專(zhuān)利名稱：耐輻射異常球菌R1 ytxH基因培育耐鹽植物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及耐福射異常球菌Rl (Deinococcus radiodurans Rl) ytxH基因 (DR0105GeneID =1799501)的新功能，具體涉及該基因在改良植物對(duì)鹽脅迫抗性方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
土壤鹽潰化是一個(gè)世界性的資源問(wèn)題和生態(tài)問(wèn)題，越來(lái)越引起人們的重視。隨著分子生物學(xué)的技術(shù)進(jìn)步，使基因的定位、分離、轉(zhuǎn)移成為現(xiàn)實(shí)，在提高農(nóng)作物耐鹽能力方面起著重要的作用。耐福射異常球菌Rl (D. radiodurans Rl)因具有對(duì)電離福射、UV福射、DNA損傷試劑及滲透脅迫等極強(qiáng)抗性，而成為研究微生物非生物脅迫適應(yīng)機(jī)制的理想菌株，也可作為一個(gè)研究高等植物耐鹽的模式物種(Battista et al. , 2001) 來(lái)源于D. radiodurans Rl 基因組中一個(gè)大質(zhì)粒，其編碼的蛋白與滲透脅迫抗性相關(guān)。ytxH基因(DR0105)編碼的蛋白 YtxH (含有40_50aa的保守區(qū)段)屬于Lea76家族，與滲透脅迫相關(guān)。但目前未見(jiàn)耐福射異球菌Deinococcus radiodurans Rl中的ytxH基因 (DR0105GeneID :1799501)在提高植物耐鹽性方面的功能的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從D. radiodurans Rl基因組中發(fā)現(xiàn)能夠提高植物對(duì)鹽抗性的基因。并將該基因轉(zhuǎn)入植物，使轉(zhuǎn)入該基因的植物獲得耐鹽的性狀。本發(fā)明通過(guò)如下研究發(fā)現(xiàn)，Deinococcus radiodurans Rl的ytxH基因 (DR0105GeneID :1799501)具有耐高滲和鹽脅迫的功能，可用于培育耐鹽性狀的植物I、獲得含有H radiodurans RlytxH基因(DR0105)的重組工程菌株I)通過(guò) PCR 從 D. radiodurans Rl (DSM 20539)菌株基因組擴(kuò)增出 D. radioduransRlytxH 基因(DR0105)，基因序列號(hào)為=GeneID 1799501 其大小為 492bp， 該基因編碼163個(gè)氨基酸，將其克隆于載體pGEMT-easy上，構(gòu)建了含有完整ytxH基因 (DR0105)的重組質(zhì)粒 pGEMT-ytxH ;2)將ytxH基因(DR0105)連接于pRADZ3穿梭質(zhì)粒上，該質(zhì)粒含有能在大腸桿菌和耐輻射異球菌中都起作用的groEL啟動(dòng)子，構(gòu)建含有g(shù)roEL啟動(dòng)子的完整ytxH基因重組質(zhì)粒 pRADZ3-ytxH G ；3)將導(dǎo)入ytxH基因(DR0105)的重組質(zhì)粒pRADZ3_ytxH G轉(zhuǎn)入受體大腸桿菌 JM109中，獲得工程菌株JM-ytxH (見(jiàn)實(shí)施例I)；2、含有D. radiodurans RlytxH基因工程菌株的耐鹽實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)4M NaCl鹽溶液沖擊后，含有D. radiodurans RlytxH基因(DR0105) 的JM-ytxH重組菌株生長(zhǎng)狀況良好，菌落數(shù)高于只含空質(zhì)粒的JM-Z3菌株(見(jiàn)實(shí)施例2及圖4)。該工程菌株具有耐受4M NaCl沖擊的能力；
3
此實(shí)驗(yàn)表明D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)具有提高原核生物耐鹽的能力。3、ytxH基因(DR0105)在油菜中表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性鑒定I)將D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)連接到植物表達(dá)載體pBI 121中，構(gòu)建具有ytxH基因(DR0105)的重組質(zhì)粒pBI121_ytxH ;2)將pBI121-ytxH重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化油菜中，獲得了能夠耐受鹽脅迫的轉(zhuǎn)基因油菜植株;此實(shí)驗(yàn)表明D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)具有培育耐鹽植物的用途(見(jiàn)實(shí)施例3及圖5)。


