專利名稱：半滑舌鰨性別連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記及遺傳性別鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)領(lǐng)域中的海水魚類遺傳性別分子標(biāo)記鑒定技術(shù)，是一種 與半滑舌鰨遺傳性別連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記及遺傳性別鑒定方法。
背景技術(shù)：
半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)屬鰈形目(Pleuronectiformes)、鰨亞目 (Soleoidei)、舌鰨科(Cynoglossidae)、舌鰨屬(Cynoglossus)、三線舌鰨亞屬(Arelia)， 為暖溫帶淺海底層大型鲆鰈魚類，在黃渤海分布最多，而在東海、南海分布較少，是目前具 有重要養(yǎng)殖前景的海水鲆鰈魚類。周麗青等(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2005，29 :417_419) 對半滑舌鰨的染色體核型進(jìn)行了研究，結(jié)果表明二倍體染色體數(shù)目為42，2n = 42，且在雌 魚的中期分裂相中存在異型性染色體，而在雄魚中不存在異型性染色體?；谌旧wC-帶 和G-帶分析的進(jìn)一步研究表明，半滑舌鰨由20對常染色體和1對性染色體(分別為Z 和W染色體)組成，半滑舌鰨屬于ZW/ZZ性別決定系統(tǒng)，雌性異配，雄性同配(Wu et al., Progress inNatural Sciences,2006,16 29-32 ；Zhuang et al. , Journal of Applied Ichthyology, 2006, 22 437-440)。成熟的半滑舌鰨雌性個(gè)體比雄性個(gè)體大2_4倍，兩者的 生長速度也相差2-4倍，雌性個(gè)體生長速度更快。因此，積極開展半滑舌鰨性別連鎖的分子 標(biāo)記或基因的研究，找到與性別連鎖的分子標(biāo)記或基因，將對半滑舌鰨性別控制與全雌苗 種培育具有重要的理論意義與應(yīng)用價(jià)值。目前，多國科學(xué)家利用基于全基因組掃描理念的一些分子標(biāo)記技術(shù)，如AFLP、 RAPD、RFLP等，篩選到了一些經(jīng)濟(jì)魚類的與性別相關(guān)的分子標(biāo)記，但這些標(biāo)記在種間不具有 通用性。中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所陳松林等(Marine Biotechnology, 2007,9 273-280)通過AFLP標(biāo)記技術(shù)分離到半滑舌鰨雌性特異AFLP標(biāo)記，轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記后能 通過簡單的PCR方法鑒定半滑舌鰨的遺傳性別。但AFLP標(biāo)記存在一個(gè)較大的缺陷，就是無 法區(qū)分純合子與雜合子，是一種顯性遺傳的分子標(biāo)記。而微衛(wèi)星標(biāo)記是由1-6個(gè)堿基組成 的短串聯(lián)重復(fù)序列，具有高度多態(tài)性，并且符合孟德爾遺傳分離規(guī)律，呈現(xiàn)共顯性遺傳的特 點(diǎn)，能夠區(qū)分純合子和雜合子。微衛(wèi)星重復(fù)序列的側(cè)翼序列一般比較保守，一般在近緣物種 中也能進(jìn)行跨種擴(kuò)增。因此如果能夠篩選到半滑舌鰨性別連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記，不僅能夠建 立準(zhǔn)確高效的遺傳性別鑒定方法，還將有助于開展半滑舌鰨性別相關(guān)基因的進(jìn)化研究以及 WW超雌魚的篩選。而有關(guān)半滑舌鰨性別連鎖或特異微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選研究，迄今國內(nèi)外尚 未見任何文獻(xiàn)或?qū)＠麍?bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)半滑舌鰨性別連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記及遺傳性別鑒定方法， 為半滑舌鰨性別決定基因篩選、性別控制和全雌苗種培育提供一種技術(shù)手段。