 在800mL單蒸水中溶解117. OgNaCl，然后定容至1L，分裝后121°C高壓滅菌 20mino(5) 50 X Tris-乙酸(TAE)242g Tris、57. Iml 冰醋酸、IOOml 0. 5mol/L EDTA (pH8. 0)，加單蒸水定容至 1000ml，使用前稀釋成1XTAE。(6)0. IM CaCl2 取l.lg CaCl2，容于90ml滅菌三蒸水中，定容至100ml，用0. 22 μ m濾器過濾除菌，
4°C保存?zhèn)溆谩?7)氨芐青霉素(Ampici 11 in，Amp)貯存液用滅菌三蒸水將氨芐青霉素配成100mg/ml，用0. 22 μ m濾器過濾除菌，分裝成小 份，-20°C保存?zhèn)溆谩?8) IPTG 溶液將固體IPTG用滅菌三蒸水溶解，配成終濃度為100mg/ml，用0. 22 μ m濾器過濾除 菌，分裝于-20°C保存?zhèn)溆谩?9)X_gal 溶液用二甲基甲酰胺(DMF)溶解固體X-gal，配制其濃度為20mg/ml，保存于棕色瓶?jī)?nèi) 或用鋁箔避光保存，貯存于-20°C備用。(10) LB液體培養(yǎng)基取IOg細(xì)菌培養(yǎng)用的胰化蛋白胨(bacto-teyptone) (0xoid Ltd公司產(chǎn)品)、5g細(xì) 菌培養(yǎng)用的酵母提取物(bacto-yeat extract) (Oxoid Ltd公司產(chǎn)品)、10g NaCl，加800ml 滅菌三蒸水?dāng)嚢枋谷苜|(zhì)完全溶解，用lOmol/LNaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 0，定容至1000ml，分裝至 試管，每管5ml，121°C滅菌20min，4°C保存?zhèn)溆谩?Il)LB固體培養(yǎng)基在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉至終濃度為1. 5% (w/v)。121°C滅菌20min，冷卻 至55°C左右時(shí)，無菌倒入滅菌平皿，凝固后4°C保存?zhèn)溆谩?12)氨芐青霉素瓊脂平板待瓊脂培養(yǎng)基溫度降至55°C左右時(shí)，加入氨芐青霉素，使終濃度為100μ g/ml，混 勻，無菌倒入滅菌平皿，凝固后4°C保存?zhèn)溆谩?13) Solution I 溶液:IM Tis-HCL (ρΗ8· 0) 25ml，0. 5M EDTA (pH8. 0) 20ml, 20 % Glucose (1. 1M) 45ml，加去 離子水定容至1L，高壓滅菌后4°C保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们懊?0ml的Solution I中加入2ml的 RNase(20mg/mL)。(14) Solution II 溶液10% SDS 50ml, 2N NaOH 50ml，加滅菌三蒸水定容至500ml，充分混勻，室溫保存。(15) Solution III溶液:KOAc 147g, CH3COOH 57. 5ml，加入 300ml 去離子水?dāng)嚢枞芙?，定容?500ml，121 °C
7滅菌20min，4°C保存?zhèn)溆谩? 方法2.1模板的制備2.1模板的制備按照MeSSick[128]報(bào)道的方法進(jìn)行常規(guī)酚/氯仿抽提，并稍加改進(jìn)，具體操作如下(1)細(xì)菌培養(yǎng)將試驗(yàn)菌株接種于5ml BHI液體培養(yǎng)基中，37°C搖床(300rpm)培 養(yǎng)過液。(2)細(xì)菌收集取1. 5ml培養(yǎng)物于1. 5ml EP管中，室溫IOOOOrpm離心5min，棄上 清，沉淀重新懸浮于Iml ΤΕ(ρΗ8· 0)中(用ddH20也行)。(3)菌體裂解加入10μ 1 50mg/ml的溶菌酶，37°C作用2h。再加2mol/LNaCl 50 μ 1，10% SDSllOy l，20mg/ml 的 Proteinase K 10 μ 1，50°C作用 3h。(此時(shí)菌液應(yīng)為透 明粘稠液體)(4)抽提將菌液均分到兩個(gè)1.5ml EP管，加等體積的酚氯仿異戊醇 (25 24 1)，混勻，室溫放置lOmin。12000rpm離心lOmin。反復(fù)抽提兩到三次。(上清 很粘稠，吸取時(shí)應(yīng)小心，最好剪去槍頭尖)。(5)沉淀加0. 6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置IOmin0 12000rpm離心IOmin0(6)洗滌用75%乙醇洗滌沉淀。(7)抽(涼)干后，溶于50 μ 1滅菌三蒸水，取6 μ 1電泳檢測(cè)，剩余樣品放于_20°C 保存，作PCR模板用。2. 2引物選擇與合成屬特異性引物參考試驗(yàn)一，根據(jù)GenbanK公布的cylA(溶血素A)、AS(聚類物質(zhì)) 和esp (表面蛋白)基因序列設(shè)計(jì)三種毒力基因檢測(cè)引物，由上海博尚生物技術(shù)有限公司合 成。見表1。表1屬特異性引物和毒力因子基因引物序列
