專利名稱：甘藍(lán)型油菜低芥酸分子標(biāo)記及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于油菜分子育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種甘藍(lán)型油菜低芥酸分子標(biāo)記的 制備及應(yīng)用。所述的分子標(biāo)記可以作為低芥酸甘藍(lán)型油菜育種標(biāo)記輔助選擇，為培育遺傳 穩(wěn)定的低芥酸油菜新品種提供新的分子標(biāo)記。
背景技術(shù)：
芥酸是一種22碳長(zhǎng)鏈脂肪酸，分子式為CH3(CH2)7CH = CH(CH2) nCOOH。主要存在 于十字花科(Cruciferae)和金蓮花科(Tropaeolaceae)植物種子中。十字花科蕓薹屬 (Brassica spp.)和糖芥屬(Erysimum spp.)植物的種子中芥酸含量一般為30% 60%， 金蓮花科植物種子的芥酸含量可高達(dá)80%，一些海洋動(dòng)物的油脂中也發(fā)現(xiàn)有芥酸存在。芥 酸和其它脂肪酸一樣大部分可以被消化吸收和進(jìn)入代謝。人體對(duì)高芥酸菜油基本能夠完 全消化(99% )，而老鼠只能消化77%左右。有試驗(yàn)顯示，芥酸可以使老鼠等動(dòng)物患心肌脂 肪沉積癥，按每千克體重飼喂6600mg芥酸時(shí)老鼠還會(huì)發(fā)生心肌壞死和纖維化，其原因可能 是，芥酸和其他長(zhǎng)鏈脂肪酸一樣，難以被線粒體氧化酶系統(tǒng)作為基質(zhì)利。但迄今為止， 還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)芥酸導(dǎo)致人體心臟疾患的直接證據(jù)(武玉花等，植物芥酸合成代謝與遺傳調(diào)控 研究進(jìn)展.中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2005，27 (2) :82 76)。在植物細(xì)胞內(nèi)，脂肪酸的合成系統(tǒng)分為從頭合成系統(tǒng)和延長(zhǎng)系統(tǒng)，其中從合成系 統(tǒng)只能合成C18以下的脂肪酸；延長(zhǎng)系統(tǒng)以油酸為底物，經(jīng)過(guò)兩個(gè)連續(xù)的縮合反應(yīng)形成C2tl 以上的超長(zhǎng)鏈脂肪酸。超長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成過(guò)程主要涉及到的酶有β-酮酰-輔酶A合 酶、β -酮酰-輔酶A還原酶、β -羥酰-輔酶A脫水酶以及烯脂酰-輔酶A還原酶，總稱 為脂肪酸延長(zhǎng)酶。其中β-酮酰-輔酶A合成酶又稱為脂肪酸延長(zhǎng)酶1或簡(jiǎn)稱KCS，在超 長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成中起主要作用，是該反應(yīng)的限速酶milar等，Very-long-chain fatty acid biosynthesis is controlled through the expression and specificity of the condensing enzyme. PlantJ，1997，12 (1) :121_131)。其他三種酶的作用幾乎微乎其微，因 此KCS酶的活性大小成為制約超長(zhǎng)鏈脂肪酸合成的重要因素。目前許多低芥酸品種的原理 都是通過(guò)該酶的突變完成的。Fael基因是β-酮酰-輔酶A合酶(KCS)的編碼基因，也是控制芥酸等超長(zhǎng)鏈 月旨肪酸合成的關(guān)鍵基因(Kunst 等，F(xiàn)atty acid elongation in developing seeds of Arabidopsis thaiiana. Plant Physiol Biochem，1992，30 :425_434)。油菜種子中芥酸含 量的遺傳受到胚基因型控制(張潔夫等，甘藍(lán)型油菜芥酸含量的遺傳與QTL定位.江蘇農(nóng) 業(yè)學(xué)報(bào)，2008，24(1):22-28)。這可能是因fael基因在發(fā)育的胚中特異表達(dá)。目前分離得 到的野生型fael基因全長(zhǎng)1521個(gè)核苷酸，不含內(nèi)含子，編碼506個(gè)氨基酸。分子生物學(xué)研究證實(shí)，油菜中從油酰CoA到芥酸的兩步延伸反應(yīng)分別由El和E2 兩個(gè)位點(diǎn)上的等位基因控制，這兩個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)加性效應(yīng)。