專利名稱：與植物種子大小相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與植物種子大小相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻的粒型和粒重是水稻品質(zhì)和產(chǎn)量的主要決定因素。最初發(fā)現(xiàn)的矮稈突變體 dl (dwarf 1)的種子相對(duì)野生型顯著變小，其千粒重約是野生型的40%。利用圖位克隆方法(map-based cloning strategy)和序列測定，發(fā)現(xiàn)Dl編碼G蛋白α亞基，其突變體表型是因該基因有833堿基缺失而造成的隱性突變。表明G蛋白α亞基調(diào)控了種子的外形， 特別是種子長短的變化。近年來又成功克隆到一個(gè)位于水稻第3號(hào)染色體著絲粒附近、控制米粒長度/粒重的主效QTL，來源于明恢63中該基因的等位基因在川7的背景下會(huì)導(dǎo)致粒長增加1. 80mm-3. 87mm，千粒重增加1. 50g-15. 6g。利用川7和明恢63構(gòu)建的近等基因系，將該QTL/基因(GS3)精細(xì)定在7. 9kb的物理區(qū)間內(nèi)。對(duì)GW2的研究表明，GW2作為一個(gè)新的E3泛素連接酶可能參與降解促進(jìn)細(xì)胞分裂的蛋白，從而調(diào)控水稻穎殼大小、控制粒重以及產(chǎn)量，在突變體g 2中谷殼的寬度、粒重以及產(chǎn)量都得到了增加。2008年又克隆了一個(gè)編碼細(xì)胞壁蔗糖酶的水稻種子灌漿相關(guān)基因GIF1，突變體在形態(tài)和結(jié)實(shí)率上表現(xiàn)正常， 但灌漿程度比野生型低、籽粒淀粉粒排列松散、堊白度高，最終的粒重比野生型低對(duì)％、直鏈淀粉和支鏈淀粉含量也明顯比野生型低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種與植株種子粒型和/或粒重相關(guān)的蛋白及其編碼基因。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，名稱為0sFBK12，來源于水稻(Oryza sativa L. cv ZhonghualO)，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中的序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中的序列2氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物種子粒型或種子長或種子寬或種子重相關(guān)由1)衍生的蛋白質(zhì)。上述序列表中的序列2由431個(gè)氨基酸殘基組成。所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。所述蛋白(0sFBK12)的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述蛋白(0sFBK12)的編碼基因?yàn)槿缦?)_5)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列1自5，末端第197-1492位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列1自5，末端第148-1589位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列1所示的DNA分子；4)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)限定的DNA序列雜交且與植物種子粒型或種子長或種子寬或種子重相關(guān)的DNA分子；5)與1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有 98%或至少具有99%同源性且與植物種子粒型或種子長或種子寬或種子重相關(guān)的DNA分子。上述序列表中的序列1由1899個(gè)核苷酸組成，其⑶S區(qū)為自5，末端第197-1492
位核苷酸。所述嚴(yán)格條件可為在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜。含有所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述重組載體的啟動(dòng)子為玉米泛素啟動(dòng)子WDiPro。所述重組載體通過如下步驟獲得1)將用I^stI和BamHI酶切質(zhì)粒KSP9得到的大小約為2. Okb的小片段插入 PUC19的PstI和BamH I識(shí)別位點(diǎn)間獲得中間載體pUC19+UbiPro ；再用SacI和EcoRI 酶切PBI221得到的小片段插入中間載體pUC19+UbiPro的McI和EcoRI識(shí)別位點(diǎn)間， 獲得中間載體pUC19+UbiPro+Noster ；再用EcoRI部分酶切和HindIII完全酶切中間載體pUC19+UbiPro+Noster得到的大小約為2. 3kb的片段插入pCAMBIA1301的EcoR I和 HindIII識(shí)別位點(diǎn)間，構(gòu)成中間載體PUN1301 ；2)將0sFBK12蛋白的編碼基因插入中間載體pUN1301的KpnI和BamHI識(shí)別位點(diǎn)
