專利名稱：一種腸球菌屬多重pcr檢測(cè)引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多重PCR檢測(cè)引物及方法，具體涉及一種腸球菌屬多重PCR檢測(cè) 引物及方法。
背景技術(shù)：
腸球菌為革蘭陽(yáng)性球菌，主要存在于人類或動(dòng)物的胃腸道，也廣泛分布于土壤， 水，食物中，是一種重要的條件致病菌。近年來(lái)，由于腸球菌耐藥菌株的日益增多，腸球菌的 醫(yī)院感染率不斷增加，引起尿路感染、菌血癥、創(chuàng)口感染、感染性心內(nèi)膜炎以及食物中毒等， 已成為醫(yī)院感染的重要病原。腸球菌可以感染多種動(dòng)物，從豬、家蠶、羔羊、驢等動(dòng)物體內(nèi)均 分離出致病性腸球菌，并且已有研究表明，腸球菌可以在人與動(dòng)物之間進(jìn)行水平傳播，有報(bào) 道稱可由發(fā)病豬直接傳染人，引起人發(fā)病死亡。目前，鑒定腸球菌的標(biāo)準(zhǔn)方法主要是依靠生化試驗(yàn)進(jìn)行表型鑒定，這需要大量的 時(shí)間進(jìn)行生化管的準(zhǔn)備和判斷結(jié)果。另外，一些商品化鑒定試劑盒API Rapid ID 32Sr印、 BBL Crystal和Vitek_32等，雖能夠?qū)⒛c球菌鑒定到種的水平，檢測(cè)結(jié)果也能在24小時(shí)后 得到有效判讀，且不適用基層快速鑒定，目前PCR儀普及率逐步提高，與單重PCR相比多重 PCR具有高效性、系統(tǒng)性、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性等優(yōu)點(diǎn)，能在同一 PCR反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出多個(gè)型別的 目的基因，適宜于成組病原體檢測(cè)，節(jié)省時(shí)間，節(jié)省試劑，節(jié)約經(jīng)費(fèi)開(kāi)支，能為臨床提供更多 更準(zhǔn)確的診斷信息，建立一種快速鑒定種屬的多重PCR方法顯得尤為必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是傳統(tǒng)的腸球菌屬和主要腸球菌種的檢測(cè)方法不適用 基層快速鑒定，提供一種腸球菌多重PCR檢測(cè)引物及方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種腸球菌屬多重PCR檢測(cè)引物，它的序列如下腸球菌屬引物的序列如下上游引物E1 5 ‘ -GTGTCGCTGATGGATGG-3 ‘；下游引物E2 5 ‘ -GCAAGCCGAACTGAGAGA-3 ‘；糞腸球菌種引物的序列如下上游引物FL1:5' -ACATATGTGAATAACTTAACC-3‘；下游引物FL2:5, -TATTGGTGACTCTTGGTTTGG-3 ‘；屎腸球菌種引物的序列如下上游引物FMl 5 ‘ -GATAATACAATAGAAGAATTAT-3 ‘；下游引物FM2:5, -AGCTTTTTTGATATTCTTCTTTA-3‘。利用腸球菌屬多重PCR檢測(cè)引物檢測(cè)腸球菌屬的方法，包括提取樣品的DNA后，用 PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序?qū)悠愤M(jìn)行檢測(cè)，所述PCR反應(yīng)體系，在25 μ 1體系中加入以下成份2 X PCRTaqMix8μ 1
E1/FL1/FM13μ 1E1/FL2/FM23μ 1模板 DNA2 μ 1dd H2O9μ 1_總體積25 μ 1所述PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性 5min ；進(jìn)入循環(huán)，94°C變性 30s，49°C退火 lmin，72°C延伸 Imin 10s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C終止IOmin。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明建立了一種快速準(zhǔn)確鑒定腸球菌的多重PCR方法， 大大簡(jiǎn)化了查驗(yàn)程序，可以在很多基層實(shí)驗(yàn)室使用。