本發(fā)明是按以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明包括三個(gè)方面一、半滑舌鰨性別連鎖微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選及其引物序列；二、半滑舌鰨雌性特異微衛(wèi)星等位基因的序列及其引物 序列；三、基于微衛(wèi)星標(biāo)記的半滑舌鰨遺傳性別鑒定方法。—、半滑舌鰨性別連鎖微衛(wèi)星標(biāo)記及其引物序列它的技術(shù)內(nèi)容包括1、微衛(wèi)星 序列的篩選與克??；2、微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)；3、性別連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記的驗(yàn)證。1、微衛(wèi)星序列的篩選與克隆提取半滑舌鰨基因組DNA，首先對基因組DNA進(jìn)行限制性酶切，再用T4連接酶給 酶切DNA片段加上接頭。連接產(chǎn)物用作PCR擴(kuò)增模板，并用接頭特異性引物進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò) 增。將擴(kuò)增片段與生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交，并用磁珠選擇性吸附與生物素標(biāo) 記探針雜交的DNA分子。然后在室溫條件下經(jīng)過3次非嚴(yán)謹(jǐn)性和3次嚴(yán)謹(jǐn)性洗脫去除未與 探針結(jié)合的DNA片段，并用磁鐵將磁珠_探針-DNA混合物從緩沖液中分離出來。接著往磁 珠中添加TE溶液并在95°C水浴變性5分鐘，用磁鐵固定磁珠后快速吸出上清液。以上清 液當(dāng)模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后與pMDIS-T載體(Takara)在16°C連接兩個(gè)小 時(shí)。將連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行克隆并涂勻在一個(gè)含氨卞青霉素的LB平板上，等 液體吸收完畢后，37°C倒置培養(yǎng)過夜。挑選白色的陽性克隆送到生物測序公司測序。2、微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)根據(jù)測序得到的序列，查看其中是否含有1-6個(gè)堿基重復(fù) 的單元。選取含有重復(fù)單元的序列，用引物設(shè)計(jì)軟件針對重復(fù)單元的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物。3、性別連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記的驗(yàn)證首先用各16尾半滑舌鰨雄性個(gè)體與雌性個(gè)體 基因組DNA樣品對每對微衛(wèi)星引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠 中電泳，并通過銀染方法進(jìn)行染色，然后比較微衛(wèi)星等位基因在雌雄個(gè)體中的分布是否有 顯著差異。最終篩選到一個(gè)引物序列為SEQID NO :l(tgaactgcaa gactgctcca)和SEQ ID N0:2(catcagttgg tggcctgtaa)微衛(wèi)星標(biāo)記與半滑舌鰨性別緊密連鎖。然后進(jìn)一步用序列 SEQ ID NO 1和SEQID NO 2的引物擴(kuò)增性成熟的半滑舌鰨22尾雌魚和22尾雄魚基因組 DNA，總共擴(kuò)增出2個(gè)等位基因，按照大小順序分別命名為A、B等位基因。根據(jù)與分子量標(biāo) 準(zhǔn)比較，A等位基因大小約為244bp，B等位基因的大小約為234bp。其中22尾雄魚和22尾 雌魚全部擴(kuò)增出A等位基因，所有22尾雌魚都擴(kuò)增出B等位基因，而所有22尾雄魚都未能 擴(kuò)增出B等位基因。因此B等位基因?yàn)榘牖圉嵈菩蕴禺惖牡任换颉６?、半滑舌鰨雌性特異的等位基因序列及其引物序列它的技術(shù)內(nèi)容包括1、雌 性特異等位基因的克隆與測序；2、雌性特異等位基因的引物設(shè)計(jì)；3、雌性特異標(biāo)記的驗(yàn) 證。1、雌性特異等位基因的克隆與測序?yàn)榱双@得雌性特異等位基因序列，用SEQ ID NO :l(tgaactgcaagactgctcca)和 SEQ ID NO :2(catcagttgg tggcctgtaa)的引物PCR擴(kuò)增1尾性成熟的半滑舌鰨雌魚DNA， 用1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，切下PCR產(chǎn)物目標(biāo)電泳條帶，用DNA純化試劑盒 純化。