間，獲得重組載體。擴(kuò)增所述編碼基因全長或任一片段的引物對(duì)；所述引物對(duì)如下所示一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育種子粒型改良的轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將所述的編碼基因?qū)肽康闹参锏玫椒N子粒型改良的轉(zhuǎn)基因植物。所述粒型改良為如下1) -3)中的至少一種1)所述轉(zhuǎn)基因植物的種子粒長大于所述目的植物；2)所述轉(zhuǎn)基因植物的種子粒寬大于所述目的植物；3)所述轉(zhuǎn)基因植物的種子的粒重大于所述目的植物。所述粒重為百粒重。所述編碼基因是通過所述重組載體導(dǎo)入所述目的植物中。所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述單子葉植物優(yōu)選為水稻，所述水稻的品種尤其優(yōu)選為中花10號(hào)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，將粳稻中花10號(hào)中克隆到的基因0sFBK12導(dǎo)入水稻中花十號(hào)獲得過過量表達(dá)0sFBK12基因的水稻，同樣將基因0sFBK12的正義、反義片段導(dǎo)入水稻中花十號(hào)獲得轉(zhuǎn)正義、反義0sFBK12水稻，發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)0sFBK12基因的水稻和轉(zhuǎn)正義、反義 0sFBK12水稻在種子粒型和粒重上發(fā)生明顯的改變；過表達(dá)水稻的種子粒長、種子粒寬、種子的百粒重均大于所述目的植物。證實(shí)0sFBK12基因可以控制水稻粒型和粒重的變化，為將來育種提供基礎(chǔ)。


圖IRT-PCR方法擴(kuò)增0sFBK12的全長cDNA圖2RT-PCR方法擴(kuò)增0sFBK12的用于RNAi構(gòu)建的部分cDNA圖3超表達(dá)載體的物理圖譜圖4RNAi載體構(gòu)建部分示意5轉(zhuǎn)基因水稻的熒光實(shí)時(shí)定量PCR鑒定圖6轉(zhuǎn)基因水稻的表型觀察
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、轉(zhuǎn)OsFBK 12水稻的獲得l、0sFBK12 的克隆根據(jù)數(shù)據(jù)庫分析的結(jié)果設(shè)計(jì)引物，5'端引物；5' -CGG GAT CCT CAG MG AGC AGG AGGAA-3‘(下劃線序列為BamHI位點(diǎn)；序列3)，3'端引物5' -GGG GTA CCG CTA CGG AGCATC AGG A-3'(下劃線序列為KpnI位點(diǎn)；序列4)，提取水稻中花十號(hào)三葉期幼苗總RNA 為模板，采用RT-PCR方法擴(kuò)增到1296bp片段。具體操作過程如下1)植物總RNA的提取選取三葉期水稻中花十號(hào)(Oryza sativa L. cv ZhonghualO)(李梅芳，水稻花培品種-中花10號(hào)，農(nóng)業(yè)科技通訊，1998年第1期第沈頁。公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得。)的幼苗IOOmg為材料，在液氮中研磨，將液氮中研碎的凍干粉轉(zhuǎn)入到含ImlTrizol試劑(Invitrogen)的1. 5ml離心管中，充分混勻；25°C放置 5分鐘；每管中加入0. 2ml新鮮氯仿，劇烈振搖15秒，25°C溫育2-3分鐘；12, OOOrpm, 4 離心15分鐘；把上清的水相0. 5ml轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1. 5ml離心管中，加0. 5ml異丙醇，室溫放置10分鐘使RNA沉淀；12，OOOrpm, 4°C，離心10分鐘；去上清，將RNA沉淀用Iml 75%乙醇清洗2次，超凈臺(tái)吹至半干；用50 μ lDEPC-ddH20重懸沉淀，60°C水浴10分鐘，以溶解RNA 沉淀。將此RNA溶液分裝后-70°C保存，備做反轉(zhuǎn)錄的模板。2) RT-PCR 取1 μ 1上述RNA溶液，用DEPC_ddH20稀釋100倍，利用600nm光吸收在分光光度計(jì)測定RNA濃度。參照RT-PCR試劑盒(!Iomega)說明書，根據(jù)RNA的定量結(jié)果， 取2 μ g上述RNA溶液，Wl.Oyg Oligo dT引物，用DEPC_ddH20補(bǔ)充至15 μ 1，混勻后70°C 變性5分鐘，冰浴5分鐘。短暫離心后，加入25 μ 1反轉(zhuǎn)錄混合物(5 μ 1 M-MLV5XReaction Buffer, 6 μ 1 dNTP Mixture (2. 5mM), 1 μ 1 M-MLV Reverse Transcriptase^. 5 μ 1 RNase Inhibitor, 12. 5 μ 1 DEPC_ddH20)?；靹蚝?，42°C水浴1小時(shí)完成反轉(zhuǎn)錄過程；75°C水浴10 分鐘使反轉(zhuǎn)錄酶失活，得到含有第一鏈cDNA的混合物。取1 μ 1上述第一鏈cDNA作為PCR的模板，按以下體系進(jìn)行進(jìn)行PCR反應(yīng) 0.2 μ ILA Taq (5U/μ 1) UO μ 1 2 X GC buffer, 1. 8μ 1 dNTPs,0. 5μ 1 5'端引物(10 μ M， 序列3)，0.5μ1 3'端引物(10μΜ，序列4)，加ddH20終體積20μ 1。