能一次PCR鑒定到腸球菌屬及糞腸球 菌或屎腸球菌種，能最少檢測(cè)出Ing的基因組DNA，敏感性高，特異性比較強(qiáng)，有利于腸球菌 的鑒別與診斷，并且具有的較好敏感性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，為臨床中腸球菌的檢測(cè)提供了一 種新的快速檢測(cè)方法，也為腸球菌感染的分子流行病學(xué)調(diào)查，研究腸球菌分子發(fā)病機(jī)制，早 期診斷，診斷試劑盒的研制與開(kāi)發(fā)，藥物或疫苗的免疫機(jī)制提供了試驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)手段。本發(fā)明的檢測(cè)結(jié)果，將190株疑似菌株，其中，70株分離自患病豬組織病料；60株 分離自健康豬糞便；60株分離自零售鮮豬肉分別進(jìn)行多重PCR，結(jié)果顯示糞腸球菌檢出率 分別為30%、46. 7%、25%，屎腸球菌檢出率分別為54. 3%,38. 3%、55%，其他腸球菌檢出 率分別為 7. 1%U0%U3. 3%。


圖 1 為 PCR 特異性擴(kuò)增結(jié)果，其中，1-5 :ATCC29212、ATCC32223、El、E2、E3, M DL2000DNAMarker 6-10 :E4、E5、葡萄球菌、鏈球菌、乳球菌；圖2為PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果，其中，M :DL2000DNAMarker ；1-10 :E6_E14，空白對(duì)照；圖3 為 PCR 敏感性試驗(yàn)結(jié)果，其中，1-5 :ATCC32223 :5ng/ul，0. 5ng/ul，0. 05ng/ ul，5pg/u，0. 5pg/ul, M :DL2000DNAMarker (由上至下分別為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、 250bp、100bp) ；6-10 :E1 :5ng/ul,0. 5ng/ul,0. 05ng/ul,5pg/ul,0. 5pg/ul ；圖4為腸球菌16S rRNA、FL和FM重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果，其中，Ml λ -EcoT14 I digestMarker, 1-3 腸球菌 16S、FL 和 FM 基因酶切，M2 :DL2000DNA Marker。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一種腸球菌屬多重PCR檢測(cè)引物，它的序列如下腸球菌屬引物的序列如下上游引物E1 5 ‘ -GTGTCGCTGATGGATGG-3 ‘；下游引物E2 5 ‘ -GCAAGCCGAACTGAGAGA-3 ‘；糞腸球菌種引物的序列如下上游引物FL1:5' -ACATATGTGAATAACTTAACC-3 ‘；下游引物FL2 5 ‘ -TATTGGTGACTCTTGGTTTGG-3 ‘；
4
屎腸球菌種引物的序列如下上游引物 FMl 5 ‘ -GATAATACAATAGAAGAATTAT-3 ‘；下游引物FM2 5, -AGCTTTTTTGATATTCTTCTTTA-3 ‘。利用腸球菌屬多重PCR檢測(cè)引物檢測(cè)腸球菌屬的方法，包括提取樣品的DNA后，用 PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序?qū)悠愤M(jìn)行檢測(cè)，所述PCR反應(yīng)體系，在25 μ 1體系中加入以下成份2XPCR TaqMix8μ 1E1/FL1/FM13μ 1E1/FL2/FM23μ 1模板 DNA2 μ 1dd H2O9 μ 1_總體積25 μ 1所述PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性 5min ；進(jìn)入循環(huán)，94°C變性 30s，49°C退火 lmin，72°C延伸 Imin 10s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C終止IOmin。本發(fā)明中，詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下1 材料1. 1試驗(yàn)菌株14株標(biāo)準(zhǔn)菌株(編號(hào)為E1-E14)為2006 2007年期間，分離自河南洛陽(yáng)、濟(jì)源、 許昌等地送檢病豬的肝、脾、腎、糞便，經(jīng)Vitek-32全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)及16S rRNA測(cè)序鑒 定的菌株，其中糞腸球菌(E. faecalis)6株、屎腸球菌(E. faecium)6株，E. sanguinicola兩 株(16s rRNA序列Genbank號(hào)分別是FJ378700. 