通過(guò)分析高芥酸油菜(E1E1E2E2) 和低芥酸油菜(elele2e2)分離群體的基因型和芥酸含量，發(fā)現(xiàn)elele2e2基因型植株的芥 酸含量< 2%，E1E1E2E2植株的芥酸含量> 40%，ElelE2e2植株的芥酸含量中等。雖然目前對(duì)兩個(gè)基因位點(diǎn)對(duì)芥酸含量的貢獻(xiàn)率大小仍有爭(zhēng)議，但一致認(rèn)為甘藍(lán)型油菜中有兩個(gè) 基因位點(diǎn)控制芥酸的合成，且表現(xiàn)加性效應(yīng)(Fourmann等，The two genes homologous to Arabidopsis FAEl co-segregate with the two loci governing erucic acid content in Brassica napus. Theor Appl Genet, 1998,96 :852_858)。Jourdren等通過(guò)數(shù)量性狀座位QTL方法和RAPD分子標(biāo)記將E1、E2兩個(gè)位點(diǎn) 定位至Ij了兩個(gè)獨(dú)立的連鎖群中(Puyanbert 等，Acyl-CoA elongase expression during seed development in Brassica napus. Biochimica et Biophysica Aeta,2001,1533 141-152)。Fourmarm等通過(guò)聚丙烯酞胺凝膠電泳檢測(cè)fael擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性，定位了兩 個(gè)fael基因拷貝(Bn-fael. 1和Bn-fael. 2)，這兩個(gè)基因拷貝與控制芥酸含量的上述兩 個(gè)QTLs (El和E2)分離。在高芥酸油菜(Gaspard)和低芥酸油菜(ISLR4)中，這兩個(gè)基 因都轉(zhuǎn)錄表達(dá),但Bn-fael. 2的表達(dá)水平比Bn-fael. 1低(Fourmann等，The two genes homologous to Arabidopsis Faelco-segregate with the two loci governing erucic acid content in Brassica napus. Theor AppI Gene,1998,96 :852_858)。Barret等利用擬南芥fael的部分序列標(biāo)記探針，篩選甘藍(lán)型油菜幼胚的cDNA 文庫(kù)，分離到兩個(gè)與fael同源的cDNA克隆(CE7和CE8)，CE7和CE8DNA同源性達(dá)97%， 氨基酸同源性達(dá)98%，定位克隆結(jié)果顯示CE7與El位點(diǎn)緊密連鎖，并調(diào)控油菜中芥酸的 含量(Barret 等，A rapeseed FAEI gene is linked to the Ellocus associated with variation in the content of erucic acid. Theor AppI Genet, 1998,96 :177-186)。Han 等從高芥酸油菜品種(Askari)和低芥酸油菜品種(Drakkar)中均分離到了 Bn-fael. 1的 序列，這兩條序列同源性很高，有一個(gè)不含內(nèi)含子的連續(xù)編碼區(qū)，都編碼507個(gè)氨基酸的 蛋白質(zhì)，其差異在于第282位的氨基酸不同，高芥酸品種中是絲氨酸(Ser)，低芥酸品種中 是苯丙氨酸(Phe) (Han J. X.等· Functional characterization of β-ketoacyl-CoA synthase genes from Brassica napus L. Plant Mol Biol,2001,46 (2) :229_239)。Gupta等人通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)fael. 1和fael. 