引物序列如前，PCR 程序?yàn)?4°C預(yù)變性3分鐘后進(jìn)入PCR循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94°C 30秒變性一58°C 30秒復(fù)性 —720C 1分鐘延伸，30個(gè)循環(huán)后在72°C繼續(xù)合成10分鐘。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離，結(jié)果如圖1所示，從圖中可以看出，得到分子量大約1. 31Λ的條帶，用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒(AxygenBiosciences)回收該片斷得到20 μ 1回收產(chǎn)物。進(jìn)行測序分析，結(jié)果為該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列1的自5’末端第148-1589位核苷酸序列，序列1的CDS區(qū)為序列1自5’末端的第197-1492位核苷酸。該P(yáng)CR產(chǎn)物的基因命名為0sFBK12，0sFBK12編碼的蛋白命名為 0sFBK12，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。2、表達(dá)載體pUN-FBK12的獲得1)含有 0sFBK12 的 cDNA 序列的載體 pTE_FBK12取3. 5μ 1上述PCR產(chǎn)物的回收產(chǎn)物，加入1μ l(3U/y 1)T4-DNA連接酶、5μ 1 2X 連接酶緩沖液、0. 5μ l(50mg/ml)pGEM-T fesy載體(Promega)4°C連接過夜，得到連接產(chǎn)物， 用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)含羧芐青霉素的抗性平板篩選得到含有重組質(zhì)粒大腸桿菌菌株。采用堿裂解法從該菌株中分離提取重組質(zhì)粒，選用PGEM-T fesy載體上的T7和SP6啟動(dòng)子序列為引物測序，測序結(jié)果為該重組質(zhì)粒為將序列1的自5 ‘末端的第148-1589位核苷酸插入pGEM-T Easy載體得到，將該重組質(zhì)粒命名為pTE_0sFBK12。2)、OsFBK 12超表達(dá)載體的構(gòu)建第一步剪取約0. 2g玉米幼苗，置于液氮中研磨；然后加入800 μ L新配制的提取緩沖液(含 0. IM Tris-HCl ρΗ8· 0，50mM EDTA, 0. 5M NaCl，1 % SDS ^P 1 % β -巰基乙醇)， 劇烈振蕩使其全部懸?。?5°C水浴30分鐘，每5分鐘顛倒混勻一次；然后加入250 μ L預(yù)冷的5Μ乙酸鉀，立即顛倒混勻，冰浴5分鐘；加入等量酚/氯仿，抽提一次，12000rpm離心5分鐘；收集上清，加入0. 6倍體積的異丙醇沉淀DNA，室溫放置40分鐘；4°C 12000rpm離心15 分鐘，棄上清；沉淀用70%、100%乙醇各洗一次；干燥后，溶于20 μ L含100 μ g/mL RNaseA 的ddH20中，得到玉米基因組DNA。第二步取上述玉米基因組DNA溶液2μ L作為模板，在帶有HindIII識(shí)別位點(diǎn)的5 '引物(GGAAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCCGG)和帶有BamHI識(shí)別位點(diǎn)的3 '引物 (CGGGATCCAAGTAACACCAAACAACAGGG)為引物，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件為先 94°C 3 分鐘；再94°C 45秒，62°C 45秒，72°C 2分鐘，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C 10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后， 對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，表明得到長度為1. 98kb的擴(kuò)增片段，與預(yù)期結(jié)果相符，回收該P(yáng)CR產(chǎn)物，再用限制性內(nèi)切酶Hind III和BamHI雙酶切后回收，得到片段經(jīng)測序，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列5自5’末端的第1-1986位核苷酸，為帶有粘性末端的玉米泛素啟動(dòng)子⑴biPro)。(玉米泛素啟動(dòng)子(WDiPro)也可以人工合成獲得。)第三步用限制性內(nèi)切酶&ic I和EcoR I將Noster poly A終止序列從質(zhì)粒載體 PBI 121(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品貨號(hào)MP-091)上切下，插入到載體pUC19 (北京百泰克生物技術(shù)有限公司目錄號(hào)DP7801)的Mc I和EcoR I識(shí)別位點(diǎn)間，得到重組載體,命名為pUC19-Noster。再用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI雙酶切pUC19_Noster，瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收線性化的載體大片段，并將該回收片段與第二步中獲得的帶有粘性末端的玉米泛素啟動(dòng)子(WDiPro)相連，得到重組載體，命名為pUN19。第四步用限制性內(nèi)切酶EcoRI部分酶切和HindIII完全酶切從第三步購建的重組載體PUN19切下包含W^iPro和Noster的長度約為2. 3kb的片段，將該片段克隆入質(zhì)粒載體pCAMBIA1301(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriclture, www. cambia. org)的EcoRI和HindIII位點(diǎn)處，得到重組載體，命名為 PUN1301。