1和FJ378705. 1)；這些菌株均于50%甘油 中在-70°C下由本實(shí)驗(yàn)室保存。鏈球菌編號(hào)是CVCC562，葡萄球菌和乳球菌由本實(shí)驗(yàn)室分離 保藏。ATCC29212、CMCC(B) 32223糞腸球菌陽(yáng)性參考菌株由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司 提供。1. 2主要儀器微量加樣器PTC-200 型 PCR 儀3K30型冷凍離心機(jī)S2-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器DYCP-31B 型電泳槽DYY-111-6B 型電泳儀sp-D垂直凈化工作臺(tái)SIM-F124 制冰機(jī)Alphalmager 2200 型凝膠成像儀水浴恒溫振蕩器 公司，SHA-C型78-1磁力加熱攪拌器
Eppendorf MJ RESEARCH 德國(guó)sigma 上海亞榮生化儀器廠 北京六一儀器廠 北京六一儀器廠 蛘埠凈化設(shè)備廠 日本三洋 Alpha Innotech 公司 金壇市榮華儀器制造有限
金壇市榮華儀器制造有限公司 司
公司
限公司
限公司
公司
司
公司
室
1. 3主要試劑 瓊脂糖
Proteinase K 溶菌酶
苯酚/氯仿/異戊醇25 24 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 X-gal、限制性內(nèi)切酶BamH I IPTG、DNA Marker 2XPCR TaqMix PTG19-T 載體 GoldView
腦_心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基(BHI) 其他試劑
基因工程菌E. coli DH5a
西班牙進(jìn)口分裝 美國(guó) Amresco 北京索萊寶科技有限公司 北京索萊寶科技有限公
北京百泰克生物技術(shù)有限
Takara生物工程(大連)有
Takara生物工程(大連)有
北京美萊博醫(yī)學(xué)科技有限
上海捷瑞生物工程有限公
北京賽百盛生物工程公司 廣東環(huán)凱微生物科技有限
國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)
1. 4主要溶液和培養(yǎng)基的配制 (1)腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基(BHI)
取9g狀培養(yǎng)基，加入250ml單蒸水，使用磁力攪拌器加熱攪拌至完全溶解，121°C 高壓滅菌20min。(2)溶菌酶用滅菌10mmol/L Tris-Cl (pH8. 0)立即溶解溶菌酶，配制成50mg/mL濃度的貯存 液，-20°C保存?zhèn)溆谩?3)蛋白酶 K:用高壓滅菌的50mmol/LTris(pH8. 0)和1. 5mmol/L乙酸鈣溶液配制成濃度為 20mg/mL的溶液。-20°C保存?zhèn)溆谩?4)2mol/L NaCl 在800mL單蒸水中溶解117.0g NaCl，然后定容至1L，分裝后121 °C高壓滅菌 20mino(5) 50 X Tris-乙酸(TAE)242g Tris、57. Iml 冰醋酸、IOOml 0. 5mol/L EDTA (pH8. 0)，加單蒸水定容至 1000ml，使用前稀釋成1XTAE。
(6)0. IM CaCl2 取l.lg CaCl2，容于90ml滅菌三蒸水中，定容至100ml，用0. 22 μ m濾器過(guò)濾除菌，
4°C保存?zhèn)溆谩?7)氨芐青霉素(Ampici 11 in，Amp)貯存液用滅菌三蒸水將氨芐青霉素配成100mg/ml，用0. 22 μ m濾器過(guò)濾除菌，分裝成小 份，-20°C保存?zhèn)溆谩?8) IPTG 溶液將固體IPTG用滅菌三蒸水溶解，配成終濃度為100mg/ml，用0. 22 μ m濾器過(guò)濾除 菌，分裝于-20°C保存?zhèn)溆谩?9)x-gal 溶液用二甲基甲酰胺(DMF)溶解固體X-gal，配制其濃度為20mg/ml，保存于棕色瓶?jī)?nèi) 或用鋁箔避光保存，貯存于-20°C備用。