項(xiàng)目引物序列(5'-3’)產(chǎn)物長(zhǎng)度(bp)Enterococcus spp.ElGTGTCGCTGATGGATGG1096E2GCAAGCCGAACTGAGAGAAS(聚集物質(zhì)>ASAlGCTCGCTATTACGAACTATGA375ASA2TATGAAAGAACATCACCACGAcylA(溶血素)cylAlACACGGGGATTGATAGGC688cylA2GCAGCTAAAGCTGCGCTTEsp(腸球菌表面蛋白)EsplAGTTTTCATCTTTGATTCTTGG510Esp2AAATGATTCTTTAGCATCTGG2. 3PCR擴(kuò)增與回收純化2. 3. IPCR 反應(yīng)體系2 X PCR TaqMix10 μ 1
8
模板DNA2 u l
dd幾05 lX l
總體積25 u l
其中2×PCR／aqMix組成為0．2U Taq DNA Polymerase／u l；400 u M dNTP each；20mM／riS—HCl，PH 8．7；100mM KCl；3mM MgCl，。
2．3．2PCR反應(yīng)
PCR擴(kuò)增在PCR儀(P／C一200型)上進(jìn)行，反應(yīng)程序如下
95℃預(yù)變性5min
72℃終止10min
用三蒸水作為空白對(duì)照。
2．3．4PCR特異性試驗(yàn)用菌株N5、N10、N30、N1、N7、N25和N42的DNA做模板按上述PCR方法做特異性試驗(yàn)，以三蒸水做空白對(duì)照。[Ol54] 2．3．5PCR靈敏性試驗(yàn)?zāi)c球菌N9株的DNA模板經(jīng)ND一1000微量紫外可見分光光度計(jì)(／hermo)測(cè)定含量后，用三蒸水進(jìn)行倍比稀釋，設(shè)定含量分別為lmg、100ng、10ng、lng、lOOpg、10pg、lpg，按確定的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增，以出現(xiàn)特異擴(kuò)增帶的模板用量的最高稀釋倍數(shù)計(jì)算可檢出的腸球菌最低DNA含量。
2．3．6PCR擴(kuò)增結(jié)果判定取lo u l PCR產(chǎn)物，經(jīng)含GoldView的1．5％瓊脂糖凝膠電泳，以MarkerDL2000為分子量對(duì)照。并用Alphalmager”2200型凝膠圖像分析系統(tǒng)拍攝。
(1)在長(zhǎng)波紫外燈下，用干淨(jìng)刀片切下所需回收的含有目的DNA的凝膠，盡量切除不含目的DNA的凝膠，得到凝膠體積越小越好。[Ol59] (2)將切下的含有目的DNA的凝膠放入1．5mL離心管，稱量出凝膠重量。
(3)加三倍體積溶膠／結(jié)合液DB(如凝膠0．1g其體積可視為100 u l，則加入300 u l溶膠液)。
(4)56℃水浴放置10min(或直至膠完全溶解)。每2—3min渦旋震蕩一次加速溶
PCR擴(kuò)增在PCR儀(PTC-200型)上進(jìn)行，反應(yīng)程序如下 95°C預(yù)變性5min
94°C變性 56 °C退火
30 s 1 min
共30個(gè)循環(huán)72°C延伸Imin IOs72°C 終止IOmin用三蒸水作為空白對(duì)照。2. 3. 3PCR方法的建立以單重PCR陽(yáng)性分離株N9株做標(biāo)準(zhǔn)株，加入四種引物做四重 PCR,單重PCR結(jié)果做對(duì)照，三蒸水做空白對(duì)照，初步建立多重PCR方法。2. 3. 4PCR特異性試驗(yàn)用菌株N5、ΝΙΟ, N30、Ni、N7、N25和N42的DNA做模板按上 述PCR方法做特異性試驗(yàn)，以三蒸水做空白對(duì)照。2. 3. 