3)表達(dá)載體pUN-FBK12的獲得用限制性內(nèi)切酶KpnI和BamHI對(duì)B步驟獲得的質(zhì)粒pUN1301進(jìn)行雙酶切，酶切體系為質(zhì)粒 10μ l、10x 酶切緩沖液 5μ 1、ΚρηΙ 1 μ 1 (10U/μ 1)、BamHI 0· 8 μ 1 (IOU/μ 1)，加 ddH20補(bǔ)充反應(yīng)體系至50μ 1，37°C酶切4小時(shí)。用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離，用 AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(Axygen Biosciences)回收線性化的pUN1301大片段，溶于 20 μ 1 ddH20 中。先用KpnI 酶對(duì)上述獲得pTE_0sFBK12進(jìn)行部分酶切，酶切體系為質(zhì)粒10 μ 1， 酶切緩沖液5 μ 1、KpnI 1 μ 1 (IOU/ μ 1)、加ddH20補(bǔ)充反應(yīng)體系至50 μ 1，37°C酶切4個(gè)小時(shí)；再加入BamHI 0. 2 μ 1 (IOU/ μ 1)，37°C酶切20分鐘。用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離，用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒回收1300bp的0sFBK12 cDNA片段。將10 μ 1上述回收的1300bp的0sFBK12cDNA溶液、6 μ 1回收的載體pUN1301大片段溶液，與2 μ 1 (3U/ μ 1) T4DNA連接酶和2 μ 1 IOx連接酶緩沖液混和，16°C連接16小時(shí)， 得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)含卡那霉素的抗性平板篩選得到陽性克隆。提取陽性克隆中的質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列表序列1的自5’末端第148-1589位核苷酸插入到載體pUN1301的KpnI和BamHI的識(shí)別位點(diǎn)間得到的，且啟動(dòng)子玉米泛素啟動(dòng)子⑴biPro)、基因和終止子的結(jié)構(gòu)正確，將該質(zhì)粒命名為pUN-FBK12，構(gòu)建成功植物表達(dá)載體，該表達(dá)載體的物理圖譜示意圖如圖3所示。3、含有0sFBK12正、反義片段的RNAi載體pTCK_FBK12的獲得正反義片段的獲得設(shè)計(jì)分別含有酶切點(diǎn)的上游引物FBK12F(5' -GG GGT ACC ACTAGT AGT ATG ACA AGC AAA ACA-3，下劃線序列為KpnI-SpeI位點(diǎn))以及含有酶切點(diǎn)的下游引物 FBKUR(5 ‘ -CG GGA TCC GAG CTC TCA GGA CTG AAG CAA TT-3，下劃線序列為 BamHHacI位點(diǎn))，提取水稻中花十號(hào)(Oryza sativa L. cv Zhonghua 10)的幼苗的RNA 反轉(zhuǎn)錄獲得的第一鏈cDNA作為PCR的模板，按以下體系進(jìn)行PCR反應(yīng)0.2μ1 LA Taq, 10 μ 1 2XGC buffer, 1. 8μ 1 dNTP，0. 5 μ 1 上游引物 FBK12F (10 μ Μ)，0. 5 μ 1 下游引物卩81(1跗(101^)，加(1(1 20終體積2(^1。PCR程序?yàn)?4°C預(yù)變性3分鐘，進(jìn)入PCR循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94°C 30秒變性一580C 30秒復(fù)性一72°C 1分鐘延伸，30個(gè)循環(huán)后在72°C繼續(xù)合成10分鐘。用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離，得到376bpPCR產(chǎn)物(圖幻，經(jīng)過測序，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列1自5’末端的第1M2-1578位核苷酸。取10 μ 1上述 PCR產(chǎn)物通過Spel/Mcl雙酶切，獲得長度為354bp的正義0sFBK12片段；另取10 μ 1上述 PCR產(chǎn)物通過BamHl/Kpnl雙酶切，獲得長度為366bp的反義的0sFBK12片段，將獲得的正、 反義片段與RNAi載體的連接。具體方法如下以下關(guān)于質(zhì)粒的提取、連接、對(duì)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化以及陽性克隆的篩選均參照實(shí)驗(yàn)2 中相應(yīng)的方法。