(10) LB液體培養(yǎng)基取IOg細(xì)菌培養(yǎng)用的胰化蛋白胨(bacto-teyptone) (0xoid Ltd公司產(chǎn)品)、5g細(xì) 菌培養(yǎng)用的酵母提取物(bacto-yeat extract) (Oxoid Ltd公司產(chǎn)品)、10g NaCl，加800ml 滅菌三蒸水?dāng)嚢枋谷苜|(zhì)完全溶解，用lOmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，定容至1000ml，分裝 至試管，每管5ml，121°C滅菌20min，4°C保存?zhèn)溆谩?Il)LB固體培養(yǎng)基在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉至終濃度為1. 5% (w/v)。121°C滅菌20min，冷卻 至55°C左右時(shí)，無(wú)菌倒入滅菌平皿，凝固后4°C保存?zhèn)溆谩?12)氨芐青霉素瓊脂平板待瓊脂培養(yǎng)基溫度降至55°C左右時(shí)，加入氨芐青霉素，使終濃度為100μ g/ml，混 勻，無(wú)菌倒入滅菌平皿，凝固后4°C保存?zhèn)溆谩?13) Solution I 溶液IM Tis-HCL(ρΗ8· 0) 25ml，0. 5M EDTA(pH8. 0) 20ml, 20% Glucose (1. lM)45ml，加去 離子水定容至1L，高壓滅菌后4°C保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们懊?0ml的Solution I中加入2ml的 RNase(20mg/mL)。(14) Solution II 溶液:10% SDS 50ml, 2N NaOH 50ml，加滅菌三蒸水定容至500ml，充分混勻，室溫保存。(15) Solution III溶液KOAc 147g, CH3COOH 57. 5ml，加入 300ml 去離子水?dāng)嚢枞芙?，定容?500ml，121°C 滅菌20min，4°C保存?zhèn)溆谩? 方法2.1模板的制備按照MeSSick[128]報(bào)道的方法進(jìn)行常規(guī)酚/氯仿抽提，并稍加改進(jìn)，具體操作如下(1)細(xì)菌培養(yǎng)將試驗(yàn)菌株接種于5ml BHI液體培養(yǎng)基中，37°C搖床(300rpm)培 養(yǎng)過(guò)液。(2)細(xì)菌收集取1. 5ml培養(yǎng)物于1. 5ml EP管中，室溫IOOOOrpm離心5min，棄上
清，沉
7
淀重新懸浮于Iml TE (ρΗ8· 0)中(用ddH20也行)。(3)菌體裂解加入10μ 1 50mg/ml的溶菌酶，37°C作用2h。再加2mol/LNaCl 50 μ 1，10% SDSllOy l，20mg/ml 的 Proteinase K 10 μ 1，50°C作用 3h。(此時(shí)菌液應(yīng)為透 明粘稠液體)(4)抽提將菌液均分到兩個(gè)1.5ml EP管，加等體積的酚氯仿異戊醇
反復(fù)抽提兩到三次。(上清 12000rpm 離心 IOmin。
(25 24 1)，混勻，室溫放置 lOmin。12000rpm 離心 IOminc 很粘稠，吸取時(shí)應(yīng)小心，最好剪去槍頭尖)。(5)沉淀加0. 6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置IOmim(6)洗滌用75%乙醇洗滌沉淀。(7)抽(涼)干后，溶于50 μ 1滅菌三蒸水，取6 μ 1電泳檢測(cè)，剩余樣品放于-20°C 保存，作PCR模板用。2. 2引物選擇與合成屬特異性引物參考表1序列，利用primer 5.0軟件自行設(shè)計(jì)；根據(jù)sodA基因序列 設(shè)計(jì)糞腸球菌和屎腸球菌種特異性引物，由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表2。表1屬特異性引物參考菌株Genbank登錄序列號(hào)
參考菌株
Genbank登錄序列號(hào) 表2屬特異性引物及種特異性引物序列
2. 3PCR擴(kuò)增與回收純化 2. 3. IPCR反應(yīng)體系 2XPCR TaqMix 模板])NA2 u l
dd H，。9 u l
一一
總體積25 u l
其中2×PCR TaqMiX組成為o．2U Taq I)NA P。lymeraSe／u l；400 u M dNTP eaCh；20mMTriS—HCl，PH 8．7；100mM KCl；3mM Mg(l。
4]] 2．3．2PCR反應(yīng)
PCR擴(kuò)增在PCR儀(PTC一200型)上進(jìn)行，反應(yīng)程序如下
95℃預(yù)變性5min
72℃終止lomin
用三蒸水作為空白對(duì)照。