5PCR靈敏性試驗(yàn)?zāi)c球菌N9株的DNA模板經(jīng)ND-1000微量紫外可見分光光度 計(jì)(Thermo)測(cè)定含量后，用三蒸水進(jìn)行倍比稀釋，設(shè)定含量分別為lmg、lOOng、10ng、lng、 100pg、10pg、lpg，按確定的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增，以出現(xiàn)特異擴(kuò)增帶的模板用量 的最高稀釋倍數(shù)計(jì)算可檢出的腸球菌最低DNA含量。2. 3. 6PCR擴(kuò)增結(jié)果判定取10 μ 1 PCR產(chǎn)物，經(jīng)含GoldView的1. 5%瓊脂糖凝膠電 泳，以MarkerDL2000為分子量對(duì)照。并用Alphalmager 2200型凝膠圖像分析系統(tǒng)拍攝。2. 3. 7PCR產(chǎn)物純化、回收按照百泰克快捷型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(離心柱型)要求回收，具體操作 步驟(1)在長(zhǎng)波紫外燈下，用干凈刀片切下所需回收的含有目的DNA的凝膠，盡量切除 不含目的DNA的凝膠，得到凝膠體積越小越好。(2)將切下的含有目的DNA的凝膠放入1. 5mL離心管，稱量出凝膠重量。(3)加三倍體積溶膠/結(jié)合液DB(如凝膠0. Ig其體積可視為100 μ 1，則加入 300 μ 1溶膠液)。(4) 56°C水浴放置IOmin (或直至膠完全溶解)。每2 3min渦旋震蕩一次加速溶
9解。(5)每IOOmg最初的凝膠重量加入150 μ 1的異丙醇，震蕩混勻。(此步可以提高 回收率)(6)將上一步所得溶液加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管)，12000rpm離心 45s，棄去收集管中廢液。(7)加入700 μ 1漂洗液WB (先加入無水乙醇)，12000rpm離心lmin，倒掉廢液。(8)將吸附柱AC放回收集管，12000rpm離心2min，盡量除去漂洗液WB，以免體系 中殘留的乙醇抑制下游反應(yīng)。(9)取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的EP管，在吸附膜中間部位加入50 μ 1洗脫緩 沖液EB (先在65 70°C水浴中加熱洗脫緩沖液效果更好)，室溫放置2min，12000rpm離心 lmin。若需要較多量的DNA，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心lmin。2. 416SrRNA基因的克隆、鑒定2. 4. IPCR產(chǎn)物與T載體的連接參照上海捷瑞生物工程有限公司T載體使用說明書進(jìn)行，將3種回收純化的PCR 產(chǎn)物分別與PTG19-T載體相連，連接反應(yīng)體系如下PTG19-T vector2. 0 μ 1純化PCR 產(chǎn)物4. Ομ 10XT4bufferΙ.ΟμΙT4DNA LigaseΙ.ΟμΙdd H2O2· 0 μ 1_總體積10. Ομ 瞬時(shí)高速離心混勻，4°C連接過夜；可直接將連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化。2. 4. 2感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)將凍存的大腸桿菌DH5ci在LB平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)14h，挑取單個(gè)菌落接 種于LB液體培養(yǎng)基，370C 200rpm震搖培養(yǎng)13h。(2)取上述培養(yǎng)物200 μ 1接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中，37 °C 200rpm震搖2h。(3)取1. 5ml分裝至無菌大EP管中，冰浴15min，4°C 5000rpm離心5min，棄上清收