純化產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接到pMD 18-T質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，并涂勻 在一個(gè)含氨卞青霉素的LB平板上，等液體吸收完畢后，37°C倒置培養(yǎng)過夜。挑選8個(gè)陽性 克隆送到生物測序公司測序。2、雌性特異等位基因的引物設(shè)計(jì)根據(jù)測序結(jié)果，8個(gè)陽性克隆測序成功，共得到 8條序列，其中大小為244bp的序列6條，大小為234bp序列2條，分別對應(yīng)A、B兩個(gè)等位 基因，B等位基因即為半滑舌鰨雌性特異等位基因。根據(jù)A、B等位基因的序列比對結(jié)果，
4除了重復(fù)區(qū)有2個(gè)GT的缺失，相對于A等位基因，B等位基因(即雌性特異等位基因)在 5’端有6個(gè)堿基的缺失。因此用引物設(shè)計(jì)軟件針對缺失的6個(gè)堿基的位置，設(shè)計(jì)了 SEQ ID NO :3(tctgcatgac attggaaag)的一條特異引物，該引物與 SEQ ID NO 2 (catcagttgg tggcctgtaa)的引物配對用于擴(kuò)增大小為204bp的半滑舌鰨雌性特異DNA片段，進(jìn)行半滑舌 鰨遺傳性別檢測。雌性特異等位基因(大小為234bp的B等位基因)序列為SEQ ID NO :4，其序列 如下tgaactgcaa gactgctcca gggcagtgtc tctgcatgac attggaaagc tgtgtgtggatgcatgtgtg tgtgcgtgta atgttctcca gctatggcct acgctggctg cagcctggagccgctctgtg gtgtggaaaa gagagcagat gcctcttcac tggagtgcat caggccaccaaatcgcaaat atcactgatc atctcccaat tcaattacag gccaccaact gatg。3、雌性特異標(biāo)記的驗(yàn)證用 SEQ ID NO 2 (catcagttgg tggcctgtaa)和 SEQ ID NO 3 (tctgcatgac attggaaag)的引物對各10尾半滑舌鰨雄性與雌性個(gè)體基因組DNA樣品進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，EB染色。結(jié)果表明，所有雌性個(gè)體中 均能擴(kuò)增出大小為204bp的DNA片段，而雄性個(gè)體中無擴(kuò)增產(chǎn)物，這表明通過雌性特異等位 基因轉(zhuǎn)化的分子標(biāo)記能夠準(zhǔn)確鑒別半滑舌鰨的遺傳性別。三、基于微衛(wèi)星標(biāo)記的半滑舌鰨遺傳性別鑒定的應(yīng)用方法可以根據(jù)以下2種引 物組合來進(jìn)行半滑舌鰨遺傳性別鑒定1、根據(jù)序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的引物PCR 擴(kuò)增半滑舌鰨基因組DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，并通過銀染方法 進(jìn)行染色，然后分析電泳圖譜擴(kuò)增出A、B等位基因的個(gè)體一定是遺傳上為雌性的個(gè)體，只 擴(kuò)增出A等位基因的個(gè)體一定是遺傳上為雄性的個(gè)體。2、根據(jù)序列為SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 3的引物PCR擴(kuò)增半滑舌鰨基因組DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物在1. 5%的瓊脂糖凝膠中電泳，EB 染色，然后分析電泳圖譜擴(kuò)增出大小為204bp的DNA片段的一定是遺傳上為雌性的個(gè)體， 而無擴(kuò)增產(chǎn)物的個(gè)體一定是遺傳上為雄性的個(gè)體。本發(fā)明與已有技術(shù)對比其特點(diǎn)是首次篩選到了半滑舌鰨性別連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)了雌性特異的等位基因，并 獲得了該特異等位基因的基因序列，設(shè)計(jì)了針對該等位基因的特異引物，建立了基于微衛(wèi) 星標(biāo)記技術(shù)的遺傳性別鑒定方法。本發(fā)明具有高效、準(zhǔn)確和穩(wěn)定的特點(diǎn)，在半滑舌鰨性別控 制和單性苗種生產(chǎn)中具有重要應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)在克隆半滑舌鰨性別決定基因研究中也具有 重要應(yīng)用前景。