2．3．3PCR特異性試驗(yàn)以葡萄球菌和鏈球菌做陰性對(duì)照。
臨床上，細(xì)菌初步鑒定需要革蘭氏染色1形態(tài)學(xué)觀察，初步判定疑似腸球菌，通過(guò)染色和形態(tài)學(xué)觀察和腸球菌較為類似的是鏈球菌和葡萄球菌，故本實(shí)驗(yàn)只用鏈球菌和葡萄球菌做特異性實(shí)驗(yàn)。
2．3．4PCR靈敏性試驗(yàn)將提取的ATC仁~32223和Fl株的I)NA模板經(jīng)ND—1000微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Therm。)測(cè)定含量后，用三蒸水進(jìn)行倍比稀釋，設(shè)定含量分別為lon臥ln臥100F小lop臥lpg，按確定的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增，以出現(xiàn)特異擴(kuò)增帶的模板用量的最高稀釋倍數(shù)計(jì)算可檢出的腸球菌最低I)NA含量。
2．3．5PCR擴(kuò)增結(jié)果判定取lo u l PCR產(chǎn)物，經(jīng)含G。ldVieW的1．5％瓊脂糖凝膠電泳，以MarkerDL2000為分子量對(duì)照。并用Alphalmager’”2200型凝膠圖像分析系統(tǒng)拍攝。
2．3．6PCR產(chǎn)物純化1回收
按照百泰克快捷型瓊脂糖凝膠I)NA回收試劑盒(離心柱型)要求回收，具體操作步驟
(1)在長(zhǎng)波紫外燈下，用干淨(jìng)刀片切下所需回收的含有目的I)NA的凝膠，盡量切除不含目的I)NA的凝膠，得到凝膠體積越小越好。
(2)將切下的含有目的I)NA的凝膠放入1．5ml+離心管，稱量出凝膠重量。
(3)加三倍體積溶膠／結(jié)合液DB(如凝膠o．1g其體積可視為lOO u l，則加入300 u l溶膠液)。
(4)56℃水浴放置lomin(或直至膠完全溶解)。每2—3min渦旋震蕩一次加速溶解。
(5)每100mg最初的凝膠重量加入150 u l的異丙醇，震蕩混勻。(此步可以提高回收率)
(6)將上一步所得溶液加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管)，12000rpm離心45S，棄去收集管中廢液。
(7)加入700 μ 1漂洗液WB (先加入無(wú)水乙醇)，12000rpm離心lmin，倒掉廢液。(8)將吸附柱AC放回收集管，12000rpm離心2min，盡量除去漂洗液WB，以免體系 中殘留的乙醇抑制下游反應(yīng)。(9)取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的EP管，在吸附膜中間部位加入50 μ 1洗脫緩 沖液EB (先在65 70°C水浴中加熱洗脫緩沖液效果更好)，室溫放置2min，12000rpm離心 lmin。若需要較多量的DNA，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心lmin。2. 416SrRNA基因的克隆、鑒定2. 4. IPCR產(chǎn)物與T載體的連接參照上海捷瑞生物工程有限公司T載體使用說(shuō)明書進(jìn)行，將3種回收純化的PCR 產(chǎn)物分別與PTG19-T載體相連，連接反應(yīng)體系如下pTG19-T vector2. 0 μ 1純化PCR 產(chǎn)物4. Ομ 10XT4buffer1· Ομ T4DNALigaseΙ.ΟμΙdd H2O2. 0μ 1_總體積10. Ομ 瞬時(shí)高速離心混勻，4°C連接過(guò)夜；可直接將連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化。2. 4. 2感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)將凍存的大腸桿菌DH5ci在LB平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)14h，挑取單個(gè)菌落接 種于LB液體培養(yǎng)基，370C 200rpm震搖培養(yǎng)13h。(2)取上述培養(yǎng)物200 μ 1接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中，37 °C 200rpm震搖2h。(3)取1. 5ml分裝至無(wú)菌大EP管中，冰浴15min，4°C 5000rpm離心5min，棄上清收