集菌體。(4)用預(yù)冷的CaCl2 (0. 1M，高壓滅菌)500 μ 1懸浮菌體，輕輕吹打混勻，冰浴 30mino(5) 4°C 5000rpm離心5min，棄上清收集菌體，再次用預(yù)冷的CaCl2IOOy 1重懸菌 體，輕輕吹打混勻，即為感受態(tài)細(xì)胞。(6) 4°C放置2h，感受態(tài)細(xì)胞直接用于轉(zhuǎn)化。2. 4. 3重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化參考薩姆布魯克的方法(薩姆布魯克，D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南[M]，第三版，科學(xué)出版社，2002.)并稍加改進(jìn)，具體步驟如下取DH5a感受態(tài)細(xì)胞100 μ 1，加入連接產(chǎn)物5 μ 1，冰浴30min，42°C熱激90s，迅 速冰浴2min，無菌加入Iml不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37 °C 250rpm振蕩培養(yǎng)lh，使菌液復(fù)蘇并表達(dá)抗性，5000rpm離心5min，棄去上清液，剩余200 μ 1重懸沉淀，再加入40 μ 1 X-gal (20mg/ml)和8 μ 1 IPTG (200mg/ml的異丙基硫代-β -半乳糖苷)，混勻，均勻涂布于 含50μ g/mlAmp的LB固體培養(yǎng)基上，超凈工作臺(tái)上吹干，37°C培養(yǎng)16h。取出放置4°C 3h， 藍(lán)白斑顏色對(duì)比更加明顯。2. 4. 5小量重組質(zhì)粒的提取(1)從上述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基中挑取2個(gè)白色單個(gè)菌落，分別接種于含 100 μ g/mlAmp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過夜，取4. 5ml菌液12000rpm離心lmin， 棄上清，收集菌體。(2)加入S I溶液150 μ 1，劇烈振蕩或吹打混合均勻。(3)加入S II溶液300 μ 1，上下快速顛倒5次，_20°C放置5min。(4)加入225 μ 1預(yù)冷的S III溶液，輕輕顛倒混勻，_20°C放置5min。(5) 4°C 12000rpm 離心 5min(6)吸 650 μ 1 上清至另一 EP 管，4°C 12000rpm 離心 3min。(7)吸600 μ 1上清至新EP管，加入300 μ 1 Tris飽和酚和300 μ 1氯仿，上下顛 倒，4°C 12000rpm 離心 5min。(8)小心吸取上清液500 μ 1至另一新EP管中，加入500 μ 1氯仿，4°C 12000rpm離 心 5min。(9)取上清400 μ 1至另一 EP管中，加無水乙醇800 μ 1，上下顛倒混勻，靜置 2min, _20°C放置 20min。4°C 12000rpm 離心 lOmin，棄上清。(8)加Iml 70%乙醇，上下顛倒，12000rpm離心2min后，棄上清。(9)吸水紙吸干管壁殘留乙醇，30 μ 1 TER溶解沉淀(勿吹打)，37°C放置30min， 取2μ 1電泳檢測(cè)。-20°C保存。2. 4. 6重組質(zhì)粒的鑒定PCR鑒定對(duì)菌液和質(zhì)粒分別PCR擴(kuò)增鑒定，反應(yīng)體系及反應(yīng)的程序同上。反應(yīng)結(jié) 束后，取8 μ 1產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳。酶切鑒定取提取的重組質(zhì)粒，用BamHI酶切鑒定，酶切反應(yīng)體系如下重組質(zhì)粒10 μ 1dd H2O7 μ 1IOXBuffer2μ 1BamH I1 μ 1_總體系20 μ 1混勻后37°C酶切反應(yīng)3h，取8μ 1酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。2. 5核苷酸序列測(cè)定及分析將鑒定正確的4株重組菌，由北京博尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)定的DNA序列以 雙鏈堿基互補(bǔ)的結(jié)果為準(zhǔn)。將測(cè)的4個(gè)基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中序列blast。3結(jié)果與分析3. IPCR的初步建立單重PCR陽(yáng)性株N9做標(biāo)準(zhǔn)株，加入四種引物做四重PCR，單重PCR結(jié)果做對(duì)照，三蒸水做空白對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增結(jié)果見圖1。由圖可知，四重PCR擴(kuò)增出期望的目的片段，取得良好的擴(kuò)增結(jié)果，與單重PCR結(jié) 果一致，且省時(shí)省力省生化試劑。3. 