圖1、用性別連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記引物SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2擴(kuò)增半滑舌鰨 雌性和雄性個(gè)體的電泳圖譜1-22 半滑舌鰨雌性個(gè)體，23-44 半滑舌鰨雄性個(gè)體；A 半滑舌鰨雌雄個(gè)體都能 擴(kuò)增出的等位基因；B 半滑舌鰨雌性特異的等位基因；M 分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖2、用雌性特異等位基因的引物SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3擴(kuò)增半滑舌鰨雌 性和雄性個(gè)體的電泳圖譜。1-10 半滑舌鰨雌性個(gè)體，11-20 半滑舌鰨雄性個(gè)體；M 分子量標(biāo)準(zhǔn)
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明技術(shù)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)敘述本發(fā)明包括三個(gè)方面一、半滑舌鰨性別連鎖微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選及其引物序列； 二、半滑舌鰨雌性特異微衛(wèi)星等位基因的序列及其引物序列；三、基于微衛(wèi)星標(biāo)記的半滑舌 鰨遺傳性別鑒定的應(yīng)用方法。一、半滑舌鰨性別連鎖微衛(wèi)星標(biāo)記及其引物序列包括1、微衛(wèi)星序列的篩選與 克??；2、微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)；3、性別連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記的驗(yàn)證。1、微衛(wèi)星序列的篩選與克隆選取1尾半滑舌鰨的鰭條約5mm2放入1. 5mL離心管中，待乙醇揮發(fā)后用干凈的手 術(shù)剪刀將其剪碎。加入700 μ L抽提緩沖液(緩沖液組分10mmol/LTriS-HCl，pH = 8. 0， 5mmol/L EDTA,0. 5% SDS)及5yL lmg/mL蛋白酶K，55°C充分消化4_6h。將冷卻到室溫的 消化好的樣品加入等體積的酚-氯仿-異戊醇(酚氯仿異戊醇為25 24 1)抽提 兩次，每次輕輕振蕩lOmin，于IOOOOrpm的4°C冷凍離心機(jī)中離心lOmin。采用剪口的吸頭 輕輕吸取上清液，轉(zhuǎn)入新的離心管中。加入6 μ L濃度為25mg/mL RNaseA于37°C水浴中消 化2-3h。然后重復(fù)一次酚-氯仿抽提。再在上清液中加入等體積的氯仿(氯仿異戊醇 為24 1)抽提1次。輕輕振蕩lOmin，于IOOOOrpm的4°C冷凍離心機(jī)中離心lOmin。采用 剪口的吸頭輕輕吸取上清液。然后在上清液中加入2倍體積的-20°C預(yù)冷的無水乙醇沉淀 DNA。將DNA沉淀用吸頭挑出，用70%的乙醇洗滌兩次，室溫下干燥，然后用IOOyL TE緩 沖液(10mmol/LTris-HCl，lmmol/L EDTA, pH = 8.0)溶解 DNA 沉淀。對提取的約 IOOng 半 滑舌鰨基因組總DNA放入含有5U的內(nèi)切酶MseI (New England Biolabs)的離心管中進(jìn)行 酶切反應(yīng)。酶切反應(yīng)混合物總體積為25 μ L，在水溫為37°C的恒溫?zé)岱€(wěn)循環(huán)儀中溫浴2h。 取 10 μ L 的酶切反應(yīng)產(chǎn)物與 MseI AFLP 接頭(5，-TACTCAGGACTCAT-3，/5，-GACGATGAGTCCT GAG-3’ )在總體積為30 μ L反應(yīng)混合液中進(jìn)行6h的連接反應(yīng)(15°C的水浴溫度)，其中加 入IOU的T4 DNA連接酶(TaKaRa)。利用連接產(chǎn)物作為模版進(jìn)行PCR反應(yīng)，25 μ L的PCR 反應(yīng)混合物中含有稀釋10倍后的5 μ L酶切-連接產(chǎn)物、終濃度為0. 