圖I是含有D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)序列的PCR產(chǎn)物的驗(yàn)證電泳2是含有D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)及groEL啟動(dòng)子的原核表達(dá)載體的構(gòu)建驗(yàn)證電泳圖譜；圖3是在鹽沖擊試驗(yàn)前的含有空載體和含有D. radiodurans RlytxH基因 (DR0105)序列的原核表達(dá)載體的大腸桿菌的生長(zhǎng)狀況的菌落照片，其中a是含有空表達(dá)載體的大腸桿菌JM 109菌株；b是含有D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)表達(dá)載體的大腸桿菌重組菌株；圖4是含有D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)的原核表達(dá)載體及空載體的大腸桿菌(E. coli)在含4M NaCl培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況的菌落照片，圖中的菌株如下a是含有空表達(dá)載體的大腸桿菌JM109菌株；b是含有D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)表達(dá)載體的大腸桿菌重組菌株。圖5 是在 300mmol. L4 的 NaCl 培養(yǎng)基上轉(zhuǎn) D. radiodurans RlytxH 基因(DR0105) 油菜與非轉(zhuǎn)基因油菜的耐鹽試驗(yàn)結(jié)果比較。圖中，從左至右，左起第I盆是非轉(zhuǎn)基因油菜， 第2-3盆是轉(zhuǎn)入D. radiodurans RlytxH基因的油菜。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中所舉的質(zhì)粒、菌株只是用于對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，并不對(duì)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容加以限制。凡未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所舉的質(zhì)粒、菌株來(lái)源如下克隆載體pGEMT-easy :為Promrga公司市售產(chǎn)品；穿梭質(zhì)粒pRADZ3 :為本實(shí)驗(yàn)室保存；植物表達(dá)載體pBI121 :為Clontech公司市售產(chǎn)品；大腸桿菌JM 109 :為北京全式金公司市售產(chǎn)品。農(nóng)桿菌EHA 105由本實(shí)驗(yàn)室保存實(shí)施例ID. radiodurans RlytxH基因(DR0105)在大腸桿菌中的表達(dá)根據(jù)已公布的D. radiodurans Rl基因組中的DR_0105基因序列設(shè)計(jì)I對(duì)PCR特異性引物，從D. radiodurans Rl基因組DNA中擴(kuò)增完整的核苷酸序列Up 5' ATTA JCWGT TCGCACGTGGGTGATGAGGC 3'；Down 5' ACGC C4Γν4rGAGGCGATCAGTCCTGGTTTT 。其中黑斜體部分是酶切位點(diǎn)。通過(guò)PCR方法從D. radiodurans Rl的基因組中擴(kuò)增出目的基因序列，反應(yīng)條件為94°C IOmin, [94°C 60sec,55°C 30sec,72°C 60sec]30 個(gè)循環(huán)，72°C lOmin，PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，克隆于載體pGEMT-easy上，命名為pGEMT-ytxH，并測(cè)序驗(yàn)證克隆基因正確；然后通過(guò)Spel/Ndel雙酶切獲得含有粘性末端的ytxH基因及含有啟動(dòng)子groEL的pRADZ3載體， 將ytxH基因連接于pRADZ3載體上，構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體pRADZ3-ytxH G，將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)PCR、酶切，測(cè)序驗(yàn)證插入序列正確(見(jiàn)圖1，2)，將該菌株命名為 JM-ytxHο將含有pRADZ3空質(zhì)粒的E. coli JMl09命名為JM-Z3。