RNAi 載體的獲得用 Spel/SacI 酶切載體質(zhì)粒 pTCK303(A Practical Vector for Efficient Knockdown of Gene Expression in Rice. Wang et al. ,2004, Plant Mol Biol Rep 22 :409_417，公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得。)，用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒回收PTCK303載體片段。將上述獲得的正義的0sFBK12片段與上述回收的PTCK303載體片段連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子提取的質(zhì)粒經(jīng)Spel/SacI雙酶切，獲得長度為3Mbp片段的質(zhì)粒為含有0sFBK12正義片段的陽性質(zhì)粒，命名為pTCK303-正義FBK12。將pTCK303_正義FBK12，再經(jīng)BamHI/Kpnl雙酶切，將回收片段與上述獲得的反義的0sFBK12片段連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒為模板，用上游引物FBK12F1(5' -ATG ACA AGC AAA ACA-3')以及下游引物 FBK12R1(5' -TCA GGA CTG AAG CAA TT_3')為模板，按以下體系進(jìn)行 PCR 反應(yīng)0. 2 μ 1 LA Taq, 10 μ 1 2 X GC buffer, 1. 8μ 1 dNTP，0· 5 μ 1 上游引物 FBK12F1 (10 μ Μ)，0· 5 μ 1 下游引物FBK12R1 (10 μ Μ)，加ddH20終體積20 μ 1。PCR程序?yàn)?4°C預(yù)變性3分鐘，進(jìn)入PCR 循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94°C 30秒變性一580C 30秒復(fù)性一72°C 1分鐘延伸，30個(gè)循環(huán)后在72°C 繼續(xù)合成10分鐘。用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離，得到348bp的片段。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Mel和BamHI進(jìn)行雙酶切，酶切體系為質(zhì)粒 6 μ 1、IOx 酶切緩沖液 5 μ 1、SacI 1 μ l(10U/y 1)、BamHI 0. 8 μ l(10U/y 1)，加 ddH20 補(bǔ)充反應(yīng)體系至50μ 1，37°C酶切4小時(shí)。用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離。得到1200bp 的片段。將上述PCR鑒定得到348bp的片段且酶切鑒定得到1200bp的片段的質(zhì)粒為陽性質(zhì)粒，命名為PTCK-FBK12。進(jìn)一步測序驗(yàn)證pTCK-FBK12，證實(shí)pTCK_FBK12的結(jié)構(gòu)是在 PTCK303載體的Spel/SacI間插入序列表中的序列1自5’末端的第1M2-1578位核苷酸和在PTCK303載體的BamHI/Kpnl間插入序列表中的序列1自5’末端的第1M2-1578位核苷酸的反向互補(bǔ)序列。從該載體的部分結(jié)構(gòu)示意圖(見圖4)可以看出，在該載體中0sFBK12 正、反義片段中間由500bp左右的水稻的內(nèi)含子序列隔開。上述驗(yàn)證結(jié)果表明，pTCK-FBK12為含有0sFBK12正、反義片段的RNAi載體。4、轉(zhuǎn)0sFBK12水稻的獲得遺傳轉(zhuǎn)化參照電激儀(EasyJecT Plus電激儀，英國EquiBio公司)操作指南，分別將上述獲得的載體PUN-FBK12和pTCK-FBK12分別用電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 EHA105 (Biovector Co. , LTD產(chǎn)品貨號(hào)Biovec-11)菌株，經(jīng)含卡那霉素的抗性平板篩選分別得到的超表達(dá)工程菌和RNAi工程菌，將超表達(dá)工程菌提取質(zhì)粒，經(jīng)KpnI和BamHI 酶切得到1300bp片段的質(zhì)粒，其對(duì)應(yīng)的工程菌為陽性的超表達(dá)工程菌，命名為EHA105/ PUN-FBK12 ；將RNAi工程菌提取質(zhì)粒，經(jīng)&icl和BamHI酶切得到1200bp片段的質(zhì)粒，其對(duì)應(yīng)的工程菌為陽性RNAi工程菌，命名為EHA105/pTCK-FBK12。水稻陽性苗的篩選分化將上述獲得的EHA105/pUN-FBK12和EHA105/pTCK_FBK12 分別導(dǎo)入中花10號(hào)水稻(Oryza sativa L. cv Zhonghua 10)的愈傷組織，再分別將導(dǎo)入 EHA105/pUN-FBK12和EHA105/pTCK_FBK12的愈傷組織用含300mg/L頭孢霉素的無菌水洗滌 4-5遍，無菌濾紙吸干后轉(zhuǎn)至N6D2S1培養(yǎng)基上，篩選一代。兩周后，轉(zhuǎn)移至N6Dj2培養(yǎng)基上篩選二代O周/代)。