4 μ M的MseI-N引物 (5，-GATGAGTCCTGAGTAAN-3，) UXPCR 緩沖液(Biostar,含 Mg2+)、0· 2 μ M 的 dNTP 以及 IU 的Taq聚合酶(Takara)。PCR反應(yīng)在MJ Research PTC-200 PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件為首 先94°C預(yù)變性5min，然后在94°C變性30s，53°C退火lmin，72°C延伸Imin進(jìn)行17個(gè)循環(huán)， 最后72°C終延伸IOmin。25 μ L經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物與5 μ L濃度為 20mM的生物素探針(GT) 13雜交。雜交緩沖液為6 X SSC+0. 1% SDS,反應(yīng)總體積為100 μ L。 雜交條件為95°C下變性5min，然后在55°C下雜交60min，雜交反應(yīng)在PCR儀中進(jìn)行。冷卻 至室溫的雜交產(chǎn)物加入 300 μ 1 的 TENlOOdOmM Tris-HCl，ImMEDTA, IOOmM NaCl，pH 7. 5) 溶液。l_2mg的包被有鏈親和霉素的磁珠用300 μ L TENlOO在室溫下洗滌3次，然后與PCR 產(chǎn)物_生物素探針復(fù)合體在室溫下混合雜交30min，其間需要不時(shí)的輕輕攪動(dòng)和吹打，以避 免磁珠沉淀。用磁鐵固定磁珠，移去雜交混合液。首先進(jìn)行3次非嚴(yán)謹(jǐn)性洗脫使用400 μ L 緩沖液 TEmOOO (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，IM NaCl, pH 7. 5)于室溫下洗滌 PCR 產(chǎn)物-生 物素探針_磁珠復(fù)合物3次，每次5分鐘，不時(shí)的攪動(dòng)或輕輕用移液器吹打。然后緊接著進(jìn) 行3次嚴(yán)謹(jǐn)性洗脫使用400 μ L 0. 2 X SSC+0. 1 % SDS于室溫下洗滌3次，每次5分鐘，不時(shí)的攪動(dòng)或輕輕用移液器吹打。每次洗滌后都需使用磁鐵固定磁珠，用移液器吸走上清液扔 掉。在離心管中加入50yL TE(pH = 8.0)，用移液器吸打均勻，然后于95°C下水浴5分鐘。 期間不時(shí)用移液器攪動(dòng)或者輕輕吹打均勻。用磁鐵固定磁珠后，迅速吸出上清液，經(jīng)DNA純 化試劑盒純化后用于PCR擴(kuò)增。純化后的5 μ L目的DNA洗脫片段用于PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件 與上面的PCR預(yù)擴(kuò)增條件一致。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與pMD18-T載體(Takara)在16°C連接兩 個(gè)小時(shí)。于-70°C的冰箱中取出一管TGl感受態(tài)細(xì)胞，立即放置于冰浴中。感受態(tài)細(xì)胞中加 入質(zhì)粒連接混合液2 μ L，冰浴30min后放置于42°C水浴中90s，然后冰浴2min。最后加入 液體培養(yǎng)基至lmL，于37°C的搖床中以小于225轉(zhuǎn)/分鐘的速度復(fù)蘇60min。以IOOOOrpm 的速度離心Imin沉淀細(xì)胞，只留下200 μ L培養(yǎng)基以重懸細(xì)胞。加入IPTG和X-Gal，混合均 勻。每100 μ L懸浮細(xì)胞液涂勻一個(gè)含氨卞青霉素的LB平板，等液體吸收完畢后，37°C倒置 培養(yǎng)過夜。挑選白色的克隆置于含有氨卞青霉素的0. 5mL LB液體培養(yǎng)基的離心管中，37°C 振蕩(300rpm)培養(yǎng)3_4h。克隆通過PCR的方法篩選。PCR反應(yīng)的總體積為12. 5 μ L，內(nèi)含 1 μ L培養(yǎng)物作為模板DNA, 0. 2 μ M的引物(MseI-N引物或M13F/R測序通用引物)，0. 5U的 Taq酶，0. 1 μ M的dNTP，IXPCR緩沖液。除循環(huán)次數(shù)為35次外，其它PCR反應(yīng)條件與上面 一致。篩選出來的陽性克隆菌液交由北京華大基因公司用3730測序儀測序。2、微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)用‘Tandem Repeats Finder’軟件查找重復(fù)序列，并輔以人 工檢查和核對。