實(shí)施例2含D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)重組菌株的耐鹽實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)方法I、將實(shí)施例I中獲得的2個(gè)重組的大腸桿菌分別接種于20mL LB液體培養(yǎng)基(含 Amp抗生素)中，搖瓶過(guò)夜培養(yǎng)后(37°C )，再轉(zhuǎn)接于IOOmL的LB液體培養(yǎng)基中，盡量保持接種量的一致，培養(yǎng)至0D_約為0. 5。2、取IOmL的菌液離心后，在等體積的4M NaCl鹽溶液里沖擊2h，每個(gè)樣品立即用無(wú)菌去離子水倍比稀釋至10_4，取10 μ L點(diǎn)在LB固體培養(yǎng)基表面，經(jīng)37°C培養(yǎng)16h，觀察菌落形成情況并照相。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖3顯示，4M NaCl鹽溶液沖擊前前含有D. radiodurans RlytxH基因(DR0105) 的JM-ytxH菌株與含空質(zhì)粒的JM-Z3菌株生長(zhǎng)狀態(tài)基本一致；4M NaCl鹽溶液沖擊后，含有 D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)的JM-ytxH菌株生長(zhǎng)狀況良好，菌落數(shù)明顯高于只含空質(zhì)粒的JM-Z3菌株(見(jiàn)圖4)。三、結(jié)論D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)提高了原核生物耐鹽的能力。實(shí)施例3ytxH基因(DR0105)在油菜中表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性鑒定(一 )農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化油菜實(shí)驗(yàn)I.根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)的制備I)挑取單菌落，接種于5mL YEB液體培養(yǎng)基(含利福平Rif 50mg/L), 28°C, 250rpm 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；2)取 2mL 菌液，加入 50mL YEB 液體培養(yǎng)基(含 Rif 50mg/L)中，28°C，250rpm 振蕩培養(yǎng)至OD600 O. 6 ;3)將菌液轉(zhuǎn)至50mL無(wú)菌離心管中，冰浴30min,5000Xg離心5min ；4)棄上清，用2mL 20mM CaCl2重懸沉淀，每份100 μ L分裝到I. 5mL離心管中，液
氣中保存?zhèn)溆谩?.重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌I)將約I μ g的pBI-ytxH質(zhì)粒DNA分別加入到100 μ LEHA105感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴5min ；2)將離心管置液氮中冷凍8min，迅速轉(zhuǎn)至37°C水浴中溫浴5min ；3)加入ImL YEB液體培養(yǎng)基，在28°C搖床上250rpm復(fù)蘇4 5h ;4)取適量菌液涂布到含利福平(Rif) 50mg/L和卡那霉素(Kan) 100mg/L的YEB固體培養(yǎng)基上，置28 °C培養(yǎng)24 48h。3.農(nóng)桿菌的質(zhì)粒的提取I)挑取菌落于含利福平(Rif) 50mg/L和卡那霉素(Kan) 100mg/L的YEB液體培養(yǎng)基中(YEB :胰蛋白胨5g/L，酵母提取物lg/L，蔗糖5g/L，硫酸鎂O. 5g/L)，28°C，250rpm振蕩培養(yǎng)20h ；2)取 I. 5mL 菌液離心后，棄上清，用 STE 溶液(Tris-HCI IOmM pH8. O, NaCl IOmM, EDTA IOmM pH 8. O)洗滌2次，棄上清，加入預(yù)冷的溶液I (50mM葡萄糖，25mM Tris-HClpH8. O, IOmM EDTA pH 8. O, RNase A 100 μ g/mL) 300 μ L，用移液器反復(fù)抽吸混勻， 室溫靜置IOmin ；3)加入新鮮配置的溶液II (O. 2M NaOH, I % SDS) 600 μ L，上下顛倒幾次混勻；4)加入預(yù)冷的溶液III (5Μ乙酸鉀pH 5. 