2分別在高低芥酸油菜中含有4個(gè)和3 個(gè)單核苷酸位點(diǎn)不同(SNPs)，因此他們提出根據(jù)上述SNPs差異既可以通過(guò)這7個(gè)SNPs來(lái) 判斷高低芥酸品種，又可以僅通過(guò)fael. 1獨(dú)有的4個(gè)SNPs中的前3個(gè)位點(diǎn)直接判斷，也就 是說(shuō)如果3個(gè)位點(diǎn)中存在el的特征核苷酸，則屬低芥酸品種，若無(wú)則屬高芥酸品種(Gupta ^,Molecular tagging of erueic acid trait in oil seed mustard (Brassica juncea) by QTL mapping and single nucleotide polymorphisms in FAEI gene. Theor AppI Genet, 2004,108 :743_749)。Fael被克隆后，對(duì)KCS的酶活性進(jìn)行了大量研究。利用定點(diǎn)突變，將低芥酸品種 (westar)FAEI蛋白第282位的Phe替換成ser，Kes活勝恢復(fù)；而將有活性的FAEI蛋白第 282位的Ser替換成中性氨基酸，包括極性(Cys、Thx、和Gly)和非極性(Ala)的脂肪族氨基 酸，酶的活性并未喪失，而且替換成Cys還使酶的活性提高，因此第282位的ser并不是酶 活性所必須的。利用酵母表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)行定點(diǎn)突變研究，還證實(shí)了 CyS223、HiS3oZ、HiS387、 His391和His420都是β -酮酰-CoA合酶的活性位點(diǎn)，這些氨基酸任何一個(gè)發(fā)生突變都會(huì) 導(dǎo)致酶的活性喪失，其中Cys223與酞基鏈的轉(zhuǎn)移有關(guān)，若將Cys223定點(diǎn)突變成Ala，即使 有18 I-CoA底物存在，突變體也不能催化丙二酸單酰-CoA的去羧基反應(yīng)，從而不能進(jìn)行縮 合反應(yīng)(Katavica 等，Gaining insight into the role of serine282 in B. napus FAEIcondensing enzyme. FEBS Letters, 2004, 562 :118_124)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于獲得一種適用于選育具有低芥酸性狀的甘藍(lán)型油菜的分子標(biāo) 記，為甘藍(lán)型油菜低芥酸育種提供一種簡(jiǎn)單、快速和有效的輔助選育方法。本發(fā)明是通過(guò)以下方案實(shí)現(xiàn)申請(qǐng)人:通過(guò)試驗(yàn)獲得一種適用于選育具備低芥酸性狀的甘藍(lán)型油菜共顯性SNP 分子標(biāo)記，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8所示。制備適用于甘藍(lán)型油菜低芥酸性狀的顯性SNP分子標(biāo)記的方法，按照以下步驟利用本申請(qǐng)人設(shè)計(jì)的引物HY-fael (其DNA序列見(jiàn)實(shí)施例1所示)擴(kuò)增低芥酸甘藍(lán) 型油菜品系甲A254和高芥酸甘藍(lán)型油菜品系4185B-2基因組DNA，得到兩個(gè)DNA擴(kuò)增片段， 然后對(duì)所述2個(gè)DNA擴(kuò)增片段進(jìn)行克隆、測(cè)序，其中從甲A254中擴(kuò)增得到如SEQ ID NO=I 和SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列，從4185B-2中擴(kuò)增得到如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列。與序列表SEQ IDNO :2相比，在序列表SEQ ID NO 1的存在1個(gè)單堿基突變(見(jiàn)附 圖2)，申請(qǐng)人利用SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中存在的突變位點(diǎn)845C —845T的單核苷酸 多態(tài)性(SNP，Single Nucleotide Polymorphisms)，采用引物3’端錯(cuò)配技術(shù)策略(Drenkard 等，A simple procedure for the analysis of single nucleotide polymorphisms facilitates map-based cloning in Arabidopsis. Plant Physiol, 2000124 1483-1492) 設(shè)計(jì)了引物對(duì)YQ-fael-1及YQ-fael-2(其DNA序列見(jiàn)實(shí)施例)。