根據(jù)微衛(wèi)星DNA側(cè)翼序列，利用在線引物設(shè)計(jì)軟件‘Primer 3’設(shè)計(jì)引物。3、性別連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記的驗(yàn)證首先用各16尾半滑舌鰨雄性個(gè)體與雌性個(gè)體 基因組DNA樣品對每對微衛(wèi)星引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，微衛(wèi)星擴(kuò)增的PCR反應(yīng)條件如下94°C 預(yù)變性5min，94°C變性30s，在55-60°C退火40s，72°C延伸40s，進(jìn)行38個(gè)循環(huán)后終延伸 lOmin。擴(kuò)增反應(yīng)體系為 12. 5 μ L，包括大約 20ng 總 DNA，引物 0. 2 μ mol/L，0. lmmol/L dNTP, 0. 5U Taq聚合酶，IXPCR緩沖液。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，銀 染顯帶。銀染步驟如下①固定粘有凝膠的玻璃板浸泡在乙酸水溶液中約IOmin ；② 漂洗把玻璃板轉(zhuǎn)入雙蒸水中漂洗掉乙酸；③染色在染色液(0. 硝酸銀，0. 06%福爾馬 林)中浸泡30min ；④再次漂洗在雙蒸水中漂洗約5s ；⑤顯色立即將漂洗過的凝膠玻璃 板轉(zhuǎn)入顯色液(0. 5-1.0%氫氧化鈉，0. 06%福爾馬林)，并在搖床上晃動(dòng)直到顯帶為止；⑥ 終止顯色把玻璃板轉(zhuǎn)入乙酸固定液中，終止顯色反應(yīng)。然后晾干保存并用數(shù)碼照相機(jī) 照相。比較微衛(wèi)星等位基因在雌雄個(gè)體中的分布是否有顯著差異。最終篩選到引物序列 為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的微衛(wèi)星標(biāo)記與半滑舌鰨性別緊密連鎖。然后進(jìn)一步PCR 擴(kuò)增性成熟的半滑舌鰨22尾雌魚和22尾雄魚基因組DNA，PCR反應(yīng)條件如下94°C預(yù)變性 5min，94°C變性30s，在61. 5°C退火40s，72°C延伸40s，進(jìn)行38個(gè)循環(huán)后終延伸IOmin0擴(kuò) 增反應(yīng)體系為 12. 5μ L，包括大約 20ng 總 DNA，引物 0. 2ymol/L，0. lmmol/L dNTP,0. 5U Taq 聚合酶，IXPCR緩沖液。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，銀染顯帶。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，總共擴(kuò)增出2個(gè)等位基因，按照大小順序分別命名為A、B等位基因。比對分 子量標(biāo)準(zhǔn)，A等位基因大小為244bp，B等位基因大小為234bp。所有22尾雄魚中只能擴(kuò)增 出A等位基因，而所有的22尾雌魚都能擴(kuò)增出A、B兩個(gè)等位基因(圖1)。二、半滑舌鰨雌性特異的等位基因序列及其引物序列它的技術(shù)內(nèi)容包括1、雌 性特異等位基因的克隆與測序；2、雌性特異等位基因的引物設(shè)計(jì)；3、雌性特異標(biāo)記的驗(yàn) 證。
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1、雌性特異等位基因的克隆與測序用序列 SEQ ID NO 1 (tgaactgcaa gactgctcca)禾口 SEQ ID NO: 2(catcagttggtggcctgtaa)的引物PCR擴(kuò)增1尾性成熟的半滑舌鰨雌魚DNA，用1. 5%的瓊 脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，切下PCR產(chǎn)物目標(biāo)電泳條帶，用DNA純化試劑盒純化。純化產(chǎn) 物用T4DNA連接酶連接到pMD 18-T質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，并涂勻在一個(gè)含氨卞 青霉素的LB平板上，等液體吸收完畢后，37°C倒置培養(yǎng)過夜。挑選8個(gè)陽性克隆送到生物 測序公司測序。2、雌性特異等位基因的引物設(shè)計(jì)根據(jù)測序結(jié)果，8個(gè)陽性克隆測序成功，共得到 8條序列，其中大小為244bp的序列6條，大小為234bp序列2條，分別對應(yīng)A、B兩個(gè)等位基 因，B等位基因即為半滑舌鰨雌性特異的等位基因。