2，冰醋酸11. 5mL，加水至IOOmL) 450 μ L， 充分混勻，冰浴5min，4°C 12000 Xg離心5min，取上清用O. 6倍體積的異丙醇沉淀；5)沉淀用適量 TE (Tris-HCI IOmmoI/L，ImmoI/LEDTA，pH 8. O)溶解后，經(jīng) PCR、Bam HI、Sac I雙酶切驗(yàn)證。4.油菜無(wú)菌苗的準(zhǔn)備及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ytxH基因(DR0105)遺傳轉(zhuǎn)化I)油菜無(wú)菌苗的培養(yǎng)甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus L. ) (84100-18)種子在超凈工作臺(tái)上用滅菌水浸泡 IOmin, 10 %的NaClO滅菌12min，再用O. I %的升汞溶液消毒7_8min，用滅菌水洗3_5遍，并把滅菌的油菜種子均勻地?cái)[放在無(wú)激素的預(yù)培養(yǎng)基上(7.5%瓊脂)。光照培養(yǎng)，4-5d齡油菜幼苗最適于遺傳轉(zhuǎn)化。2)預(yù)培養(yǎng)用75%的酒精和高溫消毒滅菌的剪刀剪掉子葉和生長(zhǎng)點(diǎn)，剪取油菜無(wú)菌苗緊鄰生長(zhǎng)點(diǎn)下約O. 5cm長(zhǎng)的下胚軸，置于預(yù)培養(yǎng)基(MS+6-BA 2mg/L+2,4_D lmg/L+AgN032. 5mg/ L+AS 19. 62mg/L)上，光照預(yù)培養(yǎng)2d。3)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)在50mL LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素100mg/L、利福平50mg/L)中加入 O. ImLytxH-EHA 105 菌液，28°C下 220rpm 振蕩培養(yǎng) 16h 左右，室溫下 4000 Xg 離心 lOmin， 棄上清液，菌體用滅菌的MS液體培養(yǎng)基(含AS 100 μ mol/L)懸浮，稀釋到原體積的5_20 倍，在28°C下220rpm振蕩培養(yǎng)lh，使菌液的OD6tltl達(dá)0. 5左右。4)共培養(yǎng)把預(yù)培養(yǎng)2d的下胚軸放入菌液中浸染lmin，用藥勺撈出下胚軸，放在滅菌的吸水紙上，吸干下胚軸上的多余菌液，再放到覆蓋有滅菌濾紙的預(yù)培養(yǎng)基上，用封口膜封好培養(yǎng)皿，25 °C左右，于暗處共培養(yǎng)約2d(暗培養(yǎng))。5)誘導(dǎo)培養(yǎng)把共培養(yǎng)2d的下胚軸放到誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+6-BA 2mg/L+AgN032. 5mg/L)上，用封口膜封好培養(yǎng)皿，25°C左右光照培養(yǎng)，每2周繼代I次，直至長(zhǎng)出膨大的愈傷組織。6)選擇培養(yǎng)把膨大的愈傷組織轉(zhuǎn)移到到篩選培養(yǎng)基(MS+6-BA 2mg/L+AgN032. 5mg/L+Kan 100mg/L)上，用封口膜封好培養(yǎng)皿，25°C左右光照培養(yǎng)，每2周繼代I次，直至長(zhǎng)出苗。7)生根培養(yǎng)當(dāng)幼芽長(zhǎng)到l-2cm高時(shí)，把它們從愈傷組織上分離，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上 (1/2MS+NAA O. 5mg/L+Kan 25mg/L)進(jìn)行生根培養(yǎng)。在抗生素篩選條件下，約87%的芽在2 周后形成根。8)煉苗和移栽生根后的幼苗長(zhǎng)到5-6cm高時(shí)，半敞開(kāi)培養(yǎng)瓶蓋子，進(jìn)行煉苗；待幼苗適應(yīng)外界環(huán)境以后，轉(zhuǎn)移到室內(nèi)滅菌的蛭石中栽種培養(yǎng)，并用1/2MS培養(yǎng)液澆灌。當(dāng)幼苗生長(zhǎng)至7-9cm 時(shí)，將幼苗移植到泥土中生長(zhǎng)，然后再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。