集菌體。(4)用預(yù)冷的CaCl2 (0. 1M，高壓滅菌)500 μ 1懸浮菌體，輕輕吹打混勻，冰浴 30mino(5) 4°C 5000rpm離心5min，棄上清收集菌體，再次用預(yù)冷的CaCl2IOOy 1重懸菌 體，輕輕吹打混勻，即為感受態(tài)細(xì)胞。(6) 4°C放置2h，感受態(tài)細(xì)胞直接用于轉(zhuǎn)化。2. 4. 3重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化參考薩姆布魯克的方法(薩姆布魯克，D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南[M]，第三版，科學(xué)出版社，2002.)并稍加改進(jìn)，具體步驟如下取DH5a感受態(tài)細(xì)胞100 μ 1，加入連接產(chǎn)物5 μ 1，冰浴30min，42°C熱激90s，迅 速冰浴2min，無(wú)菌加入Iml不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37°C 250rpm振蕩培養(yǎng)lh，使菌 液復(fù)蘇并表達(dá)抗性，5000rpm離心5min，棄去上清液，剩余200 μ 1重懸沉淀，再加入40 μ 1 X-gal (20mg/ml)和8 μ 1 IPTG (200mg/ml的異丙基硫代-β -半乳糖苷)，混勻，均勻涂布于 含50μ g/mlAmp的LB固體培養(yǎng)基上，超凈工作臺(tái)上吹干，37°C培養(yǎng)16h。取出放置4°C 3h， 藍(lán)白斑顏色對(duì)比更加明顯。2. 4. 5小量重組質(zhì)粒的提取
(1)從上述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基中挑取2個(gè)白色單個(gè)菌落，分別接種于含 100 μ g/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過(guò)夜，取4. 5ml菌液12000rpm離心lmin， 棄上清，收集菌體。(2)加入S I溶液150 μ 1，劇烈振蕩或吹打混合均勻。(3)加入S II溶液300 μ 1，上下快速顛倒5次，_20°C放置5min。(4)加入225 μ 1預(yù)冷的S III溶液，輕輕顛倒混勻，_20°C放置5min。(5) 4°C 12000rpm 離心 5min(6)吸 650 μ 1 上清至另一 EP 管，4°C 12000rpm 離心 3min。(7)吸600 μ 1上清至新EP管，加入300 μ 1 Tris飽和酚和300 μ 1氯仿，上下顛 倒，4°C 12000rpm 離心 5min。(8)小心吸取上清液500 μ 1至另一新EP管中，加入500 μ 1氯仿，4°C 12000rpm離 心 5min。(9)取上清400 μ 1至另一 EP管中，加無(wú)水乙醇800 μ 1，上下顛倒混勻，靜置 2min, _20°C放置 20min。4°C 12000rpm 離心 lOmin，棄上清。(8)加Iml 70%乙醇，上下顛倒，12000rpm離心2min后，棄上清。(9)吸水紙吸干管壁殘留乙醇，30 μ 1 TER溶解沉淀(勿吹打)，37°C放置30min， 取2μ 1電泳檢測(cè)。-20°C保存。2. 4. 6重組質(zhì)粒的鑒定PCR鑒定對(duì)菌液和質(zhì)粒分別PCR擴(kuò)增鑒定，反應(yīng)體系及反應(yīng)的程序同上。反應(yīng)結(jié) 束后，取8 μ 1產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳。酶切鑒定取提取的重組質(zhì)粒，用BamHI酶切鑒定，酶切反應(yīng)體系如下重組質(zhì)粒10 μ 1ddH207 μ 1IOXBuffer2μ 1BamHI1 μ 1_總體系20 μ 1混勻后37°C酶切反應(yīng)3h，取8μ 1酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。2. 5核苷酸序列測(cè)定及分析將鑒定正確的重組菌，由北京博尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)定的DNA序列以雙 鏈堿基互補(bǔ)的結(jié)果為準(zhǔn)。將測(cè)的3個(gè)基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中序列blast，發(fā)現(xiàn)測(cè)序結(jié) 果正確。3結(jié)果與分析3. 1方法建立及特異性試驗(yàn)以14株標(biāo)準(zhǔn)株、2株糞腸球菌參考菌株、葡萄球菌及鏈球菌基因組DNA為模板，去 離子水為空白對(duì)照，PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1及圖2。ATCC39212、CMCC (B) 32223、E4、E5、E7、E8、ElO 和 E12 株有腸球菌屬特異性條帶 1096bp及糞腸球菌種特異性條帶360bp，判定為糞腸球菌；E1、E2、E3、E6、E10和Ell株有腸 球菌屬特異性條帶1096bp及屎腸球菌種特異性條帶215bp，判定為屎腸球菌。與16S rRNA