利用軟件MEGA4. 0比對A、B等位基因 的序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了重復(fù)區(qū)有2個(gè)GT的缺失，相對于A等位基因，B等位基因(即雌性 特異等位基因)在5’端有6個(gè)堿基的缺失。因此針對缺失的6個(gè)堿基的位置，利用在線引 物設(shè)計(jì)軟件‘Primer 3，設(shè)計(jì)了 SEQ ID NO 3 (tctgcatgac attggaaag)的一條特異引物，該 引物能與SEQ ID NO :2的引物配對用于擴(kuò)增大小為204bp的半滑舌鰨雌性特異DNA片段， 從而建立簡單的PCR方法進(jìn)行半滑舌鰨遺傳性別檢測。雌性特異等位基因序列為SEQ ID N0:4(見序列表)。3、雌性特異標(biāo)記的驗(yàn)證用SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3的引物對各10尾半滑 舌鰨雄性與雌性個(gè)體基因組DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性5min， 94°C變性30s，在60°C退火40s，72°C延伸40s，進(jìn)行38個(gè)循環(huán)后終延伸lOmin。擴(kuò)增反應(yīng) 體系為 12. 5yL，包括大約 20ng 總 DNA，引物 0. 2ymol/L，0. lmmol/L dNTP，0. 5U Taq 聚合 酶，IXPCR緩沖液。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，EB染色。結(jié)果表明，所有雌性 個(gè)體中均能擴(kuò)增出大小為204bp的DNA片段，而雄性個(gè)體中無擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2)，這表明雌性 特異標(biāo)記能夠準(zhǔn)確鑒別半滑舌鰨的遺傳性別。三、基于微衛(wèi)星標(biāo)記的半滑舌鰨遺傳性別鑒定的應(yīng)用方法可以根據(jù)以下2種引 物組合開展半滑舌鰨遺傳性別鑒定1、根據(jù)序列SEQ ID NO:l(tgaactgcaa gactgctcca) 和SEQ ID NO :2(catcagttgg tggcctgtaa)的引物(引物組合1)，PCR擴(kuò)增半滑舌鰨基因 組DNA, PCR反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，在61. 5°C退火40s，72°C延伸 40s，進(jìn)行38個(gè)循環(huán)后終延伸lOmin。擴(kuò)增反應(yīng)體系為12. 5 μ L，包括大約20ng總DNA，引 物 0. 2ymol/L，0. lmmol/L dNTP,0. 5U Taq 聚合酶，1 XPCR 緩沖液。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在 6%變 性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，銀染顯帶。然后分析電泳圖譜擴(kuò)增出A、B兩個(gè)等位基因 的個(gè)體一定是雌性個(gè)體，只擴(kuò)增出A等位基因的個(gè)體一定為雄性個(gè)體。2、根據(jù)序列SEQ ID NO :2(catcagttgg tggcctgtaa)禾口 SEQ ID NO 3 (tctgcatgac attggaaag)的弓丨物(弓丨物組 合2)，PCR擴(kuò)增半滑舌鰨基因組DNA，PCR反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，在 60°C退火40s，72°C延伸40s，進(jìn)行38個(gè)循環(huán)后終延伸lOmin。擴(kuò)增反應(yīng)體系為12. 5 μ L，包 括大約 20ng 總 DNA，引物 0. 2 μ mol/L，0. lmmol/L dNTP，0. 5U Taq 聚合酶，IXPCR 緩沖液。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1. 5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，EB染色。然后分析電泳圖譜擴(kuò)增出大小 為204bp的DNA片段的個(gè)體一定是雌性個(gè)體，而擴(kuò)增不出DNA產(chǎn)物的個(gè)體一定為雄性個(gè)體。
權(quán)利要求