(二)含ytxH基因(DR0105)序列轉(zhuǎn)基因油菜的耐鹽性鑒定實(shí)驗(yàn)I、實(shí)驗(yàn)?zāi)康蔫b于該核苷酸序列已被證明在大腸桿菌中對(duì)鹽脅迫具有抗性，進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行耐鹽性鑒定。2、實(shí)驗(yàn)方法采用不同的NaCl 濃度(0、50、100、150、200、250 和 300mmol. L-1NaCl)分別對(duì)轉(zhuǎn)基因油菜植株和非轉(zhuǎn)基因油菜植株進(jìn)行生長(zhǎng)情況的觀察。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果在沒(méi)有NaCl處理的情況下，轉(zhuǎn)基因油菜和非轉(zhuǎn)基因油菜的生長(zhǎng)狀況沒(méi)有明顯的
差異;在添加50mmol. T1NaCl的情況下，非轉(zhuǎn)基因油菜仍然能保持生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)的速率比轉(zhuǎn)基因油菜要緩慢一些。表明低鹽條件下，野生型植株生長(zhǎng)已明顯受到抑制；當(dāng)NaCl的濃度增加到100和150mmol. L—1時(shí)，非轉(zhuǎn)基因的油菜葉片最初變黃、接著葉片逐漸萎蔫，20d后全部死亡；當(dāng)NaCl濃度為200mmol. Γ1時(shí)，非轉(zhuǎn)基因的油菜葉片迅速發(fā)黃、葉片萎焉，幼葉幾乎停止生長(zhǎng)，并向葉背面翻卷，由原來(lái)的綠色變淺綠，大約在15d后死亡；當(dāng)NaCl濃度增加到250和300mmol. L—1，非轉(zhuǎn)基因油菜苗均在2d內(nèi)開(kāi)始發(fā)黃，7_8d 后幾乎全部死亡，而轉(zhuǎn)基因油菜均能夠存活5周以上。從圖5可知轉(zhuǎn)基因油菜可在300mmol. Γ1的NaCl培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，非轉(zhuǎn)基因油菜在300mmol. Γ1的NaCl培養(yǎng)基上干枯死亡。結(jié)果證明，該基因?qū)}的脅迫確有抗性。而在上述各種NaCl濃度下，轉(zhuǎn)入ytxH基因(DR0105)的油菜均能正常生長(zhǎng)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表I :表I轉(zhuǎn)基因油菜和非轉(zhuǎn)基因油菜對(duì)鹽脅迫的比較
權(quán)利要求
1.Deinococcus radiodurans RlytxH 基因(DRO105, GeneID :1799501)培育耐鹽植物的用途。
2.含Deinococcus radiodurans RlytxH 基因的重組質(zhì)粒。
3.含有D.radiodurans RlytxH基因的重組工程菌株。
4.含Deinococcusradiodurans RlytxH基因的重組質(zhì)粒培育耐鹽植物的用途。
5.權(quán)利要求4所述的用途，所述重組質(zhì)粒是能在大腸桿菌表達(dá)的質(zhì)粒。
6.權(quán)利要求4所述的用途，所述重組質(zhì)粒是能在植物中表達(dá)的質(zhì)粒。
7.權(quán)利要求4所述的用途，所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞培育耐鹽植物的用途。
8.權(quán)利要求7所述的用途，所述宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。
9.權(quán)利要求I或4所述的用途，所述植物是油菜。
全文摘要
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)耐輻射異球菌Deinococcus radiodurans R1中的ytxH基因(DR0105)具有提高原核生物及植物的抗逆能力。本發(fā)明構(gòu)建了包含上述基因的重組載體，把它們分別導(dǎo)入原核及真核宿主細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ytxH基因(DR0105)能夠提高原核生物耐鹽的能力；將該基因轉(zhuǎn)入植物后獲得的轉(zhuǎn)基因植物也具有耐鹽的能力。
文檔編號(hào)C12N15/31GK102586283SQ201210046539
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月24日
發(fā)明者張維, 林敏 , 江世杰, 王勁, 趙鵬, 陳明 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所