11測(cè)序結(jié)果一致。E13、E14只有屬特異性條帶1096bp，這兩株是E. sanguinicola，未擴(kuò)增出 種特異性條帶。葡萄球菌和鏈球菌PCR陰性。3. 2敏感性試驗(yàn)分別取糞腸球菌和屎腸球菌菌株用滅菌雙蒸水倍比稀釋，最終可檢測(cè)到的DNA量 是lng。見(jiàn)圖3。3. 316S rRNA、FL和FM的T載體克隆與鑒定結(jié)果。對(duì)克隆獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)提取質(zhì)粒和酶切重組質(zhì)粒鑒定，見(jiàn)圖4，由圖可知，酶 切結(jié)果正確，并且在NCBI上Blast結(jié)果表明正確。
權(quán)利要求
一種腸球菌屬多重PCR檢測(cè)引物，其特征在于它的序列如下腸球菌屬引物的序列如下上游引物E15′-GTGTCGCTGATGGATGG-3′；下游引物E25′-GCAAGCCGAACTGAGAGA-3′；糞腸球菌種引物的序列如下上游引物FL15′-ACATATGTGAATAACTTAACC-3′；下游引物FL25′-TATTGGTGACTCTTGGTTTGG-3′；屎腸球菌種引物的序列如下上游引物FM15′-GATAATACAATAGAAGAATTAT-3′；下游引物FM25′-AGCTTTTTTGATATTCTTCTTTA-3′。
2.利用權(quán)利要求書1所述的腸球菌屬多重PCR檢測(cè)引物檢測(cè)腸球菌屬的方法，包括提 取樣品的DNA后，用PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序?qū)悠愤M(jìn)行檢測(cè)，其特征在于所述PCR反應(yīng)體系，在25 μ 1體系中加入以下成份2XPCR TaqMix8μ 1E1/FL1/FM13μ 1E1/FL2/FM23μ 1模板DNA2 μ 1dd H2O9 μ 1總體積25 μ 1所述PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min ；進(jìn)入循環(huán)，94°C變性30s，49°C退火lmin，72°C延伸Imin IOs, 30個(gè) 循環(huán)；72°C終止lOmin。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種腸球菌屬多重PCR檢測(cè)引物，包括腸球菌屬引物的序列、糞腸球菌種引物的序列和屎腸球菌種引物的序列。本發(fā)明建立了一種快速準(zhǔn)確鑒定腸球菌的多重PCR方法，大大簡(jiǎn)化了查驗(yàn)程序，可以在很多基層實(shí)驗(yàn)室使用。能一次PCR鑒定到腸球菌屬及糞腸球菌或屎腸球菌種，能最少檢測(cè)出1ng的基因組DNA，敏感性高，特異性比較強(qiáng)，有利于腸球菌的鑒別與診斷，并且具有的較好敏感性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，為臨床中腸球菌的檢測(cè)提供了一種新的快速檢測(cè)方法，也為腸球菌感染的分子流行病學(xué)調(diào)查，研究腸球菌分子發(fā)病機(jī)制，早期診斷，診斷試劑盒的研制與開(kāi)發(fā)，藥物或疫苗的免疫機(jī)制提供了試驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)手段。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101880728SQ20101024000
公開(kāi)日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月29日
發(fā)明者孟振北, 段志剛, 王亞賓, 耿鑫, 胡慧, 胡清林, 陳麗穎 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)