2敏感性試驗(yàn)?zāi)c球菌N9株的DNA模板經(jīng)ND-1000微量紫外可見分光光度計(jì)(Thermo)測(cè)定含量 后，用三蒸水進(jìn)行倍比稀釋，設(shè)定含量分別為lOOng、10ng、lng、lOOpg、10pg、lpg、0. lpg，按 確定的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增，以出現(xiàn)特異擴(kuò)增帶的模板用量的最高稀釋倍數(shù)計(jì)算 可檢出的腸球菌最低DNA含量，見圖2。由圖可知，第4空有四條目的性條帶，最終可檢測(cè)到的DNA量是lOOpg，敏感性好， 達(dá)到預(yù)期目的。3. 3特異性試驗(yàn)用菌株N5、ΝΙΟ, N30、Ni、N7、N25和N42的DNA做模板進(jìn)行PCR方法，以三蒸水做 空白對(duì)照，擴(kuò)增結(jié)果見圖3。 由圖可知，單重PCR陰性的菌株在四重PCR里對(duì)應(yīng)基因也是陰性，有良好的特異 性。3. 416S、cylA、esp和AS基因的載體克隆與鑒定結(jié)果對(duì)克隆獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)提取質(zhì)粒和酶切重組質(zhì)粒鑒定，見圖4，由圖可知，酶 切結(jié)果正確，并且Blast結(jié)果正確。
權(quán)利要求
一種腸球菌屬及毒力基因多重PCR檢測(cè)引物，其特征在于它的序列如下腸球菌屬引物的序列如下上游引物E15′-GTGTCGCTGATGGATGG-3′；下游引物E25′-GCAAGCCGAACTGAGAGA-3′；聚集物質(zhì)引物的序列如下上游引物ASA15′-GCTCGCTATTACGAACTATGA-3′；下游引物ASA25′-TATGAAAGAACATCACCACGA-3′；溶血素引物的序列如下上游引物cylA15′-ACACGGGGATTGATAGGC-3′；下游引物cylA25′-GCAGCTAAAGCTGCGCTT-3′；腸球菌表面蛋白引物的序列如下上游引物Esp15′-AGTTTTCATCTTTGATTCTTGG-3′；下游引物Esp25′-AAATGATTCTTTAGCATCTGG-3′。
2.利用權(quán)利要求書1所述的腸球菌屬及毒力基因多重PCR檢測(cè)引物檢測(cè)腸球菌屬的 方法，包括提取樣品的DNA后，用PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序?qū)悠愤M(jìn)行檢測(cè)，其特征在 于所述PCR反應(yīng)體系，在25 μ 1體系中加入以下成份 2 X PCR TaqMix10 μ 1引物 El/ASAl/cylAl/Espl4μ 1引物 El/ASAl/cylAl/Espl4μ 1模板DNA2 μ 1dd H2O5 μ 1總體積25 μ 1所述PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C 預(yù)變性 5min ；94°C 變性 30s，56 °C 退火 lmin，72°C 延伸 Imin 10s，共 30 個(gè)循環(huán)； 72°C終止 IOmin。
全文摘要
本發(fā)明的技術(shù)方案公開了一種腸球菌屬及毒力基因多重PCR檢測(cè)引物，它包括腸球菌屬引物的序列、聚集物質(zhì)引物的序列和溶血素引物的序。本發(fā)明建立了一種快速準(zhǔn)確鑒定腸球菌屬及其主要毒力基因的多重PCR方法。本方法特異性高；敏感性實(shí)驗(yàn)表明該方法最低能檢測(cè)到100pg DNA。為腸球菌感染的分子流行病學(xué)調(diào)查，研究腸球菌致病機(jī)制機(jī)制、早期預(yù)防提供了一種新的快速檢測(cè)方法，同時(shí)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒也為未來建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法提供了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12Q1/10GK101880727SQ20101023999
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月29日
發(fā)明者孟振北, 段志剛, 王亞賓, 耿鑫, 胡慧, 胡清林, 陳麗穎 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)