取出經(jīng)過3代篩選生長旺盛的抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上， 在分化培養(yǎng)箱(12小時(shí)光周期，白天，夜晚25°C )中培養(yǎng)7天；然后轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上，在分化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至產(chǎn)生再生苗。再生的苗在生根壯苗培養(yǎng)基上生根壯苗。待小苗長至10厘米左右時(shí)，打開容器封口膜，煉苗2-3天，然后將小苗移入人工氣候室栽培，分別獲得15株TO代轉(zhuǎn)pUN-FBK12水稻(即轉(zhuǎn)0sFBK12水稻)和65株TO代轉(zhuǎn)pTCK_FBK12水稻(即轉(zhuǎn)正、反義OsFBK 12水稻)。表1水稻組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化過程中使用的培養(yǎng)基及其成分
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下1)或幻的蛋白質(zhì)1)由序列表中的序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中的序列2氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物種子粒型或種子長或種子寬或種子重相關(guān)由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦?)-5)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列1自5’末端第197-1492位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列1自5’末端第148-1589位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列1所示的DNA分子；4)在嚴(yán)格條件下與1)或幻或幻限定的DNA序列雜交且與植物種子粒型或種子長或種子寬或種子重相關(guān)的DNA分子；5)與1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98% 或至少具有99%同源性且與植物種子粒型或種子長或種子寬或種子重相關(guān)的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒。
5.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述編碼基因全長或任一片段的引物對(duì)；所述引物對(duì)如下所示一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。
6.一種培育種子粒型改良的轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述的編碼基因?qū)肽康闹参锏玫椒N子粒型改良的轉(zhuǎn)基因植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述粒型改良為如下1)-3)中的至少一種1)所述轉(zhuǎn)基因植物的種子粒長大于所述目的植物；2)所述轉(zhuǎn)基因植物的種子粒寬大于所述目的植物；3)所述轉(zhuǎn)基因植物的種子的粒重大于所述目的植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述粒重為百粒重。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2或3所述編碼基因是通過權(quán)利要求4所述重組載體導(dǎo)入所述目的植物中。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述單子葉植物優(yōu)選為水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與植物種子大小相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中的序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中的序列2氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物種子粒型或種子長或種子寬或種子重相關(guān)由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，將來OsFBK12導(dǎo)入水稻中獲得過表達(dá)水稻；過表達(dá)水稻的種子粒長、種子粒寬、種子的百粒重均大于所述目的植物。證實(shí)轉(zhuǎn)OsFBK12基因可以控制水稻粒型和粒重的變化，為將來育種提供基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N1/19GK102336824SQ201010239549
公開日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2010年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月27日
發(fā)明者徐云遠(yuǎn), 種康, 陳娜, 陳苑 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院植物研究所