與序列表SEQ ID NO 4 相比，在序列表SEQ ID N0:3的第1422-1423bp處存在一個(gè)2bp的缺失突變，缺失堿基是 M(見(jiàn)附圖3)，申請(qǐng)人根據(jù)序列SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4中所示的核苷酸序列差異設(shè)計(jì) 引物對(duì)HD-f ae 1 -1及HD-f ae 1 -2 (其DNA序列見(jiàn)實(shí)施例1)。將引物對(duì)YQ-f ae 1 -1、YQ-f ae 1 -2、 HD-fael-1和HD-fael-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與甘藍(lán)型油菜低芥酸基因連鎖的共顯性SNP分 子標(biāo)記(即本發(fā)明的目標(biāo)分子標(biāo)記)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6、 SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8 所示。在上述方法中，所用引物對(duì)的核苷酸序列如下所示引物對(duì)(1)，編號(hào)為HY-fael 正向引物5，-CATGCCATGGATGACGTCCGTTAACGTAAAG-3，，反向引物5，-CATGGCTAGCTTAGGACCGACCGTTTTGGAC-3，。引物對(duì)(2)編號(hào)為YQ-fael-Ι 正向引物 5，-GGGCCGCTATTTTGCTATT-3，，反向引物5，-GTGTTCCCAAGGACTATTTGAC-3，。引物對(duì)(3)編號(hào)為YQ-fael-2 正向引物5，-GGCCGCTATTTTGCTCAC-3，，反向引物5，-GTGTTCCCAAGGACTATTTGAC-3，。引物對(duì)(4)編號(hào)為HD-fael-Ι 正向引物5，-GAGACGGAGCAAGTTATC-3，，
反向引物5，-TCCCAAGGACTATTTGGA-3引物對(duì)(5)編號(hào)為HD-fadl-2 正向引物5，-GAGACGGAGCAAGTTATC-3，，
反向引物 5，-TCCCAAGGACTATTTGTT-3，。其中，引物對(duì)HY-fael 用于擴(kuò)增序列表中 SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO: 3以及SEQ IDNO :4所示的核苷酸序列；引物對(duì)YQ-fael-lJQ-fael-2分別用于擴(kuò)增序列表 中SEQ ID NO 5和SEQ IDNO 6所示的核苷酸序列；引物對(duì)HD-fael-1、HD-fael-2分別用 于擴(kuò)增序列表中SEQ ID NO 7和SEQ IDNO 8所示的核苷酸序列。本發(fā)明的積極效果本發(fā)明采用引物3’端錯(cuò)配策略應(yīng)用于甘藍(lán)型油菜SNP多態(tài)性標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和檢測(cè)； 利用正向引物和反向引物同時(shí)錯(cuò)配手段在異源多倍體作物甘藍(lán)型油菜中開(kāi)發(fā)出基于PCR 擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳SNP標(biāo)記。本發(fā)明成功得到甘藍(lán)型油菜低芥酸的共顯性SNP分子標(biāo) 記，運(yùn)用該標(biāo)記在低芥麻酸甘藍(lán)型油菜的輔助選擇中可以克服傳統(tǒng)育種中依靠表型進(jìn)行選 擇的缺點(diǎn)，減少育種工作量，縮短育種年限，加快了甘藍(lán)型油菜低芥酸育種的進(jìn)程。更詳細(xì)的技術(shù)方案參見(jiàn)《具體實(shí)施方式
》。