一種半滑舌鰨性別連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記，其特征在于它的技術(shù)內(nèi)容包括3條特異引物SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3以及雌性特異等位基因的核苷酸序列SEQ ID NO4，其序列為SEQ ID NO1tgaactgcaa gactgctcca；SEQ ID NO2catcagttgg tggcctgtaa；SEQ ID NO3tctgcatgac attggaaag；SEQ ID NO4tgaactgcaa gactgctcca gggcagtgtc tctgcatgacattggaaagc tgtgtgtgga tgcatgtgtg tgtgcgtgta atgttctcca gctatggcctacgctggctg cagcctggag ccgctctgtg gtgtggaaaa gagagcagat gcctcttcactggagtgcat caggccacca aatcgcaaat atcactgatc atctcccaat tcaattacaggccaccaact gatg。
2.一種半滑舌鰨遺傳性別鑒定的方法，其特征在于它的方法是抽提待測遺傳性別的 半滑舌鰨基因組DNA，根據(jù)獲得的半滑舌鰨性別連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記及雌性特異等位基因的 序歹Ij SEQ ID NO :4，設(shè)計(jì) 3 條特異引物=SEQ IDNO =USEQ ID NO :2 禾口 SEQ ID NO :3。用 SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2對半滑舌鰨基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在6%變性聚 丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，銀染顯帶；然后分析電泳圖譜擴(kuò)增出A、B兩個(gè)等位基因的個(gè)體 一定是雌性個(gè)體，只擴(kuò)增出A等位基因的個(gè)體一定為雄性個(gè)體；用SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 3對半滑舌鰨基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1. 5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電 泳，EB染色；然后分析電泳圖譜擴(kuò)增出大小為204bp的DNA片段的個(gè)體一定是雌性個(gè)體， 而擴(kuò)增不出DNA產(chǎn)物的個(gè)體一定為雄性個(gè)體。
全文摘要
一種半滑舌鰨性別連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記及遺傳性別鑒定方法，包括半滑舌鰨性別連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選、驗(yàn)證、雌性特異等位基因的克隆、序列分析、特異引物設(shè)計(jì)以及半滑舌鰨遺傳性別鑒定的PCR方法；根據(jù)獲得的半滑舌鰨性別連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記引物及雌性特異等位基因序列，創(chuàng)建了半滑舌鰨遺傳性別的PCR鑒定方法。本發(fā)明首次篩選到半滑舌鰨性別連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記及雌性特異等位基因，建立了半滑舌鰨遺傳性別鑒定的PCR技術(shù)。本發(fā)明具有高效、準(zhǔn)確和穩(wěn)定的特點(diǎn)，在半滑舌鰨性別控制和單性苗種生產(chǎn)中具有重要應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)在克隆半滑舌鰨性別決定基因研究中也具有重要應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/11GK101914529SQ201010239729
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月29日
發(fā)明者廖小林, 徐亙博, 徐營, 陳松林 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所