序列表SEQ ID NO :1_4是本發(fā)明擴(kuò)增的低芥酸甘藍(lán)型油菜品系甲A254和高芥酸 甘藍(lán)型油菜品系4185B-2基因組DNA的基因組DNA獲得的4個(gè)DNA片段(核苷酸序列)。序列表SEQ ID NO :5_8是本發(fā)明制備的甘藍(lán)型油菜芥酸含量分子標(biāo)記的核苷酸序 列。序列表SEQ ID NO :9_18是本發(fā)明制備的甘藍(lán)型油菜芥酸含量分子標(biāo)記的引物對(duì) 序列。圖1 利用引物對(duì)HY-fael在甘藍(lán)型油菜品系甲A254和4185B-2以及F1的基因 組DNA中的擴(kuò)增結(jié)果。圖中=P1代表4185B-2 ;P2代表甲A254 A代表4185B-2X甲A254 ； M 代表 DNA marker (片段大小依次為 3000，2600，2050，1650，1000, 700，500 和 278bp)。圖2 利用引物對(duì)HY-fael在甘藍(lán)型油菜品系甲A254和4185B-2基因組中的擴(kuò)增 的DNA片段序列比對(duì)，圖中:N0_1、N0_2分別代表序列表中SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO 2的 序列，實(shí)心黑三角形“▲”表示序列的第845C — 845T的單堿基突變，設(shè)計(jì)的引物位置(即 引物對(duì)YQ-fael-1、YQ-fael-2的正向引物位置)參見(jiàn)下劃線處，空心三角形“▽，，表示引物 設(shè)計(jì)錯(cuò)配堿基。圖3 利用引物對(duì)HY-fael在甘藍(lán)型油菜品系甲A254和4185B-2基因組中的擴(kuò)增 的DNA片段序列比對(duì)，圖中:N0_3、N0_4分別代表序列表中SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4的 序列，實(shí)心黑三角形“▲”表示序列的第1422-1423bp的AA缺失突變，設(shè)計(jì)的引物位置(即 引物對(duì)YQ-fael-1、YQ-fael-2的正向引物位置)參見(jiàn)下劃線處。圖4 利用引物對(duì)HY-fael在甘藍(lán)型油菜品系甲A254和4185B-2基因組中的擴(kuò)增 的DNA片段序列比對(duì)，圖中N0_1、N0_2、N0_3、N0_4分別代表序列表中SEQ ID NO :1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3和SEQ IDNO :4的序列，實(shí)心黑三角形“▲”表示引物對(duì)HY-fael、 HD-fael在同一親本中擴(kuò)增的甘藍(lán)型油菜fael基因的不同拷貝之間的單堿基差異；Pri. 1
6代表引物對(duì)YQ-fael-1、YQ-fael-2的反向引物，Pri. 2代表引物對(duì)HD-fael-l、HD-fael-2 的正向引物，設(shè)計(jì)的引物位置參見(jiàn)下劃線處，箭頭代表引物方向，空心三角形“V”表示引物 設(shè)計(jì)錯(cuò)配堿基。圖5 本發(fā)明獲得的引物 YQ-fael-1、YQ-fael-2, HD-fael-l 和 HD-fael-2 在甘藍(lán) 型油菜品系甲A254、4185B-2、F1以及利用(4185B-2X甲A254)F2群體的部分單株檢測(cè)結(jié) 果。圖中=P1代表4185B-2 ;P2代表甲A254 A代表4185B-2X甲A254 ； 1-19代表F2群體 中不同芥酸含量單株(圖中正下方數(shù)值為單株芥酸含量，單位％)；片段長(zhǎng)度為所述引物 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度。圖6 是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11、制備F1代雜交種和建立F2群體在本實(shí)施例中，以本申請(qǐng)人選育的低芥酸含量(芥酸含量為2. 74% )的甘藍(lán)型油 菜品系甲A254(該材料的種子已于2009年11月20日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中 國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏號(hào)為CCTCC-P200909)為父本，以高芥酸含量(芥酸含 量為47. 76% )甘藍(lán)型油菜品系4185B-2(該材料的種子已于2009年11月20日送交湖北 省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏號(hào)為CCTCC-P200907，該材料 在本發(fā)明的在前專利申請(qǐng)(2009年11月25日提交的說(shuō)明書(shū)中已經(jīng)公開(kāi))其專利申請(qǐng)?zhí)枮?200910272868. 6，
發(fā)明者周永明, 楊慶勇, 淮東欣 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)